Para observação e medição dos pulsos estimulatórios foi utilizado um osciloscópio digital (modelo TDS 2014C, 100 MHz, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA).
3.5
Microscopia
Durante os experimentos, a CE foi colocada sobre o estágio de um microscópio (Zeiss, Jena, Alemanha) adaptado. O sistema de iluminação é baseado em um light em-
miting diode (LED) branco de alta luminância alimentado por uma bateria de 9 V. A luz
atravessa a CE pelo orifício da peça de acrílico opaco (ver sessão 3.6), atingindo a objetiva (10x, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). A imagem das células foi captada por uma câ- mera de video (Webcam 3810 Leadership; 5 MP) fixada na parte superior do microscópio e exibida na tela de um computador (Laptop Dell Inspiron 5520; Intel Core i7 2,20 GHz; 8 GB RAM 1 TB HD; Ubuntu 14.04), como mostrado na Figura 8.
A razão de amplificação do sistema foi determinada utilizando-se uma lâmina mi- crométrica de calibração, cujo comprimento foi medido em pixels. Este valor foi utilizado como referência para determinação das dimensões de cada célula.
3.6
Câmara de estimulação
A CE (fabricada no Centro de Engenharia Biomédica, Unicamp, Campinas, SP) pode ser visualizada na Figura 16. Ela é constituída de material acrílico transparente cilíndrico com 10 mm de raio e 5 mm de altura (Bassani et al., 2006). Os eletrodos de platina, cada um com 5 mm de comprimento e 0,5 mm de diâmetro, foram posicionados
de 60o em 60o perpendicularmente à base da câmara, sendo que eletrodos diametralmente
opostos compõe uma direção de estimulação.
Figura 16 – Vista explodida da câmara de estimulação (CE) (Fonseca, 2009)
As células foram depositadas em uma lâminula de vidro apoiada sobre a base da câmara. Na base, há uma peça de acrílico opaco cujo centro possui um orifício de 2mm. Este orifício delimita a área de trabalho onde o E cuja direção varia menos que 1o e cuja
amplitude varia menos de 1% em relação ao campo no centro da câmara. O E dentro da área de trabalho é dado por (Bassani et al., 2006):
𝐸 = 2𝐼
𝑏𝜋𝜎ℎ (3.1)
Em que I é a corrente que atravessa os eletrodos, b = 10 mm é o raio, h = 5 mm, a altura e 𝜎 = 0,0146 Ω-1cm-1, a condutividade da solução de Tyrode Normal (NT)
3.7
Animais
Os miócitos cardíacos utilizados foram retirados de ratos Wistar adultos (3-7 meses de idade) de ambos os sexos. Os animais foram provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB/UNICAMP) e do Biotério do Centro de Engenharia Biomédica da Universidade Estadual de Campinas (CEB/UNICAMP). Eles foram aloja- dos em gaiolas coletivas, onde receberam água e ração à vontade, sob um ciclo claro-escuro de 12:12 horas. Os ratos não sofreram nenhuma manipulação experimental até o dia de serem sacrificados para o isolamento das células.
O procedimento experimental foi analisado pela Comissão de Ética na Experimen- tação Animal – Instituto de Biologia – UNICAMP e aprovado com o protocolo: 4093-1(I).
3.8
Soluções fisiológicas
As soluções utilizadas estão listadas a seguir, e as concentrações dos solutos estão expressas em milimolar (mM).
• Solução de Tyrode Normal (NT): NaCl 140, KCl 6, MgCl2.6H2O 1.5, HEPES 5,
glicose 11.1, CaCl2.2H2O 1.
• Solução de Tyrode para isolamento de células (TyCI): tem composição igual a NT, exceto por ter CaCl2 substituído por MgCl2 e conter 10 mM HEPES.
• Solução Krebs-Henseleit para isolamento de células: NaCl 115; KCl 4,6; KH2PO4
1,2; NaHCO3 25; MgSO4 2,4; glicose 11,1.
• Solução cardioplégica para dissociação e armazenamento das células (Cpl-P): KH2PO4
10; KCl 30; MgCl2 1; taurina 20; glicose 11; HEPES 10; ácido glutâmico 70; pH 7,4
a 23oC ajustado com KOH.
3.9
Isolamento de células
Os miócitos cardíacos utilizados foram retirados de ratos Wistar adultos (3-7 me- ses de idade) de ambos os sexos e isolados por digestão enzimática do coração (Penna & Bassani, 2010). Os animais foram sacrificados por exsanguinação sob anestesia profunda com isoflurano, com imediata retirada do coração. O coração foi perfundido com solução de Krebs-Henseleit sem cálcio a 37oC em um sistema de Langendorff por 5 minutos. Em seguida, o coração foi perfundido com a mesma solução contendo 0,5 mg/ml de colagenase tipo I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, EUA) por 15-20 minutos. A enzima foi removida por perfusão com solução de Tyrode para isolamento de células
(TyCI) contendo albumina sérica bovina (0,5 mg/ml) por cerca de 10 minutos. O tecido ventricular esquerdo foi então delicadamente triturado em solução cardioplégica para dis- sociação e armazenamento das células (Cpl-P), para dissociação das células. A mesma solução foi usada para lavagem e armazenamento das células.
3.10
Protocolo experimental
Durante os experimentos, a temperatura do laboratório foi mantida em torno de 24oC.
3.10.1
Preparação da câmara
600 𝜇l de solução Cpl-P, contendo as células cardíacas isoladas, foram colocados em um tubo cônico para microcentrífuga (Eppendorf ) para sedimentação dos miócitos. Após 5 minutos, a solução sobrenadante foi removida e substituída pelo mesmo volume de solução NT.
A solução no Eppendorf foi homogeneizada e 100 𝜇l foram depositados na CE em cada experimento. Após 20 minutos para adesão das células, 1470 𝜇l de solução NT foram cuidadosamente adicionados à CE.
3.10.2
Dimensões e limiares de estimulação
Inicialmente, escolheu-se células alinhadas a algum par de eletrodos da câmara, com um desvio máximo de 5o. Uma imagem da célula em repouso foi utilizada para determinação das dimensões (comprimento e largura) da célula.
A célula foi estimulada com pulsos bipolares monodirecionais supralimiares de baixa intensidade, com duração de 5ms e frequência de 0,5 Hz, paralelos ao maior eixo da célula. Diminuiu-se gradativamente a amplitude do estímulo até que não houvesse resposta da célula. Considerou-se limiar de estimulação a menor amplitude de estímulo ao qual a célula respondeu com contração.
Os estímulos bipolares evitam a polarização dos eletrodos.
3.10.3
Determinação da relação entre o campo elétrico e letalidade
A estimulação supralimiar (1,2 x E limiar de estimulação) foi retomada para que as contrações do miócito entrassem em regime permanente. Um estímulo bipolar foi subs- tituído por um estímulo de alta intensidade (ver seção 3.2.1) de acordo com o grupo de estudo (ver seção 3.10) e a estimulação foi cessada. Caso não houvesse contração irrever- sível, esperava-se até 10 minutos para que a célula se recuperasse, a estimulação bipolar
era retomada e repetia-se o protocolo com estímulos cada vez maiores. O experimento era finalizado quando a célula apresentasse contração irreversível. Os valores dos pulsos de alta intensidade foram de 12, 16, 20, 25, 30 e 35 vezes o limiar de estimulação.
O E letal foi determinado para quatro grupos de células. Cada grupo foi nomeado de acordo com o estímulo de alta intensidade ao qual os miócitos foram submetidos:
• Grupo MONO: estímulos monodirecionais com pulso aplicado a 0o (paralelo ao
maior eixo da célula; N = 12).
• Grupo MULTI0: estímulos multidirecionais com pulsos aplicados a 0o, 60o e 120o,
respectivamente, com relação ao maior eixo da célula (N = 12).
• Grupo MULTI60: estímulos multidirecionais com pulsos aplicados a 60o, 120oe 180o, respectivamente, com relação ao maior eixo da célula (N = 12).
• Grupo MULTI120: estímulos multidirecionais com pulsos aplicados a 120o, 180o e
240o, respectivamente, com relação ao maior eixo da célula (N = 12).
Deste modo, estudamos os três casos em que um pulso coincide com a direção longitudinal da célula (0o ou 180o).
A aplicação dos estímulos está representada na Figura 17. A Figura 17A representa um miócito alinhado a um par de eletrodos sobre a área de trabalho da CE. Os eletrodos foram posicionados a cada 60o e cada par de eletrodos diametralmente opostos compõe
uma direção de estímulo.
O estímulo monodirecional de alta intensidade foi composto de um único pulso com duração de 5 ms (grupo MONO). Ele também foi produzido pelo EAI, mas apenas o primeiro canal estava conectado à CE (Figura 17A).
Os estímulos multidirecionais de alta intensidade consistiram em 3 pulsos com duração de 5 ms e intervalo de 1 ms entre eles (sem sobreposição temporal) aplicados no sentido horário. No grupo de células submetidas a estímulos de alta intensidade mul- tidirecionais, com primeiro pulso a 0o (MULTI0), o primeiro pulso foi sempre aplicado
paralelamente ao maior eixo da célula (direção longitudinal); o segundo, a 60o do pri-
meiro no sentido horário e o terceiro, a 120o, como indicado na Figura 17B. Para o grupo
MULTI60, o primeiro pulso foi aplicado a 60o da direção longitudinal do miócito; o se-
gundo, a 120o e o terceiro, a 180o (direção longitudinal, vide Figura 17C). Analogamente, para o grupo MULTI120, o primeiro pulso foi aplicado a 120o da direção longitudinal; o segundo, a 180o e o terceiro, a 240o, também representado na Figura 17D.??
Figura 17 – Protocolos de estimulação letal. A) Miócito (fora de escala) dentro da CE e protocolo de estimulação letal para o grupo MONO. B) Protocolo de estimu- lação letal para o grupo MULTI0. C) Protocolo de estimulação letal para o grupo MULTI60. D) Protocolo de estimulação letal para o grupo MULTI120.