Micotoxinas
• O termo micotoxinas abrange uma diversificada série de compostos, originários de diferentes precursores e vias metabólicas, reunidos segundo o grau e tipos de toxicidade ao homem a aos animais superiores. • Micotoxicose, é o envenenamento produzido por
micotoxinas.
• A produção de micotoxinas depende do crescimento
fúngico, portanto pode ocorrer em qualquer época
do crescimento, colheita, ou estocagem do alimento.
• Contudo, o crescimento do fungo e a presença de
toxinas não são sinônimos.
• Por outro lado as micotoxinas podem permanecer
no alimento mesmo após a destruição dos fungos
que as produziram.
• Os gêneros dos fungos mais comumente associados
com toxinas que ocorrem, naturalmente, são
Aspergillus, Penicillium e Fusarium.
Natureza Química das Micotoxinas
• Compreendem uma grande variedade de estruturas
químicas de baixo peso molecular, agrupadas de acordo
com o grau e tipo de toxicidade ao homem e animais.
• Algumas são relativamente simples, comparadas com
toxinas bacterianas.
• A grande variação na natureza química das micotoxinas
significa que são necessários numerosos métodos de
extração das toxinas dos alimentos, dificultando
também o seu controle.
• Os produtos que podem veicular micotoxinas
para o homem ou animais são os seguintes:
1)
produtos agrícolas
: cereais, sementes,
oleaginosas, frutos, vegetais;
2)
rações industrializadas;
3)
produtos de origem animal
: leite e derivados,
carnes, embutidos;
4)
queijos curados por fungos
;
Formação das Micotoxinas
• Os fungos que produzem micotoxinas dividem-se
em dois grupos:
- Os que atacam antes da colheita (fungos de
campo, Ex. Fusarium graminearium, Aspergillus
Condições favoráveis para a produção de
micotoxinas
• 1º. Umidade- a ausência de água disponível no alimento evita o crescimento de fungos; por isso, deve-se evitar situações em que alimentos sejam armazenados em condições de elevada umidade.
• 2º. PH-os fungos crescem numa faixa de pH que varia de 2 a 8. As aflatoxinas possuem crescimento ótimo na faixa de pH de 5 a 7. • 3º. Composição química do alimento- em geral, alimentos com alto teor de carboidratos são mais favoráveis a altas produções de aflatoxina do que oleaginosas, com exceção do amendoim ou alimentos com alto teor de proteína.
• 4º. Potencial redox- Os fungos são energicamente aeróbicos. Condições de atmosfera reduzida de oxigênio retardam o crescimento de fungos e podem chegar a inibir completamente o seu desenvolvimento.
• 5º. Temperatura- A temperatura ótima para o crescimento do fungo é a mesma para a produção máxima de sua toxina. Em geral, a temperatura ótima é de 20 a 30ºC, podendo-se considerar a temperatura mínima de 3 a 7ºC. Se durante o armazenamento de produtos agrícolas, a temperatura for baixa, os fungos psicrófilos (que se desenvolvem à baixas temperaturas) poderão crescer, e com isso elevar a temperatura em
determinados pontos, oferecendo condições propícias para uma contaminação secundária.
• 6º. Interação microbiana- fungos toxigênicos raramente ocorrem sozinhos em alimentos naturais; eles coexistem com outros fungos e algumas bactérias.
Tipos de micotoxinas
• Aflatoxinas
: São as micotoxinas mais estudadas, devido
a sua ação hepatocarcinogênica e altamente toxigênica.
• Primeiro Isolamento: Foi a partir do Aspergillus flavus
em 1961 por Sargeant et. al.
• Fungos Produtores de Aflatoxinas
Inicialmente, o Aspergillus flavus foi o único fungo
responsabilizado pela produção de aflatoxina.
• Uma série de aflatoxinas são produzidas por
fungos, destacando–se B1, B2 e G1 e G2.
• A aflatoxina B1 é a mais tóxica das
aflatoxinas, causando uma variedade de
efeitos adversos e, em alguns casos podem
ser letais, em diferentes espécies animais e
humanos.
• Foi considerada pelo IARC(1993) como
pertencente à classe 1, composto
carcinógeno para humanos.
• O fígado é o principal órgão atingido após
uma ingestão aguda.
• As aflatoxinas M1 e M2 são metabólitos
hidroxilados das aflatoxinas B1 e B2 e
podem estar presentes no leite e produtos
derivados obtidos de animais que ingeriram
ração contaminada com estas aflatoxinas.
Posteriormente, descobriu-se que outros fungos também produzem tais compostos, dentre os quais: temos
Aspergillus parasiticus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus citrinum, Aspergillus effusus, Aspergillus ruber, Aspergillus ochraceus, Aspergillus wentii, Aspergillus ostianum, Aspergillus fumigatus e Aspergillus frenesii. Do gênero Penicillium, temos o Penicillium puberulum, Penicillium citrinum, Penicillium variable e Penicillium frequentans. E ainda Rhizopus sp.
O Aspergillus parasiticus, que predomina nos países tropicais, é considerado um dos mais ativos produtores, produzindo principalmente as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, enquanto o
Aspergillus flavus produz B1 e G1.
Sintomas
• O efeito da Aflatoxina é acumulativo e
depende da dose e frequência da ingestão da
mesma.
• Efeitos no homem: Imunossupressão,
síndrome de Reye (torna mais susceptível à
hepatite B), câncer primário no fígado,
hemorragias e morte.
O amendoim e a Aflatoxina
• A ocorrência das aflatoxinas é maior no amendoim
porque é o produto preferido pelo fungo e, também,
porque muitas vezes há demora e chuvas no período
de secagem. Entretanto, sua maior incidência se dá
quando o amendoim é batido, ensacado e armazenado
com umidade elevada e quando reumedece depois de
estar seco.
Ácido Fusárico
• O ácido fusárico é considerado o metabólito secundário tóxico mais importante produzido pelo fungo Fusarium oxysporum. No Japão foi isolado como sendo um produto metabólico do
Fusarium heterosporum Ness que infectava plantas, e que foi
posteriormente identificado como Fusarium moniliforme Sheld. • Fungos produtores: Os fungos produtores de ácido fusárico
foram divididos em 3 classes, em função dos níveis de síntese desta toxina: baixos produtores 1 a 100 g/g; produtores moderados de 100 a 500 g/g; e altos produtores, acima de 500 g/g de peso seco do grão de onde foram isolados.
Ácido fusárico
• registrou-se a produção de ácido fusárico por 78 estirpes de
Fusarium moniliforme, F. crookwellense, F. subglutinans, F. sambucinum, Fusarium nygamai. Fusarium semifectum, Cephalosporium spp, Fusarium nygamai.
Alimentos susceptíveis
Este fungo ocorre como saprófita ou parasita não específico em gramíneas, incluindo milho, arroz, trigo, sorgo e cevada.
Ácido Penicílico
• O ácido penicílico foi isolado a partir de milho infectado com Penicillium puberulum. Atualmente, sabe-se que o mesmo também É produzido por outros membros do genero Penicillium e Aspergillus sendo uma toxina termogênica tendo como principais sintomas envenenamento, os tremores e as convulsões. • Fungos produtores: Aspergillus melleus, Aspergillus
Ácido Penicílico
• Alimentos susceptíveis: Trigo, farinha, pão, farinha de milho, milho, milho pipoca, feijão, soja, sorgo, cevada, tortas de carne, pó de cacau, queijo, salame, linguiça, maturados, presunto, curados, carne mofada, doces refrigerados e congelados, alimentos mofados de supermercados e alimentos estocados em casa refrigerados ou não.
• Animais sensíveis: Animais em geral, principalmente os que se alimentam de ração de milho e afins, e os homens. • Sintomas: Carcinogênico, citotóxico, hepatotóxico, dilata
coronárias e artérias pulmonares acarretando tremores, convulsões, salivação excessiva. Porém é considerado um potente agente antimicrobiano.
Alcalóides de Ergot
• A primeira menção sobre alcalóides de ergot é datada de 600 a.C., referindo-se a uma perigosa excrescência encontrada em espigas. Em 400 a.C. alguns registros referem-se a uma grama mortífera que causava aborto. Foi observado que a epidemia de ergotismo ocorria após períodos de fome, onde as pessoas, presumivelmente, consumiam colheitas recentes de grãos contaminados contendo escleródios tóxicos de ergot produzidos em primaveras úmidas e verões quentes com chuvas.
Os alcaloides de Ergot são produzidos por fungos do gênero:
Claviceps spp.
Alcalóides de Ergot
• Fungos produtores: Claviceps spp, Claviceps purpura,
Claviceps paspali.
• Alimentos susceptíveis: Pastagens e gramíneas em geral,
centeio, trigo, azevem, milho, aveias, e outros cereais, pão de centeio e derivados afins.
• Animais sensiveis: Bovinos, e animais de pastagem e os
homens.
• Sintomas: Afeta o sistema nervoso central (vomito, diarréia, ataxia, tremores e convulsões, gangrena e morte) provocando também constrição das arteríolas ou esclerotia e a lesões do endotélio capilar, levando à necrose gangrenosa das extremidades.
• Nos bovinos os sintomas que provoca consistem em sintomatologia nervosa, sendo a hipersensibilidade aos ruídos e aos movimentos a característica dominante.
FUMONISINAS
• A ocorrência das fumonisinas em alimentos principalmente em milho tem sido relacionada às doenças muitas delas fatais em animais. A toxidez mais dramática ocorre em cavalos e outros equinos, causando a LEM (leuco-encefalomalácia.
• Em humanos, as fumonisinas têm causado câncer de esôfago e fígado.
Esta toxina é produzida pelas cepas de Fusarium moliniforme, organismo constantemente associado aos grãos de milho. É consenso que as fumonisinas mais tóxicas são as denominadas B1, B2 e B3, produzidas por Fusarium
moniliforme Sheldon, Fusarium proliferatum (Matsushima)
Nuremberg e Fusarium subglutinans.
Ocratoxina
Esta toxina é um metabólito do Aspergillus ochraceus,
Penicillium viridicatum, P. verrucosum.
As ocratoxinas são classificadas em 3 categorias: A, B e
C.
A ocratoxina A é a mais tóxica. Sendo uma importante
neurotoxina.
Esta toxina em sua ação contaminadora passa para o
sangue tanto em animais e humanos, acumulando-se em
diversos órgãos (rim, cérebro, e cerebelo).
A ocratoxina A, produz uma inibição também na síntese
de proteína e DNA.
• Ocratoxina é uma potente micotoxina
nefrotóxica que pode causar câncer em
animais de laboratório e em suínos.
Esta toxina tem sido usada no controle do
crescimento bacteriano de
E. coli, Streptococcus agalactiae,
staphylococcus aureus, Yersinia
enterocolitica, Salmonella infantis,
Lactobacillus plantarum e L. casei.
Ocratoxina
• Fungos produtores: Aspergillus ochraceus, Aspergillus alutaceus, Aspergillus alliaceuse e Penicillium viridicatum.
• Alimentos susceptíveis: Cereais e outros alimentos, como feijão, soja, sorgo, trigo, café, cevada, cacau, frutas secas e derivados de origem animal como ovos, leite, derivados de trigo: farinha, pão, derivados de milho e milho, amendoim, pecã, tortas de carne, pó de cacau, queijo, salame, linguiça, maturada, presunto, curados, carne mofada, pimenta do reino, pimenta vermelha, doce refrigerados e congelados alimentos estocados em casa refrigerados ou não.
Patulina
• É uma micotoxina com atividade carcinogênica. • Esta toxina é produzida principalmente pelos fungos
Penicillium expansum, Aspergillus clavatus e Byssochlamys nívea. O Penicillium expansum, fungo
parasita facultativo que ataca frutas previamente danificadas. Em suco de maçã foi detectado até 150000 g/ Kg em matéria deteriorada.
• A patulina é encontrada com frequência em frutas como maçã, pêra, cidra e em seus sucos. Registra-se também a ocorrência da toxina em pão embolorado e silagem. • A patulina é um agente mutagênico e possuindo efeitos
tóxicos sobre o trato gastrointestinal e sistemas nervoso central e imunológico, em ratos. Assim como, inibe a proliferação de células fetais de pulmão em humanos.
Patulina
• Sintomas: Foi detectado carcinogenicidade por injeção subcutânea em ratos. Além disso, administração oral da patulina produz irritação estomacal, náuseas e vômitos Porém não há dado toxicológico ou epidemiológico publicado indicando se ingestões de patulina são nocivas ou não ao ser humano.
• Os principais sintomas são ação carcinogênica causando edema, focos hemorrágicos, hipersensibilidade e paralisia dos membros posteriores.
• Rações contendo patulina provocaram distúrbios no sistema nervoso bovinos.
Técnicas para a determinação de
Toxinas
• Quadro 1 – Tamanho da Amostra
Amostragem Preparo de Amostra
Lote Amostra Sub-amostra Amostra para Análise
20 ton 20 kg 1 kg 50 g
Técnicas para a determinação de
Toxinas
• Os parâmetros que devem orientar o tamanho da amostra ou seu peso dependem do:
• (1) Objetivo do estudo (pesquisa ou rotina) • (2) Tamanho do lote
• (3) Natureza ou tipo do alimento • (4) Custo
Técnicas para a determinação de
Toxinas
•
Quando o material for granulado, é requerido determinado número de partículas para que a amostra se torne representativa.• O tamanho da amostra deve aumentar com o tamanho da partícula, p.ex., trigo < milho < amendoim < castanha do Pará.
Técnicas para a determinação de
Toxinas
• Determinação – Métodos Cromatográficos
• Estes métodos são de grande utilidade dentre as técnicas analíticas para a determinação de micotoxinas.
• Inúmeras variações das técnicas cromatográficas estão descritas na literatura, envolvendo uma larga gama de equipamentos e procedimentos, que variam em grau de complexidade e aplicabilidade.
• TLC (Cromatografia em camada delgada)
• Este método continua a ser usado extensivamente na rotina da determinação preliminar das micotoxinas. TLC de alta resolução (HPTLC) com desenvolvimento bidirecional é um acurado e preciso procedimento para a determinação de aflatoxinas. A combinação de TLC com a espectrometria de massa (MS) é outra ferramenta útil a avaliação das micotoxinas.
Técnicas para determinação de Toxinas
• HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência)• A cromatografia líquida de alta eficiência é o mais novo e mais importante método de determinação e quantificação de substâncias. É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sob alta pressão. • Há cinco tipos diferentes de fases estacionárias, que implicam em cinco
mecanismos diferentes de realizar a cromatografia em HPLC, que são os seguintes:
• cromatografia líquido-sólido ou por adsorção, • cromatografia líquido-líquido ou por partição, • cromatografia líquida com fase ligada,
• cromatografia por exclusão e cromatografia por troca iônica. • A escolha adequada da técnica cromatográfica para a separação dos
componentes de uma determinada amostra deve-se considerar as propriedades tais como massa molecular, solubilidade, estrutura etc.
Técnicas de determinação de
Toxinas
• GC (Cromatografia gasosa)
• A separação por cromatografia gasosa baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre uma fase estacionária, podendo ser sólida ou líquida, e uma fase móvel que é gasosa. • A cromatografia gasosa é uma técnica com um poder de resolução
excelente, tornando possível, muitas vezes a análise de dezenas de substâncias de uma mesma amostra. Apresenta um elevado grau de sensibilidade, chegando a detectar cerca de 10-12g.
• Pequenas amostras do material a ser pesquisado, torna-se suficiente para o emprego desta técnica.
• A cromatografia gasosa é uma técnica quantitativa excelente, sendo possível à obtenção de resultados quantitativos em concentrações que variam de picogramas a miligramas.
Técnicas de determinação de
Toxinas
• A técnica de desenvolvimento mais usada em cromatografia gasosa é a eluição. Uma corrente de gás passa continuamente através da coluna e quando a amostra vaporizada é introduzida rapidamente nesta corrente de gás, ela é arrastada através da coluna. As substâncias presentes na amostra, depois de separadas, chegam ao detector, que gera um sinal para o registrador.
Técnicas de determinação de
Toxinas
• Durante análise, a temperatura da coluna pode permanecer constante, denominado-se cromatografia gasosa isotérmica, ou sofrer uma variação linear ou não, chamada então de cromatografia gasosa com temperatura programada. A programação de temperatura é significativamente importante já que melhora a separação diminuindo o tempo de análise. Sendo de extrema utilidade quando a amostra é composta de substâncias com uma grande diferença em seus pontos de ebulição.
Técnicas para a determinação de
Toxinas
• A cromatografia gasosa é uma das técnicas mais utilizadas na identificação e quantificação de diversos produtos e substâncias. Tem sido uma ferramenta nas áreas de análise ambiental, nas indústrias químicas e farmacêuticas, na análise e controle de alimentos, na medicina, na toxicologia e na indústria petroquímica dentre outros.
