UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
ANNA BEATRIZ SANTANA LUZ
INDUÇÃO DE PROCESSO INFLAMATÓRIO COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO E CARGA GLICÊMICA EM ADIPÓCITOS E EPITÉLIO INTESTINAL
DE RATOS WISTAR
NATAL/RN 2018
ANNA BEATRIZ SANTANA LUZ
INDUÇÃO DE PROCESSO INFLAMATÓRIO COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO E CARGA GLICÊMICA EM ADIPÓCITOS E EPITÉLIO INTESTINAL
DE RATOS WISTAR
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Orientadora: Profª. Dr.a Ana Heloneida de Araújo Morais
Co-Orientador: Dr. Raul Hernandes Bortolin
NATAL/RN 2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Luz, Anna Beatriz Santana.
Indução de processo inflamatório com dieta de alto índice glicêmico e carga glicêmica em adipócitos e epitélio intestinal de ratos Wistar / Anna Beatriz Santana Luz. - 2018.
63f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Nutrição. Natal, RN, 2018.
Orientadora: Ana Heloneida de Araújo Morais. Coorientador: Raul Hernandes Bortolin.
1. Adiposidade - Dissertação. 2. Alimentação animal -
Dissertação. 3. Sacarose na dieta - Dissertação. I. Morais, Ana Heloneida de Araújo. II. Bortolin, Raul Hernandes. III. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 616-008.847.9
ANNA BEATRIZ SANTANA LUZ
INDUÇÃO DE PROCESSO INFLAMATÓRIO COM DIETA DE ALTO ÍNDICE GLICÊMICO E CARGA GLICÊMICA EM ADIPÓCITOS E EPITÉLIO INTESTINAL
DE RATOS WISTAR
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Nutrição da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada em _____ de _____________ de ________.
Prof. Dr.a Lucia de Fátima Campos Pedrosa
Coordenadora do Programa de Pós Graduação em Nutrição Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.a Ana Heloneida de Araújo Morais Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Orientadora
Prof. Dr.a Ana Paula Trussardi Fayh
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Membro Interno ao Programa
Prof. Dr. Alexandre Coelho Serquiz
Centro Universitário do Rio Grande do Norte - UNIRN Membro Externo ao Programa
Dedico à minha família, que sempre esteve me apoiando em todas as escolhas que fiz.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Pai Celestial pelos desafios impostos e pelas injeções de ânimo diárias.
Aos meus familiares pelo estímulo, compreensão e entusiasmo diante de cada conquista obtida.
À minha amiga Larissa Mont’Alverne Jucá Seabra pelos conselhos, encorajamento e por sempre ter acreditado no meu potencial.
À minha orientadora pelo acolhimento, empatia, complacência, cuidado, direcionamentos, confiança e amor durante essa duradoura trajetória.
Ao meu co-orientador pelas conversas, ensinamentos, paciência, atenção e amizade no decorrer dessa caminhada.
Às minhas amigas Daline Fernandes de Souza Araújo e Mariana Silva Bezerra, pelo apoio, conselhos e incentivo a cada dia.
Ao grupo de Pesquisa em Nutrição e Substâncias Bioativas para Saúde (NutriSBioativoS) pela amizade construída, compartilhamento de conhecimentos e enorme auxílio na coleta de dados.
À Amanda Fernandes de Medeiros e Fabiana Maria Coimbra de Carvalho Serquiz pelas inúmeras palavras de apoio, auxílio nos experimentos, companheirismo, desabafos e fraternidade.
Às minhas amigas Ana Gabriella Costa Lemos da Silva, Karen dos Santos Barros e Rebecca Garcia Germoglio pelos momentos de descontração, compartilhamento de aflições e, principalmente, pela solidez de nossa amizade.
Em especial ao professor Elizeu Antunes dos Santos pela oportunidade viabilizada em aprender inúmeras técnicas no Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB).
Aos meus companheiros de análises histológicas, Fernando Vagner Lobo Ladd e Christina da Silva Camillo, pelos momentos de descontração durante as análises dos dados, além da paciência, disponibilidade e atenção dispensadas. À Maria do Socorro Medeiros Amarante pelo auxílio nas técnicas histológicas, boas conversas e por ter sido tão acessível.
Ao professor Valdir de Andrade Braga pelo acolhimento no Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba, onde pude adquirir experiências bastante enriquecedoras. E a Matheus Morais de Oliveira Monteiro e Luciano Leite Paulo, que me auxiliaram demasiadamente no aprendizado e coleta de dados.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CnPq) e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte (FAPERN), pelo provimento de auxílio financeiro a fim de tornar exequível esse estudo.
À professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa, coordenadora do Programa de Pós Graduação em Nutrição, e demais docentes, pela oportunidade concedida, e por aguçar a busca por conhecimentos, os quais foram fundamentais para o aprimoramento dessa pesquisa.
“Assim como os pássaros, precisamos aprender a superar os desafios que nos são apresentados, para alçar voos mais altos.”
RESUMO
Dietas experimentais semelhantes ao padrão alimentar da sociedade moderna têm sido utilizadas em pesquisas para induzir alterações metabólicas e corporais em animais. Este estudo investigou o efeito inflamatório de uma dieta sólida de alto índice glicêmico e carga glicêmica (HGLI) sobre a organização histológica de adipócitos, epitélio intestinal e gordura em tecidos hepático e pancreático de ratos Wistar. Dois grupos de animais adultos (n=5, cada) receberam durante 17 semanas: (1) Dieta HGLI ou (2) Dieta padrão (Labina®). Foi realizada análise microscópica, com leitura diagnóstica das lâminas e ênfase na organização histológica do tecido adiposo visceral e do jejuno, além da investigação de presença de adipócitos no fígado e pâncreas. Adicionalmente, foi realizada investigação da densidade do volume, volume total e área seccional média de adipócitos presentes no tecido adiposo visceral. E o cálculo do índice de adiposidade foi obtido considerando como gordura visceral total a soma dos compartimentos de tecido adiposo perirenal, retroperitoneal e epididimal. Para a expressão gênica, o RT-qPCR foi realizado nos seguintes genes: TNF-α (LOC103694, Rn01525859_g1) e GAPDH (Rn01775763_g1). A imunohistoquímica foi executada utilizando-se o anticorpo primário policlonal de coelho: anti-TNF-α (diluição 1:100). A intensidade de TNF-α foi medida de forma semi-quantitativa e automática. Às imagens foram atribuídas pontuações de acordo com uma nota, em que consistia na seguinte variação: negativa (0), fracamente positiva (+1), positiva (+2) e altamente positiva (+3). O soro foi utilizado para dosagem de TNF-α. A dieta HGLI provocou hipertrofia de adipócitos com densidade do volume de adipócitos igual a 97%, área seccional média equivalente a 1387 µm² e volume total de 6,97 cm³, representando um aumento de 8%, 25% e 58%, respectivamente. Além disso, a dieta HGLI aumentou a deposição de gordura em fígado e pâncreas, provocou desorganização das vilosidades intestinais e aumentou a expressão gênica de TNF-α (p=0,014) com imunomarcação positiva (+2) no tecido adiposo visceral e dosagem de TNF-α elevada quando comparada à dieta padrão. A dieta HGLI induziu inflamação em adipócitos e epitélio intestinal de ratos Wistar, disfunções comumente provocadas por dietas sólidas com alto teor de gorduras ou bebidas ricas em frutose.
ABSTRACT
Experimental diets similar to the dietary pattern of modern society have been used in research to induce metabolic and body changes in animals. This study investigated the inflammatory effect of a pellet-diet with high glycemic index and load (HGLI) on the histological organization of adipocytes, intestinal epithelium and fat in liver and pancreas in Wistar rats. Two groups of adult animals (n = 5, every) received for 17 weeks: (1) HGLI Diet or (2) Standard Diet (Labina®). Microscopic analysis was performed with a diagnostic reading of the slides and an emphasis on the histological organization of visceral adipose tissue and the jejunum, as well as the investigation of the presence of adipocytes in the liver and pancreas. In addition, the investigation of volume density, total volume and cross-sectional area of adipocytes present in the visceral adipose tissue was performed. And the calculation of the adiposity index was obtained considering as total visceral fat the sum of the perirenal, retroperitoneal and epididymal adipose tissue compartments. For gene expression, RT-qPCR was performed on the following genes: TNF-α (LOC103694, Rn01525859_g1) and GAPDH (Rn01775763_g1). Immunohistochemistry was performed using the rabbit polyclonal primary antibody: anti-TNF-α (1: 100). The intensity of TNF-α was measured semi-quantitatively and automatically. The images were scored according to a note, which consisted of the following variation: negative (0), low positive (+1), positive (+2) and high positive (+3). Serum was used for TNF-α. The HGLI diet induced hypertrophy of adipocytes with adipocyte volume density equal to 97.0%, cross-sectional area equivalent to 1387 µm² and a total volume of 6.97 cm³ an elevation of 8%, 25%, and 58%, respectively. Furthermore, the HGLI diet increased liver and pancreatic fat deposition, caused intestinal villi disorganization and increased TNF-α gene expression (p = 0.014) with a positive immunostaining (+2) in visceral adipose tissue and high plasma TNF-α in comparison to standard diet. The HGLI diet induced inflammation in adipocytes and intestinal epithelium of Wistar rats, dysfunctions are commonly caused by pellet-diets with high fat or fructose-rich beverages.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ... 14 3 OBJETIVOS ... 15 3.1 OBJETIVO GERAL ... 15 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 15 4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...16 4.1 OBESIDADE...16 4.2 GORDURA CORPORAL...18
4.2.1 Atividade inflamatória do tecido adiposo...21
4.3 DIETAS EXPERIMENTAIS...22
5 METODOLOGIA...28
5.1 ANIMAIS E DESENHO EXPERIMENTAL...28
5.2 DIETAS...28
5.3 COLETA DE SANGUE, TECIDO ADIPOSO VISCERAL E DEMAIS ÓRGÃOS...29
5.4 ANÁLISE MICROSCÓPICA DO INTESTINO DELGADO, TECIDO ADIPOSO VISCERAL E DEMAIS ÓRGÃOS... 29
5.5 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA DO TECIDO ADIPOSO VISCERAL...30
5.5.1 Densidade do volume (Vv) dos adipócitos (VvADIP)...30
5.5.2 Volume Total (VTOT) dos adipócitos (VTOTADIP)...30
5.5.3 Área seccional média de adipócitos...31
5.7 EXPRESSÃO DE mRNA, IMUNOHISTOQUÍMICA E CONCENTRAÇÕES
PLASMÁTICAS DE TNF-α EM MODELO EXPERIMENTAL...32
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA...33
6 ARTIGO PRODUZIDO...34
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS...51
1 INTRODUÇÃO
A obesidade é caracterizada pelo acúmulo de tecido adiposo, independente de idade, sexo e altura e está diretamente relacionada à inflamação e a inúmeras doenças crônicas não transmissíveis1. O padrão alimentar atual da sociedade
moderna é caracterizado pelo excessivo consumo de alimentos processados, açúcares adicionados e grãos refinados. Esse consumo, concomitantemente, associado à reduzida ingestão de frutas, verduras e peixes, resulta em uma dieta nutricionalmente desequilibrada com alto teor de energia, fornecimento insuficiente de fibras, vitaminas e minerais, além de apresentar alto índice glicêmico2.
As boas escolhas alimentares representam meios efetivos e eficientes para o controle glicêmico e de peso corporal, sendo consideradas uma ferramenta valiosa na prevenção primária e secundária de distúrbios como obesidade, diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial sistêmica, dislipidemia, síndrome metabólica, doenças inflamatórias intestinais e cardiovasculares3. Entretanto, devido às preocupações
éticas com aplicação a longo prazo de dietas nutricionalmente desequilibradas em seres humanos, visando analisar seus efeitos, inúmeras pesquisas são desenvolvidas em roedores4. Essas dietas experimentais reproduzem as
características básicas das dietas humanas para induzir alterações metabólicas e corporais5,6.
Tais dietas contêm ingredientes altamente calóricos e saborosos, sendo semelhantes às dietas habitualmente consumidas pela população humana, compostas por altos teores de carboidratos refinados. Nesse contexto, o índice glicêmico dos alimentos tem recebido grande atenção nos últimos anos e tem sido recomendado como critério de escolha dos alimentos fontes de carboidratos7. É
importante também destacar a carga glicêmica, que é o produto entre o índice glicêmico e o total de carboidratos disponíveis presentes em determinada quantidade de alimento8. Vale ressaltar que essas dietas experimentais
apresentam-se com poucas ou nenhuma informação sobre o índice glicêmico ou a carga glicêmica9, são capazes de gerar hiperfagia e consequentemente desenvolver
aumento de peso, estando na maioria das vezes relacionado ao aumento do tecido adiposo em animais de laboratório10, 11.
Não há na literatura relatos de efeitos, especialmente associados às disfunções próprias da obesidade mediadas pela inflamação, envolvendo fator de necrose
tumoral-α (TNF-α), provocados por dietas sólidas de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica em ratos machos, adultos, da linhagem Wistar. O que tem sido relatado com esse caráter está relacionado ao uso de bebidas ricas em frutose e/ou sacarose, isoladamente ou associadas a dietas, mas não especificamente apenas com dietas sólidas que se assemelham ao hábito alimentar da sociedade moderna 12-15. Estudos realizados com dietas sólidas semelhantes ao padrão alimentar da
sociedade moderna foram desenvolvidos em camundongos16-18 e, sem sucesso, em
ratos Wistar19.
Curiosamente, essa linhagem Wistar é susceptível à obesidade induzida por dieta (DIO) e à resistência à insulina com variações individuais20, uma vez que é
proveniente de pais não consanguíneos21. Entretanto, dependendo do tipo de DIO,
essa linhagem apresenta fenótipos de obesidade completamente diferentes, como observado no estudo de Bortolin et al.12, em que destacam a importância da seleção
da dieta para esse fim.
É sabido que durante o estado de obesidade o tecido adiposo pode se expandir de duas formas: os adipócitos tendem a aumentar de tamanho, processo denominado hipertrofia ou há o aumento do número dos adipócitos, o qual é chamado de hiperplasia22. Essa expansão está associada ao aumento da secreção
de citocinas inflamatórias, como o TNF-α23, que está envolvido na regulação da
função da barreira intestinal24,25, a qual encontra-se alterada em indivíduos que
apresentam obesidade26,27.
Sendo assim, o atual estudo investigou o efeito da dieta sólida de alto índice glicêmico e carga glicêmica (HGLI) sobre a organização histológica de adipócitos e epitélio intestinal, acúmulo ectópico de gordura no fígado e pâncreas, aspectos
estereológicos, índice de adiposidade visceral, expressão de mRNA,
imunohistoquímica e dosagem de TNF-α em ratos machos, adultos da linhagem Wistar. Esse foi o primeiro estudo a analisar marcadores inflamatórios com o uso dessa dieta, a qual foi desenvolvida por nosso grupo de pesquisa em Nutrição e Substâncias Bioativas para Saúde (NutriSBioativoS).
2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
Sabe-se que os estilos de vida da população têm sido importantes impulsionadores do aumento global de adiposidade corporal. Nas últimas décadas houve um aumento significativo do consumo de alimentos e bebidas fora de casa28,
que são ricos em gorduras e/ou açúcar29. E as tendências para 2020 mostram que
os estabelecimentos voltados para oferecer momentos de prazer, como cafeterias, chocolaterias e sorveterias ganharão maior participação no mercado30.
Devido ao crescimento alarmante nos últimos anos e à associação com diabetes mellitus e distúrbios cardiovasculares, atualmente o excesso de gordura que, em alguns casos culmina com o diagnóstico de obesidade11, vem se tornando
uma preocupação não só das autoridades governamentais, mas também de empresas e de consumidores30.
Em virtude disso, tem-se desenvolvido estudos com animais para induzir obesidade, porém a maioria das pesquisas que utiliza dietas ricas em carboidratos caracterizam-nas como sendo de alto ou baixo índice glicêmico baseando-se apenas no tipo e/ou percentual dos componentes de amido utilizados31,32,33,34,35. Além de
utilizar camundongos ao invés de ratos Wistar9.
Sendo assim, nosso grupo de pesquisa NutriSBioativoS elaborou uma dieta para roedores, a qual foi caracterizada por apresentar índice glicêmico e carga glicêmica elevados. Em estudo anterior, essa dieta foi capaz de desencadear aumento da glicemia de jejum, triglicerídeos e lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) no plasma de ratos da linhagem Wistar, além de gerar maior expressão gênica de PPARɣ no tecido adiposo desses animais36.
Contudo, sabe-se que é de extrema relevância investigar o efeito dessa dieta sobre a morfologia de adipócitos, sua presença em diversos órgãos e a relação com inflamação, a fim de que possa ser utilizada como mais um instrumento em pesquisas experimentais, objetivando induzir alterações metabólicas em roedores para que a partir dessas seja possível novas pesquisas, visto que ainda há necessidade de analisar novas moléculas e/ou dietas que sejam interessantes no tratamento da obesidade e demais comorbidades associadas.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o efeito inflamatório da dieta sólida de índice glicêmico e carga glicêmica elevados no intestino delgado e adipócitos em ratos Wistar.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-Avaliar a morfologia histológica do tecido adiposo e do jejuno entre os animais; -Realizar estudo estereológico do tecido adiposo;
-Investigar a presença de adipócitos em fígado e pâncreas; -Mensurar a adiposidade visceral dos animais;
-Estudar a expressão gênica e imunohistoquímica de TNF-α no tecido adiposo; -Analisar as concentrações plasmáticas de TNF-α.
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4.1 OBESIDADE
É notório que a obesidade é o distúrbio de gravidade mundial que vem atingindo desde grandes potências econômicas até países em desenvolvimento37.
Em 1995, estimava-se a presença de 200 milhões de indivíduos adultos com obesidade no mundo. Em 2000, esse número elevou-se para mais de 300 milhões de indivíduos38. Dados recentes exibem que mais de 1,9 bilhão de adultos estava
acima do peso em 2016, e desses, mais de 650 milhões estavam com obesidade39.
Estimativas do Sistema de Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (VIGITEL) mostraram que houve aumento do número de adultos com excesso de peso no Brasil. Em 2006, o indicador de brasileiros acima do peso era de 42,6%, já em 2016 esse valor subiu para 53,8%. Os dados mostraram que o percentual de indivíduos com obesidade também aumentou, de 11,8% em 2006 para 18,9% em 201640.
Há projeções sugerindo que até 2025 a obesidade poderá alcançar níveis de 45-50% nos Estados Unidos, 30-40% na Austrália, Inglaterra e Ilhas Maurício, e de 20% no Brasil41. Tais dados são extremamente preocupantes, uma vez que tanto
o sobrepeso como a obesidade podem levar à diminuição da qualidade de vida e da expectativa de vida da população42.
De maneira explícita, nota-se que esse aumento de adultos com excesso de peso e com obesidade é decorrente do atual padrão alimentar da sociedade moderna, o qual sofreu inúmeras alterações devido à inserção da mulher no mercado de trabalho, ao crescimento da indústria alimentícia e à ampliação das redes de “fast foods”, tendo desencadeado aumento da alimentação fora de casa, com consequente acesso a alimentos mais práticos e rápidos5.
Considerando a aquisição de alimentos fora do domicílio, um estudo baseado no Inquérito Nacional de Alimentação constatou alto consumo de refrigerantes, salgadinhos fritos e assados, pizzas e sanduíches no Brasil43.
Pesquisas semelhantes executadas na Europa e África ocidentais também encontraram elevada ingestão de bebidas açucaradas, bolos, salgadinhos, chocolates e outros doces fora do domicílio44,45.
No que concerne à compra de alimentos e bebidas para o consumo doméstico, as principais informações retiradas da Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009 por Canella et al.46 também mostraram que houve um
aumento do consumo de alimentos ultraprocessados pela população brasileira, o qual está diretamente ligado ao desenvolvimento da prevalência de sobrepeso e obesidade no Brasil47.
Esses alimentos são compostos por diversos ingredientes que contêm sal, açúcar, óleos e gorduras, além de substâncias que não são utilizadas em preparações culinárias, como corantes, aromatizantes, adoçantes, emulsificantes e outros aditivos, os quais normalmente são empregados para simular as qualidades sensoriais de alimentos não processados ou minimamente processados e de suas preparações culinárias48.
Sabe-se que o fornecimento de alimentos ultraprocessados se expandiu globalmente, e estes são formulados devido à praticidade, ao caráter atraente, à alta qualidade organoléptica e ao maior tempo de prateleira49. De acordo com Louzada
et al.50, a dieta da população brasileira é composta por alta densidade energética,
açúcares livres, gorduras trans, além de apresentar baixos teores de fibras e potássio.
Com isso, o excesso de gordura corporal, o qual é resultante do elevado consumo desses alimentos, que possuem alta densidade energética e são ricos em gorduras e carboidratos livres, é a principal característica da obesidade, que é causada sobretudo por um desequilíbrio energético entre as calorias consumidas e as calorias gastas51 e pela indução de lipogênese no tecido adiposo e hepático52.
É notório que a obesidade tem sido um meio de condução para o desenvolvimento de outras doenças crônicas não transmissíveis, uma vez que intensifica muitos dos principais fatores de risco cardiovasculares, como aumento da pressão arterial, das concentrações de glicose, de lipídeos e de citocinas inflamatórias53. As principais doenças decorrentes da obesidade são diabetes
mellitus, distúrbios músculo-esqueléticos, câncer, disfunções gastrointestinais, doenças cardíacas e acidente vascular cerebral39.
Devido a essas consequências, inúmeros estudos têm sido realizados em indivíduos com obesidade, normalmente objetivando identificar o perfil de consumo alimentar e sua associação com o desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis ou a fim de analisar a influência de dietas no controle do peso, abrangendo apenas avaliação antropométrica, clínica, dietética e bioquímica54,55,56,57.
Atualmente existem inúmeras formas de diagnóstico da obesidade em humanos, algumas mais dispendiosas, como pesagem hidrostática, ressonância
magnética, tomografia computadorizada e composição corporal por absorciometria com raios-X de dupla energia; outras relativamente mais acessíveis, como ultrassonografia, análise de bioimpedância e soma das dobras cutâneas; e aquelas de baixo custo, como Índice de Massa Corporal (IMC), medida do perímetro abdominal, relação perímetro abdominal/quadril, perímetro cervical, perímetro da coxa e relação cintura-estatura, a qual tem se mostrado ótima para detecção de fatores de risco cardiometabólicos29.
Entretanto, de acordo com Novelli et al58, são escassas as informações
para determinação de obesidade em ratos de laboratório. Os autores determinaram parâmetros antropométricos para identificação de obesidade em ratos machos, adultos, da linhagem Wistar e mostraram que a taxa específica de ganho de massa corporal, o índice de Lee e o índice de massa corporal são parâmetros antropométricos destinados ao diagnóstico de obesidade nesses animais, sendo esse último mais eficaz.
No que se refere ao tratamento da doença, esse deve ser baseado na gravidade, bem como na presença de complicações associadas. O tratamento principal deve ser o dietético, aliado ao aumento do gasto energético, visando reeducação alimentar e ajuste fisiológico; há também o tratamento farmacológico, que é aceito somente quando o indivíduo apresenta IMC igual a 30 kg/m² ou 25 kg/m² na presença de comorbidades, e/ou insucesso na perda de peso com o tratamento dietético; tem-se ainda o tratamento cirúrgico, que está indicado para pacientes graves, que tiveram falha com as outras terapias e para os indivíduos que apresentam complicações decorrentes da obesidade59.
Contudo, para que sejam encontradas formas de tratamento ainda mais eficazes, é necessário ter conhecimento cada vez mais detalhado sobre a fisiopatologia da doença e, para isso, devem ser realizadas pesquisas induzindo a obesidade60.
4.2 GORDURA CORPORAL
O tecido adiposo é um órgão endócrino que está envolvido no controle metabólico de diversos processos biológicos no cérebro, fígado, músculo esquelético, coração, sistema imunológico e pâncreas, tais como regulação do apetite e saciedade, sensibilidade à insulina, hemostasia, inflamação, pressão
arterial, função endotelial, distribuição de gordura, secreção de insulina e glucagon, dentre outros61.
É evidente que o consumo excessivo de energia gera aumento de peso corporal, o que pode acarretar disfunção do tecido adiposo, que funciona armazenando calorias excessivas sob a forma de triglicerídeos, e liberando ácidos graxos durante um estado prolongado de restrição calórica62. Em estado normal o
tecido adiposo subcutâneo tende a expandir sua rede capilar em relação ao tecido visceral. No entanto, o acúmulo de lipídeos gera diminuição dessa capacidade de expansão63.
Tal modificação nesse mecanismo, devido à incapacidade de armazenamento das calorias em excesso em depósitos de gordura subcutânea, tende a ocasionar acúmulo ectópico de gordura visceral em outros órgãos, como fígado, além de gerar alteração significativa de secreção de adipocinas, aumentando o risco de desenvolvimento de alterações metabólicas e cardiovasculares em indivíduos com obesidade64,65.
É explícito que o excesso de macronutrientes gera o acúmulo de tecido adiposo66, o qual é constituído, no organismo adulto, por tecido adiposo branco, que
se encontra em maior proporção, e tecido adiposo marrom, não menos importante, o qual atua na ativação da termogênese67. Essa função termogênica ocorre por meio
das mitocôndrias e devido à proteína de desacoplamento 1, que está presente especificamente nos adipócitos marrons68.
As funções desempenhadas no organismo pelo tecido adiposo branco são inúmeras, a saber: regulação energética, isolamento térmico, proteção de órgãos contra danos mecânicos, armazenamento de energia sob a forma de triglicerídeos, dentre outras69. Tais funções são executadas por meio da secreção de
citocinas e hormônios proteicos, como leptina e adiponectina70.
No entanto, há de se considerar que a obesidade acarreta disfunção do tecido adiposo, o que vai gerar desequilíbrio na secreção dessas adipocinas, ocasionando falha na regulação do apetite e da saciedade, na distribuição de gordura, na função endotelial, no sistema imune, no gasto de energia, na hemostasia, bem como na secreção e sensibilidade à insulina e no controle da pressão arterial61.
As células do sistema imune, como macrófagos, monócitos, células natural killer e linfócitos podem estar presentes excessivamente no tecido adiposo
em situações de obesidade, acarretando consequentemente a inflamação71. Um
estudo realizado constatou que as citocinas secretadas por macrófagos elevam a liberação de ácidos graxos por adipócitos, os quais geram expressão de mais citocinas inflamatórias72.
Sabe-se que o tecido adiposo branco em humanos é dividido em: visceral, que envolve os órgãos internos na cavidade abdominal, e subcutâneo, o qual compreende uma camada de gordura na hipoderme73. O tecido adiposo visceral é
subdividido em omental, mesentérico, retroperitoneal, gonadal e pericardial. O tecido adiposo subcutâneo divide-se por uma fáscia em duas camadas: tecido adiposo subcutâneo superficial e tecido adiposo subcutâneo profundo74.
É interessante destacar que em humanos o tecido adiposo subcutâneo, quando comparado ao visceral, apresenta menor infiltração de macrófagos, com consequente reduzida liberação de citocinas inflamatórias75. Em adição a isso, um
estudo realizado com mulheres por Harmelen et al.76 constatou que há maior
produção de leptina pelo tecido adiposo subcutâneo. Esses dados sugerem que o tecido adiposo em questão apresenta um papel protetor no organismo contra doenças crônicas não transmissíveis69.
De maneira oposta, os depósitos de tecido adiposo visceral em humanos, principalmente o omental, que é mais superficial, localizado próximo ao estômago e baço, e o mesentérico, que é mais profundo, o qual envolve os intestinos, têm sido associados ao desenvolvimento de doenças relacionadas à obesidade, com intensa liberação de citocinas inflamatórias74.
Em roedores, o tecido adiposo também é dividido em branco e marrom. Há depósitos de gordura marrom subescapular, interescapular, cervical, periaórtica e perirenal; os depósitos de tecido adiposo branco são: anterior-subcutâneo, posterior-subcutâneo, retroperitoneal, perigonadal e mesentérico77. Os principais tecidos
adiposos estudados são o peritoneal e o gonadal78. De acordo com Palou et al.78, os
depósitos de tecido adiposo retroperitoneal em ratos são maiores que os depósitos de tecido mesentérico e subcutâneo.
Contudo, durante o estado de obesidade também pode haver o armazenamento de gordura em diversos órgãos, devido à capacidade de expansão limitada do tecido adiposo subcutâneo, acarretando resistência à insulina e outras complicações metabólicas associadas79. O aumento da gordura no fígado, pâncreas,
músculo e miocárdio tem sido associado justamente à resistência à insulina, hipertensão e aumento do risco cardiovascular80-83.
4.2.1 Atividade inflamatória do tecido adiposo
As adipocinas são caracterizadas como mediadores solúveis produzidos principalmente por adipócitos, desenvolvendo sua função biológica de forma autócrina, parácrina ou sistêmica. Esse grupo de mediadores tem apresentado um grande vínculo entre o tecido adiposo e o sistema imunológico84. O tecido adiposo
saudável é minimamente infiltrado por células do sistema imune, que detectam invasores e mantêm a integridade do tecido85.
Entretanto, durante o estado de obesidade, os mediadores celulares de imunidade inata são afetados86. Por exemplo, em decorrência da obesidade, há
superexpressão de proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) por células imunes inatas e adipócitos, acarretando infiltração de macrófagos em tecido adiposo, com inibição da sinalização de insulina e maior diferenciação de adipócitos85.
Sabe-se que as principais adipocinas relacionadas à obesidade e aos distúrbios metabólicos associados são leptina, adiponectina, TNF-α e interleucina 6 (IL-6), uma vez que têm papeis conhecidos no metabolismo de adipócitos e na sensibilidade à insulina87. A inflamação de baixo grau, decorrente da excessiva
ingestão de nutrientes, é denominada de metaflamação e induz a produção dessas adipocinas88.
Os pré-adipócitos apresentam capacidade fagocítica e podem se converter em células semelhantes a macrófagos, os quais secretam substâncias inflamatórias, atuando diretamente na inflamação crônica durante o estado de obesidade89. Destaca-se que diversos genes inflamatórios regulados pelo tecido
adiposo branco têm sua expressão aumentada em indivíduos com obesidade90.
O TNF-α é pouco expresso no tecido adiposo branco, mas em indivíduos com obesidade há aumento de sua expressão91. Essa citocina inibe a expressão de
genes responsáveis pela captação e armazenamento de ácidos graxos e glicose, suprime fatores de transcrição envolvidos na lipogênese e aumenta os níveis de IL-692.
O excesso de peso vai estimular a cascata inflamatória, a qual é desencadeada pela compressão dos vasos sanguíneos no tecido adiposo branco,
devido à hipertrofia de adipócitos, com consequente suprimento inadequado de oxigênio93. Essa hipóxia estimula a quimiotaxia de macrófagos, que irão sinalizar a
expressão de genes inflamatórios94,95.
É importante destacar que o TNF-α, secretado por macrófagos e adipócitos em estado de obesidade, exacerba a inflamação e interfere de modo direto na sinalização de insulina85, tendo em vista que atua inibindo também a
fosforilação da tirosina presente no substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1)96.
Ademais, sua expressão em adipócitos foi correlacionada com aumento do tamanho celular em modelo animal97.
O consumo excessivo de frutose está associado ao aumento da infiltração de macrófagos e de moléculas de adesão intracelular-1 (ICAM-1) em adipócitos, de modo a regular especificamente a inflamação metabólica, uma vez que a infiltração de macrófagos vai resultar em inflamação crônica de baixo grau, com consequente aumento de adiposidade e resistência à insulina98,99.
Em vista disso, diversos estudos têm investigado a presença de TNF-α em animais com DIO, seja por determinação da concentração plasmática, expressão gênica ou imunohistoquímica em adipócitos e/ou em outros órgãos17,18,100,101, a fim
de entender de que maneira o consumo excessivo de macronutrientes modula a produção dessa citocina.
4.3 DIETAS EXPERIMENTAIS
Sabe-se que estudos mais aprofundados acerca dos efeitos de fatores ambientais sobre o excesso de gordura corporal na população humana são importantes102. No entanto, realizar experimentos de indução de alterações
metabólicas, corporais e séricas por dieta em seres humanos é um procedimento que contraria os aspectos de ética em pesquisa103.
Aliado a isso, alguns indivíduos apresentam modificação na composição corporal devido à susceptibilidade genética e não necessariamente por inadequações alimentares104. Dessa forma, torna-se necessário a utilização de
modelos animais experimentais para que seja possível explorar melhor as especificidades do excesso de adiposidade corporal102.
Inúmeras pesquisas com animais têm se mostrado ótimas alternativas para a elucidação de fenômenos fisiológicos e/ou patológicos105. Em virtude da
ratos são considerados importantes ferramentas para o estudo de condições que afetam o homem106.
As dietas que seguem o mesmo padrão das referidas dietas utilizadas pelo homem moderno têm sido frequentemente utilizadas em pesquisas experimentais107-109. Essas também são conhecidas por dietas experimentais, que
podem ser “dietas de cafeteria” ou “dietas ocidentais”. As “dietas de cafeteria” são compostas por diversas fontes alimentares extremamente palatáveis, como leite condensado, salsicha, biscoitos, bolachas e refrigerantes, visando reproduzir as dietas hiperenergéticas ou desequilibradas nutricionalmente110. Ademais,
compreende-se por “dieta ocidental” as formulações comerciais que apresentam alto teor de energia, gordura e açúcares111.
No que se refere à composição nutricional, as dietas experimentais apresentam, majoritariamente, alta densidade calórica e são predominantemente ricas em gorduras112. Contudo, destaca-se a presença marcante de carboidratos
livres nesse tipo de dieta, tendo em vista que os alimentos que a compõem, além de gordurosos, são doces113, como pães, bolos, embutidos, refrigerantes, marshmallow,
bolachas, biscoitos, balas114, além de salgadinhos, manteiga de amendoim, avelã e
cereais adoçados115. Assim, esse tem sido um método bastante utilizado para
investigar distúrbios metabólicos relacionados ao acúmulo do tecido adiposo e consequentemente a obesidade em roedores107,109,116.
Os estudos com induções por dietas em modelos experimentais têm conseguido inúmeras alterações metabólicas e cognitivas, como obesidade, síndrome metabólica, déficit de memória, redução de marcadores oxidativos, alterações dos parâmetros bioquímicos e hormonais, resistência à insulina, desordens hepáticas, renais e pancreáticas, bem como aumento de citocinas inflamatórias, elevação do diâmetro, perímetro e área de adipócitos e disfunção cardíaca109,117-120.
Uma pesquisa realizada por La Serre et al.121, em ratos Sprague Dawley,
constatou que uma dieta rica em gordura e calorias provocou alterações na permeabilidade intestinal, em virtude de dano à barreira epitelial, com consequente inflamação direta no local. Durante a inflamação, as concentrações elevadas de citocinas inflamatórias, comumente observadas em indivíduos com obesidade, podem causar comprometimento da função de barreira intestinal, alterando a estrutura e localização das junções apertadas122.
É de extrema importância desenvolver e avaliar esse tipo de dieta, pois sabe-se que nem todas as dietas experimentais são eficientes em provocar tantas alterações (corporais, séricas, gênicas), o que limita as pesquisas. Adicionalmente, poucas possuem informações da sua composição centesimal ou nutricional que possibilitem inferir de modo seguro quanto aos seus efeitos e consequências.
Daí a importância de apresentar à comunidade científica dietas robustas que sejam capazes de possibilitar o estudo de diferentes aspectos relacionados à composição corporal e ao acúmulo de gordura, principalmente quando essas dietas são eficientes em provocar distúrbios associados a patologias graves.
Ressalta-se que diversos estudos têm sido desenvolvidos de modo a comparar o efeito de dietas estritamente sólidas com aquelas sólidas associadas às bebidas ricas em frutose e/ou sacarose123-125. A escolha para utilização de dietas em
modelo experimental é relevante, uma vez que as bebidas açucaradas não representam de maneira fidedigna o atual padrão alimentar dos seres humanos, e seus efeitos têm sido divergentes daqueles provocados por dietas estritamente sólidas124,126. Um estudo desenvolvido por Glendinninget al.127 mostrou que a
susceptibilidade à obesidade induzida por açúcar vai depender da estirpe, da concentração e do tipo de açúcar ofertado.
Nesse contexto, destaca-se a dieta experimental desenvolvida por nosso grupo de pesquisa NutriSBioativoS, contendo ingredientes ricos em sacarose, que é caracterizada por apresentar índice glicêmico e carga glicêmica elevados36.
É conhecido que os carboidratos oriundos da dieta são relevantes para a preservação da homeostase glicêmica e para a saúde gastrointestinal128. Nesse
sentido, os carboidratos complexos são mais recomendados para compor a dieta dos indivíduos porque possuem baixo índice glicêmico, que é a medida do efeito que substâncias ingeridas têm nas concentrações sanguíneas de glicose pós-prandial129.
O conceito de índice glicêmico foi introduzido por Jenkins et al em 1981, após o reconhecimento de que diferentes alimentos contendo a mesma quantidade de carboidratos exerciam efeitos fisiológicos diferentes. Sendo assim, o índice glicêmico representa uma resposta glicêmica gerada por determinada porção de alimento que possui 50 g de carboidrato disponível em relação a 50 g de um alimento de referência, o qual pode ser pão branco ou uma solução de glicose8.
Todavia, para melhor entendimento, ainda há de se considerar a definição de resposta glicêmica e de carga glicêmica. Augustin et al.8 definiu resposta
glicêmica como uma resposta de glicose no sangue pós-prandial provocada após a ingestão de alimento ou refeição contendo carboidrato. Essa resposta é o principal determinante da secreção de insulina130. Então percebe-se que o índice glicêmico
surgiu como uma maneira de quantificar a resposta glicêmica de diferentes carboidratos da dieta131.
A carga glicêmica, por sua vez, é definida como o produto entre o índice glicêmico e o total de carboidratos disponíveis presentes em determinada quantidade de alimento8. De acordo com Chen132, o consumo elevado de bebidas
açucaradas pode contribuir para uma dieta com alta carga glicêmica, o que vai gerar grande quantidade de açúcares rapidamente absorvíveis, provocando resistência à insulina, inflamação crônica, além de outros comprometimentos celulares.
Apesar das recomendações, o consumo de açúcares livres tem aumentado cada vez mais pela sociedade ocidental. Como já mencionado, as dietas habitualmente consumidas possuem alta densidade calórica, sendo intituladas hiperglicídicas, apresentando altos índices e/ou cargas glicêmicas, uma vez que são ricas em açúcares60, o que vem acarretando sérios prejuízos à saúde, como
alterações cognitivas129 e metabólicas133.
O consumo de dietas ricas em gorduras e carboidratos além de provocar aumento do ganho de peso, quando comparado ao consumo de uma dieta padrão, gera maior acúmulo de gordura e elevação das concentrações plasmáticas de triglicerídeos, colesterol total e lipoproteína de baixa densidade (LDL), do mesmo modo que acarreta aumento dos marcadores de macrófagos no tecido adiposo e de citocinas inflamatórias, como TNF-α e IL-6134.
Essas alterações provenientes da ingestão de alimentos com alta densidade calórica, que normalmente contêm açúcares e gorduras em demasia, tendem a ocasionar a obesidade, que é oriunda de transformações no metabolismo lipídico, as quais resultam em acúmulo maciço de lipídeos em diversos tecidos135.
Uma investigação realizada por Johnson et al.136, abrangendo expressão
gênica e imunohistoquímica, apontou que ratos alimentados com dieta de cafeteria (rica em sódio, lipídeos, colesterol, gordura saturada e gordura trans) apresentaram elevação de danos oxidativos, bem como redução de mediadores anti-inflamatórios em tecido adiposo branco. Em consonância com esse estudo, uma pesquisa conduzida por Sampey et al.6 encontrou alto grau de inflamação no tecido adiposo
branco e fígado de ratos, bem como profundo acúmulo de gordura no tecido adiposo marrom e esteatose hepática, após consumo do mesmo tipo de dieta.
Ainda, dietas ricas em gordura têm gerado perda de integridade da barreira epitelial, com consequente prejuízo à microbiota, ocasionando disbiose, a qual altera ainda mais a homeostase epitelial137. De acordo com Gil-Cardoso et
al.100, a disfunção intestinal na obesidade tem sido associada a alterações na
permeabilidade intestinal devido à ruptura na barreira epitelial.
Yang et al.135 também constataram que ratos alimentados com dieta de
cafeteria (caracterizada por alto teor de lipídeos e sacarose) ganharam peso mais rápido e obtiveram aumento de peso do tecido adiposo branco em 74,2% no final da quarta semana de alimentação, quando comparados aos ratos alimentados com dieta baixa em carboidratos e gordura. No que diz respeito ao perfil lipídico, foi constatado aumento de colesterol total, de lipoproteína de alta densidade (HDL) e de LDL no plasma dos ratos alimentados com dieta de cafeteria, e acúmulo de lipídeos no fígado.
Outro estudo, desenvolvido por Queiroz et al.138, encontrou maior índice
de adiposidade, além de elevado peso do tecido adiposo marrom e expressão aumentada de RNA mensageiro (RNAm) da proteína de desacoplamento mitocondrial 1 (UCP1) de animais alimentados com uma dieta rica em açúcar, em relação aos animais que consumiram uma dieta nutricionalmente equilibrada.
Coate et al.139 avaliaram quatro tipos de dietas, sendo duas com alto
índice glicêmico e duas com baixo índice glicêmico (caracterizado pelo percentual de carboidratos livres), em que eram ricas em lipídeos ou apresentavam baixo teor de lipídeos, e constataram que houve aumento do peso de tecido adiposo e das concentrações séricas de leptina de camundongos alimentados com a dieta de alto índice glicêmico com baixo teor de lipídeos, quando comparada à dieta pobre em lipídeos de baixo índice glicêmico.
Além disso, uma revisão sistemática com meta-análise elaborada por Campbell et al.9 evidenciou que a dieta de alto índice glicêmico (caracterizada por
elevado percentual de amilopectina) foi capaz de aumentar o peso corporal e do tecido adiposo, bem como gerou elevação da glicemia de jejum, das concentrações de insulina de jejum e da área sob a curva de glicose e insulina em resposta ao teste de tolerância à glicose de ratos e camundongos machos, quando comparada a uma
dieta de baixo índice glicêmico (caracterizada por percentual reduzido de amilopectina).
A pesquisa, realizada por nosso grupo NutriSBioativoS, utilizando a mesma dieta deste estudo, uma dieta de índice glicêmico e carga glicêmica elevados (77,6 e 38,8, respectivamente), demonstrou que os ratos Wistar desenvolveram obesidade, hiperglicemia, bem como dislipidemia e aumento da expressão de PPARɣ tanto no tecido adiposo subcutâneo como visceral, quando comparados aos animais de mesma linhagem alimentados com uma dieta nutricionalmente adequada. O presente estudo pretende avaliar o efeito inflamatório dessa dieta, a fim de complementar os resultados já obtidos com a mesma dieta por estudos anteriores do grupo NutriSBioativoS36.
5 METODOLOGIA
5.1 ANIMAIS E DESENHO EXPERIMENTAL
Foram utilizados ratos machos (n=10), adultos, da linhagem Wistar, pesando 320-380 g provenientes do biotério da Universidade Potiguar (UnP), Natal-RN. Todos os experimentos foram desenvolvidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals140 e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA-UnP) sob protocolo nº 012/2015.
A pesquisa foi do tipo aplicada, quantitativa, explicativa e experimental. Esses animais foram igualmente distribuídos em dois grupos (cinco animais por grupo): grupo experimental, que corresponde aos animais submetidos à dieta experimental (HGLI) e o grupo controle, submetido à dieta comercial Labina®, durante um período experimental de 17 semanas, tempo necessário para o diagnóstico de obesidade, de acordo com índice de Lee proposto por Bernardis141 e classificado por Novelli (>
0.300 g / cm³)58. Os ratos ficaram alojados em gaiolas ventiladas individualmente na
condição padrão de luminosidade (12 h/12 h claro/escuro), temperatura (23-25 ºC) e umidade (50 ± 5%), com água e alimento ad libitum.
Após esse período, foi aferido o peso corporal dos animais individualmente para o cálculo do índice de adiposidade. Em seguida, foi coletado o sangue para dosagem do marcador inflamatório. Os animais foram eutanasiados para retirada do intestino delgado (jejuno), tecido adiposo visceral (perirenal, retroperitoneal e epididimal), fígado e pâncreas. O tecido adiposo também foi submetido à pesagem para o cálculo do índice de adiposidade. Posteriormente foram realizadas análises microscópicas, estereológicas, expressão relativa de mRNA, imunohistoquímica e dosagem de TNF-α.
5.2 DIETAS
As dietas utilizadas nos experimentos foram a ração padrão Labina®
(Paulínia, São Paulo, Brasil), ofertada para o grupo controle, e a dieta HGLI, ofertada para o grupo experimental, que apresentou 315,26 kcal, 21% de proteínas, 4% de lipídeos e 48% de carboidratos36. Essa dieta foi caracterizada por alto índice
glicêmico e alta carga glicêmica, com valores de 77,6 e 38,8 respectivamente. A determinação desses parâmetros foi realizada de acordo com Aguiar et al.36,
Para a elaboração de 100 g da dieta HGLI, 45,2 g da ração Labina® foram
triturados utilizando um processador de alimentos, com adição de 9,6 g de açúcar refinado e 45,2 mL de leite condensado, e posterior homogeneização manual. Em seguida, a ração foi moldada em forma de cilindros, os quais foram assados em forno pré-aquecido a 180 ºC, por aproximadamente 40 minutos, segundo metodologia descrita previamente por nosso grupo de pesquisa NutriSBioativoS36.
Ambas as rações foram ofertadas ad libitum. O leite condensado e o açúcar refinado foram adquiridos comercialmente, com o mesmo lote e marca para todo o período experimental.
5.3 COLETA DE SANGUE, TECIDO ADIPOSO VISCERAL E DEMAIS ÓRGÃOS Após 17 semanas de estudo, com a confirmação da obesidade pelo Índice de Lee, os animais de ambos os grupos ficaram em jejum por 8-12 h e, em seguida, foram anestesiados com 250 mg de cloridrato de tiletamina e 250 mg de cloridrato de zolazepam para coleta de sangue total por meio da veia porta hepática.
Os animais foram eutanasiados e o intestino delgado (jejuno), tecido adiposo visceral (perirenal, retroperitoneal e epididimal), fígado e pâncreas foram coletados para posteriores análises.
5.4 ANÁLISE MICROSCÓPICA DO INTESTINO DELGADO, TECIDO ADIPOSO VISCERAL E DEMAIS ÓRGÃOS
A análise foi realizada conforme Martins et al.142, com algumas
modificações. As secções dos tecidos (3-4 µm) foram coradas com hematoxilina e eosina. Para a análise microscópica, realizou-se a leitura diagnóstica das lâminas com ênfase na organização histológica do jejuno e tecido adiposo visceral.
Além disso, foi investigada a presença de adipócitos nos tecidos hepático e pancreático dos grupos estudados, avaliando-se lâmina por lâmina de cada animal, em Microscópio CX21 (Olympus, Shinjuku, Tóquio, Japão). As imagens foram capturadas utilizando uma câmera digital DS-Ri1 (Nikon, Edgewood, Nova York, EUA) acoplada a um microscópio Eclipse Ni (Nikon, Edgewood, Nova York, EUA) com objetiva de 20x.
5.5 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA DO TECIDO ADIPOSO VISCERAL
Foi realizada investigação da densidade do volume e volume total de adipócitos presentes no tecido adiposo visceral, adaptando as equações propostas por Ribeiro et al.143. E a área seccional média foi adquirida segundo Bargut et al.144.
5.5.1 Densidade do volume (Vv) dos adipócitos (VvADIP)
Para a estimativa de Vv, um sistema teste foi sobreposto sobre o espaço referência (Figura 1). Foram contados o número total de pontos sobre a região de interesse (adipócitos) (Pint) e o número total de pontos sobre o espaço referência
(Pref). A seguinte equação foi utilizada:
Vv = ∑Pint÷ ∑Pref
A densidade de volume varia de 0 a 1, mas pode ser expressa como porcentagem143.
Figura 1. Sistema teste sobre espaço referência (tecido adiposo). 5.5.2 Volume Total (VTOT) dos adipócitos (VTOTADIP)
Foi estimado pela multiplicação da densidade do volume (Vv) pelo volume do tecido adiposo (V tecido adiposo), o qual foi obtido por meio da multiplicação entre o
peso do tecido adiposo em gramas e a densidade de tecido adiposo (0,92 g/cm³), sugerida por Farvid et al.145.
5.5.3 Área seccional média de adipócitos
Foi obtida por meio da relação entre a densidade do volume de adipócitos (Vv) e o dobro da densidade numérica por área de adipócitos (QA), a qual foi estimada como o número de adipócitos contabilizados em um frame e a área de teste do frame144 (Figura 2), conforme equações a seguir:
ASM = Vv ÷ 2 x QA
QA= Número de adipócitos (frame) ÷ Área (frame)
Figura 2. Adipócitos em um frame.
5.6 ÍNDICE DE ADIPOSIDADE VISCERAL
Para o índice de adiposidade, o tecido adiposo visceral dos animais de cada grupo foi pesado individualmente em balança de precisão. A soma dos três compartimentos de tecido adiposo (perirenal, retroperitoneal e epididimal) foi considerada como gordura visceral total. O índice de adiposidade visceral foi calculado adaptando a fórmula utilizada por Leopoldo et al.146, substituindo gordura
corporal total por gordura visceral total:
5.7 EXPRESSÃO DE mRNA, IMUNOHISTOQUÍMICA E CONCENTRAÇÕES PLASMÁTICASDE TNF-α EM MODELO EXPERIMENTAL
O tecido adiposo dos animais, previamente armazenado a -80 ºC, foi pulverizado com nitrogênio líquido e o RNA total foi extraído utilizando o kit comercial PureLink™ RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA), seguindo as instruções do fabricante.
A quantificação foi obtida por meio do espectrofotômetro NanoDrop ND-2000 UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, Delaware, EUA) e o RNA total foi estocado a -80ºC. A síntese de cDNA foi realizada com 500 ng de RNA total por meio do High-Capacity cDNA Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA), conforme instruções do fabricante, utilizando um termociclador MyCycler™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA). O cDNA foi obtido num volume final de 20 mL e armazenado a -20ºC até ser utilizado para os ensaios de expressão de RT-qPCR.
O RT-qPCR foi realizado nos seguintes genes utilizando o sistema de amplificação TaqMan® RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA): TNF-α (LOC103694, Rn01525859_g1) e GAPDH (Rn01775763_g1) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA).
Os ensaios de PCR foram realizados utilizando o equipamento ABI Prism 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA). A expressão relativa foi calculada por meio do método 2-ΔΔCt, proposto por Livak et al.147, e os resultados
são apresentados como fold change versus valores médios do grupo controle, normalizados para GAPDH.
Para a imunohistoquímica, os procedimentos foram realizados de acordo com Khan et al.148, com algumas modificações. O material foi desidratado e
emblocado em parafina, com execução de cortes de 3 µm de espessura em micrótomo rotativo de parafina e posterior montagem em lâminas gelatinizadas. Em seguida, estas foram desparafinizadas e hidratadas. A recuperação antigênica foi realizada utilizando uma placa aquecedora durante 20 minutos até atingir 80 ºC. Entre cada passo, utilizou-se cinco ciclos de cinco minutos para lavagem em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4.
Para a detecção de TNF-α no tecido adiposo, utilizou-se o kit Rabbit Specific HRP/DAB (ABC) (Abcam, Cambridge, Reino Unido), de acordo com as instruções do fabricante, e o anticorpo primário policlonal de coelho: anti-TNF-α
(diluição 1:100) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi incubado overnight. Para a análise, imagens do tecido adiposo após a imunohistoquímica foram capturadas utilizando uma câmera digital DS-Ri1 (Nikon, Edgewood, Nova York, EUA) acoplada a um microscópio Eclipse Ni (Nikon, Edgewood, Nova York, EUA) com objetiva de 10x.
A intensidade de TNF-α foi medida de forma semi-quantitativa e automática por meio da determinação da densidade óptica em imagens de coloração diaminobenzidina (DAB), uma vez que a densidade óptica é proporcional à concentração da coloração. A avaliação foi baseada no software Image J (versão 1.51), utilizando um plugin conhecido como IHC profiler149. As imagens de coloração
DAB foram analisadas pixel por pixel e a essas foram atribuídas pontuação de acordo com uma nota, em que consistia na seguinte variação: negativa (0), fracamente positiva (+1), positiva (+2) e altamente positiva (+3). Salienta-se que o método em questão é validado, sendo considerado melhor e mais confiável quando comparado ao método qualitativo, em que há somente análise visual.
O soro foi utilizado para dosagem de TNF-α, a qual foi executada conforme Vendrame et al.150, por ELISA por meio do kit Quantikine rato TNF-α
imunoensaio (R & D Sistemas #RTA00).
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O tamanho da amostra foi calculado de acordo com o coeficiente de variação (10%) e a diferença entre os tratamentos considerados significativos (25%), com probabilidade de erro inferior a 5% (p < 0,05) e potência de 90%. O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi utilizado para comparação entre grupos para as análises das variáveis contínuas índice de adiposidade, peso do tecido adiposo, peso corporal, densidade do volume, área seccional média, volume total de adipócitos e expressão relativa de TNF-α, uma vez que essas variáveis não apresentam distribuição normal (teste Shapiro-Wilk, p <0,05).
Para análise da variável TNF-α circulante os dados foram apresentados como média e desvio padrão. Correlação de Spearman foi realizada para correlacionar as variáveis peso corporal, adiposidade e peso de tecido adiposo visceral. Os dados foram analisados utilizando o programa IBM® SPSS® Statistics 22.0 (Armonk, Nova York, EUA). O software GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, Califórnia, EUA) foi usado para plotagem dos gráficos.
6 ARTIGO PRODUZIDO
Adipocytes and intestinal epithelium dysfunctionslinking obesity to inflammation induced by High Glycemic Index Pellet-diet in Wistar rats
Anna Beatriz Santana Luz1, Júlia Braga dos Santos Figueredo2, Bianca Damásio Pereira Dantas Salviano3, Ana Júlia Felipe Camelo Aguiar3, Luiza Gabriella Soares Dantas Pinheiro3, Matheus Felipe Dantas Krause4, Christina da Silva Camillo5, Fernando Vagner Lobo Ladd5, Raul Hernandes Bortolin6, Vivian Nogueira Silbiger6, Bruna Leal Lima Maciel1,7 and Ana Heloneida de Araújo Morais1,2,7*
1 Nutrition Post Graduate Program, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
2 Biochemistry Post Graduate Program, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
3 Nutrition Course, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
4 Medicine Course, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
5 Department of Morphology, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
6 Department of Clinical and Toxicological Analysis, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
7 Department of Nutrition, Center for Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, 59078-970, Brazil
* Correspondence: aharaujomorais@gmail.com; Tel.: +55 84 99407 5497
Abstract
We investigated the inflammatory effect of a pellet-diet with high glycemic index and load (HGLI) on the histological organization of adipocytes, intestinal epithelium and fat in liver and pancreas in adult male Wistar rats. Two groups (n = 10) received for 17 weeks: (1) HGLI diet or (2) Standard diet (Labina®). Histological analyzes of adipose tissue, jejunum, liver and pancreas were performed. Stereology analysis, visceral adiposity index, gene expression and immunohistochemistry of TNF-α in visceral adipose tissue, and plasma TNF-α were also assessed.The HGLI diet induced hypertrophy of adipocytes with adipocyte volume density equal to 97.0%, cross-sectional area of adipocytes equivalent to 1387 µm² and a total volume of adipocytes of 6.97 cm³ an elevation of 8%, 25%, and 58%, respectively. Furthermore, the HGLI diet increased liver and pancreatic fat deposition, altered and inflamed the intestinal epithelia, and increased TNF-α gene expression (p = 0.014) with a positive immunostaining in visceral adipose tissue and high plasma TNF-α in comparison to standard diet. The results suggest that this diet was able generate changes commonly caused to solid diets with high fat or fructose-rich beverages. To the best of our knowledge, this is the first report in the literature concerning the properties of low-cost, sucrose-rich pellet-diet presenting high glycemic index and high glycemic load efficient on the development of obesity complications in Wistar rats that were subjected to diet-induced obesity (DIO). Therefore, the HGLI pellet-diet may be considered an effective tool to be used by the scientific community in experimental research.
Keywords adiposity; animal feed; dietary sucrose; TNF-α. Introduction
Obesity is characterized by the accumulation of adipose tissue, independently of age, sex and height1,2 and is directly related to inflammation and various chronic non-communicable diseases, influencing body composition3. The eating pattern of modern western society has been the leading cause of obesity in the world and is represented by excessive consumption of processed foods, added sugars and refined grains. This consumption, associated with reduced intake of fruits, vegetables and fish, results in a nutritionally unbalanced diet with high energy content, insufficient supply of fiber, vitamins and minerals, as presents a high glycemic index4.
