Programa de Pós-Graduação Strictu-Sensu em Educação Física
TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO E RESISTIDO ASSOCIADO À ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA POR BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA PREVIAMENTE AO INFARTO DO MIOCÁRDIO EM RATOS: EFEITOS NA
FUNÇÃO CARDÍACA, AUTONÔMICA E PERFIL INFLAMATÓRIO
CATARINA DE ANDRADE BARBOZA
São Paulo – SP
2 CATARINA DE ANDRADE BARBOZA
TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO E RESISTIDO ASSOCIADO À ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA POR BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA PREVIAMENTE AO INFARTO DO MIOCÁRDIO EM RATOS: EFEITOS NA
FUNÇÃO CARDÍACA, AUTONÔMICA E PERFIL INFLAMATÓRIO
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Educação Física, área de concentração: escola, esporte, atividade física e saúde, da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Educação Física.
Orientador: Prof. Dr. Érico Chagas Caperuto Co- Orientador: Prof. Dr. Bruno Rodrigues
São Paulo 2017
3
4 “A maioria não fracassa.
A maioria desiste!”
“Não tente ser uma pessoa só de sucesso. Em vez disso, seja uma pessoa de valor”
Albert Einstein
“O melhor guerreiro não é aquele que sempre vence. E sim aquele que volta para guerra sem medo.”
5 DEDICATÓRIA
Dedico essa tese aos meus pais João (em memória) e Francisca, meus exemplos de vida. Que me mostraram que trabalho, dedicação, honestidade e viagens, nos ensina,
enobrecem, nos realiza e, portanto nos faz feliz!
Obrigada por cada dia, por cada mimo, por cada sonho realizado e por cada momento inesquecível. Tenho certeza, que meu pai, onde estiver, está feliz com a minha
continuidade.
E a minha mãe, eu sendo filha única, temos uma a outra. E como dupla, sempre me apoiou, financiou, incentivou e compreendeu a importância e as dificuldades desse
período. Muito obrigada, Mãe!!!
A minha família, que justamente nesse período do doutorado teve que ser guerreira em superar a dor da perda de pessoas especiais e importantes, como meu primo Xande e
minha avó Iracema.
Ao meu afilhado, o super Arthur, que resgatou em mim a criança que estava adormecida.
6 AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Bruno Rodrigues, meu primeiro orientador, agradeço por seu expertise, uma mente alimentada pelo conhecimento, que reflete em suas produções e suas conquistas profissionais. Obrigada pelo trabalho conjunto desde o mestrado.
Ao Prof. Dr. Érico Chagas Caperuto, agradeço profundamente por ter aceito me orientar no final deste processo, em que seu perfil de encorajar os alunos foi de extrema importância para mim. Graças a sua confiança e seus conselhos rompi barreiras, encarei novos desafios e com isso espero seguir caminhando rumo a novas conquistas. Obrigada pela parceria e pelos desafios que conseguimos transpor e pela conclusão deste ciclo.
Aos amigos do laboratório, Leandro Yanase, Nicole Carrozzi, Luiza Melanie, Juliana Cristina, Gabriel Honorato o meu muito obrigada. Encerro essa tese graças à parceria e o companheirismo que tivemos ao longo dos últimos seis anos, nos quais trabalhamos juntos. E quem convive demais, briga, faz as pazes, chora, se diverte e hoje podemos comemorar juntos. O grupo foi desfeito, mas cada passo dado com este trabalho, eu o fiz por mim e por vocês. Que a minha realização, seja a semente em vocês!
Aos amigos de outros laboratórios, Nathalia Bernardes e Danielle Dias meu sinceros agradecimentos por terem sido as primeiras a me mostrar que na pesquisa científica a parceria faz o trabalho. E que caráter, generosidade e esforços não se mede e nem muda. A Christiane Malfitano, obrigada por me mostrar que competência está acima da política. E que é preferível se juntar ao loucos, do que aos falsos. Jacqueline Machi, o que dizer de alguém que evoluiu e se transformou em referência, em amiga e em parceira nos desafios profissionais?! Obrigada por todos os esforços para me
7 incentivar e viabilizar o intercambio científico que fiz na reta final. E que venham as próximas viagens.
Agradeço imensamente aos colaboradores do Lab. de Hipertensão do InCor, Leandrão, Maikon, Katia Scapini, Paula Cruz, Oscar, Pamela, Dudu, Isabel, Dr. Paulo e em especial a Dra Maria Claudia Irigoyen e Dra Katia de Angelis que foram fundamentais para execução deste trabalho. Muito obrigada pela colaboração e comprometimento.
Ao colaborador e espero que novo parceiro, o farmacêutico Prof. Dr André Fukushima cuja competência e conhecimento foi de extrema valia na facilitação e entendimento do fármaco utilizado neste trabalho. Obrigada pela disponibilidade de sempre e pela enorme contribuição na qualificação.
A Coordenadora do programa de pós graduação, Profa. Dra. Maria Luiza de Jesus Miranda, meu muito obrigada pelo apoio, pelas intervenções e pelas cartas de referência que me possibilitaram experiências enriquecedoras.
A Larissa, que no momento delicado, com sua experiência e realidade latente me incentivou, encorajou, me mostrou que fazer o que gosta, com humildade, bom caráter e dedicação fará a vida ser mais colorida, o que inclui momentos cinzas.
Aos meus amigos espalhados pelo mundo, Juliana Nicolau, Miriam, Leonor, Grupo Brunetti e alunos, que perto ou longe, os que entraram e aos que se foram, muito obrigada por nunca terem me deixado sozinha. Nos momentos mais delicados e nos mais festivos, por WhatsApp ou nos bares, sempre tive vocês ao meu redor.
A FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho, sob número do processo 2014/06669-2.
8 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ... 10 LISTA DE ABREVIATURAS ... 11 RESUMO ... 14 1. INTRODUÇÃO ... 18 1.1. Infarto do Miocárdio ... 19
1.2. Infarto do Miocárdio e Disfunção Autonômica ... 20
1.3. Disfunção Autonômica e Resposta Inflamatória ... 21
1.4. Treinamento Físico Aeróbico e Resistido ... 24
1.5. Estimulação Colinérgica por Brometo de Piridostigmina ... 28
2. OBJETIVOS ... 31 2.1. Geral ... 31 2.2. Específicos ... 31 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 32 3.1. Animais e Grupos ... 32 3.2. Sequência Experimental ... 33 3.3. Procedimentos Experimentais ... 33
3.3.1. Testes de Esforço, Carga Máxima e Treinamento Físico ... 33
3.3.2. Tratamento com Brometo de Piridostigmina ... 34
3.3.3. Infarto do Miocárdio ... 35
3.3.4. Avaliações Ecocardiográficas ... 35
3.3.5. Canulação e Registro da Pressão Arterial (PA) ... 40
3.3.6. Avaliação da Sensibilidade do Barorreflexo ... 41
3.3.7. Tônus Vagal e Tônus Simpático ... 41
3.3.8. Avaliação da Modulação Autonômica ... 41
3.3.9. Atividade de Acetilcolinesterase ... 42 3.3.10. Concentração de Citocinas ... 43 3.3.11. Análise Estatística ... 43 4. RESULTADOS ... 44 4.1 Peso Corporal ... 44 4.2 Capacidade Física ... 45 4.3. Avaliações Ecocardiográficas ... 47 4.3.1. Variáveis Morfométricas ... 47 4.3.2. Função Ventricular ... 51
9
4.6. Concentração de citocinas inflamatórias ... 59
5. DISCUSSÃO ... 72
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 83
10 LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Peso corporal. ... 44
Figura 2. Teste de esforço em esteira rolante. ... 45
Figura 3. Teste de carga máxima ... 46
Figura 4. Área de infarto ... 48
Figura 5. Massa do ventrículo esquerdo. ... 49
Figura 6. Diâmetro final do ventrículo esquerdo em diástole. ... 50
Figura 7. Espessura relativa da parede. ... 51
Figura 8. Fração de ejeção do ventrículo esquerdo. ... 52
Figura 9. Relação entre as ondas e e a ... 53
Figura 10. Índice de desempenho miocárdico ... 54
Figura 11. Tônus simpático (ts), tônus vagal (tv) ... 56
Figura 12. Concentração de IFN-γ – interferon gama no ventrículo esquerdo ... 60
Figura 13. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no ventrículo esquerdo ... 61
Figura 14. Concentração de IL-1β – interleucina 1 beta no ventrículo esquerdo. ... 62
Figura 15. Concentração de TNF-α – fator de necrose tumoral alfa no ventrículo esquerdo ... 63
Figura 16. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no ventrículo esquerdo ... 64
Figura 17. Concentração de IFN-γ – interferon gama no sóleo. ... 65
Figura 18. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no sóleo. ... 66
Figura 19. Concentração de IL-1β – interleucina 1 beta no sóleo. ... 66
Figura 20. Concentração de TNF-α – fator de necrose tumoral alfa no sóleo ... 67
Figura 21. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no sóleo ... 68
Figura 22. Relação il-10/ TNF-α no ventrículo esquerdo (ve) e no sóleo i. ... 69
Figura 23. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no soro. ... 70
11 LISTA DE ABREVIATURAS
C Grupo controle
SI Grupo sedentário + infarto
SPI Grupo Sedentário + PIR + infarto
TAI Grupo Treinado aeróbico + infarto
TAPI Grupo Treinado aeróbico + PIR + infarto
TRI Grupo Treinado resistido + infarto
TRPI Grupo Treinado resistido + PIR + infarto
DCV Doenças cardiovasculares
IM Infarto do miocárdio
VE Ventrículo esquerdo
FC Frequência cardíaca
PA Pressão arterial
PAS Pressão arterial sistólica
PAD Pressão arterial distólica
PAM Pressão arterial média
PIR Brometo de Piridostigmina
12
+dP/dt Derivada de contração
VFC Variabilidade da frequência cardíaca
VAR-IP Variância do intervalo de pulso
AF Alta frequência
BF Baixa frequência
AF/BF Balanço simpáto-vagal
DP-IP Desvio padrão de intervalo de pulso
RMSSD
Raiz quadrada da média dos quadrados das diferenças dos intervalos R-R normais e sucessivos
TF Treinamento físico
SERCA2 Ca²+ ATPase do retículo sarcoplasmático
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VO2máx Consumo máximo de oxigênio
DDVE Diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo
DSVE Diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo
PPDIA Espessura diastólica da parede posterior
MVE Massa do ventrículo esquerdo
13
FE Fração de ejeção
VEC Velocidade de encurtamento circunferencial
Relação E/A Razão da velocidade da onda E e da onda A
TDE Tempo de desaceleração da onda E
TRIV Tempo de relaxamento isivolumétrico
14 RESUMO
No contexto das doenças cardiovasculares (DCV), a alta incidência do infarto do miocárdio (IM) consiste em um enorme problema de saúde pública, cujas complicações, como redução funcional do miocárdio, associado a disfunção autonômica e alterações no sistema imunológico elevam os índices de mortalidade em todo o mundo. Assim, diferentes estratégias terapêuticas tem sido estudadas afim de prevenir e/ou atenuar tais disfunções. Portanto, com intuito de obter redução na morbidade e mortalidade, o treinamento físico (TF), aeróbio e mais recentemente, o resistido, tem sido recomendado na prevenção/manejo das DCV por apresentar benefícios frente a diferentes fatores de risco. Por outro lado, a administração de brometo de piridostigmina (PIR), um inibidor da acetilcolinesterase, tem demonstrado potencial benéfico em diferentes patologias, dentre elas a insuficiência cardíaca, promovendo melhora na função cardíaca e autonômica. Nesse sentido, o objetivo principal do presente estudo foi avaliar os efeitos da estimulação colinérgica prolongada com o PIR, na função ventricular e autonômica, bem como o impacto no perfil inflamatório associado ao TF aeróbico ou resistido prévio ao IM. Para tal, foram utilizados ratos Wistar macho, dividido em (n=9, por grupo): controle (C), sedentário + IM (SI), sedentário + PIR + infarto (SPI), treinamento aeróbio + IM (TAI), treinamento aeróbio + PIR + infarto (TAPI), treinamento resistido + IM (TRI), treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI), submetidos a 60 dias de TF aeróbico ou resistido associados ao tratamento farmacológico com PIR (0,14 mg/ml/dia). Como resultados, houve melhora adicional na capacidade física dos grupos treinados associados com tratamento. A área de IM foi menor nos animais tratados com PIR e de forma semelhante, a fração de ejeção foi aumentada nos grupos tratados com PIR. A sensibilidade barorreflexa também estava melhorada nos grupos treinados e tratados, tendo sido mais responsivo ao treinamento aeróbico. O que também foi observado no
15 tônus vagal, aumentada nos grupos tratados isoladamente. Já no tônus simpático, tanto o tratamento e o TF, isoladamente, quanto a associação, foram eficazes em prevenir o aumento dessa variável. No entanto, uma redução adicional do tônus simpático foi evidenciada nos grupos associação. Assim, tais dados sugerem que o efeito preventivo da estimulação colinérgica com PIR isoladamente foi evidenciado na redução das alterações cardíacas, melhora da função ventricular e das respostas imunológicas. Assim como a associação entre os tipos de TF e o tratamento com PIR se mostrou eficaz em prevenir a redução da capacidade física de acordo com as especificidade do treinamento, e do tônus. Dessa forma, a associação entre tais estratégias terapêuticas apresentam impacto relevante pelos benefícios do treinamento físico aeróbio/resistido na cardioproteção aos efeitos deletérios da isquemia miocárdica.
Palavras-chave: Treinamento físico prévio; Brometo de piridostigmina; Infarto do miocárdio.
16 ABSTRACT
In the context of cardiovascular diseases (CVD), the high incidence of myocardial infarction (MI) is a huge public health problem, whose complications such as functional reduction of the myocardium associated with autonomic dysfunction and alterations in the inflammatory profile raise the mortality worldwide. Thus, different therapeutic strategies have been studied in order to prevent and / or mitigate such dysfunctions. Therefore, in order to obtain a reduction in morbidity and mortality, exercise training (ET), aerobic and, more recently, resistance training, has been recommended in the prevention / management of CVD because it presents benefits against different risk factors. On the other hand, the administration of pyridostigmine bromide (PYR), an acetylcholinesterase inhibitor, has demonstrated beneficial potential in different pathologies, among them heart failure, promoting improvement in cardiac and autonomic function. In this sense, the main goal of the present study was to evaluate the possible effects of prolonged cholinergic stimulation with the PYR, in the ventricular and autonomic function, as well as the impact on the inflammatory profile associated with the aerobic or resistance training prior to MI. Male Wistar rats were divided in (n = 9, per group): control (C), sedentary + MI (SI), sedentary + PYR + infarcted (SPI), aerobic training + infarcted (TAI), aerobic training + PYR+ infarcted (TAPI), resistance +infarcted (TRI), resistance training + PYR + infarcted (TRPI), submitted to 60 days of aerobic or resistance training combined with pharmacological treatment with PYR (0.14 mg / ml / day). As results, there was an additional improvement in the physical capacity of the trained groups associated with treatment. The MI area was smaller in the PYR treated animals and similarly, the ejection fraction was increased in the PYR treated groups. Baroreflex sensitivity was also improved in trained and treated groups, and was
17 more responsive to aerobic training. This was also observed in the vagal tonus, increased in the groups treated alone. In the sympathetic tone, both the treatment and the ET, alone, as well as the combination, were effective in preventing the increase of this variable. However, an additional reduction of sympathetic tone was evidenced in the combined groups. Thus, such data suggest that the preventive effect of cholinergic stimulation with PYR alone was evidenced in the reduction of cardiac alterations and improvement of ventricular function. As well as the combined between ET types and PYR treatment has been shown to be effective in preventing physical capacity reduction according to training specificity and tone. Thus, the combined between such therapeutic strategies has a relevant impact by the benefits of aerobic / resistance training in cardioprotection to the deleterious effects of myocardial ischemia.
18 1. INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causas de morbidade e contribuem significativamente para os custos elevados em saúde pública, sendo uma das principais causas de mortalidade em todo mundo (1). O crescente número de estudos na área da cardiologia tem como metas a identificação, a prevenção e o controle, tanto dos fatores de risco, como dos efeitos secundários associados as DCV que desencadeiam e aumentam a incidência da mortalidade.
Dentre as DCV, o infarto do miocárdio (IM) é uma das mais prevalente e com o maior índice de mortalidade. Nos Estados Unidos estima-se que a cada 44 segundos um indivíduo sofra um IM e, cerca de 49% das mortes por DCV são atribuídas ao evento isquêmico cardíaco (1). No Brasil, segundo a Sociedade Brasileira de Cardiologia (SBC), em 2015 foram registrados 346.896 óbitos por DCV.
De acordo com a necropsia, 95% dos óbitos por IM apresentava no mínimo uma artéria coronariana epicárdica principal com estreitamento luminal grave ou oclusão total com placa aterosclerótica típica . Assim, o desenvolvimento da placa aterosclerótica coronariana pode comprometer o fluxo coronariano, resultando em isquemia miocárdica.
Ao longo dos anos e com a alta prevalência de IM alguns fatores de risco foram identificados e associados a doença arterial coronariana (DAC). Com características modificáveis estão a hipertensão arterial, o tabagismo, dislipidemia, obesidade, diabetes e a inatividade física. (119).
19 1.1. Fisiopatologia do Infarto do Miocárdio
O IM é uma doença isquêmica do coração, que leva a necrose da musculatura miocárdica, devido ao desbalanço entre oferta e demanda, gerando uma deficiência de fluxo sangüíneo e consequentemente a falta de suprimento de oxigênio para o miocárdio (112).
A convergência comum da maioria dos fatores risco, podendo ser a primeira manifestação da doença arterial coronariana (DAC) ou ocorrendo repetidamente em pacientes com a doença estabelecida (2). O IM, em sua grande maioria, resulta de aterosclerose das artérias coronárias, placas que causam o estreitamento luminal da árvore coronariana, geralmente com trombose sobreposta. Ocorre então, agregação plaquetária e depósito de fibrina, posteriormente culminando na formação do trombo agudo evoluindo para o IM (3). Portanto, o IM é um processo dinâmico que não ocorre instantaneamente, mas evolui progressivamente durante algumas horas.
Após a oclusão da coronária, os miócitos supridos por essa artéria perdem a capacidade contrátil podendo apresentar áreas de dissincronismo, discinesia, hipocinesia e acinesia. Por outro lado, o miocárdio não infartado apresenta hipercinesia como resultado de mecanismos compensatórios agudos, como ativação do sistema nervoso simpático e mecanismo de Frank-Starling (2-4). Adicionalmente, o IM inicia um processo de remodelamento ventricular, o qual é caracterizado pela progressiva dilatação do ventrículo esquerdo (VE), rearranjo da estrutura da parede ventricular e aumento da massa muscular remanescente (5). O rearranjo ventricular após a isquemia miocárdica do ventrículo esquerdo passa pela disfunção ventricular em cascata, caracterizada pela aumento da pressão diastólica final, cujo o reflexo é a diminuição da contratilidade na sístole e a redução do debito cardíaco. No entanto, estes mecanismos de compensação
20 possuem uma capacidade limitada de sustentação da função cardíaca e, quando o tecido contrátil remanescente deixa de manter a hemodinâmica em condições de normalidade, o indivíduo evolui para insuficiência cardíaca (IC) (3).
Experimentalmente, a oclusão dos ramos da artéria coronária vem sendo amplamente utilizada pelos pesquisadores no intuito de melhor compreender os efeitos cardíacos, autonômicos e hemodinâmicos do IM (6-8). Nosso grupo vem se dedicando há alguns anos no estudo das alterações induzidas pelo IM individualmente (9,10) ou associado a diferentes fatores de risco, como a hipertensão arterial (11,12), a privação dos hormônios ovarianos (13), a denervação sinoaórtica (14) e o diabetes (15-20). Além disso, nesses trabalhos também testamos diferentes abordagens terapêuticas no manejo das complicações advindas do IM, bem como na mortalidade dos animais estudados. Dentre estas intervenções podemos destacar: o treinamento físico (10,13,19), a terapia com células tronco, mesenquimais e da medula óssea, in situ (12) e endovenosamente (11), bem como a terapia gênica com fator de crescimento vascular derivado do endotélio (VEGF, in situ) (18).
1.2. Infarto do Miocárdio e Disfunção Autonômica
O desequilíbrio autonômico crônico entre simpático e parassimpático constitui um elemento fundamental da fisiopatologia da IC após um evento isquêmico (21-23) e é acompanhado por anormalidades no controle cardiorrespiratório reflexo, ou seja, prejuízo do barorreflexo, maior ativação do ergorreflexo e quimiorreflexo (21,24,25). Nesse sentido, o controle reflexo da circulação comandado pelos pressorreceptores tem sido reconhecido como um importante preditor de risco após evento cardiovascular. O estudo ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) forneceu evidências clínicas do valor prognóstico da sensibilidade do barorreflexo e da variabilidade da frequência cardíaca (VFC) na mortalidade após o IM, independente da
21 fração de ejeção e de arritmias ventriculares (21). Além disso, Kleiger et al. (26), estudando pacientes do - Multicenter Post Myocardial Infarction Program -, encontrou risco relativo de mortalidade cinco vezes maior naqueles pacientes que apresentavam reduzida VFC se comparados aos que apresentavam níveis aumentados dessa variável.
Paralelamente, dados experimentais também apontam para o prejuízo da função autonômica em animais após a oclusão da artéria coronária. De fato, em nosso grupo temos consistentemente evidenciado que, após o IM crônico, os animais apresentam maior disfunção barorreflexa, redução da VFC total, da modulação parassimpática, bem como aumento da modulação simpática em relação aos animais não infartados (9,10,13,14,16,18-20,27).
O significado clínico e prognóstico do aumento da atividade simpática após um evento isquêmico e, consequentemente, na IC já está claramente estabelecido (28), tanto que o bloqueio beta adrenérgico tornou-se um elemento padrão na terapia desses pacientes (29). Por outro lado, a redução do tônus parassimpático, embora já demonstrada a mais de 40 anos (30), tem recebido menos atenção. Reduzido tônus parassimpático, além do prejuízo do barorreflexo e da VFC são indicativos de mau prognóstico em pacientes com IC e após um IM (21,31,32). Dessa forma, intervenções no sentido de detectar, prevenir e/ou atenuar a disfunção autonômica cardiovascular, principalmente associada à redução da atividade vagal, têm sido visto como importantes estratégias no manejo das alterações provocadas pelo IM (21).
1.3. Disfunção Autonômica e Resposta Inflamatória
O processo inflamatório, concomitante a elaboração de citocinas são partes integrantes da resposta a uma lesão tecidual e desempenha um papel particularmente ativo após o IM. As citocinas pró-inflamatórias, tais como o fator de necrose tumoral-alfa
22 (TNF-α), interleucinas-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-10 (IL-10), são liberadas logo após a lesão isquêmica aguda e podem regular a sobrevivência dos miócitos ou apoptose, bem como desencadear uma resposta celular inflamatória adicional (33). Cronicamente, as citocinas podem mediar a reparação e o remodelamento cardíaco, ativando a formação de matriz de metaloproteinases e colágeno, além de regular as integrinas, a angiogênese e a mobilização de células progenitoras (33). Após o aumento inicial da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias na região infartada, seus níveis normalmente começam a diminuir em direção a linha de base após uma semana de IM (35). No entanto, segundo Ono et al. (35), se o tamanho do IM for grande, ou se houver outros fatores de estresse em curso no miocárdio, a expressão gênica de citocinas pode permanecer significativamente elevada na região não infartada, mesmo após 20 semanas de IM. Além disso, os mesmos autores evidenciaram que os níveis de citocinas, como a IL-1β, estão associados ao diâmetro diastólico do VE e a deposição de colágeno na área infartada após 8 e 20 semanas da indução do IM.
Dessa forma, aguda e/ou cronicamente, a liberação de citocinas (pró-inflamatórias) desfavoravelmente afeta a função do VE, exerce efeito inotrópico negativo (36), induz anormalidades no metabolismo cardíaco e promove o remodelamento miocárdico, conduzindo assim à IC (37,38). Adicionalmente, a ativação do sistema imune promove o desenvolvimento de disfunção endotelial, atrofia e apoptose do músculo esquelético na IC (39,40).
A origem da ativação imune após um evento isquêmico possui muitas linhas de investigação e ainda é incerta. Existem ao menos cinco hipóteses que tratam dos principais estímulos à elaboração da resposta inflamatória após um evento (41); porém, uma delas, tem chamado atenção dos pesquisadores nos últimos anos. Essa hipótese aponta para redução da participação parassimpática em sendo a principal mediadora da
23 ativação da resposta inflamatória (41). Estudos conduzidos pelo grupo de Kevin J. Tracey têm contribuído de forma importante para a hipótese de relação direta entre a ativação parassimpática e resposta do sistema imunológico. Este grupo inicialmente descreveu que a ativação do nervo vago (eletricamente ou por agonistas colinérgicos) reduz a resposta inflamatória em modelos experimentais de sepse, posteriormente sendo postulada como a teoria do "reflexo inflamatório".
Nesse sentido, o Sistema Nervoso Autónomo (SNA), caracterizado pelas duas vias eferente: sistema nervo simpático e sistema nervoso parassimpático assume um papel regulado da inflamação. Cuja a influência do sistema nervoso simpático apresenta efeito pró-inflamatórios por promover a elevação de TNF pela estimulação de receptores α2-adrenérgicos, e anti-inflamatório por promover a diminuição de TNF pelos receptores β2-adrenérgicos. Enquanto o sistema nervo parassimpático, via nervo vago, é sensível aos níveis aumentados de TNF e IL-1, respondendo com Acetilcolina (ACh) para a redução do TNF sendo predominantemente anti-inflamatório, conforme ilustração 1.
24 Como sistema modulador da resposta inflamatória, o aumento da atividade do sistema parassimpático é descrito pela estimulação de macrófagos com ACh, que inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL-1, IL-6 e IL-18). Com a atenção voltada a esse sistema, verificou-se que a estimulação do nervo vago era capaz de reduzir a produção de várias citocinas inflamatórias (TNFα, IL-1, HMGB-1) (120).
Nesse sentido, Borovicova et al. (47) demonstraram que a injeção de endotoxina (lipopolissacarídeo) em animais que foram submetidos à estimulação do nervo vago resultou na reduzida liberação de macrófagos e citocinas inflamatórias sistêmicas, sem afetar de liberação de IL-10. No entanto, a transecção do nervo vago aboliu esta proteção. Além disso, em culturas de macrófagos humanos, acetilcolina inibiu a liberação de TNF-α quando estas foram submetidas ao tratamento com endotoxina. Estes resultados indicam que o nervo vago desempenha um papel importante na resposta imunológica (47).Em humanos, a redução da VFC está significante associada com níveis elevados de citocinas inflamatórias (IL-6) e proteína C reativa (PCR) (48). Lanza et al. (49) evidenciaram que os níveis séricos de PCR foram significativamente associados com a VFC reduzida em pacientes com angina instável. Esta associação também tem sido observada em indivíduos saudáveis, pacientes com doença arterial coronariana estável e com IC (50). Dessa forma, prevenindo e/ou atenuando a disfunção autonômica desencadeada pelo IM, poderia induzir uma elaboração da resposta inflamatória menos intensa, a ponto de reduzir o comprometimento estrutural e funcional cardíaco, bem como de sistemas periféricos.
1.4. Treinamento Físico Aeróbico e Resistido
Dentre os fatores de risco para o desenvolvimento das DCV, encontra-se a inatividade física. Para a Organização Mundial da Saúde (OMS), o indivíduo ativo regular é aquele que pratica alguma atividade física pelo menos três vezes por semana, em seu
25 tempo livre, com duração mínima de 30 minutos. No Brasil, o Diesporte aponta que a população mais jovem é a que mais pratica atividade física. Nas faixas entre 15 e 19 anos os declarados sedentários são 32,7%, já na faixa 20 a 24 anos o número sobe para 38,1%. A partir daí, a pesquisa aponta que 45,9% dos brasileiros não praticam esporte ou atividade física e vai crescendo continuamente até atingir 64,4% dos brasileiros entre 65 e 74 anos (PNAD – IBGE, 2015).
Os primeiros indícios de que a atividade física estava relacionada a saúde ou bem estar, data de 2500ª.C. na China, em que os registro feitos por Hua To mostram que havia uma relação entre os exercícios organizados e a promoção da Saúde. (123). Na Grécia Antiga, filósofos como Hipócrates e Platão acreditavam que a atividade física era importante para o bem-estar e no tratamento de doenças e incapacidades (122). Tais observações seguiram com o passar do tempo, isso porque já no século XVIII, o italiano Romazzinni (1940) observou que estafetas (corredores) apresentam bem-estar em relação a péssima saúde de trabalhadores sedentários. Assim, os benefícios e mecanismos potencias por meio dos quais o exercício físico pode reduzir o risco de eventos cardíacos, seguiram sendo analisados por estudos epidemiológicos dentre eles se destaca um dos primeiros que foi o Estudos de funcionários públicos Britânicos (Morris et al., 1953), que observou o risco de cardiopatia associado a atividade física entre cobradores e motorista de ônibus.
Dessa forma, postulou-se que a atividade física reduz o risco de doenças cardíacas por meio de alguns mecanismos, como pela ação direta ao coração, aumentando o suprimento de oxigênio para o miocárdio, reduzindo a demanda e o trabalho miocárdico, induzindo a bradicardia de repouso e manutenção da pressão arterial, com significativa redução do tônus simpático. Outras alterações como, aumento do diâmetro e da dilatação
26 das artérias coronarianas e da formação de colaterais, também são alguns dos benefícios atrelados a pratica continua de exercício físico. (FUSTER 1992; KRAMSCH, 1981).
Os benefícios cardiovasculares, autonômicos, metabólicos e anti-inflamatórios de um estilo de vida fisicamente ativo têm levado muitos investigadores a sugerirem o treinamento físico (TF) de moderada intensidade como uma conduta não farmacológica importante na prevenção e no tratamento dos fatores de risco e das DCV (51-55). As evidências de que o TF é uma ótima ferramenta no tratamento de pacientes com DAC estabelecida, com ou sem IM, são bastante relevantes e amplamente conhecidas (56,57).
Uma das adaptações positivas ao TF, geralmente associada à redução da mortalidade, é a do sistema nervoso autonômico. Estudos clássicos como os de Billman et al. (58) e Hull et al. (59) já sugeriam que esta intervenção reduz a mortalidade de indivíduos após um IM, principalmente associada ao aumento do tônus vagal e redução da atividade simpática. De fato, La Rovere et al. (51) evidenciaram que o TF modificou favoravelmente a sobrevida em longo prazo de pacientes infartados, sendo esta associada a uma clara mudança do equilíbrio autonômico em direção a um aumento da atividade vagal. Experimentalmente, para o nosso grupo de pesquisa, os principais benefícios funcionais, bioquímicos e moleculares do TF aeróbico após o IM parecem estar também associados à melhora da função autonômica (9,10,13).
Além dos benefícios na função autonômica, Adamapoulus et al. (60) demonstraram uma redução na concentração plasmática de marcadores inflamatórios periféricos após 12 semanas de TF aeróbico em pacientes com IC moderada a severa, sugerindo uma correlação entre a melhora na tolerância ao exercício e a atenuação do processo inflamatório. Em um modelo experimental de IC, Batista et al. (61) observaram que o TF aeróbico em ratos infartados aumentou a razão IL-10/TNF-α no músculo sóleo
27 dos animais, ressaltando o efeito anti-inflamatório do exercício após um evento isquêmico.
Apesar dos benefícios do TF aeróbico estarem bem descritos em pacientes com DAC, IM ou IC, as consequências do TF resistido per se nessas populações dispõem de evidências menos sólidas. Em pacientes com IC, apesar das anormalidades no músculo esquelético estarem bem descritas, o TF resistido vinha sendo tradicionalmente desencorajado em virtude das preocupações em promover comprometimento da função do VE e potencial efeito adverso no remodelamento cardíaco, principalmente decorrente do aumento da pós-carga. Pu et al. (2001) afirmam que as respostas hemodinâmicas, bem como o remodelamento cardíaco não tem sido demonstrado por pacientes com IC que realizaram o TF resistido. Nesse sentido, nos últimos anos o TF resistido vem sendo discutido e por vezes recomendado para pacientes com IC, baseado em parte na lógica de que esta forma de treinamento pode ser mais eficaz em reverter à atrofia muscular esquelética do que o exercício aeróbico, e que o aumento da força/resistência podem melhorar a qualidade de vida dessa população. O TF resistido tem atenuado a perda da massa muscular, melhora da força, da resistência, bem como o consumo máximo de oxigênio em pacientes com IC. No entanto, ainda são escassos os estudos que tratam dos efeitos do TF resistido no remodelamento cardíaco, na disfunção ventricular, bem como no perfil hemodinâmico e autonômico desencadeados pelo IM.
Sob diferente perspectiva, no que tange aos benéficos do TF quando realizado previamente a um evento cardíaco, adaptações vasculares, sistêmicas, neuro-humorais e cardiopulmonares ao exercício têm se mostrado bastante eficazes em prevenir complicações cardiometabólicas, bem como minimizar os efeitos deletérios da isquemia seguida de reperfusão (68). De fato, dados epidemiológicos indicam que o exercício físico regular reduz o risco de morte durante a reperfusão clínica após a isquemia (69). Nesse
28 contexto, pesquisadores vêm buscando os possíveis mecanismos cardioprotetores do exercício físico à isquemia e reperfusão. Mecanismos tais como a formação de vasos colaterais (70), elevação das heat shock proteins 70 (71), aumento da expressão da ciclooxigenase miocárdica (72), proteção antioxidante (73), bem como o papel anti-inflamatório do exercício físico (74) têm sido apontados como desencadeadores de cardioproteção. Entretanto, poucos estudos têm relatado os efeitos do TF previamente à isquemia permanente em animais e, dentre eles, os resultados são contraditórios (75-78).
Experimentalmente, Dayan et al. (75) demonstraram que 3 semanas de natação antes do IM atenuaram o remodelamento e melhoraram a função ventricular de animais treinados. De maneira semelhante, Freimann et al. (76) observaram que o treinamento de natação prévio ao IM reduziu o tamanho da cicatriz, aumentou a densidade capilar, bem como promoveu adaptações gênicas relacionadas o metabolismo enérgico. Em contrapartida, Veiga et al. (77,78) não observaram adaptações positivas da natação na função ventricular, na área de IM e no perfil hemodinâmico de ratos treinados previamente ao IM. Recentemente, Bozi et al. (79) demonstraram que o TF aeróbico de moderada intensidade em esteira, realizado previamente, atenuou a disfunção e deterioração estrutural cardíaca promovida pelo IM, e tais benefícios foram associados com a preservação das propriedades morfológicas e contráteis dos cardiomiócitos.
1.5. Estimulação Colinérgica por Brometo de Piridostigmina.
A busca por fármacos com ação cardioprotetora, capazes de reduzir a ocorrência e as complicações dos eventos cardíacos em pacientes coronariopatas e/ou infartados, é de grande relevância. Estudos anteriores têm demonstrado que a estimulação colinérgica permite um aumento da resposta vagal e inflamatória em pacientes após um IM agudo, onde sabidamente existe uma diminuição da atividade parassimpática (80,81).
29 O sistema nervoso autônomo, pela sua divisão parassimpática apresenta um neurotransmissor ganglionar e pós-ganglionar, a Acetilcolina (Ach), que é um neurotransmissor liberado pelo terminal nervoso quando o corpo necessita de estímulos específicos, na maioria das vezes, contração ou relaxamento muscular, que por sua vez é inativada pela enzima Acetilcolinesterase (AchE). No sistema nervoso simpático, o neurotransmissor ganglionar também é a Ach, no entanto, nos órgãos efetores o neurotransmissor é a Noradrenalina e a adrenalina, essa, liberada pela medula da adrenal. (Edilberto, 2008).
A acetilcolina exerce as suas ações através da estimulação dos receptores nicotínicos (nAcCor) e muscarínicos (mAcCor), no entanto, o efeito anti-inflamatório é associado a subunidade α7 do recetor nicotínico da acetilcolina (a7nAcCor), em que somente a estimulação deste subtipo gera uma resposta anti-inflamatória relevante (129).
Em busca de mecanismos para induzir a estimulação colinérgica, está a utilização de inibidores da acetilcolinesterase, como o brometo de piridostigmina (PIR), que por exemplo, têm se mostrado eficientes (82). Apesar de seus efeitos amplamente conhecidos na profilaxia contra intoxicação por organofosforados (83) e no tratamento da Miastenia Gravis (84), hiatos existem sobre o impacto desse fármaco nas alterações autonômicas ocasionadas pelo IM. A estimulação colinérgica aguda com PIR causou bradicardia e reduziu o intervalo QT, sem efeitos colaterais importantes em pacientes com doença coronariana (85). Em pacientes com IC, o fármaco aumentou significativamente a recuperação da frequência cardíaca no primeiro minuto após o exercício físico máximo (82), melhorou o pulso de oxigênio (indicador de volume sistólico), bem como a frequência cardíaca de reserva (86). Experimentalmente, Yu et al. (87) demonstraram que o tratamento com PIR (30 mg/kg/dia) aumentou a angiogênese após o IM em ratos. Recentemente, nosso grupo testou a influência do tratamento com brometo de
30 piridostigmina por 7 dias (0,14 mg/ml/dia) na função autonômica de ratos após o IM. O grupo infartado tratado melhorou a frequência cardíaca intrínseca e o tônus vagal, bem como reduziu o tônus simpático e a área de infarto em relação ao grupo infartado placebo (88). Além disso, foi demonstrado que a administração em longo prazo de PIR aumentou o tônus vagal cardíaco e reduziu o tônus simpático, atenuando o remodelamento cardíaco e disfunção ventricular esquerda durante a progressão da insuficiência cardíaca em ratos.
Nesse cenário, a PIR parece ser um fármaco interessante por melhorar a função autonômica e sua resposta ao exercício físico em pacientes infartados ou com IC, além de induzir alterações autonômicas e estruturais importantes em animais submetidos à oclusão da artéria coronária, conforme evidenciado na literatura. No entanto, várias perguntas emergem diante desses achados clínicos e experimentais, como: o TF prévio é suficiente para desencadear efeitos cardioprotetor independentemente do tipo de treinamento? A associação do TF aeróbico com a administração de PIR pode desencadear efeitos positivos adicionais na função autonômica e, consequentemente, na resposta inflamatória ao IM? O TF resistido, realizado isoladamente antes do IM, é uma prática que induz a um fenótipo cardioprotetor? Por fim, a associação do TF resistido com a administração de PIR pode desencadear efeitos positivos adicionais na função autonômica e, consequentemente, na resposta inflamatória ao IM?
31 2. OBJETIVOS
2.1. Geral
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar as respostas ventriculares, hemodinâmicas, autonômicas e inflamatórias da isquemia miocárdica em ratos previamente submetidos ao TF aeróbico ou resistido, associados ao tratamento com brometo de piridostigmina.
2.2. Específicos
Estudar as respostas ventriculares, hemodinâmicas, autonômicas e inflamatórias da isquemia miocárdica em ratos previamente submetidos ao TF aeróbico ou resistido, associados ao tratamento com brometo de piridostigmina, por meio das seguintes avaliações:
Área de IM e morfometria cardíaca Função ventricular
Pressão arterial e frequência cardíaca: Sensibilidade barorreflexa
Tônus vagal, tônus simpático e frequência cardíaca intrínseca Modulação autonômica
32 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais e Grupos
Foram utilizados ratos Wistar machos (230-260g) provenientes do biotério da Universidade São Judas Tadeu (USJT). O presente estudo teve a aprovação da Comissão de Ética em Uso de Animais de Experimentação da USJT (CEUA/USJT - 008/2013). Os animais foram mantidos agrupados, em ambiente com temperatura (22o–24oC) e com luz controlada em ciclo de 12 horas (claro/escuro). Água ou PIR e comida foram oferecidas de modo irrestrito, sendo que a dieta foi normoproteica (12% de proteínas). Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais (n=9 por grupo):
Controle Sham (C) Sedentário + infarto (SI)
Sedentário + PIR + infarto (SPI) Treinamento aeróbico + infarto (TAI)
Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI) Treinamento resistido + infarto (TRI)
Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI)
Os animais foram treinados/tratados por 2 meses e, ao final desse período, foram submetidos ao IM ou cirurgia fictícia sem a oclusão da artéria coronária (Sham). As análises propostas foram realizadas na primeira semana após o IM ou Sham.
33 3.2. Sequência Experimental
A sequência experimental está descrita a seguir:
Onde: IM – infarto do miocárdio; TE – teste de esforço máximo; TCM – teste de carga máxima; ECO – Avaliação ecocardiográfica.
3.3. Procedimentos Experimentais
3.3.1. Testes de Esforço, Carga Máxima e Treinamento Físico
Todos os grupos estudados foram submetidos a um protocolo de teste de esforço máximo (TE) em esteira ergométrica e um teste de carga máxima (TCM) em escada adaptada para ratos (com aproximadamente 54 degraus verticais e 0,5 cm de espaço entre eles) ao início, aos 30 dias e ao final dos programas de TF aeróbico e resistido. Os animais foram adaptados em esteira ergométrica (10 minutos a 0,3 Km/h) durante 3 dias. O TE consistiu em colocar o animal correndo na esteira a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo que esta carga foi incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até que o animal atingisse a exaustão. Este protocolo de TE apresenta correlação significativa com a medida do consumo direto de oxigênio em ratos machos, o que nos confere validade e fidedignidade para prescrição e controle do TF. Após o teste inicial, os grupos que realizaram o treinamento aeróbico foram submetidos a um protocolo de TF em esteira ergométrica
34 com velocidade e carga progressiva durante 2 meses (5 dias por semana) e intensidade de 60 a 75% da velocidade máxima atingida no TE.
Na adaptação à escada, os animais foram colocados nos degraus inferiores e adaptados ao ato de escalar, sem nenhum peso. No topo da escada os animais encontraram uma gaiola (20x20x20 cm) onde descansaram por 120 segundos. Este procedimento foi realizado por 3 dias até que os animais escalassem voluntariamente a escada 3 vezes consecutivas. O teste de carga máxima consistiu em uma escalada com carga inicial de 75% do peso corporal. Após 2 minutos de descanso, um peso adicional de 15% do peso corporal foi aplicado no aparato da cauda, e assim sucessivamente, com descansos de 2 minutos entre cada escalada, até que o animal não conseguisse completar a subida. O protocolo de TR foi realizado durante 2 meses, 5 dias por semana, com intensidade moderada (40-60% da carga máxima de subida normalizada), conforme recomendado para pacientes com doença cardiovascular, 15 escaladas por sessão e 1 minuto de descanso entre cada escalada.
3.3.2. Extração e Tratamento com Brometo de Piridostigmina
Para a realização do tratamento com Brometo de Piridostigmina, foi realizada a etapa de extração do fármaco comercial Mestilon® 60 mg. Para tal, foi realizada a trituração dos comprimidos de uma cartela com Blíster em grau de vidro com pistilo até a obtenção de um pó. O pó foi diluídos em água potável filtrada, em balão volumétrico de 2L. A solução obtida, foi colocada em banho de ultrassom até assegurar completa dissolução do brometo de piridostigmina e em seguida foi filtrada, utilizando filtração a vácuo com funil de Buckener, 1Kitassato e bomba de vácuo. Após o processo de extração, foi retirada uma alíquota de 1ml para comparação com curva padrão de 14mg/ml comparada com padrão de brometo de piridostigmina Sigma®.
35 Assim, o tratamento com brometo de piridostigmina (0,14 mg/mL) foi realizado por via oral na água de beber, com o consumo médio de solução ingerida por dia de 50ml/rato, sendo que a dose diária ingerida de brometo de piridostgmina foi de aproximadamente 15mg/rato, considerando que peso médio dos ratos foi em torno de 350g, a dose diária corrigida pelo peso do animal foi então de aproximadamente 40mg/Kg/dia do fármaco (88,92), por 60 dias.
3.3.3. Indução do Infarto do Miocárdio
Após o treinamento/tratamento, os animais foram anestesiados com uma mistura de Cetamina (80 mg/Kg) e Xilazina (12 mg/Kg) por via intraperitoneal, submetidos à respiração artificial em pressão positiva (Harvard Aparattus©, Model 683, Holliston, MA) e a artéria coronária descendente anterior esquerda ocluída a aproximadamente 1mm de sua origem, abaixo da extremidade do átrio esquerdo (fio mononylon 6.0). Posteriormente, incisão torácica foi fechada (fio mononylon 5.0) e o pneumotórax retirado. Os músculos afastados foram reposicionados e a pele suturada (fio mononylon 4.0). Os animais receberam 30000 UI de Benzilpenicilina Benzatina (Penretard, Cibran, Tanquá, RJ, Brasil, i.m.) e foram colocados em ambiente aquecido para recuperação (9-20). A cirurgia fictícia Sham ocorreu de forma semelhante, exceto pela ligadura da artéria.
3.3.4. Avaliações Ecocardiográficas
As avaliações ecocardiográficas foram realizadas 2 dias após o IM. Essas avaliações foram realizadas seguindo as recomendações do Comitê de Padronização do Modo M da Sociedade Americana de Ecocardiografia (93).
Em cada avaliação, foram analisados parâmetros de função sistólica (como a fração de ejeção e a fração de encurtamento do VE); parâmetros de função diastólica (como o tempo de relaxamento isovolumétrico, a relação entre as ondas E e A, bem como
36 o tempo de desaceleração da onda E); a área de infarto; e morfometria cardíaca (como a espessura relativa da parede, massa do ventrículo esquerdo, diâmetros sistólico e diastólico finais), previamente padronizados pelo nosso grupo (9-12,15-19,94).
Para a realização do exame ecocardiográfico, os animais foram anestesiados com uma solução intraperitoneal de Cetamina (80 mg/kg) e Xilazina (12mg/kg), e tiveram a região torácica devidamente tricotomizada, sendo mantidos em decúbito lateral para a realização do exame ecocardiográfico com aparelho SEQUOIA 512 (ACUSON, Corporation, Mountain View, CA-EUA). O transdutor utilizado foi linear e multi frequencial (10-14mHz), que permite imagens bidimensionais e monodimensionais simultâneas, além da análise de fluxo por efeito Doppler espectral. A profundidade de imagem trabalhada foi de 2cm.
Foram utilizadas as janelas longitudinais para esternais direitas para a obtenção dos cortes longitudinal e transversal; e as janelas longitudinais paraesternais esquerdas para a obtenção dos cortes apicais (duas, quatro e cinco câmaras). As medidas lineares foram realizadas nas imagens obtidas pelo modo-M, conforme descrito por Schiller et al. (1979), com as seguintes medidas: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE), diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (DSVE) e espessura diastólica da parede posterior (PPDIA). A massa ventricular esquerda (MVE) foi então obtida a partir da fórmula: 1,047 x ((SIVDIA+VEDIA+PPDIA)3-VEDIA3) onde: 1,047 representam a densidade do miocárdio, validada em ratos por Fard et al. (2000). A espessura relativa da parede (ERP) foi calculada levando-se em consideração as medidas de PPDIA e DDVE.
A função sistólica foi avaliada pela fração de ejeção (FE, em %) pelo método Simpson modificado, por se mostrar mais fidedigno em corações infartados, e também
37 pela velocidade de encurtamento circunferencial (VEC, em circ/seg 10-4), cujas fórmulas estão a seguir:
Simpson modificado: onde L = comprimento do
ventrículo esquerdo dividido em 20 discos (i= 1 a i= 20) da base ao ápice, com o diâmetro de cada disco determinado em duas visões apicais (a e b). Com este procedimento feito tanto na diástole como na sístole. A velocidade de encurtamento circunferencial foi obtida pela seguinte fórmula: VEC = (VEDIA-VESIS)/(VEDIA x TE), onde TE = tempo de ejeção.
A função diastólica foi analisada utilizando-se os índices derivados da curva de velocidade de fluxo diastólico mitral e do fluxo sistólico da via de saída do VE, obtidos pela técnica de Doppler pulsátil. A curva de velocidade do fluxo diastólico foi obtida a partir da imagem apical quatro câmaras posicionando-se o volume amostra próximo à face ventricular da valva mitral. Foram determinadas: a) onda E – maior valor da velocidade de fluxo inicial do enchimento ventricular (enchimento rápido do ventrículo); b) onda A – maior valor da velocidade de fluxo telediastólico mitral (correspondente à contração atrial); c) a relação E/A - razão entre a velocidade máxima da onda E e a velocidade máxima da onda A; d) tempo de desaceleração da onda E (TDE) – tempo (em milissegundos, ms), entre o pico da onda E e o ponto em que a rampa de desaceleração intercepta a linha de base da curva de velocidade do fluxo diastólico mitral. A curva de velocidade dos fluxos para análise do tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) foi obtida posicionando-se o volume amostra numa posição intermediária entra a valva mitral e a via de saída do VE. Foi determinado o TRIV (em milissegundos, ms) entre o final do fluxo sistólico na via de saída do VE e o início do fluxo diastólico mitral.
38 Além das avaliações da função sistólica e diastólica separadamente, utilizamos outro método de avaliação funcional combinado, o índice de desempenho miocárdico (IDM), derivado de intervalos obtidos pelo Doppler pulsátil. Validado em camundongos por Broberg et al. (2003) e já padronizada pelo nosso grupo em ratos infartados (Rodrigues et al., 2012), o IDM é conceitualmente simples e representa a razão do tempo total gasto na atividade isovolumétrica (contração e relaxamento isovolumétricos) pelo tempo de ejeção. Para tanto, mede-se o tempo de relaxamento da válvula mitral (a), que corresponde à soma do tempo de contração isovolumétrica, tempo de ejeção e tempo de relaxamento isovolumétrico. O tempo de ejeção é obtido pela medida da duração do fluxo de via de saída do ventrículo esquerdo (b). Pela fórmula (a)-(b) / b, podemos então obter o IDM.
A região de infarto foi delimitada de acordo com a cinética das paredes do miocárdio, avaliadas pelas seguintes janelas ecocardiográficas: longitudinal paraesternal direita, transversal (ao nível dos músculos papilares) e apical (2 e 4 câmaras). Regiões hipocinéticas (espessamento sistólico abaixo do normal) e acinéticas (ausência de espessamento durante a sístole) foram consideradas como infartadas. Desta forma, a área de infarto foi delimitada através da razão destas regiões com a área total das paredes miocárdicas do VE. Moisés et al. (2000) e Nozawa et al.(2006), utilizando-se desta metodologia, demonstraram altíssima sensibilidade e especificidade para a delimitação da área de infarto do miocárdio em ratos, com 100% de confiabilidade quando comparada a estudos anatomopatológicos. Além disso, nosso grupo tem utilizado essa medida em diversos estudos, sendo muito bem padronizada pelo nosso grupo de pesquisa (Mostarda et al., 2010; Jorge et al., 2011; Rodrigues et al., 2011; Rodrigues et al., 2012). Todas as medidas seguiram as recomendações da Sociedade Americana de Ecocardiografia.
39 Dessa forma, as variáveis ecocardiográficas analisadas nos grupos experimentais foram:
Variáveis Morfométricas: Área de infarto
MVE – Massa do VE (absoluta); DDVE – Diâmetro diastólico do VE; DSVE – Diâmetro sistólico do VE; ERP – Espessura relativa da parede. Variáveis de Função Sistólica:
FE – Fração de Ejeção;
VEC – Velocidade de Encurtamento Circunferencial. Variáveis de Função Diastólica:
TRIV – Tempo de Relaxamento Isovolumétrico; TDE – Tempo de Desaceleração da Onda E; E/A – Relação entre as ondas E e A.
Variável de Função Global:
40 3.3.5. Canulação e Registro da Pressão Arterial Direta e Sistema Nervoso Autonômico Cardiovascular
Para análise do sistema nervoso autônomo foram utilizados diferentes ferramentas de avaliação, como:
Modulação autonômica cardiovascular: Análise de variabilidade da frequência cardíaca (intervalo RR) e da pressão arterial (por meio da análise espectral). Reflexo do barorreceptor cardíaco: para se investigar as respostas autonômicas
cardiovasculares reflexas.
Comportamento tônico do sistema nervoso autônomo cardíaco: por bloqueio farmacológico com atropina e propranolol
Após as avaliações ecocardiográficas, os animais foram anestesiados com uma mistura de Cetamina (80 mg/Kg) e Xilazina (12 mg/Kg) por via intraperitoneal e realizada a implantação de cateteres na veia jugular (para administração de drogas) e na artéria carótida (para registro direto da PA e FC). Cada animal foi mantido em uma caixa individual padrão durante a realização das avaliações hemodinâmicas sistêmicas que são iniciadas 24 horas após a canulação. Com o animal acordado, a cânula arterial é conectada a uma extensão de 20 cm, permitindo livre movimentação do animal pela caixa, durante todo o período do experimento. Esta extensão é conectada a um transdutor eletromagnético de pressão (Kent Instruments®) que por sua vez, é conectado a um pré-amplificador (Stemtech). Sinais de PA são gravados durante um período de 30 minutos em um microcomputador equipado com um sistema de aquisição de dados (DATAQ Instruments, DI-158U), permitindo análise dos pulsos de pressão, batimento-a-batimento, com uma frequência de amostragem de 2KHz por canal para estudo dos valores de PA e FC (9,10,13,14,16,19,20).
41 3.3.6. Avaliação da Sensibilidade do Barorreflexo
Após o registro da PA, com os animais em condições de repouso, a sensibilidade dos pressorreceptores são testadas através de doses crescentes da infusão de fenilefrina e de nitroprussiato de sódio. A sensibilidade barorreflexa é avaliada pelo índice calculado pela divisão de variação da FC pela variação da PAM (9,10,13,14,16,19,20).
3.3.7. Tônus Vagal e Tônus Simpático
Após a avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores e com o retorno da FC e da PA a valores próximos dos obtidos no registro basal, é realizada a injeção de atropina (3 mg/kg) e PA e FC são registradas por 8 minutos. Ainda sob efeito da atropina, é realizada a injeção de propranolol (4 mg/kg) e PA e FC são registradas por 8 minutos. Com o duplo bloqueio farmacológico atinge-se a FC intrínseca. No dia seguinte, repete-se o mesmo procedimento descrito anteriormente invertendo-repete-se a repete-sequência das injeções dos fármacos (bloqueio invertido). O tônus simpático é calculado pela subtração da máxima FC alcançada após bloqueio do parassimpático com atropina menos a FC intrínseca, observada após o duplo bloqueio (atropina + propranolol). Já o tônus simpático é calculado pela subtração da mínima FC atingida após o bloqueio simpático com propranolol, menos FC intrínseca, observada após o duplo bloqueio (atropina + propranolol) (13).
3.3.8. Modulação autonômica
A variabilidade da FC e da PA sistólica foi avaliada no domínio do tempo (variância) e no domínio da frequência usando a Transformada Rápida de Fourrier. Em resumo, neste método, séries temporais do intervalo de pulso e da PA sistólica são divididas em segmentos de 350 batimentos com sobreposição de 50%. Um espectro é
42 obtido para cada um dos segmentos via o recurso de Levinson-Durbin, com a ordem modelo escolhido de acordo com critério do Akaike, variando entre 10 e 14. Os componentes oscilatórios dos espectros são quantificados em 2 faixas de frequência: baixa frequência (BF: 0,20-0,75 Hz) e alta frequência (AF: 0,75-4,0 Hz). A potência do espectro é calculada para cada componente reconhecível nas faixas de BF e AF integrando-se os espectros dos componentes. A potência é expressa como a intensidade de BF e AF. Os segmentos que apresentam oscilações muito lentas (<0,1 Hz), que contribuem para mais de 70% da variabilidade total, são considerados não estacionários e portanto descartados do estudo (14,20).
3.3.9. Atividade de Acetilcolinesterase
Para determinar a magnitude da inibição de acetilcolinesterase pelo tratamento com a PIR, amostras de 200 µl de sangue foram centrifugadas a 5000 rpm durante 15 min e 100 µl de plasma foram congeladas a -20o C. A atividade de acetilcolinesterase foi determinada por kit imunológico Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
43 3.3.10. Concentração de Citocinas
Após as avaliações citadas acima os animais foram pesados e eutanasiados por decapitação. O VE e o plasma foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer -80º C. As proteínas dos tecidos foram extraídas em tampão (Tris base 100nM, pH 7,5; EDTA 10nM; fluoreto de sódio 100nM; pirofosfato de sódio 10nM; ortovanadato de sódio 10nM; aprotinina 10µg/ml; leupeptina 1µg/ml; PMSF 2nM) e incubadas com Triton X100 – 10% por 30 minutos em gelo. Imediatamente após, a amostra foi centrifugada a 13.000 rpm, a 4º C, durante 20 minutos e os sobrenadantes submetidos à quantificação proteica pelo método Bradford, utilizando-se uma curva padrão de 50 a 1.000 µg/ml de albumina bovina sérica e reagente de Bradford (coomassie brilliant blue 0,01%, etanol 47%, ácido fosfórico 4,5% e água destilada q.s.p); a absorbância foi determinada em 595 nM (9,15,19,95). As avaliações quantitativas das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10 e TNFα foram realizadas por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) no ventrículo esquerdo e em amostras de músculo esquelético (sóleo) e soro dos animais.
3.3.11. Análise Estatística
Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média. Depois de confirmar que todas as variáveis contínuas foram normalmente distribuídas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, os testes de análise de variância (ANOVA) de duas vias e para medidas repetidas foram devidamente aplicados para análise dos dados seguidos do post-hoc de Bonferroni. Valores de P<0,05 foram considerados significativos.
44 4. RESULTADOS
4.1 Peso Corporal
O peso corporal (Figura 1) no início do protocolo foi semelhante entre os grupos. No entanto, ao final do protocolo todos os grupos experimentais apresentaram aumento do peso corporal em relação às suas respectivas avaliações iniciais. Os grupos experimentais TAI, TAPI, TRI e TRPI apresentaram redução do peso corporal se comparados ao grupo C. Adicionalmente, os grupos TAPI, TRI e TRPI também apresentaram redução do peso corporal em relação ao grupo SI. Já os grupos TAPI e TRI reduziram o peso corporal em relação ao grupo SPI e, no caso dos animais TRI, a redução ocorreu também em relação aos animais TAI.
Figura 1. Peso corporal avaliado ao início e após as cirurgias Sham e infarto do miocárdio nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
C SI SPI TAI TAPI TRI TRPI
Inicial Pós-Sham/IM # # # # #*†‡ # * *†‡¥ *† gr am as
45 + PIR + infarto (TRPI). # P<0,05 vs. Avaliação inicial; * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI.
4.2 Capacidade Física
Na Figura 2, é possível observar que não há diferença entre os grupos no teste de esforço em esteira rolante realizado ao início do protocolo. Ao final do período de treinamento/tratamento, os animais dos grupos TAI, TAPI, TRI e TRPI apresentaram aumento da capacidade física em relação aos grupos sedentários C, SI e SPI. Após a indução do IM, o grupo SI e SPI apresentaram redução da capacidade aeróbia em relação ao grupo C. No entanto, esta queda não foi observada nos grupos TAI e TRI. Já os animais dos grupos TAPI e TRPI apresentaram aumento dessa variável em relação aos grupos C, SI e SPI, bem como em relação aos seus respectivos controles não tratados (TAI e TRI). Por outro lado, o grupo TAPI apresentou um aumento adicional dos valores de teste de esforço em relação ao grupo TRPI.
Figura 2. Teste de esforço em esteira rolante avaliado ao início, ao final dos períodos de treinamento/tratamento e após as cirurgias Sham e infarto do miocárdio nos
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
C SI SPI TAI TAPI TRI TRPI
Inicial Final Pós-Sham/IM
K m /h * * *†‡ †‡ *†‡¥ *†‡¥ *†‡¥ †‡¥ *†‡£$ *†‡£$
46 grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.
Ao início do estudo, todos os grupos experimentais evidenciaram semelhante resultado no teste de carga máxima (Figura 3). Ao final dos períodos de treinamento/tratamento, os grupos TRI e TRPI aumentaram os valores atingidos no teste em comparação aos grupos C, SI e SPI, bem como em relação aos grupos TAI e TAPI, respectivamente. Após as cirurgias Sham e de IM, os grupos TRI e TRPI continuaram com valores aumentados obtidos no teste em comparação aos grupos C, SI, SPI, TAI e TAPI, porém, vale ressaltar que os animais do grupo TRPI obtiveram um aumento adicional no teste de carga máxima se comparado ao grupo TRI.
Figura 3. Teste de carga máxima realizado em escada adaptada para ratos avaliado ao início, ao final dos períodos de treinamento/tratamento e após as cirurgias Sham
0 100 200 300 400 500 600
C SI SPI TAI TAPI TRI TRPI
Inicial Final Pós-Sham/IM
*†‡¥ *†‡£ *†‡¥£ *†‡¥£$ gr am as
47 e infarto do miocárdio nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.
4.3. Avaliações Ecocardiográficas
Os grupos experimentais foram submetidos à avaliação ecocardiográfica de morfometria e função cardíaca após a cirurgia de indução do infarto ou cirurgia Sham, ao final dos protocolos de treinamento/tratamento ou acompanhamento. Os parâmetros analisados serão apresentados em variáveis morfométricas e função ventricular.
4.3.1. Variáveis Morfométricas
A área de infarto, apresentada na Figura 4, apresentou redução somente nos grupos tratados, SPI e TAPI vs SI. Já a massa do ventrículo esquerdo (Figura 5), foi aumentada nos grupos TAI e TRI em relação aos grupos C e SI. Vale ressaltar que os animais TRI apresentaram aumento adicional dessa variável se comparados aos animais dos grupos TAI e TAPI. Adicionalmente, os animais TAPI e TRPI demonstraram menores massas ventriculares em relação aos seus respectivos controles treinados e não tratados (TAI e TRI, respectivamente).
48 Figura 4. Área de infarto avaliada pelo ecocardiograma nos grupos Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ vs. TRI.
0 10 20 30 40 50 60
SI SPI TAI TAPI TRI TRPI
%
†
‡
†
49 Figura 5. Massa do ventrículo esquerdo avaliada pelo ecocardiograma nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ vs. TRI.
Em relação ao diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (Figura 6), foi observada redução no grupo TAPI em relação ao SI e ao seu controle direto (TAI). Contrario, houve um aumento entre o grupo TRI vs TAPI. Já a espessura relativa de parede (Figura 7), foi aumentada no grupo TAI em comparação ao SI e TAPI. O grupo TRI demonstrou um aumento dessa variável em relação aos grupos C, SI, TAI e TAPI. O treinamento resistido associado ao tratamento provocou uma queda da espessura relativa da parede nos animais TRPI em comparação aos animais TRI.
0 0,5 1 1,5 2
C SI SPI TAI TAPI TRI TRPI
g ram as ¥ *†‡¥£ ¥$ *†‡
