Mapeamento de epítopos baseado em peptídeos na caracterização do anticorpo FabC4
Aluno: Douglas Alexsander Alves
Orientadora: Profa. Dra. Thaise Gonçalves de Araújo Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
UBERLÂNDIA - MG 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
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Mapeamento de epítopos baseado em peptídeos na caracterização do anticorpo FabC4
Aluno: Douglas Alexsander Alves
Orientadora: Profa. Dra. Thaise Gonçalves de Araújo Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Genética e Bioquímica (Área Genética).
UBERLÂNDIA - MG 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil.
A474m 2018
Alves, Douglas Alexsander, 1994
Mapeamento de epítopos baseado em peptídeos na caracterização do anticorpo FabC4 [recurso eletrônico] / Douglas Alexsander Alves. - 2018.
Orientadora: Thaise Gonçalves de Araújo. Coorientador: Luiz Ricardo Goulart Filho.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica.
Modo de acesso: Internet.
Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2018.811 Inclui bibliografia.
Inclui ilustrações.
1. Genética. 2. Peptídeos. 3. Mamas - Câncer. I. Araújo, Thaise Gonçalves de, (Orient.). II. Goulart Filho, Luiz Ricardo, (Coorient.). III. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica. IV. Título.
CDU: 577.1 Angela Aparecida Vicentini Tzi Tziboy – CRB-6/947
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Mapeamento de epítopos baseado em peptídeos na caracterização do anticorpo FabC4
ALUNO: DOUGLAS ALEXSANDER ALVES
COMISSÃO EXAMINADORA
Presidente: Profa. Dra. Thaise Gonçalves de Araújo (Orientadora) Examinadores:
Dra. Luciana Rodrigues Carvalho Barros Instituto Nacional de Câncer- INCA Profa. Dra. Vivian Alonso Goulart Universidade Federal de Uberlândia Profa. Juliana Franco Almeida (suplente) Universidade Federal da Paraíba
Profa. Dra. Yara Cristina de Paiva Maia (suplente) Universidade Federal de Uberlândia
Data da Defesa: ______ /_____ /______
As sugestões da Comissão Examinadora e as Normas PGGB para o formato da Dissertação/Tese foram contempladas
___________________________ Profa. Dra. Thaise Gonçalves de Araújo
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
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“Achar que o mundo não tem um criador é o mesmo que afirmar que um dicionário é o resultado de uma explosão numa tipografia” (Benjamin Franklin).
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DEDICATÓRIA:
Dedico essa conquista, primeiramente a Deus, por não me deixar perder as esperanças em meio às dificuldades. Aos meus pais, Darc e Leicimar: Amo vocês!! Família e amigos.
vii AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer à Profa. Dra. Thaise Gonçalves de Araújo, minha mentora e orientadora desde o início da graduação, por quem manifesto grande admiração pessoal e profissional. Obrigado pelas valiosas contribuições
acadêmicas, pelas oportunidades, pela confiança, pela amizade. Serei eternamente grato!!!
Ao Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho, meu co-orientador, por confiar no meu trabalho e abrir as portas do Laboratório de Nanobiotecnologia. Obrigado pela
grande oportunidade de crescimento pessoal e científico.
À minha família e amigos que me ampararam e suportaram nos momentos mais difíceis da minha vida acadêmica.
Á Emília Resende Vaz, Lara Vecchi e Sara Teixeira Soares Mota, pelas valiosas contribuições e aprendizados que tive no dia-a-dia laboratorial desde as iniciações
científicas.
À Natássia Corrêa (“Um dia, e pode ser que esse dia nunca chegue...” kkk), pelas valiosas contribuições e favores, pelo meu amadurecimento crítico, socorros e
conselhos. Obrigado por quebrar a cabeça comigo!
À Antonielle (Toninha), uma amizade que se fortaleceu bastante e pretendo levar para a vida, pelas longas conversas sobre os perrengues da vida, e por trazer
alegria nos “dias de luta”.
Ao Matheus Ribeiro, um agradecimento especial pelo esforço desempenhado em me ajudar, mesmo em momentos bastante difíceis. Obrigado pela amizade sólida
construída e saiba que pode contar comigo sempre!
À Emília Resende, Sara Teixeira, Lara Vecchi e Galber Araújo pelas valiosas contribuições para a realização deste trabalho.
À Angela Rausis, com quem tenho a felicidade de partilhar meus sonhos e faz os meus dias serem melhores, pela paciência, carinho e conforto. Obrigado por não
me deixar desanimar!
Aos meus primos Capitão, Recruta e Rico (Sorriam e acenem rapazes). À equipe médica do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia
Às pacientes, que apesar de toda a dor e sofrimento contribuíram diretamente para a realização desse estudo.
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À Capes, financiadora do meu trabalho.
Ao Laboratório de Nanobiotecnologia, que foi a minha segunda casa e grande responsável pela minha formação profissional.
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SUMÁRIO
RESUMO ...11
ABSTRACT...12
1 INTRODUÇÃO ... 13
1.1 A COMPLEXIDADE DO CÂNCER DE MAMA E SEU DESAFIO CLÍNICO 13 1.2 A IMPORTÂNCIA DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS NA TERAPIA DE TUMORES 16 1.3 PHAGE DISPLAY ... 19 2 OBJETIVOS ... 22 2.1 Objetivo Geral: ... 22 2.2 Objetivos específicos:... 22 3 MATERIAL E MÉTODOS ... 23
3.1 PRODUÇÃO DO ANTICORPO RECOMBINANTE ... 23
3.1.1 Expressão em sobrenadante de cultura ... 23
3.1.2 Purificação e concentração ... 23
3.1.3 Dot-blotting para detecção das moléculas de Fabs ... 24
3.2 BIOSSELEÇÃO ... 24
3.2.1 Extração de proteínas totais de pacientes ... 24
3.2.2 Mapeamento dos epítopos por Phage Display ... 25
3.2.3 Amplificação e purificação dos fagos recombinantes ... 27
3.3 CARACTERIZAÇÃO DOS FAGOS SELECIONADOS ... 27
3.3.1 Reatividade ao FabC4 ... 28
3.3.2 Purificação de fagos promissores ... 28
3.3.3 Amostras sorológicas ... 29
3.3.4 Phage-ELISA em soro de pacientes ... 30
x
3.3.6 Extração de DNA e sequenciamento ... 31
3.4 PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COMO EPÍTOPOS DO FABC4 ... 32
3.5 ANÁLISES IN SILICO... 33
3.5.1 Sequenciamento do anticorpo FabC4 ... 33
3.5.2 Modelagem molecular e docking ... 33
3.6 ENSAIOS CELULARES ... 34
3.6.1 Linhagens ... 34
3.6.2 Imunofluorescência ... 34
4 RESULTADOS ... 35
4.1 SELEÇÃO DE MIMOTopos por phage display ... 35
4.2 PERFIL DIAGNÓSTICO DOS FAGOS SELECIONADOS ... 36
4.3 ESPECIFICIDADE DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS ... 40
4.4 COMPORTAMENTO PROTEICO EM CELULAS DE CÂNCER DE MAMA42 4.5 DOCKING MOLECULAR ... 44
5 DISCUSSÃO ... 48
6 CONCLUSÃO ... 53
7 REFERENCIAS ... 54
11 RESUMO
Phage Display é uma técnica molecular pela qual proteínas exógenas são
expressas na superfície de partículas virais. Esta é uma ferramenta extremamente poderosa para selecionar peptídeos ligantes específicos dentre um vasto número de variantes. Considerando tumores, é uma tecnologia promissora na seleção de alvos com relevância clínica, capaz de reconhecer sua diversidade molecular. Nós caracterizamos, por Phage Display, um novo anticorpo FabC4 com relevância clínica no diagnóstico e prognóstico do Câncer de Mama (CM). Neste estudo, foi realizado um ensaio de bioprospecção contra o FabC4 para mapear seus epítopos, após seleção subtrativa contra um Fab irrelevante e eluição em duas etapas: contra proteínas não malignas, que foram descartadas, e contra proteínas de CM, as quais foram amplificadas. Quatro dos clones selecionados diferenciaram, por Phage-ELISA, amostras de soros de pacientes com CM, de doença benigna da mama (DBM) e de mulheres saudáveis. Os peptídeos correspondentes quimicamente sintetizados (pA5, pA7, pC4 e pD6) se ligaram ao FabC4. O que apresentou maior afinidade ao FabC4 foi o pC4 (p<0,05 quando comparada às demais). Contudo, apenas o pD6 diferenciou as amostras neoplásicas. Demonstramos ainda, pela primeira vez, por imunofluorescência, a co-localização citoplasmática da Anexina A2 (ANXA2) e Citoqueratina 10 (CK10) na linhagem celular MDA-MB-231, sugerindo um novo comportamento molecular dessas proteínas em CM-triplo negativo (CMTN). Análises de docking molecular confirmaram a interação entre o FabC4 e os peptídeos, com melhor cobertura e identidade para pC4. Este peptídeo também mimetizou as regiões das proteínas ANXA2 e CK10 responsáveis por se ligaram ao FabC4. Portanto, nossa estratégia resultou na descrição de biomoléculas com potencial uso diagnóstico do CMTN e no mapeamento bem-sucedido dos epítopos do FabC4, abrindo novos caminhos na compreensão e no tratamento do CMTN.
Palavras-chave: Peptídeo mimético, Câncer de Mama, Anticorpo recombinante,
12 ABSTRACT
Phage Display is a molecular technique by which exogenous proteins are expressed on the virus surface. It is an extremely powerful tool to select peptides with specific binding properties from a wide number of variants. Regarding tumors, Phage Display is a promising technology for the selection of targets with clinical relevance, being capable of recognize cancer molecular diversity. Here we describe the characterization of a new FabC4 antibody, made with Phage Display technique, clinically relevant for breast cancer (BC) diagnosis and prognostic purposes. In this study, a bioprospecting assay was done against FabC4 in order to map its epitopes, after using a subtractive selection against an irrelevant Fab, and elution in two steps: with non-malignant proteins, which were discarded, and against BC proteins, which were amplified. By using Phage-ELISA, four of selected clones were able to differentiate serum samples of patients with BC, from serum of patients with benign disease and healthy women. The peptides were chemically synthesized (pA5, pA7, pC4 e pD6) and bound to FabC4. The pC4 demonstrated higher specificity when compared to the others peptides (p<0.05). However, only pD6 peptide was able to differentiate neoplastic samples. Also, we showed for the first time, by immunofluorescence, the cytoplasmic co-localization of annexin A2 (ANXA2) and cytokeratin 10 (CK10) in MDA-MB-231 cell line, suggesting a new molecular behavior of these proteins on triple-negative BC (TNBC). Molecular docking analysis confirmed interactions between FabC4 and the peptides, with better coverage and identity for pC4. This peptide also mimicked ANXA2 and CK10 protein regions that bind to FabC4. Therefore, we described new molecules for the diagnosis of TNBC and our strategy resulted on a successful mapping of FabC4 epitopes, opening new perspectives to better understand and treat TNBC.
.
Key words: Mimotope peptide, Breast Cancer, Recombinant antibody, Phage Display
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 A COMPLEXIDADE DO CÂNCER DE MAMA E SEU DESAFIO CLÍNICO
O câncer é uma doença altamente prevalente nos dias atuais, sendo a segunda maior causa de morte no mundo e responsável por 8,8 milhões de óbitos em 2015. Globalmente, cerca de uma a cada seis mortes é decorrente de neoplasias, destas 70% ocorrem em países de baixa e média renda (WHO, 2018). Os gastos, diante de índices tão alarmantes, impactam economicamente os sistemas de saúde. Em 2010 o custo estimado anual foi de aproximadamente 1,16 trilhão de dólares (STEWART & WILD, 2014).
Segundo a última estimativa, o Câncer de Mama (CM) é considerado o tipo de tumor mais comum em mulheres, com cerca de 1,7 milhões de novos casos diagnosticados em 2012. Representa 25% de todos os canceres que acometem o sexo feminino e a quinta maior causa de morte pela doença, mundialmente (WCRF, 2018).
No Brasil, o CM também é o mais incidente entre as mulheres, excluindo o de pele não melanoma, correspondendo a 28% das novas lesões identificadas anualmente. São esperados para o biênio 2018-2019 cerca de 59.700 novos casos. Estima-se que no Brasil houve 15.403 óbitos por esta neoplasia em 2015 (BRASIL, 2018b).
Diversos fatores têm sido descritos como responsáveis pelo surgimento dessa doença como: predisposição genética relacionada à presença de mutações nos genes BRCA1 (Breast Cancer 1) e BRCA2 (Breast Cancer 2); a idade; características endócrinas/história reprodutiva da mulher, incluindo estímulo hormonal, menarca precoce, menopausa tardia e nuliparidade; e fatores ambientais/comportamentais como a ingestão de bebida alcoólica, sobrepeso e exposição à radiação ionizante (BRASIL, 2018; ANDERSON et al., 2014).
O câncer, inclusive o de mama, é uma doença predominantemente genética, em que modificações genômicas herdadas ou oriundas de mutações ao longo da vida conduzem à transformação maligna. Molecularmente, são identificadas deleções, inserções, recombinações e alterações na expressão de oncogenes e genes supressores de tumor e em vias diretamente relacionadas à regulação do
14 funcionamento celular (SUGIMURA & USHIJIMA, 2000). A epigenética também está associada à tumorigênese, como a metilação e remodelagem de cromatina (MEHTA et al., 2015). Esses eventos conduzem a alterações na fisiologia das células que propiciam o crescimento da lesão, incluindo: a insensibilidade aos sinais de inibição clonal, a autossuficiência proliferativa, evasão à apoptose, angiogênese sustentada e capacidade metastática (LUND et al., 2006; PRADO-GARCÍA & SÁNCHEZ-PRADO-GARCÍA, 2017).
Tumores mamários são classificados quanto ao componente epitelial comprometido, definidos como carcinomas in situ (Ductal e Lobular) ou invasivos. Dentre estes, os ductais são caracterizados pela proliferação maligna das células dos ductos mamários juntamente com a invasão estromal. São subclassificados em: tubular, cribriforme, mucinoso, medular, papilar, micropapilar, apócrino, neuroendócrino, metaplastico, rico em lipídios, secretor, adenoide cístico, oncocítico e de célula acínica. Os lobulares, por sua vez, originam- se nos lóbulos secretórios e se subdividem em: clássico, pleomórfico, histiocitóide, e tubulolobular (MAKKI, 2015).
Após o diagnóstico, são classificados e estadiados. Desde a sua criação, em 1977, o padrão de estadiamento proposto pela International Union Against Cancer (IUAC) ainda permanece amplamente empregado. O sistema TNM baseia-se em achados anatômicos e analisa três aspectos principais: o tamanho do tumor (T), o comprometimento dos linfonodos (N) e a ocorrência ou não de metástases (M) (GIULIANO et al., 2018).
Contudo, são tumores altamente heterogêneos do ponto de vista clínico, biológico e morfológico. São descritos, também, três subtipos moleculares principais, com diferentes perfis prognósticos e estratégias terapêuticas (DENKERT et al., 2017; MILLS & ETHIER, 2017; CIRQUEIRA et al., 2011). Ensaios de expressão gênica em microarranjos e experimentos de imunohistoquímica os subclassificaram em: luminal (A e B); os que superexpressam o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER-2) e os triplo-negativos. Além disso, também são descritos os “claudin-low” e o molecular apócrino (CIRQUEIRA et al., 2011; BARROS & LEITE, 2015; CAREY et al., 2006).
O subtipo luminal A se caracteriza, principalmente, pela presença de receptores de estrógeno e de progesterona (RE e RPg), além de não expressar
15 (HER-2). Origina-se em células epiteliais dos lúmens ducto-lobulares e corresponde a cerca de 30 a 40% dos casos (PRAT & PEROU, 2011; BARROS & LEITE, 2015). O luminal B também é reconhecido por possuir RE, contudo, pode ou não expressar HER-2. Seu elevado índice mitótico (ki67>14) o define como um tumor de pior prognóstico (TRAN; BEDARD, 2011).
Os que superexpressam HER-2 não apresenta os receptores hormonais e, em geral, apresentam um pior prognóstico em relação aos luminais. O HER-2, primeiramente descrito na mama em 1987 por Slamon et al., (1987), está relacionado ao aumento da agressividade do tumor, das taxas de recorrência, da mortalidade e da resistência a terapias endócrinas (BORG et al., 1990; (CIANFROCCA & GOLDSTEIN, 2004; WOLFF et al., 2007). Contudo, é passível de terapia alvo baseada em anticorpos monoclonais anti-HER2 como o Trastuzumab. Após mais de uma década de sua aprovação, este é responsável por melhorar a sobrevida das pacientes que expressam o receptor (WEINER et al., 2010; SWAIN et al., 2015; CAMERON et al., 2017; NORTON et al., 2018).
O tumor triplo-negativo carece de RE, RPg e HER-2 (BARROS & LEITE, 2015). Dentre estes, o grupo basalóide é definido pelo padrão de expressão semelhante ao das células basais/mioepiteliais da mama com perfil molecular associado à mutação germinativa em BRCA1. Essas lesões expressam HER-1 e citoqueratinas de alto peso molecular/basais e originam-se de células tronco luminais indiferenciadas (PRAT & PEROU, 2009).
Os claudin-low foram reconhecidos em 2007 e são caracterizados pela baixa expressão de proteínas de junções e adesões célula-célula como claudinas 3,4 e 7, E-caderina e Ocludina (HERSCHKOWITZ et al., 2007). Esse subtipo exibe marcadores de transição epitélio-mesenquima, de resposta imune e assemelha-se às células tronco. São, em sua maioria, tumores ductais invasivos metaplásicos e triplo-negativos (PRAT et al., 2010).
O molecular apócrino, como o nome descreve, possui morfologia apócrina característica, são descritos imunohistoquimicamente como triplo-negativos, expressando receptores androgênicos, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e, em alguns casos, HER-2. Essas proteínas são associadas ao seu pior prognóstico (LIU et al., 2018; LIU, XIAOZHEN et al., 2018).
16 Portanto, é evidente a dificuldade em se classificar sistematicamente os tumores triplo-negativos. Em geral são agressivos, de pior prognóstico e correspondem a cerca de 15% dos diagnósticos (PALA et al., 2015). Divergem morfologicamente, geneticamente, imunofenotipicamente e clinicamente, além de não possuírem uma estratégia terapêutica específica já definida (RAKHA et al., 2008; CAREY et al., 2007; COUCH et al., 2015). Há diferentes perfis de expressão proteica e de mRNA, impossibilitando a definição de um único modelo de CM triplo-negativo (CMTN) (DENKERT et al., 2017; GLUZ et al., 2009).
Nesse contexto, inúmeros esforços estão voltados na busca de novas e promissoras abordagens terapêuticas, além de estratégias que possam melhor elucidar esse subtipo tumoral (DENKERT et al., 2017; LEHMANN et al., 2011). Uma abordagem que se destaca nesse cenário é o uso de anticorpos monoclonais com o intuito de identificar moléculas biológicas que possam servir como biomarcadores e/ou mediadores terapêuticos (TOMAO et al., 2015; SPECHT et al., 2017; KUMAR
et al., 2017).
1.2 A IMPORTÂNCIA DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS NA TERAPIA DE TUMORES
Os anticorpos, também chamados de Imunoglobulinas (Ig) são moléculas glicoproteicas circulantes com tamanho aproximado de 160 quilodaltons (KDa). São responsáveis por detectar e se ligarem especificamente a um antígeno (SILVERTON et al., 1977). Em humanos existem cinco classes: IgA, IgG, IgE, IgM e IgD, as quais são altamente reativas a epítopos específicos e responsáveis pela imunidade humoral, neutralizando patógenos, toxinas e materiais estranhos ao nosso organismo (GREENSPAN & CAVACINI, 2019; (FILPULA, 2007; ROMER et al., 2011).
Do ponto de vista estrutural as Igs são compostas por duas, em alguns casos mais, cadeias pesadas (H) idênticas e número igual de cadeias leves (L) que ocorrem nas formas kappa (κ) e lambda (λ). Cada cadeia pesada possui três ou quatro domínios constantes (C) chamados CH1, CH2, CH3 e CH4 e apresenta, na porção amino-terminal, um domínio variável de cadeia pesada (VH). Cada cadeia leve possui um domínio constante e um variável de cadeia leve (VL). Estas
17 subunidades polipeptídicas e as duas cadeias pesadas são unidas por pontes dissulfeto (GREENSPAN & CAVACINI, 2019) (Figura 1).
Figura 1: Representação estrutural de uma IgG. Pontes dissulfeto (S-S) ligam as duas cadeias H e também as cadeias L e H. Os fragmentos gerados por clivagem proteolítica estão representados pelas setas. H: cadeia pesada; L: cadeia leve.
Adaptado de (BARBAS, 2001a).
Nas porções VL e VH encontram-se as regiões hipervariáveis, cuja variabilidade é resultante de rearranjos gênicos durante recombinação e hipermutação somática. A junção das regiões VH e VL formam o fragmento variável (Fv) e as constantes CH2 e CH3 (e CH4 quando houver) formam o fragmento cristalizável (Fc). O sítio de ligação ao antígeno é comporto por seis regiões determinantes de complementariedade (CDR), três em cada VL e VH (BUJOTZEK
et al., 2015; GACIARZ; RUDDOCK, 2017).
Os domínios estruturais e funcionais das imunoglobulinas são passiveis de separação por meio de digestão proteolítica. O fragmento de ligação ao antígeno (Fab) é composto pelas porções VH/CH1 e VL/CL, liberadas após clivagem enzimática da papaína, gerando dois Fab e um Fc. Quando clivado por pepsina,
18 produz a forma dimérica (Fab)2 (BERELI et al., 2015; KOMATSU et al., 2014; TAHERIAN et al., 2018).
Essa particularidade é importante do ponto de vista biotecnológico, uma vez que fragmentos de anticorpos possuem a vantagem de maior penetrabilidade nos tecidos, serem eficazes e não induzirem a resposta efetora (BARBAS, 2001; MORAIS et al., 2014; HOLLIGER & HUDSON, 2005). O fragmento Fab, em seu formato monomérico, permite maior estabilidade, capacidade de reconhecimento com alta afinidade ao seu alvo, sem problemas quanto à avidez (ZHANG, QING et
al., 2007; KOERBER et al., 2015).
Anticorpos monoclonais são moléculas proteicas utilizadas, rotineiramente, para fins terapêuticos e diagnósticos. Além disso, devido à sua excelente capacidade de reconhecer seletivamente o alvo (NILVEBRANT & ROCKBERG, 2018) têm sido empregadas na identificação de antígenos tumorais, por ensaios tradicionais ou por métodos de varredura como o Phage Display (WEINER et al., 2010; MILLER et al., 2003). Nesse contexto, fragmentos de anticorpos expressos em bacteriófagos vem sendo desenvolvidos em plataformas de alto rendimento (KOERBER et al., 2015) principalmente nos formatos Fab e scfv (RIZK et al., 2017; RAHBARNIA et al., 2017; LEDSGAARD et al., 2018).
A região específica do antígeno reconhecida pelo anticorpo é denominada epítopo. Estes podem ser lineares ou descontínuos, dependendo da disposição de seus resíduos e de sua estrutura tridimensional na interação com a imunoglobulina (NILVEBRANT & ROCKBERG, 2018). Com o advento da engenharia de anticorpos, seleção in vitro e tecnologia do DNA recombinante (NILVEBRANT & ROCKBERG, 2018) moléculas promissoras vem sendo construídas (BROOKS et al., 2014) e caracteriza-las se torna crucial para a medicina translacional (BALLEW; REIFERT; DAUGHERTY, 2018).
Na oncologia clínica, nos últimos 40 anos, 21 anticorpos foram aprovados para imunoterapia contra o câncer pela Food and Drug Administration (FDA) (ALMAGRO et al., 2018). De fato, o mapeamento de epítopos vem se destacando na última década, ao fornecer dados importantes para a caracterização de anticorpos de interesse clínico, estratificando pacientes, desenvolvendo modelos vacinais (VOLK et al., 2016) e novos direcionadores de drogas (LIU, BIN et al., 2004; TRAIL et al., 2018). Além disso, a elucidação precisa de alterações
19 estruturais tridimensionais ou moleculares podem auxiliar na compreensão da tumorigênese e malignidade (STEPHEN & LANE, 1992).
Um dos grandes desafios no CM consiste no desenvolvimento de terapias específicas para o subtipo triplo-negativo (COLLIGNON et al., 2016). Tomao et al. (2015) descreveu a existência de características moleculares inerentes a esse tumor passíveis de abordagem terapêutica. O Phage Display, descrito pela primeira vez na década de 1985, consiste na busca de peptídeos ligantes a alvos específicos por meio da utilização de vetores virais (SCOTT & SMITH, 1990). Essa técnica tem se mostrado promissora no mapeamento de epítopos-chave para desvendar os mecanismos inerentes ao surgimento e progressão de diversas doenças, uma vez que não exige conhecimento prévio de seus alvos (ARAP et al., 2001; MOREIRA
et al., 2018).
1.3 PHAGE DISPLAY
O Phage Display consiste em uma técnica baseada na apresentação de peptídeos ou proteínas expressos na superfície de bacteriófagos (BARBAS, 2001b). Revolucionou a biologia ao permitir a identificação de ligantes para fins de compreensão e diagnóstico de diferentes doenças (SMITH, 1985; SMITH & PETRENKO, 1997; AZZAZY & HIGHSMITH, 2002; KEHOE & KAY, 2005; GAGIC et al., 2016) ou para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas envolvendo o mapeamento de epítopos, o bloqueio de receptores e o direcionamento de drogas (XING et al., 2018), o que evidencia sua importância nos dias atuais (SHAVE et al., 2018).
No Phage Display são utilizados bacteriófagos que infectam bactérias gram-negativas portadoras de pillus sexual (PENNAZIO, 2006; STRAUS; BO, 2018). Não induzem o ciclo lítico, o que possibilita a amplificação procariótica e obtenção de altos títulos virais (ARAP, 2005). A partir da clonagem na região gênica correspondente, peptídeo exógenos são expressos nas porções N-terminais da proteína pIII ou pVIII o (SMITH; SCOTT, 1993; ZHANG, SHUAI et al., 2015). Sidhu (2001) destaca a maleabilidade do revestimento deste fago frente às intervenções genéticas, permitindo a expressão de curtas sequencias de aminoácidos, mas também fragmentos de anticorpos com potencial biotecnológico (SIDHU, 2001).
20 O bacteriófago filamentoso mais amplamente utilizado é o M13, composto por um DNA circular fita simples fita envolto por um capsídeo proteico, sendo este constituído por cinco proteínas (pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX) ( Figura 2) (SAWADA, 2017). Apesar da proteína pVIII ser a mais abundantemente expressa (cerca de 2700 cópias) e também passiva de fusão com peptídeos exógenos, o sistema baseado em pIII é mais amplamente utilizado. Esta proteína está presente em 3 a 5 cópias conferindo maior especificidade durante o processo de obtenção dos ligantes (PASCHKE, 2006; ZHANG, SHUAI et al., 2015).
Figura 2: Imagem representativa de um fago filamentoso M13. Um gene exógeno é incorporado ao DNA do bacteriófago e o fenótipo representado pela sequência peptídica é expresso fusionado à pIII do vírus.
Fonte: Sawada, 2017 (Adaptada).
Uma vez exposto, esse peptídeo ou proteína pode ser selecionado em um processo conhecido como Biosseleção ou Biopanning (BARBAS, 2001). Para isto, é necessária que uma biblioteca combinatorial variável de peptídeos (ou fragmentos de anticorpos) seja expressa na superfície dos bacteriófagos, favorecendo sua ligação à molécula de interesse. Esse procedimento consiste em 4 etapas. O primeiro passo é a incubação da biblioteca com o substrato, a segunda é a remoção dos fagos não ligantes ou inespecíficos por sucessivas lavagens e a terceira é a eluição e amplificação dos ligantes ao infectar cepas de E. coli (GÜNAY; KLOK, 2015). A cada ciclo, a biblioteca de fagos é gradualmente enriquecida de
21 ligantes de alta afinidade, que posteriormente são isolados, sequenciados e caracterizados (’T HOEN et al., 2012).
Nosso grupo de pesquisa caracterizou em estudo anterior, por Phage
Display, um novo anticorpo FabC4 com relevância clínica no diagnóstico do CM e
no prognóstico do CMTN (ARAÚJO et al., 2014). O anticorpo recombinante foi associado com idade mais jovem, ausência do receptor de progesterona, maiores graus histológicos e fenótipo não-luminal. Além disso, identificou um subgrupo de CM triplo-negativos de bom prognóstico. No entanto, a caracterização adicional de seu alvo é essencial para o manejo clínico dessa neoplasia.
Dada a natureza heterogênea, multifatorial e multifocal do CM, a busca por potenciais biomarcadores e suas associações moleculares envolvidas na ocorrência e desenvolvimento dessa doença é fundamental para um diagnóstico mais preciso e para esclarecer o fenótipo neoplásico (MITTAL et al., 2017). Recentemente vários estudos vem sendo realizados voltados para a identificação e validação de antígenos para detecção de tumor (ZHOU, JUAN et al., 2017), sobretudo na busca de biomarcadores séricos (GERASIMOV et al., 2017).
Neste estudo, realizamos um ensaio de bioprospecção contra o FabC4 utilizando uma biblioteca PH.D-12 a fim de mapear seu epítopo. Nossos resultados abrem novas perspectivas no diagnóstico de CM e no desenvolvimento de novas terapias, além de demonstrar a seletividade do procedimento utilizado. Selecionamos clones de fagos que mimetizam epítopos (mimotopos) correspondentes às proteínas Anexina A2 e Citoqueratina 10 (CK10) e descrevemos, pela primeira vez, a co-localização dessas duas moléculas no CMTN.
22
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL:
Mapear, por meio da tecnologia de Phage Display, os epítopos ligantes ao fragmento de anticorpo FabC4.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
✓ Utilizar a tecnologia de Phage Display na seleção de peptídeos que possuam afinidade ao fragmento de anticorpo FabC4;
✓ Caracterizar por meio de sequenciamento e ferramentas de bioinformática os peptídeos expressos na superfície dos fagos selecionados;
✓ Avaliar o potencial diagnóstico dos fagos por ensaios imunoenzimáticos
Phage-ELISA frente a anticorpos IgG presentes no soro de pacientes com
CM, Doença Benigna da Mama (DBM) e controles saudáveis;
✓ Proceder a síntese química dos peptídeos expressos na superfície dos clones mais reativos para o FabC4 e avaliá-los como ferramenta diagnóstica; ✓ Avaliar a imunorreatividade dos peptídeos sintéticos frente ao FabC4; ✓ Predizer as estruturas tridimensionais e as interações inter-estruturais entre
os peptídeos selecionados pelo Phage Display e o FabC4 por meio de modelagem e Docking Molecular;
✓ Validar a expressão dos alvos do FabC4 (Anexina A2 e Citoqueratina 10) em linhagens celulares;
✓ Predizer os epítopos correspondentes aos alvos protéticos por modelagem e Docking Molecular.
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 PRODUÇÃO DO ANTICORPO RECOMBINANTE
3.1.1 Expressão em sobrenadante de cultura
Bactérias da linhagem não supressora TOP10 foram transformadas com fagomídeos portando a sequência do clone FabC4. Para sua expressão, 5 mL de meio SB (peptona de caseína 3%, extrato de levedura 2% e MOPS 1%) contendo 2% de glicose (2M) e 50µg/mL de carbenicilina foram inoculados com 20µL dos transformantes e crescidos por 16 horas sob agitação (260 rpm) a 37°C. No dia seguinte 2mL da cultura foram transferidos para um novo meio (200mL) suplementado como descrito acima, porém com 100µg/mL de antibiótico e mantidos sob agitação a 37°C até atingirem a densidade ótica de 600nm (OD600nm) próxima de 1.
Após esse período a cultura foi centrifugada a 3000 x g por 10 min e o sedimento foi ressuspenso em 1L de SB, nessa etapa suplementado com IPTG (isopropil-β-D- thiogalactopiranosídeo - 2mM) e carbenicilina (100µg/mL). Para expressão do FabC4 em sobrenadante de cultura, esse meio foi incubado sob agitação a 30°C por 18 horas, seguida de centrifugação por 40 minutos a 5000 rpm. O sobrenadante foi então transferido para um novo recipiente estéril para posterior purificação.
Os passos acima descritos também foram realizados para a expressão de um Fab irrelevante (FabIR). Este foi utilizado como controle nos demais experimentos.
3.1.2 Purificação e concentração
O anticorpo recombinante FabC4 e o irrelevante foram purificados em cromatógrafo liquido de alta performance (HPLC) utilizando o kit HisTrap (GE Healthcare), conforme as recomendações do fabricante, com algumas modificações. Em resumo, aos sobrenadantes de cultura foram adicionados 10mM de imidazol, o ph foi ajustado para 7,4 e as soluções filtradas em filtro Milipore de
24 0,22µm. Foram injetados 30mL das amostras e os Fabs foram eluídos com tampão Imidazol (Fosfato 20mM, NaCl 0,5 M, Imidazol 500mM, ph 7,4). Foram coletadas frações de 500µl para análises por dot blotting e as correspondentes aos picos de eluição foram reunidas em um único tubo (um para cada um dos anticorpos).
Para a concentração dos purificados foram utilizadas as colunas Amicon 3kda (Millipore) e o tampão de eluição com imidazol foi substituído por tampão fostato salino 1X (PBS1X) em sucessivas centrifugações de 30 min a 7500 rpm a 4°C. As amostras foram quantificadas utilizando o kit Pierce® BCA Protein Assay (Thermo) segundo as especificações do fabricante.
3.1.3 Dot-blotting para detecção das moléculas de Fabs
Para a confirmação da presença dos Fabs nos purificados concentrados foi realizado o ensaio de dot-blotting. Para tal, foram pipetados 5µl das soluções coletadas após centrifugação em coluna Amicon (Millipore) em uma membrana de nitrocelulose Amersham Protran Premium 0,2µm NC (GE Healthcare), mantida por 5 minutos a temperatura ambiente (T.A.). Posteriormente, esta foi bloqueada com PBS1X-BSA3% durante 1 hora a T.A.
Após lavagem com PBS1X, a membrana foi incubada com anticorpo anti-HA (anti-hemaglutinina) conjugado com peroxidase (Roche Applied Science) (diluído 1:5.000 em PBS1X-BSA3%) e novamente mantida por 2 horas à T.A., sob agitação. Procedeu-se a lavagem com PBS1X-Tween 20 0,05% (PBST) e o ensaio foi revelado utilizando o substrato 3,3-Diaminobenzidina (DAB) (Sigma Fast®). A
reação foi paralisada com água destilada. 3.2 BIOSSELEÇÃO
3.2.1 Extração de proteínas totais de pacientes
Este projeto foi realizado em conjunto com o Serviço Obstétrico do Hospital Universitário da UFU. O protocolo do estudo foi aprovado sob o número 176/2008 pelo Comitê de Ética em Pesquisa local, de acordo com a Declaração de Helsinki
25 de 1975, revisada em 2008, e um termo e consentimento livre esclarecido foi obtido de todos os participantes.
Os fragmentos de tecidos das pacientes foram macroscopicamente dissecados e macerados em nitrogênio líquido utilizando cadinho com bastão de porcelana em tampão de extração (Tris-HCL 20mM pH7,2, EDTA 10mM, EGTA 2mM, sacarose 250mM, DTT 1mM, Benzamidina 1mM). O material resultante foi transferido para um microtubo e centrifugado a 20.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteínas totais foi quantificada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). Para a preservação de sua integridade foram adicionados os inibidores de protease benzamidina (100mM) e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) (150 mM). Foram extraídas proteínas de tecidos de pacientes (cinco para cada grupo) diagnosticadas com CM ductal invasivo, Doença Benigna da Mama (DBM) e amostras provenientes de mamoplastia, consideradas normais (CO).
3.2.2 Mapeamento dos epítopos por Phage Display
Foi utilizada uma biblioteca de peptídeos aleatórios de 12 aminoácidos fusionados à proteína de revestimento menor (pIII) dos bacteriófagos M13 - PhD-12 (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA). Nesta abordagem de bioprospecção foram utilizadas 1,5 × 1011 partículas virais em três ciclos de seleção contra o anticorpo FabC4, amplificadas como descrito anteriormente (BARBAS, 2001), com modificações. O desenho experimental encontra-se demonstrado na Figura 3.
26
Figura 3: Imagem ilustrativa da estratégia utilizada no processo de biosseleção. Destaca-se a eluição em duas etapas, visando identificar proteínas referentes ao processo tumoral. O ciclo apresentado foi repetido três vezes.
Para a seleção foram utilizados 10μg do FabC4 e do FabIR imobilizados em uma placa de 96 poços por 24h a 4°C. O bloqueio foi realizado por 1h a 37°C com PBS1X-BSA3%, seguido de duas lavagens com 300μL de TBS-T0,1% (solução salina tamponada com Tris e 0,1% de Tween 20). Em uma estratégia de seleção subtrativa, o FabIR foi incubado com 1,5 x 1011 partículas de fago da biblioteca de PhD-12 em 200μL de solução de TBS à T.A. durante 30 min. Posteriormente, o sobrenadante contendo os fagos não ligantes foram expostos ao FabC4 por 1 hora a T.A.
Após esse período, o poço contendo o FabC4 foi lavado dez vezes com TBS-T0,1% e as partículas que não se ligaram foram descartadas. Em seguida os fagos que reconheceram o FabC4 foram desligados do alvo por meio de uma eluição em duas etapas objetivando selecionar peptídeos relacionados e específicos ao CM. Em um primeiro momento, o complexo FabC4-Fago foi incubado com proteínas extraídas de tecidos benignos e normais (30 min a T.A.) eluindo-se competitivamente, os peptídeos miméticos a proteínas não-tumorais. Estas foram
27 descartadas. Os vírus que permaneceram ligados ao FabC4 foram submetidos a uma segunda eluição competitiva com proteínas extraída de tecidos com CM (30 min a T.A.) desligando, assim, os peptídeos miméticos a proteínas tumorais. Estes foram amplificados em Escherichia coli ER2738 (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA), purificados com PEG-NaCl (20% de Polietilenoglicol 8000 e 2,5 M de NaCl – solução estéril) e utilizados em um novo ciclo de seleção. A partir do segundo aumentou-se a estringência do tampão de lavagem de 0,1% para 0,5%, de Tween 20. Após o terceiro round, colônias bacterianas individuais contendo clones de fagos amplificados foram cultivadas em uma placa deep well para validação do biopanning e seleção de clones promissores.
3.2.3 Amplificação e purificação dos fagos recombinantes
Os fagos foram amplificados utilizando uma colônia de E. coli da linhagem ER2738 previamente inoculada em 20mL de meio Luria-Bertani (LB) estéril contendo tetraciclina (20 μg/mL); mantido sob agitação a 37ºC até OD600nm = 0.3. Esta cultura foi diluída em novo meio LB contendo tetraciclina (1mL de cultura/120mL de meio) sendo esta distribuída em uma placa deep well (1mL/poço). Usando palitos esterilizados, colônias azuis (bactérias infectadas com fagos) foram retiradas da placa de petri (referente ao terceiro round não-amplificado) e transferidas para um poço da placa deep well contendo a cultura previamente diluída. Esta foi vedada com um adesivo e incubada, por 5 horas, sob forte agitação a 37ºC. Para segurança, 100μL de cada poço foram estocados em uma placa de microtitulação (Falcon® -Thermo Fisher) acrescidos de 100μL de glicerol 50%. Após a incubação, a placa deep well foi centrifugada por 20 minutos a 3700 rpm e os sobrenadantes transferidos para outra placa estéril. A esta foi adicionado 1/6 do volume em PEG/NaCl com incubação por 14 horas a 4ºC. Transcorrido esse período, a placa foi centrifugada por 1 hora a 3700 rpm e todo o sobrenadante dispensado. O precipitado foi ressuspendido em 200μL de PBS1X.
28 3.3.1 Reatividade ao FabC4
Para confirmar o reconhecimento dos peptídeos selecionados pela molécula alvo foram realizados ensaios de Phage-Elisa em duplicata. Placas de microtitulação de 96 poços (Nunc MaxiSorp-Sigma®) foram revestidas com 1 μg/poço de FabIR e FabC4 diluídos em tampão carbonato/bicarbonato (50mM pH 9,6); mantidas por 16 horas a 4°C. Os poços foram lavados com PBS-T0,1% e bloqueados durante 1h a 37°C com PBS-BSA3%.
Posteriormente, a placa foi lavada duas vezes com PBS-T0,1% e o sobrenadante de cultura contendo partículas virais amplificadas (~1010 pfu/mL) foi adicionado, com posterior incubação por 1h a 37°C. Foram realizadas quatro lavagens com PBS-T0,1% para então ser pipetado o anticorpo anti-M13 conjugado com peroxidase (Roche Applied Science) diluído 1:5000 em PBS1X-BSA3%. A placa foi mantida por 1h a 37°C seguida de quatro lavagens com PBS-T0,1%.
A reação com o substrato OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina) SigmaFast® (Sigma-Aldrich), interrompida com H2SO4 (2N), foi analisada em espectrofotômetro no comprimento de 492 nm (TP-Reader ThermoPlate). O fago M13 sem exibir qualquer peptídeo (selvagem) foi utilizado como controle negativo e normalizador dos valores obtidos. Para os ensaios posteriores foram escolhidos os fagos cuja reatividade ao irrelevante foi inferior a 0,1 e ao FaC4 foi superior a 0,2.
3.3.2 Purificação de fagos promissores
Os clones que obedeceram aos critérios de absorbância descritos anteriormente foram utilizados em testes mais específicos. Para cada fago, 40mL de LB contendo tetraciclina (20μg/mL) foram inoculados com bactéria E. coli e a cultura mantida sob agitação a 37ºC até OD600nm=0,3. Um volume de 10μL de cada fago foi então adicionado, com posterior incubação sob agitação vigorosa durante 12 horas a 37ºC.
Após esse período, o meio de cultivo foi centrifugado a 10000 rpm por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, onde foi adicionado 1/6 do volume de PEG/NaCl, mantido por 16 horas a 4°C. Posteriormente,
procedeu-29 se uma centrifugação de 10000 rpm por 15 min a 4°C e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi diluído em 1 mL de PBS1X e centrifugado a 14000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi, então, transferido para outro tubo onde novamente acrescentou-se 1/6 do volume de PEG/NaCl, mantido durante 1 hora no gelo. Após centrifugação a 14000 rpm por 10 min o novo sobrenadante foi descartado e o precipitado contendo os fagos foi ressuspendido em 200μL de PBS1X.
3.3.3 Amostras sorológicas
Foram coletadas amostras de soros de 150 pacientes categorizadas em três grupos: CM, DBM e controles saudáveis (CO), baseado em parâmetros clínico-patológicos (Tabela 1). As pacientes com CM foram classificadas de acordo com o critério TNM, e os tumores foram definidos como T1, T2, T3 ou T4. O grupo CM ainda foi classificado segundo o grau de Nottingham, como sendo grau I (GI), grau II (GII) ou grau III (GIII) e quanto à presença dos receptores hormonais RE, RPg e HER2. O status de HER2 foi considerado positivo quando score 3+ e negativo para score 0-1+; as pontuações 2+ foram excluídas das análises.
Tabela 1: Variáveis clinico-patológicas
Amostras sorológicas
Grupo N Idade média (anos)
CM 50 46,2 (intervalo 30-80)
DBM 50 46,8 (intervalo 18-58)
CO 50 47,6 (intervalo 20-73)
Total 150
Parâmetros clínico-patológicos para os pacientes com CM
TNM N % T1 19 37,5 T2 22 45 T3 4 7,5 T4 5 10 Grau de Nottingham N % GI 5 10% GII 28 55% GIII 17 35% Expressão de RPg N % Positivo 29 57,5 Negativo 15 30
30 Não definido 6 12,5 Expressão de RE N % Positivo 36 72,5 Negativo 8 15 Não definido 6 12,5 Expressão de HER2 N % Positivo 11 22,5 Negativo 31 62,5 Não definido 8 15
N, número; % percentagem; TNM, Tumor-linfonodo-metástase; RPg, receptor de progesterona; RE receptor de estrógeno; HER2, receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano; CM, câncer de mama; DBM, doença benigna da mama; CO, controle saudável.
3.3.4 Phage-ELISA em soro de pacientes
Ensaios de ELISA foram realizados para identificar os antígenos como circulantes. Testes preliminares foram conduzidos para determinar as condições ótimas referentes ao título viral, diluição dos soros e dos conjugados e soluções de lavagem. Após esse experimentos iniciais, microplacas de poliestireno (Nunc
MaxiSorp-Sigma®) foram revestidas com 1010 pfu de cada clone de fago diluído em tampão carbonato/bicarbonato (50mM pH 9,6), incubadas por 16 horas a 4°C. Após sensibilização, as microplacas foram lavadas uma vez com PBS-T0,05% e bloqueadas a 37°C por 1 hora com 300μL de PBS-T0,05%M5% (PBST0,05% acrescido de leite desnatado a 5% - PBSTM). Em seguida, amostras de soro diluídas 1:400 em PBSTM foram incubadas por 1 hora a 37°C. Foram utilizados três pools de soro correspondentes a cada um dos grupos: CM (10 pacientes com carcinoma ductal invasivo); DBM (10 pacientes) e CO (10 pacientes).
As placas foram lavadas cinco vezes com PBS-T0,1% e foi adicionado o anticorpo anti-IgG humano marcado com peroxidase (Sigma) diluído 1: 5000 em PBSTM. Após 1 hora de incubação a 37°C e lavagem com PBS-T0,1%, foi acrescido o substrato OPD e a reação interrompida com H2SO4 (2N). As densidades ópticas foram determinadas a 492 nm em leitor de ELISA (TP-Reader
ThermoPlate) e os experimentos foram conduzidos em triplicata.
As absorbâncias foram normalizadas com os valores obtidos para o fago M13 selvagem, utilizado como controle. Quatro clones foram, em seguida, testados individualmente em triplicata contra um novo grupo de 150 pacientes (50 CM; 50
31 DBM; 50 CO). O ponto ótimo de reação (cut-off) foi determinado baseando-se nos dados da curva ROC.
3.3.5 Análises estatísticas
Os dados foram analisados com o auxílio do software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc. - La Jolla, CA, USA) e valores de probabilidade (P) inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
O teste ANOVA foi realizado para comparar a absorbância entre os grupos e o pós-teste de Bonferroni foi utilizado em comparações múltiplas. A curva ROC foi construída para avaliar o poder diagnósticos dos fagos e a área sob curva (ASC) determinou a sensibilidade (Se), especificidade (Sp) e razão de verossimilhança (LR + e LR2) dos clones selecionados. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado nas comparações entre grupos para os ensaios de ELISA com 150 pacientes.
Foram realizadas análises de correlação de Pearson entre os fagos no software R (2017, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Para a significância destes dados foram calculados os valores de P a partir do teste t de Student.
3.3.6 Extração de DNA e sequenciamento
Para extração do DNA dos fagos 10µl de bactérias infectadas com cada clone foram inoculados em 1mL de meio LB em placas Deep well. Esta foi incubada por 16 horas a 37°C sob agitação e posteriormente centrifugada a 3700 rpm durante 50 min a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para uma nova placa e incorporado 1/6 do volume de PEG/NaCl mantido a 4°C por 10 min. Após nova centrifugação durante 1 hora a 3700 rpm a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e em cada well foram adicionados 100µl de tampão iodeto (10mM de Tris-HCl pH 8,0, 1mM de EDTA e 4M de NaI). Após breve agitação foram adicionados 250µl de etanol absoluto e a solução permaneceu incubando durante 10 min T.A.. Posteriormente, a placa foi centrifugada por 40 min a 3700 rpm a 20ºC. Descartou-se o sobrenadante, adicionou-se 150µl de etanol 70% com nova centrifugada por 10 min
32 a 3700 rpm. O sobrenadante foi dispensado e o DNA dos fagos ressuspendido em 15ul de água ultrapura.
As reações de sequenciamento foram conduzidas em sequenciador automático ABI3500 (Applied Biosystem, California, USA), seguindo-se as recomendações do fabricante e utilizando o primer −96M13 (5’-CCCTCATTAGTTAGCGCGTAACG-3′). As sequências de aminoácidos foram deduzidas a partir das sequências nucleotídicas com o auxílio do software ExPASy (http://www.expasy.org). Foi feita ainda uma análise dos peptídeos utilizando o software SAROTUP (http://immunet.cn/sarotup/index.html) para validar os peptídeos como não ligantes à superfícies de adsorção. O alinhamento via BLASTp (NCBI) permitiu a análise de similaridade dos peptídeos selecionados.
3.4 PEPTÍDEOS SINTÉTICOS COMO EPÍTOPOS DO FABC4
Os clones A5, A7, C4 e D6, que foram capazes de discriminar o soro de indivíduos com CM de DBM e CO por Phage-ELISA, foram sintetizados quimicamente pela GenScript USA Inc. Para aumentar a imunogenicidade, os peptídeos foram acoplados ao BSA. Ensaios imunoenzimáticos foram conduzidos para avaliar a capacidade do anticorpo FabC4 em reconhecer esses peptídeos.
Uma placa de microtitulação foi sensibilizada com 2,5 μg/poço de cada um dos peptídeos diluídos em tampão de carbonato/bicarbonato (50mM pH 9,6) e mantida por 16 horas a 4°C. Após bloqueio com PBS1X-BSA3% (1 hora a 37°C) uma única lavagem com PBS1X precedeu à adição do FabC4 (1ug), incubado por 1 hora a 37°C. Após lavagem com PBS1X, foi adicionado o anticorpo anti-HA marcado com peroxidase (Roche Applied Science) diluído 1:5000 em PBS-BSA3% por 1h a 37°C. Após lavagem com PBS1X, a reação com o substrato OPD SigmaFast® (Sigma-Aldrich), interrompida com H2SO4 (2 N), foi analisada em espectrofotômetro no comprimento de 492 nm (TP-Reader ThermoPlate).
As mesmas condições foram utilizadas para analisar a capacidade diagnóstica dos peptídeos frente ao soro dos 150 pacientes previamente descritos. Novamente o teste ANOVA e Mann Whitney foram utilizados para fins comparativos entre grupos com o auxílio do software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software
33 3.5 ANÁLISES IN SILICO
3.5.1 Sequenciamento do anticorpo FabC4
O DNA dos fagos contendo a sequência codificante para FabC4 foi isolado e purificado utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN®) seguindo as recomendações do fabricante. A qualidade do DNA de fita simples foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% corado com GelRed (1:500 - Uniscience) e visualizado por luz ultravioleta (sistema de vídeo documentação ImageSystem – VDS, Amersham Biosciences®).
A reação de sequenciamento foi realizada por eletroforese capilar em aparelho ABI3730 (Applied Biosystems®), utilizando-se polímero POP7 e BigDye v3.1. (Myleus Biotechnology®) e os primers mmb4
(5’-GCTTCGGGCTCGTATGTTGTGT-3’) e mmb5
(5’-CGTTTGCCATCTTTTCATAATC-3’). Para análise das sequências utilizou-se o software Sequence Scanner (Applied Biosystems®).
3.5.2 Modelagem molecular e docking
Para determinar a estrutura tridimensional do FabC4, assim como as possíveis interações e ligações entre os peptídeos e o anticorpo recombinante foram realizados ensaios in silico de modelagem molecular e docking. A estrutura tridimensional do fragmento de anticorpo FabC4 foi modelada a partir da construção em FASTA das cadeias leves e pesadas das porções variáveis e constantes
utilizando o software RaptorX
(http://raptorx.uchicago.edu/StructurePrediction/predict/). Este, em seu script, inclui ferramentas de predição por homologia a proteínas conhecidas, com estruturas cristalográficas depositadas em bancos de dados para predizer o modelo 3D ótimo para uma sequência definida de aminoácidos. O modelo foi escolhido com base nos escores apresentados bem como com o auxílio do software Verify 3D (http://servicesn.mbi.ucla.edu/Verify3D/) e RAMPAGE: Ramachandram Plot
34 Os peptídeos foram modelados pelo método de novo utilizando o software PEPFOLD2.0 - RPBS (http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD) e os filtros do programa. As interações (docking molecular) entre os peptídeos e o FabC4 foram preditas pelo software HPEPDOCK (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/). Já os arquivos de visualização tridimensionais dos alvos ANXA2 e Ck10 foram localizados em banco de dados de proteínas, mais especificamente o Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb).
Foram realizados, ainda, dockings moleculares, via PATCHDOCK (https://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/), entre proteínas previamente descritas como alvos do FabC4 (ARAÚJO, 2014) e o anticorpo recombinante. Finalmente, a predição para avaliar se os epítopos selecionados correspondem a regiões específicas dessas proteínas, e todas as visualizações e análises foram realizadas no software PyMol.
3.6 ENSAIOS CELULARES
3.6.1 Linhagens
Foram utilizadas as linhagens celulares tumorais mamárias MCF-7 (fenótipo luminal) e MDA-MB-231 (fenótipo triplo-negativo) obtidas do ATCC. Seu cultivo foi conduzido em meio IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e gentamicina (100 mg/mL). As células foram mantidas em estufas a 37°C com taxa de CO2 a 5%.
3.6.2 Imunofluorescência
Ensaios de imunofluorescência foram realizados para a visualização dos alvos do FabC4 em células tumorais mamárias. Após confluência, estas foram tripsinizadas, contadas e plaqueadas a uma concentração de 1.105 células em lamínulas esterilizadas. Depois de aderidas, foram realizadas duas lavagens com PBS1X e as células foram fixadas e permeabilizadas adicionando o reagente
Cytofix Cytoperm (BD Biosciences, San Diego, California, USA) seguido de
35 mantida durante 10 min. Após três lavagens com PBS1X procedeu-se o bloqueio com PBS1X-BSA1% durante uma hora.
As células então foram incubadas durante 1 hora T.A. com os anticorpos primários anti-Anexina II (1:100, Life Technologies®) anti-CK10 (1:100,
Sigma-Aldrich®) e FabC4 (1µg/µL) diluídos em PBS1X. As lamínulas foram lavadas 3
vezes com PBS1X, com posterior adição dos anticorpos secundários incubados por uma hora T.A: anti-HA marcado com FitC para o anticorpo FaC4; anti-IgG marcado com FitC e anti-IgG marcado com Ficoeritrina (PE) para a detecção de Anexina II, e marcado com Ficoeritrina para a visualização de CK10.
Após uma lavagem com PBS1X os núcleos foram contrastados com o reagente TO-PRO-3® Iodide (1:250, Invitrogen). As localizações do FabC4, Anexina II e CK10 foram avaliadas em microscopia confocal com sobreposição das imagens (Zeiss LSM510).
4 RESULTADOS
No presente estudo nós mapeamos os epítopos do anticorpo recombinante FabC4 (ARAÚJO et al., 2014) utilizando sucessivos ciclos de seleção de peptídeos apresentados na superfície de fagos filamentosos. Nós combinamos análises in
vitro e docking molecular para validar os peptídeos enquanto ligantes ao FabC4 e,
adicionalmente, como passíveis de se tornarem uma estratégia diagnóstica para o CM. A caracterização dos alvos do FabC4, Anexina A2 (ANXA2) e Citoqueratina 10 (CK10) (ARAUJO et al., 2014), em células MCF7 e MDA-MB-231, aliada à capacidade dos peptídeos em mimetizar suas regiões, revelam nossas moléculas como promissoras em formulações. Estas podem auxiliar no tratamento da doença e, sobretudo, na caracterização de tumores triplo-negativos.
4.1 SELEÇÃO DE MIMOTOPOS POR PHAGE DISPLAY
Com o objetivo de identificar os peptídeos ligantes ao FabC4, uma biblioteca P.h.D.-12 foi utilizada em três ciclos de seleção. O FabC4 foi previamente definido como um marcador prognóstico em pacientes com CM triplo-negativo, inédito quanto ao seu comportamento nesse subtipo tumoral (ARAUJO et al., 2014).
36 Para confirmar as especificidades dos fagos selecionados, 95 clones foram randomicamente escolhidos do terceiro ciclo e suas afinidades avaliadas por ensaios de Phage-ELISA. Um anticorpo recombinante irrelevante e o fago selvagem foram utilizados como controles experimentais. Apesar de vários clones apresentarem elevada reatividade ao FabC4 (absorbância acima do fago selvagem), apenas cinco foram selecionados, considerando o parâmetro baseado na absorbância acima de 0,2 para o FabC4 e inferior a 0,1 para o FabIR (Figura 4). Essa estratégia permitiu a identificação de fagos com elevada afinidade ao FabC4.
Figura 4: Triagem dos fagos selecionados por Phage Display e identificação dos reativos ao anticorpo recombinante FabC4. Em (A) são apresentadas as afinidades dos clones ao alvo FabC4 e em (B) ao Fab irrelevante (FabIR). As barras brancas representam os fagos que obedeceram ao parâmetro de absorbância acima de 0,2 para o FabC4 e inferior a 0,1 para o FabIR.
4.2 PERFIL DIAGNÓSTICO DOS FAGOS SELECIONADOS
Para investigar a sensibilidade desses fagos a IgGs circulantes de pacientes com CM, DBM e CO, testes imunoenzimáticos foram conduzidos em duas etapas
37 (Figura 5). Primeiramente, foi utilizado três pools de soros constituídos por 10 amostras de cada grupo para uma avaliação preliminar dos cinco clones escolhidos (Figura 5A). As reatividades dos fagotopos em soros agrupados diferenciaram significativamente o CM do grupo DBM em três dos cinco clones testados. O fago A7 foi mais reativo ao soro de CM apenas quando comparado ao das pacientes CO (P<0,001).
Figura 5: Imunorreatividade dos fagos selecionados a imunoglobulina G de amostras de pacientes com câncer de mama (CM), doença benigna da mama (DBM) e mulheres saudáveis (CO). A triagem inicial contra o pool de soros foi realizada para selecionar fagos capazes de discriminar CM dos outros grupos (A). Em um segundo momento, soros de 50 mulheres de cada grupo foram avaliados individualmente. Os clones A5 (B), A7 (C), C4 (D) e D6 (E) diferenciaram CM e CO. As absorbâncias foram normalizadas com o fago M13 selvagem sem peptídeo exibido e o teste U de Mann-Whitney foi utilizado para comparação entre grupos. Os valores medianos de cada grupo são apresentados pelas linhas horizontais. ** p <0,01; *** p <0,0001.
38 Em um segundo momento, os fagos A5, A7, C4 e D6 foram conduzidos a ensaios de ELISA com um número maior de pacientes (50 de cada grupo). Todos os valores foram normalizados com a absorbância obtida para o fago selvagem. Os resultados demonstraram uma seleção por afinidade bem-sucedida de quatro mimotopos capazes de reconhecer, significativamente, IgGs presentes no soro de pacientes com CM.
O clone A5 apresentou valores médios de absorbância relativa de 0,031 para amostras de tumor mamário, 0,020 para DBM e 0,023 para amostras CO (Figura 5B). Considerando o fago A7 (Figura 5C), para o CM a absorbância relativa média foi de 0,034. Além disso, sua reatividade foi menor a soro de pacientes com DBM (0,011) e CO (0,008). Observou-se que os valores de absorbância foram 3,10 e 4,25 vezes maiores no tumor, quando comparados às dos demais grupos (DBM e CO, respectivamente).
O clone C4 (Figura 5D) apresentou a maior média de absorbância relativa para as lesões malignas (CM=0,067, DBM=0,036 e CO=0,038). Finalmente, o fago D6 (Figura 5E) demonstrou o perfil de absorbância de 0,032, 0,017 e 0,013 para CM, DBM e CO, respectivamente. Para nenhum dos clones foi verificada diferenças estatisticamente significantes entre pacientes DBM e CO.
A curva ROC foi então construída para predizer o valor global de cada fago como ferramenta diagnóstica. A área sob a curva (AUC) foi calculada, assim como a sensibilidade, a especificidade e a razão de verossimilhança (Tabela 2). Como no ensaio de ELISA, os quatro clones apresentaram comportamento semelhante com AUC acima de 0,70, exceto o fago C4 quando seus dados para DBM foram comparados aos CO.
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Tabela 2: Curva ROC para os fagos selecionados por Phage Display contra o FabC4 recombinante.
Fago A5 Fago A7 Fago C4 Fago D6
CM x DBM CM x CO CM x DBM CM x CO CM x DBM CM x CO CM x DBM CM x CO AUC 0.702 0.756 0.767 0.805 0.706 0.683 0.71 0.74 Valor- p 0.00052 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0004 0.0016 0.00030 <0.0001 Cut-off 0.043 0.016 0.01 0.006 0.025 0.025 0.03 0.008 Sensibilidade 38% 40% 50% 52% 48% 44% 42% 40% Especificidade 82% 90% 82% 90% 82% 82% 80% 94% Verossimilhança 2.11 1.80 1.57 1.88 1.58 1.46 2.10 1.57
AUC: Àrea sob a curva; CM: Câncer de Mama; DBM: Doença benígna da mama; CO: mulheres saudáveis.
O clone A7 se destacou pelo conjunto de valores: AUC=0.767 (P=0.01), sensibilidade de 50% e especificidade de 82%, comparando CM com DBM e AUC=0.805 (P=0.01), sensibilidade de 52% e especificidade de 90%, comparando CM e CO. Já o clone A5 apresentou uma baixa sensibilidade ao se diferenciar pacientes malignos dos diagnosticados com doença benigna.
Portanto, os quatro fagos selecionados exibiram um perfil de reatividade semelhante. Avaliamos, então, a correlação entre as absorbâncias para o grupo CM, com o objetivo de demonstrar o sinergismo no comportamento desses clones. Análises de correlação linear corroboraram nossa hipótese (Figura 6). Verificamos uma correlação positiva significante em todas as análises (p<0,05). Para cada uma das duplas de clones: A5xA7 (R= 0,5917, p= 0.000228), A5xC4 (R= 0,734, p= 7,7e-07), A5xD6 (R= 0,806, p= 8,841e-09), C4xA7 (R= 0,554, p= 0,000127), D6xA7 (R= 0,61, p= 0,000127) e D6xC4 (R= 0,71, p= 2,62e-06).
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Figura 6: Análise das correlações entre os resultados de ELISAs para os clones A5, A7, D6 e C4 em amostras de pacientes com câncer de mama. Todos os fagos analisados apresentaram correlação positiva e foram validados pelo teste t com nível de significância de 5% (P<0,05).
4.3 ESPECIFICIDADE DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS
Fragmentos de ssDNA circular dos quatro clones validados foram extraídos, sequenciados e traduzidos pelo programa ExPASy. Foram obtidas sequências distintas: A5-LTPLTSPGTLLR, A7-RYLPTFDMVSRT, C4-VMPAAKYSLRVL e D6-VTPCSSFSSFLP, indicando que esses motivos foram positivamente selecionados durante o processo de biopanning. As análises no banco de dados SAROTUP confirmou a não redundância dessas sequencias.
Uma vez que se objetivou mapear o epítopo do FabC4, os peptídeos foram então quimicamente sintetizados (GenScript) e avaliados quanto à sua capacidade de se ligarem ao fragmento de anticorpo por ELISA (Figura 7). Todos reagiram ao FabC4. O peptídeo pC4 apresentou a maior absorbância quando comparado aos demais (p<0,05 para todas as comparações), seguido pelo pD6 (também p<0,05 para todas as comparações).
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Figura 7: Reatividade dos peptídeos sintéticos ao FabC4. Peptídeos C4 e D6 apresentaram maiores valores de absorbâncias, significantes em relação ao demais. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,0001.
Os quatro peptídeos foram então testados quanto à sua capacidade diagnóstica contra o soro de 150 pacientes (50 de cada grupo de estudo). Apenas o peptídeo pD6 apresentou reatividade diferencial entre as amostras (Figura 8).
Figura 8: Especificidade do peptídeo pD6 a soro de pacientes com câncer de mama (CM), doença benigna da mama (DBM) e mulheres saudáveis (CO). O peptídeo foi capaz de diferenciar os três grupos de estudo. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,0001.
42 A curva ROC foi significativa para CM x DBM (AUC= 0,68) e CM x CO (AUC = 0,78) com sensibilidades de 88,10% e 42,2% e especificidades de 86,0% e 51,1%, respectivamente.
4.4 COMPORTAMENTO PROTEICO EM CELULAS DE CÂNCER DE MAMA
Ensaios celulares foram conduzidos a fim de avaliar a capacidade do anticorpo FabC4 de se ligar aos alvos ANXA2 e CK10, já previamente descritos (ARAUJO et al., 2014) (Figura 9). Em um primeiro momento, foi avaliado o comportamento dessas proteínas nas linhagens MCF7 e MDA-MB-231 (Figura 9A-B). A ANXA2 foi encontrada, predominantemente, no citoplasma das células MCF7. Essa marcação se mostrou menos intensa do que em MDA-MB-231 (Figura 9A-B).
Identificada no citoplasma, a marcação para a CK10 também foi diferente entre as duas linhagens, mostrando-se mais intensa na MDA-MB-231. Nestas células, a proteína também foi visualizada no núcleo. Interessantemente, nesse modelo celular, as duas proteínas co-localizaram no citoplasma (Figura 9A-seta), comportamento ainda não descrito em tumores mamários.
A marcação para o FabC4 foi citoplasmática e também mais intensa na linhagem MDA-MB-231, seguindo o perfil de seus alvos (Figura 9B-C). A co-localização com a ANXA2 (Figura 9B-seta) e CK10 (Figura 9C-seta) confirmam a capacidade desse anticorpo recombinante em reconhecer essas proteínas.
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Figura 9: Marcação da Anexina A2 (ANXA2), Citoqueratina 10 (CK10) e FabC4 nas linhagens celulares de câncer de mama MCF-7 e MDA-MB-321.A localização imunofluorescente da ANXA2 nas células foi observada com o anticorpo anti-ANXA2 (marcado com FITC em A e PE em B); a citoqueratina 10 com o anti-CK10 (PE) e o FabC4 foi localizado com coloração por marcação com anti-HA (FITC). Os núcleos foram contra-corados com TO-PRO-3 (azul). As co-localizações das proteínas estão indicadas pelas setas. Imagens mescladas em roxo indicam a presença de CK10 no núcleo das células MDA-MB-231(A e C).
44 4.5 DOCKING MOLECULAR
O FabC4 foi modelado in silico de acordo com sequencia linear sequenciada apresentado na Tabela 3. Foi possível sequenciar com sucesso as três CDRs assim como as suas porções constantes para posterior modelagem molecular.
Tabela 3: Sequência do anticorpo FabC4
Ensaios de docking foram conduzidos a fim de caracterizar, in silico, os epítopos do FabC4. Para melhor elucidar as interações e em função das correlações observadas nos ensaios de Phage-ELISA, os peptídeos (pA5, pA7, pC4 e pD6) foram modelados de maneira individual e em combinações.
Os peptídeos modelados pelo software PEPFOLD 2.0, bem como o FabC4, modelado pelo RAPTORX, apresentaram dados de estabilidade ranqueados conforme Anexo I. O primeiro programa forneceu 100 modelos mais prováveis para cada um dos quatro peptídeos e suas combinações. O melhor resultado individual foi submetido como input no formato .pdb, juntamente com a estrutura tridimensional modelada do FabC4, na ferramenta online HPEPDOCK. Este forneceu o docking entre o FabC4 e cada um dos peptídeos formulados. O software gerou outros 100 modelos de interações FabC4-Peptídeos e suas combinações, os quais foram ranqueados e avaliados individualmente pelo software Fast Interaction
REfinement in molecular DOCKing (FIREDOCK).Os melhore encontram-se
representados na Figura 10. Nesta é possível visualizar a interação dos melhores modelos de dinâmica molecular entre o FabC4 e cada uma das estruturas peptídicas. Destacam-se aqueles que possuíram o melhor score e valor médio para o desvio dos átomos, ou seja, simulações in silico que obtiveram melhores condições de existência, coerência físico-espacial e maior estabilidade interativa.
45 Nesse sentido, os peptídeos pA7 e pC4 se mostraram preferencialmente mais prováveis a interagirem com o FabC4 e, portanto, elegíveis para as análises seguintes.
Figura 10: Imagem esquemática das interações entre o FabC4 com os peptídeos selecionados pA5, pA7, pC4 e pD6 individuais e combinados. Em (A) os modelos mais prováveis para o docking entre o FabC4 e os peptídeos individuais e combinados. Em (B) o ranking com as interações de maior score refinados pelo FIREDOCK.
