CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL CAMPUS DE PATOS-PB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
BACTÉRIAS QUE DEGRADAM MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO
EXPEDITO KENNEDY ALVES CAMBOIM
PATOS-PB 2012
EXPEDITO KENNEDY ALVES CAMBOIM
BACTÉRIAS QUE DEGRADAM MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO
Prof. Dr. Franklin Riet-Correa Orientador
Profa. Dra. Marcia Almeida Melo Co-Orientadora
PATOS-PB 2012
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina Grande como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária.
FICHA CATALOGRÁFICA
Dados de Acordo com AACR2, CDU E CUTTER Biblioteca Setorial - CSTR/UFCG – Campos de Patos/PB
C176b
2012 Camboim, Expedito Kennedy Alves
Bactérias que degradam monofluoroacetato de sódio / Expedito Kennedy Alves Camboim - Patos: CSTR/PPGMV, 2012.
56 f.
Inclui bibliografia.
Orientador (a): Franklin Riet-Correa
Tese (Doutorado em Medicina Veterinária). Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande.
1 – Toxicologia veterinária. 2 – Biologia molecular. 3 – Bactérias. 4 – Fluoroacetato dehalogenase – Título.
Nome: CAMBOIM, Expedito Kennedy Alves
Título: Bactérias que degradam monofluoroacetato de sódio
Aprovada em 09/11/ 2012
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________ Prof. Dr. Franklin Riet-Correa - Orientador
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos/PB Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
___________________________________________ Prof. Dr. Luciano Nakazato
Universidade Federal do Mato Grosso – Cuiabá/MT Laboratório de Biologia Molecular
___________________________________________ Prof. Dr. Edson Moleta Colodel
Universidade Federal do Mato Grosso – Cuiabá/MT Departamento de Clínica Médica Veterinária
___________________________________________ Prof. Dr. Sergio Santos Azevedo
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos/PB Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
___________________________________________ Prof. Dr. Sara Vilar Dantas Simões
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos/PB Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina Grande como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária.
"Uma família feliz nada mais é do que o paraíso antecipado". Aos meus pais Davi e Preta, irmãos Kadmu e Kadna,
pelo carinho, dedicação e compreensão, dedico.
AGRADECIMENTOS
Ao Deus Pai, por guiar-me nesta caminhada, por me dar forças para enfrentar as dificuldades do dia a dia e por estar presente iluminando os caminhos de minha vida.
Aos meus pais Davi e Maria de Fátima (Preta) e irmãos Kadmu e Kadna pelo amor, carinho e incentivos constantes em mais uma vitória em nossas vidas.
Aos meus tios, primos, avós, por fazerem uma família unida e feliz.
A minha Co-orientadora, que foi orientadora, Professora Marcia e ao Professor Paulo Andrade, pela confiança, atenção, amizade e pela minha formação.
Ao meu Orientador Professor Riet, pelos ensinamentos e exemplo profissional. Aos professores Sara, Eldinê, Rosane, Flávio, Edisio, Sérgio, Moraes, Olaf, Pedro Isidro, Carlos Peña e Josemar Marinho pelos ensinamentos profissionais e pessoais.
Aos colegas e amigos de Pós-Graduação: Adriana, André, Clarice, Adílio, Renault, Lizziane, Valéria, Tatyane, Albério, Giovana, Luciano e Rômulo pela amizade e por lutarem pelos seus ideais e darem continuidade ao aprendizado.
A equipe do laboratório de Biologia molecular: Tereza, Eduardo Vaz, Vanessa, Arthur, Aline, Gilsane, pela convivência, trabalhos realizados, apoio que me ofereceram, pelos momentos de desabafo e amizade, que foram essenciais para esse sucesso.
À UFCG e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária pela oportunidade de oferecer este curso de Pós-Graduação.
À UFPR por ter colaborado para conclusão da pesquisa, especialmente aos professores Emanuel Maltempi e Fábio Pedrosa, a Michelle, Walter, Marcelo e Helisson.
Ao INCT para o controle de plantas tóxicas por ter financiado toda esta pesquisa. À EMATER Paraíba e aos meus colegas e amigos Bruno, Branco, Bezerra, Jailson, Cícero, Chico Acácio, Bosco, Ronaldo, Socorro, Mariazinha, Luzimar, Geovanne Medeiros, Jeferson, Alexandre Alfredo, Romero, Marineide, Marconi, Alan Bergman, Franklyn, Marcigleudo, Madeline, Celiane, Esdras e Vespucci pelo profissionalismo, companheirismo e amizade.
Aos membros da banca examinadora, por aceitarem o convite e por suas valiosas considerações.
A todos os amigos que tenho.
Todas estas pessoas foram muito importantes para mim durante esta caminhada.
SUMÁRIO
Pag.
Introdução ... 8
Referências ... 9
CAPÍTULO I Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil Resumo ... 11
Introdução... 12
Material e Métodos …... 13
Coleta das amostras ... 13
Isolamento bacteriano ... 13
Identificação da sequência do gene 16S rRNA ... 14
Análise das sequências e filogenia ... 15
Resultados ... 15
Discussão ... 19
Referências ... 21
CAPÍTULO II Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen de caprino no Brasil Resumo ... 25
Introdução... 26
Material e Métodos …... 27
Coleta e processamento das amostras ... 27
Isolamento bacteriano ... 27
Identificação da sequência do gene 16S rRNA ... 28
Análise das sequências e filogenia ... 28
Resultados e Discussão... 29
Referências ... 35
CAPÍTULO III Ubiquidade da fluoroacetato dehalogenase em bactérias: uma abordagem in silico Resumo ... 40 Abstract ... 41 Introdução... 41 Material e Métodos …... 43 Resultados e Discussão... 43 Referências ... 53 Considerações finais ... 56
LISTA DE TABELAS
Pag. CAPITULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil Tabela 1 Resultados do BLAST para as sequências do gene 16S rRNA obtidas de
bactérias isoladas de amostras de solo e plantas ... 16 CAPITULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen de caprino no Brasil
Tabela 1 Resultados do alinhamento local das sequências bacterianas de 16S rRNA dos isolados que degradam fluoroacetato. As sequências foram comparadas àquelas depositadas no National Center for Biotechnology Information, utilizando o algoritmo regular BlastN disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Os organismos com sequências similares aos isolados ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) estão listadas na segunda coluna. Os valores dos parâmetros de escore total, cobertura e identidade máxima estão apresentados nas colunas 3 a 5. O código de acesso ao GenBank está apresentado em parênteses ... 30 CAPITULO III
Ubiquidade da fluoroacetato dehalogenase em bactérias: uma abordagem in silico Tabela 1 Alinhamento das sequências de fluoroacetato dehalogenases entre
Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac 08
(gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712) e as sequências enzimáticas de bactérias que possuem a mesma tríade catalítica (seleção em preto), motivos estruturais (seleção em cinza claro) e confirmado/ provável resíduo de sítio ativo (seleção em cinza escuro) ... 45 Tabela 2 Alinhamento das sequências de fluoroacetato dehalogenases entre
Burkholderia sp. (gi|95102016), Micromonospora lupini str. lupac 08
(gi|386690726), Moraxella sp. (gi|216773) e Rhodopseudomonas palustris (gi|81829712) e as 108 sequências enzimáticas de bactérias que possuem algumas alterações no sítio ativo. Tríade catalítica (seleção em preto), motivos estruturais (seleção em cinza claro) e confirmados/ prováveis resíduo de sítio ativo (seleção em cinza escuro) ... 47 Tabela 3 Percentual de substituição dos aminoácidos do sítio ativo das 108
sequências disponíveis no banco de dados de sequências proteicas do NCBI, em relação à fluoroacetato dehalogenase de Burkholderia sp. (gi|95102016) ... 51
LISTA DE FIGURAS
Pag. CAPITULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil Figura 1 Árvore filogenética baseada em sequências 16S rRNA pelo método de
máxima parcimônia. ECPB01 a ECPB07 representam os códigos dos
isolados e Methanobacterium sp. MO-MB1
(gi|311141366|dbj|AB598270.1|) o grupo externo. A história evolucionária foi inferida utilizando o método de Máxima parcimônia. A árvore consenso do bootstrap foi inferida a partir de 1000 repetições e representa a história evolutiva do táxon examinado. O percentual de árvores de consenso nos quais os táxons se agruparam no bootstrap (1000 réplicas) é mostrado perto dos ramos. A árvore foi obtida utilizando o método Close-Neighbor-Interchange com algoritmo de busca nível 1, no qual as árvores iniciais foram obtidas mediante a adição aleatória de sequências (10 réplicas). A análise evolutiva foi realizada pelo método MEGA5 ... 18 Figura 2 Taxa de degradação do fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de
amostras de solo e plantas no Estado da Paraíba, Brasil. Os símbolos são como se segue. O círculo branco: ECPB01, o triângulo preto: ECPB02, o quadrado preto: ECPB03, o círculo cinza: ECPB04, o quadrado cinza: ECPB05, o triângulo cinza: ECPB06, o círculo preto: ECPB07 ... 19 CAPITULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen caprino no Brasil
Figura 1 Árvore filogenética baseada nas sequências do gene do 16S rRNA por análise de Máxima Parcimônia. ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) são os códigos dos isolados. Em parênteses estão os códigos do GenBank. É apresentada a relação entre ECPB08 (JQ345720) (a), ECPB09 (JQ345721) (b), os táxons relacionados e os grupos externos Achromobacter ruhlandii, A.
denitrificans e Starkeya novella. A árvore de consenso bootstrap inferida a
partir de 1000 repetições mostra a história evolutiva dos táxons analisados. Escala de 0,002: distância evolutiva ... 32 Figura 2 Taxa de degradação de fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de
rúmen caprino. Isolado ECPB08 (quadrado cinza claro), isolado ECPB09 (losango preto), e P. fluorescens (triângulo cinza escuro, controle positivo). 33
INTRODUÇÃO
As plantas e os animais são habitantes de nosso planeta em relação de mútuo benefício. Em casos específicos, esta relação ocasiona o aparecimento de intoxicações por plantas em animais de produção, relatados no Brasil desde a introdução dos primeiros bovinos. Isto ocorre porque ao sofrer predação pelos animais as plantas desenvolveram mecanismos físicos e químicos de defesa contra a herbivoria. Entre os mecanismos químicos, sintetizados a partir do seu metabolismo secundário, substâncias químicas podem promover quadros de intoxicação em animais que ingerirem estas plantas (BARBOSA et al., 2007). Entre estas substâncias, uma destaca-se por causar quadros de intoxicações que levam o animal ao óbito, é o monofluoroacetato de sódio (MFA). Composto altamente letal, responsável por causar anualmente milhares de mortes de ruminantes no Brasil, ocasionando perdas econômicas significativas. No Brasil, o grupo de plantas tóxicas mais importante é o das plantas que causam morte súbita associada ao exercício, em que o MFA está envolvido (TOKARNIA et al., 2000). Tentativas de controlar esta intoxicação pelos métodos tradicionais, incluindo a utilização de herbicidas, o uso de cercas para isolar as áreas onde as plantas ocorrem, ou eliminação das mesmas por métodos mecânicos não têm apresentado resultado satisfatório. Outra forma de controle desta intoxicação seria através da indução de resistência dos animais a essas plantas. Isto pode ser possível utilizando-se microrganismos que codificam a enzima fluoroacetato dehalogenase, capaz de metabolizar o MFA. Esta tentativa foi realizada na Austrália, através da inoculação no rúmen, de cepas da bactéria Butyrivibrio fibrisolvens modificadas geneticamente com a introdução de um gene, proveniente de uma espécie de
Moraxella, que codifica uma dehalogenase, capaz de degradar este composto, reduzindo os
sinais clínicos da intoxicação por este composto (GREEG et al. 1998).
Esta tese teve o objetivo de isolar e identificar bactérias de solo e de rúmen que degradam fluoroacetato de sódio, bem como estudar a enzima envolvida neste processo. A mesma está dividida em três artigos, formatados de acordo com o que estabelece a NORMA Nº 01/2011 de 03 de junho de 2011 do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG, Campus de Patos/PB (Anexo 1). O primeiro capítulo é um artigo de pesquisa, publicado na The Scientific World Journal, que aborda o isolamento de bactérias de solo e plantas capazes de degradar MFA. O segundo capítulo é uma pesquisa publicada na mesma revista, e descreve o isolamento de duas bactérias de rúmen caprino, capazes de
degradar MFA. O terceiro capítulo refere-se a uma análise computacional de sequências enzimáticas disponíveis no banco de dados do NCBI, para caracterização catalítica como fluoroacetato dehalogenase, ao apresentarem conservados tríade catalítica e sítio ativo.
REFERÊNCIAS
Barbosa, R. R.; Ribeiro Filho, M. R.; Silva, I. P. & Soto-Blanco, B. Plantas tóxicas de interesse pecuário: importância e formas de estudo. Acta Veterinaria Brasílica, v.1, n.1, p.1-7, 2007.
Gregg K., hamdorf b., Henderson K., Kopency J., Wong C. Genetically modified ruminal bacteria protect sheep from fluoroacetato poisoning. Applied and Environmental Microbiology. v. 64, n. 9, p. 3496-3498, 1998.
Tokarnia C.H., Döbereiner J. & Peixoto P.V. 2000. Plantas Tóxicas do Brasil. Helianthus, Rio de Janeiro. 310p.
CAPÍTULO I
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
(Defluorination of sodium fluoroacetate by bacteria from soil and plants in Brazil)
Publicado na ―The Scientific World Journal‖ (anexo 2), de acordo com o que estabelece a Norma nº 01/2011 de 03 de junho de 2011, do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG, Campus de Patos/PB.
Defluoração de fluoroacetato de sódio por bactérias de solo e plantas no Brasil
Expedito K. A. Camboim1, Michelle Z. Tadra-Sfeir2, Emanuel M. de Souza2, Fabio de O. Pedrosa2, Paulo P. Andrade3, Chris S. McSweeney4, Franklin Riet-Correa1 e Marcia A.
Melo1
1
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande, Patos, Paraíba, Brasil.
2
Laboratório de Fixação Biológica de Nitrogênio, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná, Brasil.
3
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética, Recife, Pernambuco, Brasil.
4
CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, St Lucia, Qld, Austrália
Autor para correspondência
Marcia A. Melo, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande. Av. Universitária, s/n, Bairro Sta. Cecília, Patos, Paraíba, Brasil. CP: 64, CEP: 58708-110. e-mail: [email protected]
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar bactérias capazes de degradar fluoroacetato de sódio (FS) em amostras de solo e plantas, coletadas em áreas onde são encontradas plantas que contêm fluoroacetato tais como Mascagnia rigida e Palicourea aenofusca. As amostras foram cultivadas em meio mineral acrescido de 20 mmol L−1 de fluoroacetato de sódio. Através do sequenciamento do gene 16S rRNA os sete isolados foram identificados como Paenibacillus sp. (ECPB01), Burkholderia sp. (ECPB02), Cupriavidus sp. (ECPB03), Staphylococcus sp. (ECPB04), Ancylobacter sp. (ECPB05), Ralstonia sp. (ECPB06), e Stenotrophomonas sp. (ECPB07). Todos os sete isolados degradaram o FS contido no meio, alcançando uma taxa de degradação de 20 mmol L−1 de íon flúor. Dos
isolados, seis são descritos pela primeira vez como capazes de degradar FS. No futuro, alguns destes microorganismos podem ser utilizados para estabelecer no rúmen uma população bacteriana capaz de degradar o fluoroacetato de sódio e proteger ruminantes de intoxicações por este composto.
INTRODUÇÃO
No Brasil, treze espécies de plantas que causam morte súbita associada a esforço físico são responsáveis por cerca de 500.000 mortes de bovinos por ano: Palicourea
marcgravii, P. aeneofusca, P. juruana, P. grandiflora, Pseudocalymma elegans, Arrabidaea bilabiata, A. japurensis, Mascagnia rigida, M. elegans, M. pubiflora, M. aff. rigida, M. exotropia, e M. sepium [1, 2]. O Fluoroacetato de sódio (FS) foi identificado
como o princípio ativo de P. maracgravii [3] e A. bilabiata [4] e provavelmente está presente em outras plantas destes gêneros. Ele atua interrompendo o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), sendo primeiro convertido a fluorcitrato que inibe a enzima aconitase e succinato desidrogenase, resultando em acúmulo de citrato nos tecidos e plasma e, finalmente, causando privação de energia e morte animal [5].
O uso de FS é proibido no Brasil, ocorrendo exclusivamente como produto natural em plantas. Na Austrália, o composto é usado em iscas impregnadas para o controle de coelhos, raposas, cachorro do mato e outras populações de mamíferos; contudo, quando introduzido no ambiente pode selecionar microorganismos capazes de degradar FS [6].
A degradação microbiológica do fluoroacetato de sódio é catalisada pela haloacetato halidohidrolase, a qual é capaz de quebrar a forte ligação do carbono-flúor [7]. Vinte e quatro microorganismos que degradam FS foram isolados de solo na Austrália Central, pertencentes a sete gêneros bacterianos (Acinetobacter, Arthrobacter,
Aureobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Weeksella, e Streptomyces) e quatro gêneros de
fungos (Aspergillus, Fusarium, Cryptococcus e Penicillium) [8].
A possibilidade para prevenir intoxicações por fluoroacetato em ruminantes através da inoculação ruminal de bactérias geneticamente modificadas, contendo um gene que codifica uma fluoroacetato dehalogenase vem sendo investigada [9, 10]. Uma pesquisa aprofundada em amostras retiradas do ambiente, tais como solo, folhas e conteúdo do trato digestivo de herbívoros que estão em contato com o FS, seria importante para verificar a
diversidade e ocorrência de microorganismos capazes de degradar esta toxina. No futuro, genes que codificam enzimas provenientes destes microorganismos podem ser utilizados em engenharia genética para modificar bactérias que colonizam o rúmen para que se tornem capazes de degradar FS de plantas tóxicas, protegendo os animais da intoxicação por este composto.
Este estudo objetivou isolar e identificar bactérias capazes de degradar o fluoroacetato de sódio proveniente de amostras de solo e plantas coletadas no Estado da Paraíba, Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras
Amostras de solo e plantas foram coletadas no Estado da Paraíba, Brasil, em áreas onde Mascagnia rigida e Palicourea aenofusca estavam presentes. As amostras de solo foram coletadas na base das plantas, 1 a 8 cm de profundidade. Folhas e flores também foram coletadas. As amostras foram colocadas individualmente em tubos tipo Falcon de 50 mL e enviadas ao laboratório sob refrigeração para cultivo imediato das bactérias associadas.
Isolamento bacteriano
O isolamento bacteriano foi realizado em tubos tipo Falcon de 50 mL em meio
mineral (Brunner), acrescido com vitaminas
(http://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ Medium457.pdf) e 20 milimoles (mmol) L−1 de fluoroacetato de sódio (Sigma-Fluka) como única fonte de carbono. Este meio será aqui designado de meio Brunner. As amostras foram incubadas a 28°C em um agitador orbital. Após 48 horas, um (1) mL do cultivo primário foi transferido para tubos de ensaio, contendo nove (9) mL de meio Brunner e incubados sob as mesmas condições descritas acima.
A defluoração do FS foi mensurada com eletrodo seletivo para F− (Thermo
Electron Corporation) em placas de 24 poços, contendo 500 μL de cultura e 500 μL de Total Ionic Strength Adjustment Buffer-TISAB (diaminociclohaxano, cloreto de sódio e ácido acético glacial, pH 5.5). A liberação de íon flúor proveniente da degradação
microbiana do fluoroacetato de sódio foi expressa em milimoles. A taxa de defluoração de 20 mmol L−1 de FS corresponde a liberação de 20 mmol L−1 F−.
As amostras que apresentaram defluoração do FS foram cultivadas em diluições seriadas de 10−1 a 10−9. Para obter colônias puras, a maior diluição que apresentou defluoração do FS foi plaqueada em Ágar Brunner (meio Brunner acrescido com 1% de Ágar) e incubada a 28°C por 72 horas. Subsequentemente, cada colônia foi usada para inocular três tubos de ensaio contendo nove (9) mL de meio Brunner, que foram monitorados quanto à defluoração do FS. Pseudomonas fluorescens (DSM 8341) foi utilizada como controle positivo para atividade da fluoroacetato dehalogenase. Nove mL de meio Brunner foram incubados sem inóculo bacteriano, sob as mesmas condições, para avaliar a estabilidade da degradação do FS.
A amostra padrão (Pseudomonas fluorescens DSM 8341) e as bactérias isoladas de solo e plantas foram cultivadas em meio Brunner em concentrações crescentes de FS (20 mmol L−1, 40 mmol L−1, 60 mmol L−1 e 80 mmol L−1 a 200 mmol L−1) para avaliar a maior taxa de defluoração. Adicionalmente, para avaliar a defluoração na presença de outras fontes de carbono, a amostra padrão e as bactérias isoladas de solo e plantas foram também cultivadas em meio Brunner enriquecido com extrato de levedura e glicose, sob as seguintes concentrações: (1) somente meio Brunner; (2) meio suplementado com extrato de levedura 0.01% e glicose 2%; (3) meio com extrato de levedura 0.01%; (4) meio com glicose 2%.
Identificação da sequência do gene 16S rRNA
As bactérias que apresentaram atividade de defluoração foram identificadas por amplificação do gene 16S rRNA pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) e posterior sequenciamento. A extração de DNA foi realizada com Brazol® (LGC Biotecnologia) de acordo com as especificações do fabricante. A amplificação do gene 16S rRNA foi efetuada em tampão contendo 0.5 µM dos primers 27F e 1492R [11], 2U de Taq DNA polimerase, 0.2 mM de dNTP, 100 ng de DNA e água ultra pura para volume final de 20 µL. No controle negativo, o volume de DNA foi substituído por água ultra-pura. Os produtos de amplificação foram aplicados em gel de agarose 1% e submetidos à eletroforese. O DNA foi corado com brometo de etídio e as bandas visualizadas em capturador de imagem (UVP- BioImaging Systems).
A reação de sequenciamento foi realizada utilizando-se kit BigDye (Applied Biosystems), de acordo com as recomendações do fabricante, e os produtos sequenciados no sequenciador da Genetic Analyzer 3500 XL (Applied Biosystems).
Análise das sequências e filogenia
As sequências do gene 16S rRNA foram montadas com o programa CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). As sequências de DNA foram analisadas através do Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) disponível no website do National Center for Biotechnology Information (NCBI - www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST). A identificação das espécies foi baseada no escore máximo, na identidade e no valor de cobertura. O banco de dados do Greengenes e workbench (http://greengenes.lbl.gov) foi utilizado para corroborar com a identificação das espécies. A árvore filogenética foi gerada com o
programa MEGA 5 usando os parâmetros padrões
(http://www.megasoftware.net/mega.php) [12, 13].
RESULTADOS
Após a análise das sequências dos genes 16S rRNA, sete isolados foram identificados como Paenibacillus sp. (ECPB01), Burkholderia sp. (ECPB02), Cupriavidus sp. (ECPB03), Staphylococcus sp. (ECPB04), Ancylobacter sp. (ECPB05), Ralstonia sp. (ECPB06) e Stenotrophomonas sp. (ECPB07) (Tabela 1). Cupriavidus sp. e Ralstonia sp. foram isolados em amostras de solo e plantas, enquanto Paenibacillus sp., Burkholderia sp. e Ancylobacter sp. foram encontrados em amostras de solo e, Staphylococcus sp. e
TABELA 1. Resultados do BLAST para as sequências do gene 16S rRNA obtidas de bactérias isoladas de amostras de solo e plantas.
*
Gêneros foram identificados baseados sobre o escore máximo, identidade e cobertura.
Objetivando um suporte adicional à atribuição de gênero que foi baseada no escore máximo, na identidade e na cobertura do BLAST, as sequências foram previamente aparadas para ter o mesmo tamanho e foi construída uma árvore filogenética, identificando-se que cinco isolados eram filogeneticamente relacionados (Figura 1):
Ancylobacter sp., três Burkholderiaceae (Cupriavidus sp., Ralstonia sp. e Burkholderia sp.)
e Stenotrophomonas sp. Duas outras espécies, Paenibacillus sp. e Staphylococcus sp. formam um grupo heterogêneo.
Código do isolado Espécie mais similar Origem do isolado Tamanho sequência 16S rRNA Cobertura (%) Escore Máximo Valor de cobertura Identidade (%)
ECPB01 Paenibacillus sp. Solo 1425 99 2619 0.0 99
ECPB02 Burkholderia sp. Solo 1398 99 2553 0.0 99
ECPB03 Cupriavidus sp. Solo e
Planta 1398 99 2540 0.0 99
ECPB04 Staphylococcus
sp. Planta 1402 100 2569 0.0 99
ECPB05 Ancylobacter sp. Solo 1368 99 2435 0.0 99
ECPB06 Ralstonia sp. Solo e
Planta 1407 99 2551 0.0 99
ECPB07 Stenotrophomonas
FIGURA 1. Árvore filogenética baseada em sequências 16S rRNA pelo método de máxima parcimônia. ECPB01 a ECPB07 representam os códigos dos isolados e
Methanobacterium sp. MO-MB1 (gi|311141366|dbj|AB598270.1|) o grupo externo. A
história evolucionária foi inferida utilizando o método de Máxima parcimônia. A árvore consenso do bootstrap foi inferida a partir de 1000 repetições e representa a história evolutiva do táxon examinado. Ramos com valores de bootstrap abaixo de 50% foram recolhidos. O percentual de árvores de consenso nos quais os táxons se agruparam no
bootstrap (1000 réplicas) é mostrado perto dos ramos. A árvore foi obtida utilizando o
método Close-Neighbor-Interchange com algoritmo de busca nível 1, no qual as árvores iniciais foram obtidas mediante a adição aleatória de sequências (10 réplicas). A análise utilizou oito (8) sequências de nucleotídeos. As posições com espaços ou dados perdidos foram eliminadas. Foram consideradas um total de 1235 posições no conjunto de dados final. A análise evolutiva foi realizada pelo método MEGA5.
Todos os isolados bacterianos apresentaram atividade de degradação do FS, alcançando um nível de liberação de 20 mmol L−1 de íon flúor, após 32 horas de incubação em meio Brunner, contendo 20 mmol L−1 de FS (Figura 2). O mesmo resultado foi observado com a amostra controle de Pseudomonas fluorescens (DSM 8341). Não houve liberação de íon flúor quando o meio Brunner foi incubado na ausência de bactérias.
FIGURA 2. Taxa de degradação do fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de amostras de solo e plantas no Estado da Paraíba, Brasil. Os símbolos são como se segue. O círculo branco: ECPB01, o triângulo preto: ECPB02, o quadrado preto: ECPB03, o círculo cinza: ECPB04, o quadrado cinza: ECPB05, o triângulo cinza: ECPB06, o círculo preto: ECPB07.
Quando as amostras foram cultivadas em diferentes concentrações de FS, a taxa máxima de defluoração foi de 140 mmol L−1 F− em 140 mmol L−1 de concentração. Nas maiores concentrações de FS (160 mmol L−1, 180 mmol L−1 e 200 mmol L−1), o nível de degradação permaneceu em 140 mmol L−1. Quando os isolados foram cultivados em meio Brunner acrescido de outras fontes de carbono (extrato de levedura 0,01% e glicose 2%), um intenso crescimento bacteriano foi observado após 24 horas, porém a degradação de FS apenas alcançou 20 mmol L−1 F− entre 48 a 64 horas com 20 mmol L−1 de FS na concentração inicial.
DISCUSSÃO
Ancylobacter sp., as Burkholderiaceaes (Cupriavidus sp., Ralstonia sp. e Burkholderia sp.) e Stenotrophomonas sp. pertencem às classes de Alfa, Beta e Gama
proteobacteria, respectivamente. As duas outras espécies, Paenibacillus sp. e
Staphylococcus sp., são das famílias Paenibacillaceae e Staphylococcaceae,
respectivamente, formando um grupo heterogêneo; a atribuição do gênero baseada sobre os valores do BLAST foi coerente com a árvore filogenética, que está de acordo com a filogenia destas bactérias. A existência de uma atividade similar de haloácida dehalogenase entre microorganismos distantemente relacionados, isolados em uma área restrita, sugere uma pressão seletiva comum e efetiva, atuando sobre um amplo conjunto de microorganismos de solo.
As sequências genômicas das espécies Burkholderia sp., Cupriavidus taiwanensis,
Staphylococcus saprophyticus, Paenibacillus sp., Ralstonia sp. e Stenotrophomonas maltophilia estavam disponíveis no banco de dados de genoma do NCBI. O genoma de Ancylobacter dichloromethanicus ainda não foi sequenciado, porém, há uma sequência de
16S rRNA para esta espécie depositada no Genbank. Dos gêneros listados acima, a
Burkholderia sp. era a única para qual já havia citação sobre a fluoroacetato dehalogenase
(Fac-Dex FA1) [14]. Para Cupriavidus sp., Staphylococcus sp., Paenibacillus sp.,
Ralstonia sp., Stenotrophomonas sp. e Ancylobacter sp. as dehalogenases estavam
anotadas como proteína com domínio de hidrolase dehalogenase haloácida [15, 16], hidrolase tipo dehalogenase haloácida [17, 18], 2-haloalcano dehalogenase [17, 18], haloacetato dehalogenase [18, 19], e diclorometane dehalogenase [20]. Contudo, quando os sete isolados foram cultivados na presença de FS o substrato foi degradado. Este achado pode ser explicado pela inespecificidade das dehalogenases, que podem usar como substrato outros compostos estruturalmente similares ao FS, processo conhecido como adaptação cruzada [21]. Liu et al. [22] verificaram que a fluoroacetato dehalogenase degrada outros compostos halogenados como cloroacetato, bromoacetato, iodoacetato e dicloroacetato. Resultados similares foram obtidos por Donnelly e Murphy [23], que encontraram atividade da fluoroacetato dehalogenase sob cloroacetato, bromoacetato e etil fluoroacetato. O FS também pode ser degradado pela L-2 haloácida delalogenase [24]. Outra possibilidade é a transferência lateral de genes que codificam fluoroacetato dehalogenase.
Embora outras bactérias ambientais como Moraxella sp. [25], Acinetobacter,
Arthrobacter, Aureobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Weeksella e Streptomyces [8]
também apresentem atividade de fluoroacetato dehalogenase, não existem relatos anteriores sobre a referida atividade de microorganismos pertencentes a qualquer das seis espécies descritas aqui: Cupriavidus sp., Staphylococcus sp., Paenibacillus sp., Ralstonia sp., Stenotrophomonas sp. e Ancylobacter sp., para os quais os genes de haloácida dehalogenases foram anotados nos genomas das cinco primeiras espécies. Por isso, é sensato assumir que todos os sete isolados têm os genes de fluoroacetato em seus cromossomos e não em plasmídeos, o que é um suporte adicional da existência de uma pressão ambiental seletiva forte, durável e comum sobre estes organismos.
Em todos os isolados ocorreu defluoração após 32 horas de cultivo, com a liberação de 20 mmol L−1 de íon flúor na presença de 20 mmol L−1 de FS. Estes resultados foram similares aos relatados por Davis et al. [26] com Burkholderia sp., que também degradou FS em 32 horas, liberando 20 mmol L−1 F− com 20 mmol L−1 de FS.
Os cultivos dos isolados em diferentes concentrações de FS indicaram que a maior taxa de degradação foi 140 mmol L−1 F− com 140 mmol L−1 de substrato. Para as maiores concentrações de FS a taxa de defluoração não aumentou, o que pode ser devido à exaustão dos outros nutrientes.
Quando as bactérias foram cultivadas em meio Brunner acrescido de extrato de levedura e glicose, a atividade da dehalogenase foi tardia, provavelmente devido à disponibilidade de outras fontes de energia e a difícil quebra da forte ligação carbono-flúor do fluoroacetato [7].
Em conclusão, sete bactérias capazes de degradar o fluoroacetato foram isoladas de solo e plantas, das quais seis não foram previamente descritas como capazes de degradar o FS. A possibilidade de usar algumas destas bactérias para estabelecer no rúmen, uma população bacteriana capaz de degradar o fluoroacetato e proteger ruminantes de intoxicações por este composto, deve ser explorada no futuro.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi apoiado pelo INCT para o controle de plantas tóxicas. Projeto número: 573534/2008-0.
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[26] C. K. Davis, S. E. Denman, L. I. Sly, and C. S. Mcsweeney, ―Development of a colorimetric colony-screening assay for detection of defluorination by micro-organisms,‖
CAPÍTULO II
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen caprino no Brasil
(Isolation of sodium fluoroacetate degrading bacteria from caprine rumen in Brazil)
Publicado na ―The Scientific World Journal‖ (anexo 3), de acordo com o que estabelece a Norma nº 01/2011 de 03 de junho de 2011, do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG, Campus de Patos/PB.
Isolamento de bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de amostras de rúmen caprino no Brasil
Expedito K. A. Camboim1, Arthur P. Almeida1, Michelle Z. Tadra-Sfeir2, Felício Garino Jr1, Paulo P. Andrade3, Chris S. McSweeney4, Marcia A. Melo1 e Franklin Riet-Correa1
1
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande, Patos, Paraíba, Brasil.
2
Laboratório de Fixação Biológica de Nitrogênio, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná.
3
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética, Recife, Pernambuco, Brasil.
4
CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, St Lucia, Qld, Australia.
Autor para Correspondência
Marcia A. Melo, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina Grande. Av. Universitária, s/n, Bairro Sta. Cecília, Patos, Paraíba, Brasil. CP: 64, CEP: 58708-110. E-mail: [email protected]
RESUMO
O objetivo deste artigo foi descrever o isolamento de duas bactérias que degradam fluoroacetato de sódio de rúmen caprino. Os animais foram caprinos adultos, machos, mestiços, com fistula ruminal, alimentados com feno e pastagem nativa. O líquido ruminal foi obtido através das fístulas ruminais e 100 μL foi inoculado imediatamente em meio mineral acrescido de 20 mmol L−1 de fluoroacetato de sódio (FS), incubados a 39° C em agitador orbital. Pseudomonas fluorescens (DSM 8341) foi utilizada como controle positivo para a atividade da fluoroacetato dehalogenase. Dois isolados foram identificados por sequenciamento do gene 16S rRNA como sendo Pigmentiphaga kullae (ECPB08) e
mmol L−1 de íon flúor, após 32 horas de incubação em meio Brunner, contendo 20 mmol L−1 de fluoroacetato de sódio. Não há relatos anteriores da atividade de fluoroacetato dehalogenase em P. kullae e A. dichloromethanicus. Medidas de controle para prevenir intoxicação por plantas, incluindo uso de cercas, herbicidas ou outros métodos de eliminação das plantas tóxicas, foram mal sucedidas para evitar intoxicações por plantas contendo fluoroacetato no Brasil. Desta forma, P. kullae e A. dichloromethanicus podem ser utilizadas para colonizar o rúmen de animais susceptíveis para evitar a intoxicação por plantas que contem fluoroacetato.
INTRODUÇÃO
No Brasil, o grupo de plantas tóxicas mais importante é o que causa ―morte súbita‖ durante esforço físico, responsável por cerca de 500.000 mortes de bovinos anualmente, e composto por 13 espécies de plantas, pertencentes a 3 famílias: Rubiaceae (Palicourea
marcgravii, P. aeneofusca, P. juruana e P. grandiflora); Bignoniaceae (Pseudocalymma elegans, Arrabidaea bilabiata e A. japurensis); e Malpighiaceae (Mascagnia rigida, M. elegans, M. pubiflora, M. aff. rigida, M. exotropica e M. sepium) [1–10]. P. marcgravii é a
planta tóxica mais importante do Brasil e M. rigida é a mais importante no Nordeste do Brasil [11]. O fluoroacetato de sódio foi identificado como princípio ativo em P.
marcgravii, A. bilabiata [12, 13] e M. rigida [14]. Nas outras plantas o princípio ativo
ainda não foi identificado, porém é provável que também seja fluoroacetato de sódio [15], que atua interrompendo o ciclo do ácido tricarboxílico, sendo primeiro convertido a fluorcitrato, que por sua vez inibe a enzima aconitase, resultando em acumulo de citrato nos tecidos e plasma e finalmente causando privação de energia e morte animal [16]. A degradação microbiológica do fluoroacetato de sódio é catalisada pela fluoroacetato dehalogenase, que cliva a forte ligação do carbono-flúor [17], mas também cliva, embora de forma menos eficiente, outras ligações tais como carbono-cloro, carbono-bromo e carbono-iodo [18]. Fluoroacetato de sódio também pode ser defluorado pela L-2 haloácida dehalogenases [19].
Várias bactérias de solo têm a capacidade de degradar o fluoroacetato de sódio. Na Austrália Central, foram isolados sete gêneros bacterianos que degradam o fluoroacetato, incluindo Acinetobacter, Arthrobacter, Aureobacterium, Bacillus, Pseudomonas,
bacterianas isoladas de amostras de solo no Brasil, pertencentes aos gêneros Ancylobacter,
Burkholderia, Cupriavidus, Paenibacillus, Staphylococcus, Stenotrophomonas e Ralstonia
[21]. Contudo, um único isolado bacteriano ruminal, pertencente ao filo Synergistetes, foi relatado como sendo capaz de degradar o fluoroacetato de sódio [22, 23]. Como resultados de nossa tentativa para verificar a ocorrência natural de microorganismos que degradam fluoroacetato existentes no sistema digestivo de animais, relatamos aqui o isolamento de duas novas bactérias que degradam o fluoroacetato de amostras de rúmen caprino.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e processamento das amostras
Os animais foram caprinos adultos, machos, mestiços, com fistula ruminal, alimentados com feno e pastagem nativa e água ad libitum. Os animais foram criados no Hospital Veterinário da Universidade de Campina Grande, Nordeste do Brasil, e não tinham acesso a áreas com plantas tóxicas contendo fluoroacetato.
O líquido ruminal foi obtido através das fístulas ruminais e inoculado imediatamente em tubos de ensaio.
Isolamento bacteriano
O isolamento bacteriano iniciou pela inoculação de 100 μL de fluido ruminal em tubos contendo 9 mL em meio mineral (Brunner) acrescido com vitaminas (http://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ Medium457.pdf) e 20 mmol L−1 de fluoroacetato de sódio (FS) (Sigma-Fluka) como única fonte de carbono. Este meio será aqui designado de meio Brunner. As amostras foram incubadas a 39°C em um agitador orbital. Após 48 horas, 1 mL do cultivo primário foi transferido para tubos de ensaio, contendo 9 mL de meio Brunner e incubados sob as mesmas condições, descritas acima.
A defluoração do FS foi mensurada com eletrodo seletivo para F− (Thermo
Electron Corporation) em placas de 24 poços, contendo 500 μL de cultura e 500 μL de Total Ionic Strength Adjustment Buffer-TISAB (diaminociclohexano, cloreto de sódio e ácido acético glacial, pH 5.5). A liberação de íon flúor proveniente da degradação microbiana do fluoroacetato de sódio foi expressa em milimoles (mmol), a taxa de defluoração de 20 mmol L−1 de FS corresponde a liberação de 20 mmol L−1 F−.
As amostras que apresentaram defluoração do FS foram cultivadas em diluições seriadas de 10−1 a 10−9. Para obter colônias puras a maior diluição que apresentou defluoração do FS foi plaqueada em Agar Brunner (meio Brunner acrescido com 1% de Agar) e incubada a 39°C por 72 horas. Subsequentemente, cada colônia foi usada para inocular três tubos de ensaio contendo 9 (nove) mL de meio Brunner, que foram monitoradas quanto a defluoração do FS. Pseudomonas fluorescens (DSM 8341) foi utilizada como controle positivo para atividade da fluoroacetato dehalogenase, cultivada sob as mesmas condições, exceto a incubação que foi a 28°C [24]. Nove mL de meio Brunner sem inóculo bacteriano foram incubados sob as mesmas condições para avaliar a estabilidade da degradação do FS.
Identificação da sequência do gene 16S rRNA
A identificação do gênero bacteriano que apresentou atividade de defluoração foi realizada através da amplificação do gene 16S rRNA pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e posterior sequenciamento. A extração de DNA foi realizada com Brazol® (LGC Biotecnologia) de acordo com as especificações do fabricante. A amplificação do gene 16S rRNA foi realizada em tampão contendo 0.5 µM de 27F e 1492R dos primers universais [25], 2U de Taq DNA polimerase, 0.2 mM de dNTP e 100 ng de DNA e água ultra pura para volume final de 20 µL. No controle negativo, o volume de DNA foi substituído por água ultra pura. Os produtos de amplificação foram aplicados em gel de agarose 1% e submetidos a eletroforese. O DNA foi corado com brometo de etídio e as bandas visualizadas em capturador de imagem (UVP- BioImaging Systems).
O sequenciamento foi realizado com kit BigDye de acordo com as recomendações do fabricante (Applied Biosystems) e os produtos foram sequenciados no sequenciador da Genetic Analyzer 3500 XL (Applied Biosystems).
Análise das sequências e filogenia
As sequências do gene 16S rRNA foram montadas com auxílio do programa CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). As sequências de DNA foram analisadas através do Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) disponível no website do National Center for Biotechnology Information (NCBI - www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST). A identificação das espécies foi baseada no escore máximo, identidade e valor de cobertura. Os dados do Greengenes e workbench foram usados para corroborar com a identificação das espécies (http://greengenes.lbl.gov). A árvore filogenética foi gerada com o programa MEGA 5
usando o método estatístico neighbor-joining (http://www.megasoftware.net/mega.php) [26].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As sequências dos genes 16S rRNA dos dois isolados que degradam fluoroacetato ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) foram similares aos genes 16S rRNA das espécies Pigmentiphaga e Ancylobacter, respectivamente (Tabela 1). Com base apenas no valor do escore, a sequência de P. kullae foi a mais similar (escore = 2237) a ECPB08, embora outras sequências de 16S rRNA tiveram os mesmos valores nos parâmetros cobertura e identidade. Similarmente, as sequências de Ancylobacter vacuolatus e
Ancylobacter sp. WPCB135 foram mais similares (escore 2388) a ECPB09, mas as
diferenças nos parâmetros de alinhamento para outras sequências de 16S rRNA de
Ancylobacter foram apenas marginais. Consequentemente, não foi possível inferir a partir
dos valores do escore, quais espécies seriam filogeneticamente mais próximas a ECPB09 (JQ345721).
Tabela 1: Resultados do alinhamento local das sequências bacterianas de 16S rRNA dos isolados que degradam fluoroacetato. As sequências foram comparadas aquelas depositadas no National Center for Biotechnology Information, utilizando o algoritmo regular BlastN disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Os organismos com sequências similares aos isolados ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) estão listadas na segunda coluna. Os valores dos parâmetros de escore total, cobertura e identidade máxima estão apresentados nas colunas 3 a 5. O código de acesso ao GenBank está apresentado em parênteses.
A análise comparativa das sequências usando o alinhamento global confirmou que os isolados ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) são filogeneticamente relacionados com os gêneros Pigmentiphaga e Ancylobacter, respectivamente (Figura 1). Na verdade, o alinhamento global corrobora com a inferência taxonômica com base nos resultados do alinhamento 16S rRNA para ECPB08 (JQ345720), indicando que o isolado está relacionado com a P. kullae K24 (Figura 1a), e está apoiado pelos resultados anteriores sobre a taxonomia deste gênero [27, 28]. Contudo, o alinhamento global permitiu uma melhor estimativa da posição taxonômica para ECPB09 (JQ345721), sugerindo uma estreita relação com A. polymorphus (Figura 1b). Embora a parte superior Isolado
(Acc.nr) Espécies/linhagens (nº de acesso)
Escore total Cobertura (%) Identidade máx. (%) EC P B 0 8 (JQ345720)
Pigmentiphaga kullae strain K24 (NR_025112.1) 2237 100 98 Pigmentiphaga daeguensis strain K110 (NR_044082.1) 2215 100 98 Pigmentiphaga daeguensis strain NML080357 (JN585327.1) 2197 100 97 Pigmentiphaga litoralis strain JSM 061001 (NR_044530.1) 2152 99 97
EC P B 0 9 (JQ345721) Ancylobacter sp. WPCB135 (FJ006900.1) 2388 99 99
Ancylobacter vacuolatus strain DSM 1277 (NR_042794.1) 2388 99 99 Ancylobacter dichloromethanicus strain DM16 (EU589386.1) 2387 99 99 Ancylobacter polymorphus strain DSM 2457 (NR_042795.1) 2372 99 99 Ancylobacter rudongensis strain AS1.1761 (NR_029047.1) 2370 99 99 Ancylobacter polymorphus T10AII (GQ921957.1) 2358 98 99
Ancylobacter aquaticus (NR_044737.1) 2351 99 98
da árvore na Figura 1b apresente baixos valores de bootstrap, a totalidade do dendrograma é consistente com os resultados apresentados por Firsova et al. [29] para o gênero
Ancylobacter.
Figura 1: Árvore filogenética baseada nas sequências do gene do 16S rRNA por análise de Máxima Parcimônia. ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) são os códigos dos isolados. Em parênteses estão os códigos do GenBank. É apresentada a relação entre ECPB08 (JQ345720) (a), ECPB09 (JQ345721) (b), os táxons relacionados e os grupos externos Achromobacter ruhlandii, A. denitrificans e Starkeya novella. A árvore de consenso bootstrap inferida a partir de 1000 repetições mostra a história evolutiva dos táxons analisados. Escala de 0,002: distância evolutiva.
O gênero Pigmentiphaga foi inicialmente proposto por Blümel et al. [30] com
Pigmentiphaga kullae (K24) como única espécie, que degrada compostos xenobióticos.
Em 2007, Yoon et al. [31] descreveram um novo membro do gênero, Pigmentiphaga
daeguensis ( K110T), isolado de águas residuais coletadas de tinturarias na Coréia. Mais
tarde, Chen et al. [27] e Lee et al. [28] isolaram Pigmentiphaga litoralis ( JSM 061001) e
P. soli de amostras de planície de maré no mar da China e de solo na Coréia do Sul,
Raj e Maloy [32] propuseram a substituição no nome do gênero Microcyclus por
Ancylobacter, com uma única espécie, A. aquaticus [33]. Desde então, cinco novas
espécies foram descritas, a última sendo Ancylobacter dichloromethanicus (DM16), isolada de solo contaminado [29]. Esta espécie usa os compostos diclorometano, metanol, formiato e policarbonato de formaldeído como fontes de carbono e energia. Análises enzimáticas mostraram que a presença de diclorometano dehalogenase dependente de GSH (glutationa).
Ambos ECPB08 (JQ345720) e ECPB09 (JQ345721) cresceram em meio de cultura contendo FS como única fonte de carbono. Estas bactérias apresentaram atividade de degradação do FS, liberando 20 mmol L−1 de íon flúor após 32 horas de incubação em meio Brunner com 20 mmol L−1 de FS (Figura 2). Estes resultados são similares aos relatados por Davis et al. [34] para Burkholderia sp. A amostra controle Pseudomonas
fluorescens (DSM 8341) alcançou o mesmo nível de defluoração e não houve liberação de
íon flúor quando o meio Brunner foi incubado sem bactéria, devido à estabilidade da forte ligação carbono-flúor do fluoroacetato [17]. Não há relatos anteriores sobre a atividade de fluoroacetato dehalogenase para as espécies de Pigmentiphaga ou Ancylobacter.
Figura 2: Taxa de degradação de fluoroacetato de sódio por bactérias isoladas de rúmen caprino. Isolado ECPB08 (quadrado cinza claro), isolado ECPB09 (losango preto), e P.
fluorescens (triângulo cinza escuro, controle positivo).
0 5 10 15 20 0 8 16 24 32 Conce n tr aç ão d e fl ú or ( m M )
A capacidade de defluoração de ambos isolados pode ser devida à expressão de um gene que codifica uma fluoroacetato dehalogenase ou outra dehalogenase inespecífica. Embora não tenha sido descrito nenhum gene de dehalogenase para Pigmentiphaga, está depositada no GenBank uma sequência de diclorometano dehalogenase para A.
dichloromethanicus [29]. Liu et al. [35] confirmaram que a fluoroacetato dehalogenase
degrada outros compostos halogenados, tais como cloroacetato, bromoacetato, iodoacetato e dicloroacetato, por um mecanismo de adaptação cruzada [36]. Resultados semelhantes foram obtidos por Donnelly e Murphy [24] que observaram capacidade da fluoroacetato dehalogenase para degradar cloroacetato, bromoacetato e etil fluoroacetato. Alternativamente, o fluoroacetato de sódio foi defluorado pela L-2 haloácida dehalogenase [18].
Bactérias que degradam fluoroacetato de sódio, principalmente espécies de Bacillus e Flavobacterium, foram isoladas em amostras de solo na Austrália, mesmo na ausência de fluoroacetato no ambiente [37]. Neste estudo, duas espécies Pigmentiphaga e Ancylobacter foram isoladas do rúmen caprino, apesar dos animais não serem alimentados com plantas que produzam esse composto. Este achado sugere que o gene que codifica a fluoroacetato dehalogenase é ubíquo e que sua expressão pode representar vantagem seletiva para microorganismos, pela possibilidade da enzima degradar outros compostos, como mencionado antes.
Por outro lado, tem sido relatado que animais que pastam em áreas onde Mascagnia
rigida está presente são mais resistentes à intoxicação do que aqueles que não têm contato
com a planta [6]. Resultados recentes de nosso grupo de pesquisa demonstram que a resistência a intoxicação por M. rigida pode ser induzida através de administrações sucessivas de doses não tóxicas da planta ou por transfaunação da fauna ruminal de animais resistentes para susceptíveis (dados não publicados). Estes resultados sugerem que tanto as alterações na microflora ruminal ou níveis sustentados de expressão de gene que codifique uma fluoroacetato dehalogenase da microbiota endógena do rúmen são responsáveis por esta tolerância.
Medidas de controle para prevenir intoxicações por plantas, incluindo uso de cercas, herbicidas ou outros métodos de eliminação das plantas, foram mal sucedidas para evitar intoxicações por plantas que contem fluoroacetato no Brasil [38]. Uma forma alternativa pode ser através da detoxificação microbiana de plantas pela inoculação no rúmen de bactérias que degradam fluoroacetato. Esta estratégia foi utilizada por Gregg et al. [39] que inoculou no rúmen uma estirpe geneticamente modificada de Butyrivibrio
fibrisolvens com um gene que codifica uma fluoroacetato dehalogenase proveniente de
uma espécie de Moraxella, que foi eficiente em prevenir a intoxicação por fluoroacetato em ovino. Numa abordagem alternativa, os dois isolados, Pigmentiphaga sp. e
Ancylobacter sp. são candidatos para serem utilizados na colonização do rúmen para evitar
intoxicação por plantas que contem fluoroacetato.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi apoiado pelo INCT para o controle de plantas tóxicas. Projeto número: 573534/2008-0.
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