Estudos em heterocromatina de Melipona scutellaris

)))))

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)

UNIVERSIDADE

FEDERAL

DE

UBERLÃNDIA

Ú

INSTITUTO

DE

GENÉTICA

E

BIOQUÍMICA

CURSO DE

CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESTUDOS

EM HETEROCROMATINA

DE

Melipona scutellaris

Rosilene

Rosa Tavares

APROVADA PELA BANCA EXAMINADORA EM

x_i/Lilª”,

Nota TW _'"ç

Prof/7 DrªAgá" _Mapia,

?Tetti

;" ;

Oríenffadpra

“"'ÉÍÇ' [" ' ' ª

Prof

Drª Sa Ara Morelli

k/

*

,

'

1

]

— Co--orie tadora

” “LW/'uww

MSQRosanade Cássia Oliveira

Co-orientadora

SDÉÇDICMTÓQM

vago

autor

da

WQQQ.

ª

meus pais:

Joao

ÇTavams

dos

Santos

()

Joanissa

R

Tavares,

aos

meus irmãos

e

irmãs.

3153

minhas

orientadoras:

©rª

_(dna

Maria

SBonotti,

MSC.

Rosana de

Íassia

Oliveira,

©?“

Sandra

Morelli

e

a

todos aqueles, os

quais

Qeus

_permite-me

o

convívio

”Se

tiveres

de

atmvessar

a

_água,

estarei

contigo.

8

os rios

não

te

submergirão;

se

caminhams

pelo

fogo,

não

te

_queimarás,

(9

a

chama não

te

consumirá.

?orque

és

precioso

a

meus

olhos,

_porque

eu

te

aprecio

e te

(uno,

pennuto

reinos

por

ti,

eim'ego

nações

em

troca.

de

ti.”

ngmmcmvmºos

]lo

Sen/tor da

(VW)/?!, peío encontro glorioso de

duas

ce'íuías que se

uniram

e

muítipíicaram

Elf/iões de vezes

nas entranlias

do

seio em _que

fui

formada,

até

o

dia

em que

fizestes-me conhecera

[uz

do mundo, o colorido

da

vida, o som

da

tua

voz. Oõngado

Senhor

por

reinar

em

cada

átomo que

constitui as

céíuías que

formam

o

meu corpo, “a

cada

fração

de segundos que

formam

os

dias da

min/ia

existência,

peías

infinitas

dádivas,

por

todos os momentos de aíegrias, e tamõém os difíceis,

pois

são nestes que mais aprendemos,

e _que

muitas

vezes sentimos mais

a

tua

presença.

?eías

pessoas

maraviíhosas

_{que coíocastes} em min/ia

vida

ao longo

da

jornada

de

minha formação

acadêmica.

E

ao término de mais uma

etapa,

gostaria

defazer—te

aguns

agradecimentos indispensáveis:

]Í

(Profª (Drª

jlna

Maria

(Bonetti pela

orientação segura, confiança, incentivo, peío carinho, respeito, compreensão, amizade, pelos 'puxões de oreína';

quando

necessários, que

aíiás

foram

muitos,

peía sua

viõração

quando

oõtinliamos Bons

resultados na

pesquisa, peío exemplo de

profissionaí

e

ser

Humano.

ji

(Profª (Drª

Sandra Moreííi

peías

preciosas sugestões, escíarecimentos,

paciência

e amizade.

][

MSC.

Rosana

de

Cássia Oíiveira, peía sua

amizade,

compreensão, incentivo, dedicação, respeito, esclarecimentos, disponiõiíidade e sugestões vaíiosissimas.

]lo

(Prof. (Dr.

Warwicâqãstevam

Kerr,

peío exemplo.

à dona Lígia Kerr

e

Çiída, peía atenção

e carinho.

Ã

meus

pais

]oão

Tavares dos

Santos

e

joanissa

Rosa

Tavares, à

quem devo

a

vida, peío

amore pela

forma

que

educaram-me.

jªtos meus irmãos e irmãs:

José,

Maria

de

jesus,

Ena,

Maria

(Rosa,

(Ekonita,

joaquim,

£[iane

e

]oão

Tiílio,

porvocês

serem o

jlos

meus

cunhados

(as),

soõrinlios (as)

e

afiíãados

(as).

Ã

todos os cofegas

da

_Qiofogia.

Ãos

amigos de

Laboratórios: Rosana,

Maria

jll'ice,

Car[os,

Colette, 'Ffávia, Cristiano, (Patrícia,

Eduardo,

Renato,

]uíiano,

Çis[ene,

gustavo, Vânia,

(Vanessa,

Marcoíino,

Cicero, jªll'cione, Claudio,

Cristina(s),

]uíianaÇs),

Katiere,

Wey,

jªlna Tanta,

Viviane,

(Frederico,

Ternanda,

_{Cíáudio, Soraya, Luciene,}

Mac/iam,

jlíessandra,

]lna

Cristina, ?aõío, ]amií, Trâncis

e

Wânia.

Ãos

amigos(as), que não mediram esforços

para

colaõorar na

realização

de

_{algumas etapas}

deste

traõaílio:

_(Bonati,,

Rosana,

Eiiomar, Maria

jºlíice,

Caríos, Coíetto,

(Vânia,

gisíene, Tíávia,

Qºatrícia e

Luciene Sarmento.

Ãos

secretários do

_{IWÇÉÉ, Maríene, Cida}

e _Gerson.

Ás

secretárias

do _Curso de _Ciências

_{$ioíógicas: Siríene}

e

ªíeíena.

jlos

técnicosde

[aôoratória' jlnsel'mo,

Cãico e (Bel'cliior.

,ºlos professores:

Oswaldo,

Cecília,

Tãomás

e

demais

professores

e

funcionários

dessa

Instituição.

Ã

coordenadora do _Curso de _Ciências (Bioíógicas,

,ªlna Maria

Coeíão

Carvaííio.

jlo

Chefe do (Departamento de

genética

e (Bioquímica, (Prqfº

(Dr.

Maícon

ji.

M. (Brandeâurgo.

jªtos amigos e irmãos em Cristo: (Pe.

Osmar

$ezutte,

(Pe.

(Eugênio, QDia'cono

Ternando

Leite

e

família.

jlos

meus

amados

irmãos do

gO'U-Stº Inácio

de

Loyoía

(Çrupo de Oração

Universitário)

e demais

ÇOUS

de

Uôeríândia.

(Peíos _{nossos momentos} maravil'liosos, _{nossas (Partiíãas,} fVigííias,

Qincontros, rViagens,

Serenatas,

Intercessão, Wúcíeo, etc..

Não

vou

registrar aqui

o nome de

cada

um,

pais

corro o risco de

não lembrar

o nome de todos, assim,

saiõam

que o mais

importante

e' _que

estamos todos no coração de (Deus e

£[e

no coração de

cada

um de

nós.

_jamais

_{esquecereique:}

”Cristãos não

se despedem, encontram—se

RESUMO

Com o objetivo de estudar a heterocromatina de abelhas sem ferrão

Melipona scutellaris foram realizadas análises _que enfocaram,

especialmente os cromossomos metafásicos de larva defecante e _pupas

dessa espécie.

Foi _{possível desenvolver uma metodologia eíiciente, para a obtenção}

de metáfases em vários estágios do desenvolvimento ontogenético, desde

larva defecante até _pupa de olho _preto e _{corpo pigmentado, com a}

utilização de Cloreto de Cobalto (CoClz) definido esse composto como

agente indutorde metáfasesem abelhas.

Foi _{possível, também, verificar que} a cromatina de Mscutellarz's,

assim como a de humanos e outros animais, é _{sensível ao composto} 5—

azacitidina, respondendo com descondesação dacromatina.

Os resultados obtidos com esses estudos em heterocromatina de

Melipona scutellarz's _{abrem perspectivas para} o desenvolvimentode outras

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO_... 01

1.1

_{Considerações}

sobre

abelhas...

01

1.2

_{Organização cromossômica...}

02

1.3

S-Azaoitidina...

08

1.4

Cloreto

de

Cobalto

(CoClz)

_...

09

II. OBJETIVOS_... 10

111.MATERIALE MÉTODOS_... 11

III.1.

Material biológico...

11

111.2.

Material

de

Laboratório...

16

III.2.1

_{Tratamento com S-Azacitidina...}

17

[112.2

Tratamento com Cloreto

de

Cobalto

_(CoClz)... 17

lll.2.3 Preparação

de

_{lâmina para Análise}

de

Cromossomos Metafásicos...

18

IV. RESULTADOS ... 20

IV.] Efeitos da S-azacitidina em cromossomos metafásicos

de

Melipona

scutellaris

_...

20

IV.2

Efeitos

do

tratamento

de

larvas

e

_pupas

de

Melipona

scutellaris

com Cloreto

de

Cobalto

(CoClz)

_...

22

V. DISCUSSÃO ... 25

VI. CONCLUSOES_... 29

TABELA

DE

ABREVIATURAS

E

FÓRMULAS

DNA... Ácido desoxirribonucléico RNA... Ácido ribonucléico

LD_{... Larva defecante}

POB... Pupade olho branco

POR... Pupa de olho _rosa

POM... Pupade olho _marrom

POP... Pupade olho _preto

POPP... Pupade olho _{preto piguimentada}

HPRH... hipoxantinaguanína fosforibosiltransferase

TK_... Thymidine Kinase

mC_{... Metílcitidina}

CoClz_{... Cloreto}de Cobalto

KCl... Cloretode Cálcio

CZZHZSNOÓ, 0,005%... Colchicina

Na3C6H5O7ZHZO, 0,95%... Citratode Sódio

C8H12N405_{... 4-amino-l-B-D-ribofuranosyl-5-triazin-2}

)

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ESTUDOS EM l-[ETEROCROMATINADE

.rlle/iponascale/laris-I.

INTRODUÇÃO

I.1

_{Considerações sobre abelhas}

As _{abelhas podem ser agrupadas} em duas famílias: Megachilidae e

Apidae. Dentre os Apídeos são encontradas três subfamílias: _Xylocopinae,

Nomadinae e Apinae. Os Apinae estão divididos em 19 _{tribos, abrangendo}

indivíduos corbiculados, com concavidade na tíbia das patas posteriores,

adaptadas ao transporte de pólen e resina e os não-corbiculados. A tribo

Meliponini faz parte dos _{corbiculados (ALSINA}& MICHENER, 1993).

As abelhas são holometábola, isto e', _{passam por metamorfose} completa,

desde larva verrniforrne, _{passando por estágio} de _{pupa, até} o adulto voador,

alimentam-se de néctar, pólen e mel e vivem socialmente em colônia, que

compreende muitos indivíduos de dois sexos (macho e fêmea) e duas castas

(rainhae operária) (STORER, 1991).

A Ordem Hymenoptera apresenta características que a tornam um

interessante _{grupo para variados estudos} de biologia, visto que se destaca pela

grande diversidadede _padrões de vida, nichose evoluçãode formas sociais.

O sistema de determinação de sexo nos Apoidea e do _{tipo haplodiploide,}

onde os machos se desenvolvem a partir de óvulos não fecundados e as fêmeas,

a partir de óvulos _{fecundados por partenogênese arrenótoca (DZIERZON,}

1845).

Os _{Hymenoptera da} sub-família _{Meliponinae estão distribuídos} ao longo

da América Central, América do Sul, Áiiica, Austrália, Indonésia, dos quais,

mais de 300 _espécies

_já

foram descritas. As abelhas são _{parte integrante} do

ecossistema e a sua principal função na natureza e' _a polinização das flores _e

3

))))))))

)

₎

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DEA[elipona scale/Idris

são _{responsáveis,} conforme o ecossistema, por 40 a 90% da polinização das

árvores nativas (KERR et al., 1996).

Melz'pona scutellarz's, popularmente conhecida como Uruçu do Nordeste,

foi _{domesticada pelos Potiguara,} Kiriri, Xucuru, Pataxo, Paiaku, Tupirucuba,

Caete, Aymore, entre _{outros povos} do Nordeste, cujas técnicasde _manejoforam,

imediatamente, passadas aos lavradores portugueses que muito apreciavam seu

mel. _{A destruição} das florestas nordestinas diminuiu muito o número de

meliponicultores porém, recentemente, devido à habilidade dessas abelhas em

coletar pólen, e assim realizarem a polinização, elas vêm sendo novamente

cultivadas. KERR et al., (1996) recomendam que os meliponários contenham,

no minimo, 44 colméias, para evitar a perda das colônias pela redução do

número de alelos sexuais, o _que leva à produção de machos diplóides que são

mortos pelas operárias. Em _{pouco tempo,} o número de indivíduos da colônia

abaixae ela se extingue.

KERR (1948) determinou 2n=l8 cromossomos para fêmea de _Melipona

rufzíventris e Melipona marginata, sendo esse o primeiro registro citogenético

para esse gênero.

1.2

_{Organização cromossômica}

O comando central da diferenciação e da morfogênese está no genoma,

ele e' _capaz de comandar a síntese de todas as macromoléculas _{que um}

organismo necessita ao longo de sua vida, pelo menos em tese. Nas células

somáticas de _eucariotos, o DNA está associado a proteínas básicas (historias)

formando um complexo núcleo-protéico, ao qual se associam também as

proteínas ácidas (proteinas nucleares não-histonas) e o chamado RNA nuclear

)

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ESTUDOS EM HETEROCROMATlNA DE :Ue/ipona .tcufel/aris

células _{quiescentes (não-divisão)} uma estrutura enovelada, conhecida como

cromatina. A estrutura da cromatina (Figura 1) é semelhante a um colar de

pérolas, sendo o tio do colar a cadeia duplex do DNA e cada "pérola" um

agregado de _{quatro tipos} de histonas. A cromatina de diferentes células é

ª);

classificada em duas categorias: cromatina condensada, que corresponde

heterocromatina, que se cora fortemente em _presença de corantes específicos e

cromatina estendida _{ou "frouxa", que} corresponde à eucromatina. _{A proporção}

de histonas nestas duas _frações é _{a mesma, porém a proporção} de _proteínas

cromossomaisnão-histônicas, na forma "iiouxa",e' bem maior (MOTTA, 1980).

Durante a divisão _{celular ocorrem}algumas alterações nucleares, das quais

a mais _importantee', sem dúvida, a condensação da cromatina. Na intérfase e no

início da prófase, a cromatina está na forma de eucromatinae durante a divisão

celular, a cromatina vai, aos poucos, assumindo a forma de heterocromatina,

localizando-se na vizinhança dos _{centrômeros, nas extremidades} dos _braços

cromossômicos (telomérica) ou em outras posições ao longo do cromossomo

(BURNS& _BOTTINO, 1989).

Em nivel molecular, a constituição da heterocromatina e' caracterizada

como uma associação de _{sequências altamente repetitivas} de _códigos

não-prote'icos (PARDUE & _{HENNIG, 1990) que se cora fortemente}com Tripsinae

Giemsa (GELEHRTER & COLLINS, 1992). Citogeneticamente, a

heterocromatina pode ser detectada pela técnica de Banda-C (SUMNER, 1990),

a qual mostra que sua distribuição e conteúdo nos cromossomos varia entre os

diferentes organismos, tendo por isso um importante papel na diferenciação do

cariótipo.

Em algumas espécies, e _{possível reconhecer, por técnicas} simples de

coloração, em quais regiões dos _cromossomos se situam os blocos

heterocromáticos, uma vez que, na prófase, esses blocos são mais

ESTUDOS EM HETEROCROMAT'INADE_r'líelipmm scale/faria“

regiões de síntese _{tardia, reveladas pela} timidina tritiada, demonstrando,

portanto, que a heterocromatinadifere da eucromatina por se replicar ao final da

fase S. Os _{primeiros citogeneticistas observaram que, após a telófase, quando os}

cromossomos voltavam ao estado descondensado, alguns cromossomos ou

segmentos cromossômicos mantinham-se condensados, e apareciam no núcleo

interfásico, como blocos mais corados, os cromocentros. BROWN, 1966 _(apud

GUERRA, 1988) fez uma revisão do que se conhecia sobre heterocromatina e

concluiu _{haver pelo menos} dois _{tipos distintos, que ele chamou de}

heterocromatina constitutiva e heterocromatina facultativa. A constitutiva se

caracteriza pelas propriedades de: a) _{permanecer condensada durante todo} o

ciclo celulare em todas as células do individuo, b) geralmente, concentrar-seem

blocos no cromossomo, os quais se distribuem, preferenciahnente, nas regiões

próximas ou terminais dos cromossomos e, também, em torno da constrição

secundária; c) _aparecer em ambos os homólogos, na mesma posição e com o

mesmo tamanho; d) não conter genes estruturais ou só muito excepcionalmente,

apresentar regiões codificantes; e) ser o local onde se situa, se não todo ao

menos a maior parte, o DNA satélite, embora a heterocromatina constitutivanão

seja formada exclusivamentede DNA satélite.

A heterocromatina facultativa e', _por definição, um tipo de cromatina_que,

as _vezes, se comporta como heterocromatina (mantém-se condensada durante _a

intérfase, apresenta replicação tardia e ausência de expressão gênica) as _vezes,

como uma típica eucromatina. Além _{disso, distingue-se da constitutiva pelas}

seguintes características: a) _aparece em _apenas um dos homólogos de cada par

cromossômico; b) envolve todo o cromossomo e não apenas blocos; c) não

possui nenhuma particularidade quanto à composição do DNA. Na verdade, a

composição dessa heterocromatina é _típica de _eucromatina, não sendo rica em

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Ale/ipana scale/Iuris

A heterocromatina facultativa pode conter, também, genes que estão

permanentemente inativos em algumas linhagens de células mas não,

necessariamente, em outras. Esse e' _o caso do cromossomo X de mamífero. No

macho, o cromossomo X, é _{primariamente,} eucromático. Na fêmea, um X é,

aleatoriamente, inativado, tornando-se heterocromático. Portanto, parece _{que a}

atividade transcricional de um cromossomointeiro _{pode estar relacionado, a} sua

organização estrutural e nesse caso, uma intensa e permanente condensação do

material genético resultaria em inatividade genética (BURNS & BOTTINO,

1989).

O DNA de células de eucariotos, como

já

foi dito, está complexado corn

proteínas, especialmente historias, formando a cromatina. Os resíduos de

aminoácidos da porção N terminal de cada historia (20-60 resíduos) são ricos em

lisina e estendem-se para a superHcie do nucleossomo (estrutura formada pelo

empacotamentode 146 _pares de bases do DNA em um “core” de 8 _histonas) e

podem ser modificados por metilação, fosforilação ou pela adição de ubiquitina.

A metilação e acetilação das histonas estão associadas a regulação da expressão

gênica durante a intérfase. Genes em regiões do DNA _que estão condensados na

forma de _{heterocromatina,}são inacessíveis à RNA polimerase e outras proteínas

requeridas para transcrição (LODISH et al., 2000, NELSON& COX, 2000).

Em estudo de conteúdo e composição da heterocromatina em oito

espécies de abelhas do gênero Melz'pona, entre elas, M. scutellarz's, ROCHA e

POMPOLO (1998) confirmaram o número cromossômico para esta espécie,

2n=l8 (para fêmeas) e n=9 (para machos) e observaram que diferentes espécies

de _{Melipona apresentam uma ampla variação} no conteúdo heterocromático.

Segundo essas autoras, em M. _{scutellaris, a heterocromatina ocupa quase toda a}

extensão de todos os cromossomos, com a eucromatina limitada às

))

)

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)

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ESTUDOSEM HETEROCROMATINA DE Ale/ipona scutel/aris

Uma das _{principais características da heterocromatina} é _{a ausência} de

atividade gênica. O fato de que esse tipo de cromatina se encontra

constantemente condensado, e, que o estado condensado se encontra comumente

associado ao bloqueio de _{transcrição, sugere que mesmo que ocorram genes na}

heterocromatina estes estarão permanentemente bloqueados. Estudos tem

demonstrado a relação entre condensação cromatím'ca e atividade gênica

))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))I

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Alelipona scutellarís

CmosspmoMúsico "; _, ,,,.- ; rj ';f ';:J');_{Jr:-ff'yªffgr«} ; ”,“, )tifIr-Llí ₁ rvlf;;,_ —" ## Cmaunacondensada (nº (heterou'omatina), [' ?OO-nm _»,.“ jj; , )

Seção extendida da cromatina mostrando odomínioem“loop"

Fibra de cromatinadeat:-nm de à _ª:

pé

nucleossomosempacota—dos fª

(ªªi

Como oDNA_{seempacota no cromossomo metafásico}

Figura 1: Ultra estrutura _{do cromossomo metafásico (adaptado de PURVES et}

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ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE)))-[elipona .S'cufel/aris

1.3

_{S-Azacitidina}

A 5-azacitidina, de _{composição química CgH12N405 e nomenclatura}

4-amino-1-[5-D-ribofuranosyl-5-triazin—2(lH)-one, e' um _análogo da base

nitrogenada Citosina, que faz parte dos ácidos nucléicos DNA (ácido

desoxirribonucléico)e RNA (ácido ribonucléico).Em vertebrados, o resíduo de

Citosina e', frequentemente, modificado por _metilação. Em eucariotos, estima-se

que 5% das Citosinas sejam metiladas a 5 _{metilcidina, nas duas fitas do DNA}

(GRIFFITHS et al., 2000). O análogo 5-azacitidinaque pode ocupar, no DNA, 0

lugar da _{Citosina, não} sofre _metilação. O estado de _metilação do _{DNA implica}

em alteração na sua atividade de _{transcrição para produção de mRNA. Sabe-se,}

ainda,que a metilaçãodo DNA reprime a migração de Transposons (LODISH et

al., 2000).

Em _{humanos, a 5-azacitidina} e' _capaz de induzir _a descondensação

cromossômica quando aplicado em culturas de linfócitos, de acordo com a dose

e _tempo de tratamento (SCHMID et al., 1984). Esses autores usaram a

5-azacitidina para induzir _{descondensação} da heterocromatina constitutiva dos

cromossomos 1,9,15,16 e Y humanos.

O tratamento de culturas de células de mamíferos com azacitidina evita a

condensação de _{regiões cromossômicas} definidas. Estudos tem mostrado _que

esse compostoinibe _{condensação} de _{cromatina somentequando usado durante a}

fase S, _por se incorporar ao DNA, durante a replicação (VIEGAS-PÉQUIGNOT

& _DUTRILLAUX, 1976 _apud VIEGAS-PÉQUIGNOT & _DUTRILLAUX,

1981).

HAAF et al., (1993) trataram com 5-azacitidina o cromossomo X de

replicação tardia de fêmea de mamífero e demonstraram a eficiênciae utilidade

desse composto para análisee estudode heterocromatina.

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ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DEHeli/90170scurel/aris

Clones de células híbridas de _camundongose humanos, com cromossomo

X normalmenteinativado, _{deficientes para a enzima HPRT (hipoxantina}guanina

fosforibosiltransferase) foram _{tratados com 5-azacitidina e testados para}

reativação e expressão de genes ligados ao X. A frequência de clones com

enzima ativa foi maior _{do que no Controle não tratado (MOHANDAS et al.,}

1981). Esses autores obtiveram evidências de _{submetilação na cromatina ativa e}

conseguiram reativar a expressão de genes do cromossomo X. O nível de

expressão gênica e o _{grau de} metilação são _{inversamente proporcionais. A}

5-azacitidina, que não pode ser metilada após sua entrada no _{DNA, promove a}

expressão de genes em tecidos onde normalmente eles não se _expressam

(GRIFFTHS et al., 2000).

1.4

_Cloreto

de

Cobalto

(CoClz)

Em humanos, grandes quantidades de Cloreto de Cobalto (CoClz)

reprimem a produção de _{eritrócitos, provoca ruborização cutânea, dermatites,}

náuseae vômitos (BUDARI etal., 1989).

FARAH (1983) analisou células somáticas e germinativas de machos de

Mesocricetus _{auratus (hamster)} de 6 _a 16 _semanas de vida, tratados com

solução de Cloreto de _{Cobalto, com a} linalidade de _{investigar a} influência da

persistência nuclear na não-disjunção cromossômica. Ocorreu aumento

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ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DEArrlelipona scale/Idris

II. OBJETIVOS

6 Obtenção de metáfases nos diferentes estágios de _pupas de _rainhas,

operárias e machos de Melipona scutellaris, _que receberam ou não

tratamentocom Cloretode Cobalto(CoC12)

'

Verificarse o análogo de _{base 5-azacitidina tem ação na descondensação}

dos _cromossomosde _Melipona scutellarz's e _comparar os resultados com

)

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ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Melipona mute/Idris

111.

MATERIAL

_E

MÉTODOS

111.1.

_Material

_biológico

O _{material biológico utilizado} foi _{a abelha sem ferrão Melipona}

scutellarz's, de ambos os sexos (macho e fêmea) e castas (rainha e operária)

provenientes da Bahia (Catu, Murici e Alagoinhas)e mantidas no

Meliponário-Uberlândia. Esse localiza-se na Fazenda Água Limpa/UFU,que dista 30 Km de

Uberlândia-MG (latidudesul de l8º 55' 23" e longitude oeste de Greenwichde

48º 17' _{19") no Triângulo Mineiro, com}

Htogeograiia de Cerrado.

Foram utilizados _{gânglios cerebrais (Figura 2) de larva defecante (LD),}

pupa de olho branco (POB), _pupa de olho _{rosa (POR), pupa} de olho _marrom

(POM), pupa de olho _{preto (POP) e pupa} de olho _{preto pigmentada (POPP)} de

machos, rainhase operáriasde Melz'pona scutellarz's (Figura 3 _).

O dimorfismo sexual, _{na fase} de _{pupa, pode ser evidenciado por} meio do

gonóstilo (Figura _{4) que se localiza na região posterior-ventraldo abdômen. Os}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Melipona scutellaris

)

)

)))))))

))))))))))))))))))))))))))))))))))))

ESTUDOS EM HETEROCROMATTNADE Adeliponascutellaris

Figura3: _Fases do _{desenvolvimentoontogenético}de _{Melipona scutellaris:}

A: Larva 1 (1), Larva2 (2), Larva3 (3)

B: Larva Defecante

C: _Pupade Olho _Branco

D: _Pupade Olho Rosa

E: _Pupade Olho Marrom _(Fls. 14)

F: _Pupade Olho Preto (Fls. 14)

)

))))))'

))))))))))))))))))))))))))))))))

))))))

)

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Melipona scutellaris

ESTUDOSEM _{HETEROCROMATINA DE,vlfelipo/rascale/Ian.?}

III.2. Material

de

_Laboratório

.

QOQQÓQQQQÓQQQQQQQQÓQÓÓ

Solução de colchicina 0,1%

Solução de citratode sódio 1%

Fixador I: _{1,5ml de ácido acético glacial: 1,5ml de etanol: 2ml de água}

duplamente destilada(HZO dd)

FixadorII: 2ml de ácido acéticoglacial: 2ml de etanol

Fixador Ill: ácido acéticoglacial 100%

Metanol Glicerina

Água duplamente destilada Giemsa

Cloretode Cobalto(4mg/ml)

5-Azacitidina1%

Lâminas Estiletes

Papelde _{fotografia Kodadrome RC, Contraste 83}

Filme de _{fotografia ASA}400 e 125

Câmara escura Cartelade _{comprimidosvazia} Conta-gotas Pinça Placasde Petri Papelde filtro Estereomicroscópio Microscópio óptico Estufade Cultura à 32ºC Freezer

ESTUDOSEM _{HETEROCROMATINA DE Me/iporm scale/[aria}

III.2.1

_Tratamento

_com

_{S-Azacitidina}

Pupas de olho _{branco (POB) de operárias foram submetidas à aplicação}

tópica de 1ul da solução de 5-azacitidina à _{1% (0,125g de 5-azacitidina}

: 12,5

ml de HgO _{deionizada) na região dorsal. Após 2 horas, procedeu-se à extração}

do glânglio _{cerebral. A preparação das lâminas foi feita conforme itens III.2.3.}

Em um dos experimentos foram _{aplicados 4u1 da solução em tuna pupa de}

operáriae umade rainha.

No _grupo controle aplicou—se

lul

_{de água, e os indivíduos foram}

iguahnente manipulados.

III.2.2

Tratamento

com

Cloreto

de

Cobalto

_(CoClz)

Para obtenção de células _{metafásicas, em fases posteriores à Larva}

Defecante e Pupa de Olho Branco _{e, também, para melhorar a qualidade e}

quantidade de _{metáfases para análises citológicas, introduzimos, nesse trabalho,}

uma modificação da técnica descrita por CUCCHI & _BARUFFALDI, 1990

(apud MARGARIDO, _{1995) que} utilizaram cloreto de _{cobalto (CoClg) para}

aumentar a frequênciade metáfasesem peixes.

Foram aplicados, topicamente, 4ul de _{solução aquosa de cloreto de}

cobalto _{(4mgzlml) na região dorsal de larvas defecantes (LD), pupa de olho}

branco (POB), _pupa de olho _{rosa (POR), pupa de olho marrom (POM), pupa de}

olho _{preto (POP) e pupa de olho preto pigmentado (POPP) de M. scutellaris.}

Após aplicação do COClz, foram _{testados vários intervalos de tempo, de 5 horas}

até 7 _{dias, para verificar o mais eficiente para obtenção do resultado final, a}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Ale/mona scale/[arm

com umidade relativa de 85%, _{mantida por} meio de _{solução saturada} de KCl

(ASTM, 1951). A preparação das lâminas foifeitaconforme itens 111.2.3.

No _{grupo controle aplicou-se 4ul} de água, e os indivíduos foram

igualmente manipulados.

III.2.3

_Preparação

de

lâmina

_para

Análise

de

Cromossomos

Metafásicos

As lâminas _para análise _{citogenética foram preparadas segundo a técnica}

de _{IMAI et al., (1988).}

Faz-se a dissecação do glânglio cefálico em solução hipotônica de

colchicinasobre lâmina _pré lavada.

Com auxílio de _{pinças e estiletes remove-se o excesso de gordura e}

tecidos adjacentes e, em seguida, transfere-se o gânglio cefálico _para um

recipiente individual, _{contendo solução fresca} de colchicina - citrato,

(C22H25N06, _0,005%,-Na3C6H5O7 ZHZO, _0,95%) onde o material permanece por

2 _{horas, à temperaturaambiente e em ausênciade luz.}

Cada gânglio hipotonizado e' transferido para outra lâmina limpa, em

inclinaçãode mais ou _{menos 20º paraque a solução hipotônica seja}drenada.

O FixadorI e' colocado sobre _{o material, na lâmina inclinada. Em seguida,}

retira-se o excesso de líquido _{com um papel} filtro e _{repete-se a operação.}

Dissocia-se o _{tecido, com} auxílio de estiletes. _{Adiciona-se sobre a lâmina, duas}

gotas do Fixador II _{antes que o Fixador} I _{evapore. Retira-se o excesso do}

FixadorII com um papelfiltro e adiciona-seduas _gotasdo FixadorIII.

Secar à temperatura ambiente _{por um período} de 24 horas. _{Corar com}

solução de Giemsa e Tampão Sorensen(Nªg HPO4, 0,06 M; KHz PO4, 0,06 M;

)

)

)

)

)

))))

)

)

)

)

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Meli'ponascale/Iam

Lava-se em água corrente e analisa-se em microscópio óptico (NIKON,

modelo MICROPHOT-FXA).

Para retirar, macerar e Hxar os gânglios foi utilizado um

estereomicroscópio (WILD, modelo 308700).

As lâminas _{foram fotografadas comfilme Asa 125 e copiadas em papel}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE .fl/e/iponasome/laws

IV.

_RESULTADOS

IV.1

_{Efeitos da 5-azacitidina}

_em

_{cromossomos metafásicos}

_de

Melipana scutellaris

As _pupas de olho branco e _{operárias tratadas com 5-azacitidina por} duas

horas foram submetidas a análise citológica e _{apresentaram característica}

descondensação cromossômica, em comparação com as lâminas Controle, de

pupas que não receberam tratamento,como mostra a Figura5.

O efeito de _{descondensação} foi o _{mesmo quando} se aplicou l ul e 4ul da

solução de 5-azacitidina. O efeito em _pupas de _{operárias e} de _{rainhas, também}

foi o mesmo, embora tenha sido _{analisada uma única pupa} de _rainha, o _que não

é suficiente _{para uma conclusão} definitiva. O _{experimento deve ser repetido. A}

descondensação ocorreuao longo de todo cromossomo.

Não foram feitos _{testes para verificar se os efeitos da S-azacitidina são}

dependentesounão do _tempode _{exposição dessa espécie adroga.}

Foram realizados poucos experimentos com esse composto pelo fato dele

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Melipona scutellan's

Figura5: Metáfases de _{Melipona scutellaris: pupa} de _operárianão tratada (A) e

ESTUDOS EM HETEROCROMATINADE.=lÍeÍ1p01mscale/Iuris

IV.2

Efeitos

do

_tratamento

de

larvas

e

_pupas

de

_Melipona

scutellaris

com

Cloreto

de

Cobalto

(CoClz)

Nesse trabalho utilizou-se 4ul de _solução de Cloreto de _{Cobalto aplicados}

topicamente nas larvas e _{pupas. CUCCHI} & _BARUFFALDI, 1990 _(apud

MARGARIDO, 1995) recomendaram o uso de 0,5ml desta solução _{para cada}

100g de _peso de animal. Em larvas _{e pupas} de

_M

_{scutellaris, cujo peso médio} é

de 120 _{mg, deveria ser utilizado 0,75 ul dessa solução para manter a proporção}

recomendada, caso a administração fosse intraperitoneal. Em abelhas a injeção

fica _{prejudicada e por isso optamos pela aplicação tópica, que produz resultados}

satisfatórios.

O número de _{metáfases obtidas a partir do tratamento de larvas}

defecantes, pupas de olho _{branco, rosa, marrom, preto e pupa de olho preto}

pigmentada _{em Melz'pona scutellarz's com solução}de Cloretode Cobalto quando

comparado com metáfases obtidas _{de indivíduos que não receberam tratamento}

com esse composto, aumentou (Figura 6) embora não tenham sido feitos _testes

de significância. O _tempo de _{tratamento que se mostrou mais adequado para a}

obtenção dos resultados aqui apresentados foi o de 24 horas. Estes resultados

confirmam os dados

_já

_{descritos para peixes obtidos por CUCCHI &}

BARUFFALDI, 1990 _{(opcít MARGARIDO, 1995). É importante relatar que,}

mesmo sem o tratamento com Cloreto de Cobalto (indivíduos _Controle) foram

obtidas metáfases, desde o estágio de Larva Defecante até _Pupa de Olho Preto.

A grande variação que se verificou foi com relação ao número de metáfases

obtidas.

As fotos das _Figura 6 _{foram apresentadas em diferentes aumentos porque}

as lâminas foram processadas em momentos distintos e fotografadas. Não

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE.:Ugliponusente!/(íris

porque o material das lâminas havia sido _{perdido devido ao seu breve tempo de}

Vida.

A umidade relativa de 85% _{obtida por}meio de _{solução saturada} de KCl à

320C de _{temperatura mostrou—se eficiente para manutenção das pupas}

(experimentais e _controle) em condições saudáveis, assim como

já

havia sido

verificada para essa e outras espécies de _{Melipona e} de _{uso rotineiro no}

Laboratóriode _{Genética/UFU.}

Nãoforam _{testadas concentrações diferentesde CoClZ.}

As lâminas igualmente _preparadas, de _{machos revelaram n=9}

cromossomos, conforme o descrito por Kerr (1948) _{e coníinnado por Rocha e}

Pompolo (1998). Não foi feito _{tratamento de lâminas de macho com 5}

Azacitidinae CoClZ. O número de_{machos à época do experimento}

))) )))))))))) )))) ))))))))))))) )))))))

)

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Melipona scutellarís

Figura 6: _{Metáfases (setas) de Melipona scutellarís que não receberam}

tratamento (A) e _que receberam tratamento com Cloreto _{de Cobalto (B). Em A,}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE glfelípona same/laws

V.

DISCUSSÃO

A expressão _{de genes} é _{regulada por meio de vários processos que afetam}

as taxas pelas quais os produtos gênicos são sintetizados _{ou degradados, sendo}

que a taxa de _{transcrição} de diferentes _{genes determina o funcionamento e as}

propriedades das células e tecidos. A regulação da expressão gênica_{é a base da}

diferenciação celular e do _{funcionamento equilibrado dos diferentes tipos}

celulares _{em um organismo pluricelular. A atividade de transcrição em cada}

célula depende do _{estado da cromatina e esta pode se apresentar, em um}

organismo Vivo, _{sob duas formas, eucromatinae heterocromatina. Por definição,}

a eucromatina constitui-se_{em regiões} de atividade de _{transcrição, enquanto que}

na heterocromatina, o DNA está inativo _{transcricionalmente. A cromatina ativa}

em _{transcrição} e' estruturalmente distinta da cromatina inativa

e sabe-se _que o

DNA de _{cromatina inativa frequentemente, apresenta resíduo de citidina}

modiiicado a metilcitidina(mC) _{por metilação, via enzima Dammetilase.}

Quando, em um organismo, a transcrição _{de um gene} não é _{necessária, a}

metilação do _nucleossomo e' _{aumentada, tornando a cromatina}

transcricionalmente_{inativa, como partedo processo de silenciamento gênico.}

O _papel da _metilação do DNA e íhncionamento_{gênico tem sido estudados}

por vários laboratórios buscando, especialmente, gerar uma estrutura

cromossômica _{que permita transcrições de regiões silenciosas para estudos de}

citodiferenciação e _programasde _{ativação de estruturas cromatínicasem regiões}

de heterocromatina.

Células inativas de _{camundongos com Herpes simplex, com o gene TK}

(Thymidin _{Kinase) inativo, foram ativadas transcricionalmente com tratamento}

de 3 _{uM de 5-azacitidina (CLOUGH et al., 1982).}

Cromossomos X, de _{replicação tardia em fêmea de mamíferos, foram}

ESTUDOSEM _{HETEROCROMATINA DE.flleliponn _s'cufellrzris}

grande eficiência e utilidade para estudos _{de heterocromatina (HAAF et al.,}

1993)

MOHANDAS et al., _{(1981) conseguiram reativar a expressão de genes do}

cromossomo X em mamíferos, com aplicação de _{5-azacitidina, que ao entrar no}

DNA no lugar de uma citosina e não _{aceitando metilação fez com que os genes}

daquela região passassem a se _expressar.

Em genes de retrovírus _{de aves, a estrutura} da _{cromatina pode ser}

moditicada pela exposição das células à 5—azacitidina, _{que produz hipometilação}

e ativação transcricionaldo vírus _{ev-l, (GROUDINE et al., 1981).}

Em _{cromossomos humanos, a 5-azacitidina induziu nítida descondensação}

da cromatina (SCHMID et al., 1984).

O que _{despertou nosso interesse para} análise _{cromossômica de Melipona}

scutellarz's utilizando _{5-azacitidina foi, primariamente, o fato de abelhas M.}

scutellaris apresentarem alto _grau de _{condensação cromatinica, tendo sido}

classificadas por ROCHA e POMPOLO (1998) _{em grupo de alto conteúdo de}

heterocromatina, com _{cromatina condensada ocupando quase toda extensão do}

cromossomo,com a eucromatina, limitada às _{extremidades.}

Nossos resultados demonstraram _{(Figura 5) que, assim como em}

cromossomos humanos e de _{outros organismos, a 5-azacitidina} e' eficiente na

descondensaçãode _{cromossomosde abelhas.}

Não e' _{possível definir, pela metodologia utilizada}

a quantidade de

Citosinas substituídas pela 5-azacitidina, mas e' possível _{afirmar, pela}

observação dos _{resultados, que as regiões heterocromáticas contém DNA}

altamente metilado, visto _{que como resultado da submetilação ocorreu}

descondensação da _{heterocromatina. Esse resultado indica, ainda, a presença de}

regiões com bases GC ao longo de toda heterocromatina. Como não foram

detectadas, nessa análise, blocos _{que não descondensaram, isso pode ser}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE illelipona

scale/laris-A heterocromatinade _{abelha apresenta a característicade ser sensível à}

5-azacitidina, assim como _{a heterocromatina humana e de outros organismos.}

Nosso interesse _{em testar a droga 5-azacitidina veio, também, do fato de a}

5-azacitidina provocar submetilação e com _{isso promover a transcrição do}

segmento de DNA onde a base Citosina é _{substituída pela 5-azacitidina. As}

consequências disso na expressão gênica em abelhas são _{desconhecidas mas, se}

é _{possível promover a descondensação da heterocromatina por meio de}

tratamento com 5-azacitidina, como ficou _{demonstrado nesse trabalho, algumas}

hipóteses podem ser levantadas a partir dos _{conceitos inerentes à expressão}

gênicae resultados apresentados na _literatura.

Em _{Hymenoptera, de modo geral, o número de metáfases que se obtém}

em _{boas preparações citológicas restringe-se a material nas fases de larva,}

prepupa (POMPOLO& _{TARAHASHI, 1990, COSTA et al., 1993, GOMES er}

al., 1995; POMPOLO & CAMPOS 1995; CAXEIRO & POMPOLO 1998 e

1999; _{MARCOLINO et al., 1998; ALVES, et al., 1999; BRITO-RIBON et al.,}

199% 199%, COSTA et al., 1999) e _pupa de olho _{branco (COSTA et al., 1992),}

não tendo sido _{descrito, ate' o momento, uma metodologia eficiente}

para

obtenção de boas metáfases _{em fases posteriores de desenvolvimento dessa}

ordem.

Em função disso, decidimos _{testar uma nova metodologia para indução de}

metáfases em _{abelhas, adaptando uma técnica que CUCCHI & BARUFFALDI}

1990 _{(apud MARGARIDO, 1995) utilizaram para peixes.}

₀

_{resultado foi}

positivo,conforme _{demonstrado pelas fotosde lâminas (Figura 6).}

A análise _{realizada por FARAH (1983) com células de hamster mostrou}

que o Cloreto de Cobalto é _{uma ferramenta útil para estudos cromossômicos,}

mostrando—se _{superior ao tioacetamida e S-Huorodeoxiuridina, testados por}

outros _{pesquisadores, para tal análise. Os resultados dessa autora mostraram}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE Me/ipmm scale/Ian.?

Em _{nossas análisesnão se observou alteraçãodo número de}

cromossomos

em função do_{tratamentoa que foram submetidosas larvas e}

pupas.

O _{mecanismo pelo qual o CQC]; intensifica}

ou induz o número de

metáfases, ou seja, _{a razão pela qual o ciclo celular é influenciado ou}

alterado,

não é conhecido. _{Sabe-se que o Cobalto age na transcrição de RNA.}

TRES _et

al., _{(1972) observaram correlação positiva entre a biossíntese}

de RNA

ribossomale a quantidadede cations_{no núcleo. Esses resultadosindicam efeitos}

do CoClz_na atividade _{da RNA polimerase.}

Os _{objetivos atingidos em nossa pesquisa com}

as metodologias testadas e

otimizadas por nós abrem ótimas _{perspectivas para estudos em regulação da}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DEfla/elipom] scmel/arI'S

VI.

CONCLUSÓES

Os _{resultados obtidos a partir de nossa investigação sobre a}

heterocromatina de abelhas _{sem ferrão Melz'pona scutellaris permitiram}

verificar_que:

& Cromossomos de _M. scutellaris _{são sensíveis ao}

composto S-azacitidina,

respondendo com _{nítida descondensação da cromatina. Os resultados obtidos}

com a _{metodologia utilizada para indução de deseondensação, indicam a}

presença de bases GC ao longo da heterocromatina dessas abelhas.

o Cloreto de Cobalto é _{um eficiente agente indutorde metáfasesem abelhasM.}

scutellaris, promovendo o aumento significativo de _{metáfases nos indivíduos}

tratados em relaçãoao Controle;

0 Metáfases foram _{obtidas em pupas, independentemente da utilização do}

CoClg, _{porém em menor número. Preparações adequadas de cromossomos}

metafásicos em _pupas de _{abelhas não haviam sido, até então, relatadas na}

ESTUDOS EM HETEROCROMATINA DE ;Ue/ipona scale/Jari?

VII.

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