Analisando os parâmetros comprimento, largura, E limiar e ΔVmax limiar das
células, notamos que não há diferença estatística entre os valores medidos para cada grupo experimental, de forma que é razoável considerar que as quatro populações de células são uniformes (Tabela 1). Os valores observados também foram semelhantes aos relatados em estudos anteriores, conforme o esperado (Prado et al., 2016; Fonseca et al., 2013; Goulart
et al., 2012; Oliveira et al., 2008).
5.2.1
Curvas de letalidade
Para o grupo MONO, o E50 foi igual a 98,5 V/cm (IC95 = 96,8 a 100,1 V/cm) e coeficiente de Hill (h) = 9,56 (IC95 = 8,04 a 11,1), o que está próximo dos resultados da literatura (Prado et al., 2016, E50 = 90,73 V/cm e h = 7,40),
Quanto aos resultados inéditos, houve sobreposição do IC95 do E50 para os grupos MONO, MULTI0 e MULTI120 (Tabela 2), indicativo de que não há diferença estatística entre as curvas de letalidade destes grupos.
Uma possível explicação para a semelhança entre probabilidade de letalidade para estímulos com protocolos MONO, MULTI0 e MULTI120 pode ser feita por meio do cálculo da ΔVminduzida pelos pulsos de alta intensidade. Analisando individualmente o efeito de
cada pulso em uma célula com dimensões médias (com comprimento igual a 120 𝜇m e largura igual a 30 𝜇m), um E aplicado a 60o ou 120o do maior eixo da célula produz
uma despolarização equivalente a 62% da despolarização induzida por um E de mesma amplitude na direção longitudinal (equação 3.3). Como a maioria dos processos relacio- nados à morte da célula em virtude da aplicação de um E estão relacionados à ΔVm, o
dano causado por pulsos não paralelos à célula é bem menor do que o pulso na direção longitudinal.
No entanto, além de possuir uma relação com a direção do E, a ΔVm induzida
por um pulso de um estímulo multidirecional depende do efeito dos pulsos anteriores, pois, se o pulso anterior causar eletroporação, a ΔVm induzida pelo próximo E aplicado
será menor, dado que a eletroporação reduz a resistividade da membrana em duas ordens de grandeza (Kinosita et al., 1988), caracterizando-se como um fenômeno auto limitante. Por outro lado, se o E aplicado anteriormente não causar eletroporação, pode ocorrer uma soma do efeito com o próximo estímulo, ou seja, a ΔVm causada pelo pulso anterior
pode se somar à ΔVm induzida pelo próximo estímulo devido às características passivas
da membrana (Aidley, 1998; Kotnik et al., 1997; Malmivuo & Plonsey, 1995), causando eletroporação.
Para as células do grupo MULTI0, o pulso na direção longitudinal é o primeiro pulso do estímulo multidirecional. Como a formação de poros hidrofílicos é um processo
que ocorre na escala de ns (Kotnik et al., 2012; Saulis, 2010), a membrana já sofreu eletropermeabilização quando os pulsos subsequentes foram aplicados. Assim, o efeito dos pulsos a 60o e a 120o é atenuado, justificando a sobreposição dos IC95 do E50 para os
grupos MONO e MULTI0.
Para o grupo MULTI120, a sobreposição do IC95 do E50 com o grupo MONO também pode ser explicada pelo efeito reduzido dos pulsos não orientados na direção longitudinal, pois estes induzem menor ΔVm. Neste grupo experimental, o primeiro pulso
do estímulo multidirecional foi aplicado a um ângulo de 120o em relação ao maior eixo da célula. A partir dos resultados obtidos experimentalmente, inferimos que esse pulso não tem efeito expressivo na ΔVm induzida, logo, na formação de poros hidrofílicos causada
pelo pulso subsequente, aplicado na direção longitudinal (180o, seção 3.10.3).
As células do grupo MULTI60, por sua vez, apresentaram um E50 de 114,3 V/cm, valor cerca de 14 % maior que o obtido para os outros grupos. O E50 não possui sobrepo- sição de IC95 com nenhum outro grupo experimental. Neste protocolo de estimulação, o pulso aplicado na direção longitudinal é o terceiro (seção 3.10.3). Este efeito também foi observado com a aplicação de estímulos bipolares, em que o E50 do pulso bipolar é cerca de 17 % maior que o monopolar, de mesma duração (Oliveira et al., 2008). De fato, a ΔVminduzida pelo protocolo MULTI60 se assemelha à induzida por um estímulo bipolar,
pois consiste de uma hiperpolarização seguida de despolarização, para a região da célula voltada para o anodo dos eletrodos a 0o (Figura 24; ver Apêndice). A ΔV
m induzida
por um estímulo com protocolo MULTI120, contudo, se assemelha à ΔVm induzida pela
aplicação de um pulso monopolar (Figura 24).
Desta forma, observamos que um único pulso aplicado na direção longitudinal está associado a uma maior probabilidade de letalidade que um pulso idêntico precedido por pulsos a 60o e a 120o. Em outras palavras, este protocolo exerce um efeito protetor na
célula, devido à inversão de polaridade, do mesmo modo que no estímulo bipolar (Oliveira
et al., 2008).
Apesar de nossa análise discutir a ΔVminduzida durante a aplicação de estímulos
de alta intensidade e a formação de poros hidrofílicos no sarcolema, é necessário destacar que a morte celular é um fenômeno que abrange outros mecanismos. Por exemplo, para que a célula sofra hipercontratura irreversível, é necessário que haja entrada de Ca2+ pelos poros hidrofílicos (Oliveira, 2008). Adicionalmente, um estímulo de alta intensidade pode alterar a conformação de proteínas na membrana celular, modificando características eletrofisiológicas do miócito, como Vmde repouso ou a amplitude do PA (Chen et al., 2006;
Tung, 1996).
O fator de segurança (FS) é um parâmetro definido como a razão entre o E50 e o limiar de estimulação da célula, para uma dada forma de onda (Prado et al., 2016; Oliveira
Figura 24 – Variação do potencial transmembrana teórica calculada para uma célula com dimensões médias (2a = 30 𝜇m e 2c = 120 𝜇m) submetida a um estímulo multidirecional com amplitude E = 100 V/cm. A) Grupo MULTI60. B) Grupo MULTI120.
é idêntico ao E limiar para estímulos monodirecionais aplicados paralelamente ao maior eixo da célula (Fonseca et al., 2013) e que o E50 para estímulos multidirecionais também possui uma amplitude semelhante ao E50 para estímulos monodirecionais longitudinais, o FS de um estímulo multidirecional é da ordem do FS de um estímulo monodirecional. Para pulsos monopolares com 5 ms de duração, este valor é da ordem de 20 (Prado et al., 2016). Apesar de não apresentarem aumento do FS, estímulos multidirecionais tem um potencial de redução de danos em protocolos desfibrilatórios, pois a amplitude do estímulo é menor (Viana et al., 2016).
5.2.2
Implicações clínicas
Com os valores de E observados para células submetidas a estímulos multidireci- onais, espera-se que protocolos desfibrilatórios multidirecionais tenham menor potencial de lesar o tecido cardíaco.
As curvas de letalidade para estímulos multidirecionais estão próximas à curva de letalidade para estímulos monodirecionais. Ao aplicarmos um estímulo multidirecional em um paciente sofrendo fibrilação ventricular, espera-se que cada pulso do estímulo mate um número de células equivalente ao número de células mortas por um estímulo monodirecional. Entretanto, a energia do limiar desfibrilatório é cerca de 30 % menor
para estímulos multidirecionais (Viana et al., 2016), o que equivale a uma redução de 16 % na amplitude do E aplicado. Observando as curvas de letalidade (Figura 23), podemos observar que esta redução de 16 % na amplitude do E acarreta em uma drástica redução da probabilidade de letalidade de uma célula (54 % para 17 %) para valores em torno de 100 V/cm, que podem ocorrer durante a aplicação de um estímulo desfibrilatório monodirecional (Yabe et al., 1990).
Considerando que as células cardíacas estejam orientadas em todas as direções, esta redução na probabilidade de letalidade equivale a uma ligeira diminuição do número total de células lesadas pelo pulso desfibrilatório, pois o estímulo monodirecional apre- sentaria uma mortalidade de 54 %, enquanto o estímulo multidirecional apresentaria uma mortalidade de 51 %. Entretanto, esta análise não leva em consideração a anisotropia do coração. Como a distribuição do E é heterogênea no tecido cardíaco, espera-se que uma fração reduzida do miocárdio seja exposta à mesma amplitude de E para os três pulsos do estímulo multidirecional. Assim, as curvas de letalidade obtidas neste trabalho esta- belecem um limitante superior para a probabilidade de letalidade das células cardíacas. A fim de determinar precisamente a lesão causada no miocárdio são necessários mais es- tudos sobre a distribuição do E aplicado pelos estímulos desfibrilatórios multidirecionais, baseados em simulações computacionais ou preparações com corações isolados, análogos aos já realizados por Sambelashvili et al. (2004), Al-Khadra et al. (2000) e Yabe et al. (1990).
6 Conclusão
Neste trabalho, construímos um estimulador multidirecional de alta intensidade e o utilizamos na determinação das curvas de letalidade de miócitos cardíacos de rato para estímulos multidirecionais.
O EAI desenvolvido cumpre seu objetivo ao gerar pulsos com duração e intensidade desejados. O equipamento possui diversas funcionalidades controladas por um microcon- trolador. Os pulsos gerados pelas três saídas possuem a mesma amplitude, próxima da desejada pelo usuário. O protocolo de sincronismo do EAI com o estimulador multidire- cional de baixa intensidade (EBI) automatiza o protocolo de estimulação, facilitando a execução dos experimentos. O circuito de controle foi eletricamente isolado dos circuitos de alta tensão, por meio dos optoacopladores e do transformador do CF, garantindo maior segurança. O EBI também está isolado do EAI, por meio de relés. O projeto modular do EAI facilita que futuros trabalhos possam investigar outros efeitos de estímulos multidi- recionais partindo de algumas alterações pontuais do circuito, como a produção de pulsos bipolares ou a geração de pulsos com diversas durações.
As curvas de letalidade obtidas para cada grupo experimental apresentaram so- breposição do IC95 para campo elétrico correspondente a 50% de letalidade (E50), com exceção do grupo MULTI60, cujo E50 foi 14 % maior que o dos outros grupos, indicativo de um efeito, aparentemente, protetor.
De uma maneira geral, os resultados deste trabalho corroboram com a hipótese de que a desfibrilação multidirecional não causa mais danos ao coração que a monodirecional, utilizada atualmente. No entanto, mais estudos devem ser realizados para comprovar esta hipótese.
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