UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE JOICE GUILHERME DE OLIVEIRA
Avaliação do efeito da incorporação de ativo natural em diferentes tipos de nanopartículas sobre a atividade larvicida de Aedes aegypti (LINNAEUS, 1762)
Tubarão 2017
JOICE GUILHERME DE OLIVEIRA
Avaliação do efeito da incorporação de ativo natural em diferentes tipos de nanopartículas sobre a atividade larvicida de Aedes aegypti (LINNAEUS, 1762)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestra em Ciências da Saúde.
Orientador (a): Profa Josiane SomarivaProphiro, Dra. Coorientador (a): Prof. Luiz Alberto Kanis, Dr.
Tubarão 2017
Oliveira, Joice Guilherme de, 1992-
O45 Avaliação do efeito da incorporação de ativo natural em diferentes tipos de nanopartículas sobre a atividade larvicida de larvas de Aedes aegypti (LINNAEUS, 1762) / Joice Guilherme de Oliveira; -- 2017.
60 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientador : Profa. Dra. Josiane Somariva Prophiro. Coorientador : Prof. Dr. Luiz Alberto Kanis.
Dissertação (mestrado)–Universidade do Sul de Santa Catarina, Tubarão, 2017.
Inclui bibliografias.
1. Nanopartículas. 2. Aedes aegypti. 3. Piper nigrum. I. Prophiro, Josiane Somariva. II. Kanis, Luiz Alberto. III. Universidade do Sul de Santa Catarina – Mestrado em Ciências da Saúde. IV. Título.
CDD (21. ed.) 616.921 Ficha catalográfica elaborada por Francielli Lourenço CRB 14/1435
“A quem caminha à vitória”
Aos meus pais, Marilda e Célio, pelo incentivo aos estudos e exemplo de caráter. Aos meus irmãos, Jéssica e Juninho, por estarem presentes em toda minha caminhada sempre prontos para o abraço sincero. Aos meus avós (in memorian) Arina, Cláudio e Jovita, por em algum lugar se orgulharem.
AGRADECIMENTOS
Como o tempo passou rápido! Muitas pessoas fizeram parte dessa fase, contribuindo direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
Agradecimento em especial a minha família, por incentivarem aos estudos e acreditarem no meu potencial. Sabemos que esses dois anos foram de difíceis para nós, mas também de muitos aprendizados. Sou infinitamente grata por vocês, não
teria chego até aqui sem o apoio de todos. Minha mãe Marilda por sempre dar aquele “colinho de mãe” e pelas palavras de conforto nos momentos em que entrei
em aflição. Ao meu pai “Célio” que sempre perguntou “E como estão os experimentos?” e comemorava ou se preocupava com os resultados, mesmo quando
ele me dizia que não entendia. Além de todo o apoio emocional, vocês também não mediram esforços para me ajudar financeiramente, podemos dizer que este trabalho
teve financiamento “Bolsa Pais” (risos).
Não poderia deixar de agradecer aos meus irmãos. Pelas risadas, mensagens de conforto, as danças (ou tentativas) nos finais de semana, e por acreditarem em mim! Juninho por ser por diversas vezes meu motorista, nas minhas idas e vindas de
Imaruí/Tubarão/Garopaba e nunca se negar em me ajudar. Jéssica pelos puxões de orelha, me fazendo ver que preciso ter paciência e não desistir dos meus sonhos.
A minha orientadora Professora Josi. Obrigada pelo conhecimento transmitido, pelas oportunidades, desafios, orientações, otimismo, amizade e por me proporcionar esta valiosa oportunidade de aprendizado, nesses sete anos (graduação e mestrado) de convivência. Admiro muito você pela excelente profissional e uma pessoa com um
“coração” nobre, servindo de inspiração para seguir nossos objetivos com determinação. Sou muito grata por sua confiança e colaboração.
Ao Professor Luiz, que nestes anos de pesquisa pude conhecer e admirar ainda mais seu profissionalismo. Obrigada por todas as oportunidades de crescimento, desafios propostos, pelas ideias geniais e oportunas colocações. Sobretudo por ser exemplo de cientista e servir de inspiração aos anos de convívio.
A galera do “Lab”! Como esquecer de vocês e as melhores trilhas sonoras para trabalhar. Obrigada Felipe, Douglas, Jéssica, Milena, Isabela e Cynthia pelas contribuições nos experimentos, aturarem (ou quase) minhas “pequenas bagunças”
no laboratório, pelos diversos cafés e “papos filosóficos na bancada” e momentos de descontração fora do laboratório.
A Millena por diversas vezes me receber em sua casa, quando precisei ficar de um dia para outro. Felipe, sei que você não gosta de exposição, mas não posso deixar de dar um agradecimento especial para você. Obrigada por ser um grande amigo, pelas críticas construtivas e conselhos sinceros. Pelas “centenas de vezes” que me recebeu em sua casa para dormir ou almoçar, por não medir esforços quando
precisei de ajuda nos finais de semana, feriados ou sair tarde da noite do laboratório. Obrigada pela parceria no profissionalismo e nos momentos de diversão.
A galera do outro “Lab”, o TecFarma, pelo senso de humor contagiante, até em um domingo ensolarado no laboratório, e aturarem todas as vezes que eu ia fazer um
“pequeno barulho” lá. Adorei conviver esse tempo com vocês!
Aos meus amigos Paula, Thiago, Jéssica Mendes, Thalita e Camila Sousa pela amizade sincera. Amo vocês galera!
Ao professor Dr. Eduardo e ao Instituto Federal de Santa Catarina (IFSC), pela contribuição que está nos dando nos cortes histológicos.
Aos professores e a coordenação do PPGCS pelos ensinamentos e apoio prestados. As maravilhosas secretárias do PPG, a Fran (que foi seguir seu sonho, feliz por você!) e a Sil, por toda sua dedicação, carisma, profissionalismo e paciência
em nos (aturar) atender.
A banca examinadora, professora Ana e professora Aline pelas contribuições para melhorias futuras nessa e em novas pesquisas.
E a CAPES pelo apoio financeiro!
“São tempos difíceis para os sonhadores.”
RESUMO
O presente trabalho avaliou a mortalidade de larvas de Ae. aegypti expostas a nanocpásulas (NC) e nanoemulsões (NE) tendo o ativo piperina incorporado. As nanopartículas foram preparadas pelo método de nanoprecipitação e caracterizadas por Espalhamento de Luz Dinâmico. Larvas de Ae. aegypti 3º instar final e 4º instar inicial foram expostas as nanopartículas em diferentes concentrações e avaliação da mortalidade foi feita a cada 24 horas, para determinação das CL50. Foram analisados também o comportamento das larvas
submetidas as substâncias estudadas e os efeitos causados na morfologia externa. Foram realizados testes residuais para determinação do tempo de efeito larvicida. A NC apresentou diâmetro de 187,4nm, PDI 0,197nm e potencial Zeta de -31,51mV. A NE apresentou diâmetro de 112nm, PDI de 0,116 e potencial Zeta de -11,47mV. As CL50 da piperina não nanoencapsulada
foi de 14,50ppm em 24 horas de exposição, 6,05ppm em 48 horas e 5,48ppm em 72h. A NE apresentou CL50 22,8ppm (24h), 7,12ppm (48h) e 6,25ppm
(72h). A NC CL50 de 34,8ppm (24h), 12,14ppm (48h) e 8,28ppm (72h). Durante
os bioensaios foi possível observar as alterações nas larvas de Ae. aegypti submetidas aos diferentes tratamentos, tais como letargia, falta de mobilidade e diminuição do tamanho corporal. Pelo método de nanoprecipitação foi possível produzir os sistemas nanoestruturado, apresentando diâmetro de
partículas e potencial Zeta adequados pelo método. As CL50 das substâncias
estudadas apresentaram diferença significativas. As nanopartículas e a
solução piperina, foram consideradas promissoras como agentes larvicidas. A
nanocápsula e a nanoemulsão apresentarem efeito residual mais prolongado, comparado com a Piperina não nanoencapsulada. As larvas expostas aos bioensaios contendo piperina apresentaram diferença comportamental e na morfologia externa, das larvas que foram expostas ao controle.
ABSTRACT
The present study evaluated the mortality of Ae. aegypti exposed to nanocapsules (NC) and nanoemulsions (NE) incorporated with active piperine. Nanoparticles were prepared by nanoprecipitation method and characterized by Dynamic Light Scattering.
Ae. aegypti larvae of late 3rd instar and early 4th instar were exposed to nanoparticles
in different concentrations and mortality were verified every 24 hours for IC50
determination. The behavior of larvae submitted to the substances studied were analyzed. And external morphological alterations of larvae controls were also verified. Residual tests were performed to determine the larvicidal effect. NC had diameter of 187.4nm, PDI of 0.197nm and Zeta potential of -31.51mV. NE had diameter of 112nm, PDI of 0.116 and Zeta potential of -11.47mV. LC50 of non-nanoencapsulated piperine
was 14.50ppm in 24 hours exposure, 6.05ppm in 48 hours and 5.48ppm in 72 hours. NE presented 22.8ppm (24h), 7.12ppm (48h) and 6.25ppm (72h) LC50. The NC LC50
of 34.8ppm (24h), 12.14ppm (48h) and 8.28ppm (72h). During the bioassays it was possible to observe alterations of Aedes aegypti larvae submitted to different treatments, such as lethargy, lack of mobility and decrease of body size. By the method of nanoprecipitation it was able to produce nanostructured systems, presenting the diameter of particles and Zeta potential suitable for the method. The analyzed substances LC50 presented significant differences. As nanoparticles and a
piperine solution, they were considered promising as larvicidal agents. The nanocapsule is a nanoemulsion, in summary, more prolonged, compared to a non-nanoencapsulated Piperin. The larvae exposed to the tested substances presented behavioral differences and external morphology alteration, compared to larvae that were exposed to control.
LISTAS
Lista de abreviaturas
Ae. - Aedes
CHIKV – Chinkungunya DENV - vírus da dengue YFV – vírus da febre amarela ZIKV – Zika Vírus
SE – Semana Epidemiológica
OMS – Organização mundial da Saúde NC – nanocápsula
NE – nanoemulsão Piper –piperina
TecFarma – Grupo de Pesquisa em Tecnologia Farmacêutica IMPAR – Grupo de Pesquisa em Imunoparasitologia
Lista de quadros
Quadro 1– Variavéis de estudo... 44
Lista de tabelas
Tabela 1– Teste piloto para determinação das concentrações ... 47 Tabela 2 – Tamanho médio de partícula, PDI e potencial zeta das formulações
estudadas... 48 Tabela 3 – Resultados dos testes de mortalidade das soluções produzidas, relacionando a concentração com a % de larvas mortas em diferentes tempos (24, 48 e 72 horas)... 49
Lista de figuras
Figura 1 - Distribuição global dos vetores Ae. aegypti e Ae. albopictus... 17 Figura 2 - Ciclo Biológico do Aedes aegypti... 18 Figura 3 - Morfologia externa de larva de Ae. aegypti ... 19
Figura 4 - Sistema Digestivo de Larva de mosquito ... 20
Figura 5 - Número de casos prováveis de dengue, febre zika e febre chikungunya na SE 35 de 2016 e 2017... 23
Figura 6 - Piper nigrum... 28
Figura 7 – Estrutura do composto piperina... 29
Figura 8 – Representação da escala nanométrica... 30
Figura 9 - Exemplos de sistemas manométricos obtidos a partir de homo e copolímeros... 32
Figura 10 - Estrutura química da poli(caprolactona triol)... 33
Figura 11 – Estrutura química do polímero Eudragit L100... 33
Figure 12 - Representação esquemática do método empregado na preparação de nanopartículas baseado na precipitação do polímero pré-formado... 34
Figura 13 - Representação da nanocápsula e da nanoemulsão... 35
Figura 14: Fluxograma representando os tópicos dos procedimentos experimentais... 39
Figura 15 - A: Método de nanoprecitação... 41
Figura 16 - Representação dos Bioensaios... 44
Figura 17 – Raio de distribuição das partículas... 48
Figura 18 – Gráfico com os resultados dos testes de mortalidade em 24h das soluções produzidas... 51
Figura 19 – Gráfico Concentração letal (CL50) das substâncias estudadas... 52
Figura 20 - Gráfico Concentração letal das soluções de piperina, NC e NE em relação ao tempo (24, 48 e 72 horas)... 53
Figura 21 - Atividade residual das substâncias estudadas: mortalidade das larvas de Ae. aegypti a cada 48 horas... 54
Figura 22 – Morfologia externa das larvas exposta as substâncias estudadas e os respectivos controles... 58
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 16
1.1.1 Aedes ... 16
1.1.1.1 Morfologia externa e interna de larvas de mosquitoErro! Indicador não definido.8 1.1.2 Vetores ... 21
1.1.2.1 Arboviroses ... 22
1.1.2.2 Controle de Vetores... 25
1.1.3 Piperina (Piper nigrum) ... 28
1.1.4 Nanotecnologia ... 29
1.1.4.1 Breve histórico e aspectos gerais ... 29
1.1 4.2 A formação dos nanomateriais ... 31
1.1.4.3 Nanotecnologia aplicada a inseticidas... 36
2. OBJETIVOS ... 38 2.1 OBJETIVO GERAL ... 38 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 38 3. MÉTODOS ... 39 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 39 3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ... 39
3.3 OBTENÇÃO DAS LARVAS DE Ae. aegypti ... 39
3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 40
3.5 ENSAIOS/TESTES/TÉCNICAS ... 40
3.5.1 Síntese das nanopartículas poliméricas ... 41
3.5.2 Determinação do tamanho médio de partícula e PDI. ... 42
3.5.3 Determinação do Potencial Zeta ... 43
3.5.4 Avaliação da atividade larvicida do ativo e incorporado nas nanoestruturas para determinação das concentrações letais 50 (CL50) ... 43
3.5.5 Estudo da atividade residual ... 44
3.5.6 Avaliação do comportamento e aspecto morfológico das larvas expostas as substâncias estudadas ... 44
3.7 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS ... 45
3.8 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ... 45
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 46
4.1 SÍNTESE DAS SOLUÇÕES ESTUDADAS ... 46
4.1.1 Caracterização das nanopartículas estudadas. ... 47
4.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO LETAL E RESULTADOS DA MORTALIDADE EM LARVAS DE Ae. aegypti. ... 48
4.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO RESIDUAL ... 54
4.4COMPORTAMENTO E ASPECTO DAS LARVA DURANTE OS BIOENSAIOS .. 56
5 CONCLUSÃO ... 60
5.1 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 60
REFERÊNCIAS ... 61
APÊNDICE ... 71
APÊNDICE A – Artigo relativo à dissertação ... 71
APÊNDICE B –Produção científica publicada durante o período do Mestrado...93
ANEXO A- Normas da revista “Experimental Parasitoloy” para publicação de artigos...96
1. INTRODUÇÃO
As arboviroses são doenças causadas por vírus e que são transmitidas por artrópodes vetores. Estes vírus são considerados de importância médica e veterinária por causarem, no mundo, milhões de infecções humanas e animais1. Em humanos,
são responsáveis por uma alta carga de morbidade e mortalidade especialmente nos países mais pobres, causando ausência escolar, aumento da pobreza, diminuição da produtividade econômica e sobrecarga dos sistemas de saúde2.
O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) é o vetor de diversas arboviroses de importância médica que acometem grande parte da população mundial, sendo transmissor do vírus da febre amarela urbana, da dengue, da Chikungunya e do Zika vírus3. O aumento destas infecções nos último anos4–6 e
das comorbidades relacionadas a elas7; os gastos que são gerados em saúde, sejam
no setor público ou privado8; e os casos de óbitos gerados por estas infecções3; são
razões que vem contribuindo para que este mosquito seja alvo de estudos de novas metodologias de controle do mesmo, principalmente larvicidas e inseticidas.
Atualmente, apesar de doenças como a febre amarela contarem com vacinas eficazes, a melhor forma de prevenção destas doenças transmitidas pelo Ae. aegypti, está no controle do vetor9. Diferentes métodos de controle do Ae. aegypti vêm sendo
propostos, uma das metodologias mais adotadas para o controle de vetores com importância em saúde pública é uso de inseticidas de origem orgânica ou inorgânica10. No entanto, a forte exposição dos mosquitos aos inseticidas sintéticos na
agricultura, pecuária e nas áreas de saúde pública acaba permitindo a seletividade dos mosquitos mais resistentes10–12.
Neste aspecto, novas alternativas para o controle de vetores são necessárias, em especial de alternativas biodegradáveis, que diminuam ou letifiquem o processo de resistência. As plantas e compostos químicos derivados destas, podem ser utilizados como alternativas aos inseticidas, em que a seleção de indivíduos resistentes é difícil devido à grande quantidade de agentes ativos em uma única planta, além de permitir um controle de vetores rápido seguro e sustentável 13,14.
Um exemplo de planta que pode estar sendo utilizada como alternativa de controle, e a espécie Piper nigrum15. O gênero Piper tem recebido atenção
plantas deste gênero possuem vem sendo estudados para utilização como fármacos, conservantes, inseticidas e agentes de controle larvicida15,16. A espécie Piper nigrum
tem mostrado em estudos ter potencial inseticida para ser utilizada como agente larvicida de Aedes aegypti15,17. Entretanto, por ser uma substância de origem vegetal,
seu uso pode se tornar limitado devido a sua baixa atividade residual18. Esta
característica pode ser corrigida por sistemas de liberação controlada, sendo uma alternativa atraente, pois aumenta a disponibilidade das substâncias inseticidas aos vetores em contato com a água parada19.
As nanopartículas vêm sendo estudadas, como sistemas de liberação de ativos de origem botânica para controle de mosquitos vetores. Estas associações entre nanopartículas e plantas, têm sido relatadas como eficazes no controle de ovos, larvas, pupas e adultos de mosquitos de importância médica e veterinária20.
A utilização de nanopartículas tem sido uma ferramenta versátil para inseticidas, aumentando a sua dispersão em meios aquosos e permitindo uma liberação controlada do composto ativo. Suas vantagens, como sistemas de liberação são, maior seletividade, sem prejudicar o composto bioativo21, possibilidade de
preparação de formulações contendo compostos insolúveis que podem ser mais facilmente dispersos em solução; que leva a uma interação mais eficaz com o inseto-alvo. Estas particularidades permitem a menor quantidade na utilização do composto ativo por área, se a formulação proporcionar uma liberação adequada da concentração do inseticida para o organismo alvo22.
Contudo, são necessários estudos que analisem o comportamento de nanopartículas na morfologia de larvas de Aedes aegypti e que avaliem quais destes sistemas nanoestruturados tem maior potencial para desenvolvimento de novos inseticidas. E sabendo que substâncias derivadas de plantas possuem uma redução da atividade residual, sendo necessária a reaplicação do produto. Torna-se importante estudos que avaliem a atividade residual destas substâncias, estando ou não nanoencapsuladas para que se possa ter uma melhor veiculação dos métodos de controle.
Frente a isso, o presente trabalho avaliou o ativo piperina, derivado da planta
Piper nigrum, como possível agente larvicida de Aedes aegypti, estando incorporado,
ou não, em diferentes nanopartículas. A mortalidade das larvas de Ae. aegypti exposta as diferentes substâncias, foi avaliada para determinação das concentrações
letais 50 (CL50), foram analisados os aspectos dos efeitos na morfologia externa e no
comportamento das larvas, e realizados testes residuais com as CL50 das diferentes
substâncias estudadas.
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 Aedes
O gênero Aedes, pertence à família Culicidae, e compreende espécies de mosquitos de importância médica e veterinária. Os seguintes subgêneros de Aedes ocorrem no Brasil: Ochlerotatus, Stegomyia, Howardinae Protomacleaya. Sendo que nos subgêneros Stegomyiae Ochlerotatus estão agrupadas as espécies de importância epidemiológica. Destacando-se o subgênero Stegomyia¸ em especial a espécie Aedes (Stegomyia) aegypti, sendo que o Aedes (Stegomyia) albopictus também pertence a este subgênero. São originárias da Europa, Ásia e África, mais precisamente da região etiópica, mas estas duas espécies invadiram países fora de sua distribuição zoogeográfica original, incluindo o Brasil23.
O Ae. aegypti é um mosquito originário da África, onde existem populações silvestres e domésticas. A espécie Ae. aegypti tem distribuição mundial (Figura 1), encontrando-se, em geral, entre as latitudes 35° Norte e 35° Sul. É um mosquito adaptado ao ambiente urbano e utiliza os recipientes mais frequentes no domicílio ou peridomicílio – tanques de armazenamento de água e vasilhames temporários, dentro e fora das casas, como potes, barris, pneumáticos usados, latas, garrafas e vasos de plantas – para o desenvolvimento de sua fase larvária. As larvas também podem ser encontradas em calhas de telhado, axilas de folhas, bambus cortados 24.
Figura 1 Distribuição global dos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus. Fonte: Argawal, et al. 2017
O Ae. Aegypti é holometábolo, apresentando desta forma, metamorfose
completa em seu ciclo evolutivo (Figura 1). Como os demais culicídeos, seu ciclo de vida engloba duas fases de vida, a aquática que inclui três estágios de desenvolvimento: ovo, larva (quatro estágios =L1, L2, L3 e L4) e pupa e a terrestre, que corresponde ao mosquito adulto 25.
Figura 2 – Ciclo Biológico do Aedes aegypti. Fonte: Sanofi, 200426.
1.1.1.2 Morfologia externa e interna de larvas de mosquito
As larvas de mosquitos (Figura 2), sempre aquáticas, têm aspecto vermiforme, seu corpo é dividido em cabeça, tórax (que são mais globosos), e em abdome que tem aparência semicilíndrica e está dividido em nove segmentos (segmentos I-VIII, similares entre si, e IX, diferenciado em lobo anal). O corpo da larva apresenta cerca de 222 pares de cerdas, dispostas de maneira simétrica, que têm função sensorial e auxiliam na flutuação25.
Figura 3 - Morfologia externa de larva de Ae. aegypti. A- Cabeça; 1-Boca; 2- Antenas; 3- Olhos. B- Tórax. C- Abdômen; 4- Pares de Cerdas; 5 Papilas anais; 6 Sifão.
Fonte: Elaborado pelos autores.
A cápsula cefálica, das larvas de mosquitos possuem um conjunto de escleritos, cujos limites são evidenciados pelas suturas ou linhas. É provida de um par de antenas e de olhos compostos por 1 a 5 grupos de ocelos laterais 27. Estes últimos
aparecem como mancha escura bilateral, posterior a qual existe uma mácula, geralmente de aspecto reniforme, que persistirá na fase pupal e representa o olho composto do adulto em formação. No primeiro estágio, a larva é provida de um "dente" quitinoso no clípeo, que a auxilia no processo de eclosão25
Diferente dos adultos que possuem aparelho bucal adaptado à punção, as larvas têm aparelho bucal do tipo mastigador-raspador, as peças bucais consistindo de epifaringe, mandíbulas, maxilas, hipofaringe e lábio. As mandíbulas e maxilas são placas robustas, dotadas de dentes e cerdas fortes, úteis à trituração dos alimentos e empregadas em estudos filogenéticos28.
A B C 1 3 2 4 5 6
À frente da cabeça das larvas encontram-se as escovas orais ou palatais, constituídas de um par de escovas laterais e um de escovas medianas (ventrais). Tais escovas, quando em movimento, promovem correntes hídricas que trazem para a boca da larva as partículas que serão mastigadas25. A maioria das larvas de
mosquitos alimenta-se indistintamente do microplâncton presente em seus habitats, a ingestão não seletiva de partículas por parte das larvas facilita a utilização de larvicidas por ação digestiva28 principal órgão de armazenamento é o corpo
gorduroso, que se localiza sob a epiderme nas regiões torácica e abdominal. As reservas consistem principalmente em proteínas e glicogênio e são de primordial importância para o desenvolvimento dos estágios superiores de pupa e adulto25.
Embora as larvas de mosquitos possam raspar superfícies com as suas peças bucais, a filtração constitui a forma mais comum de alimentação. Uma larva pode filtrar até 2 litros de água por dia. A faringe e esôfago constituem o intestino
anterior, e o esfíncter cardíaco, existente no início do intestino médio tem por função evitar o regurgitamento e impulsionar o alimento para frente. As células que revestem o estômago são altas e possuem os bordos estriados, estando adaptadas à secreção e absorção. No revestimento dos cecos gástricos existem grandes células de citoplasma granular, provavelmente adaptadas à secreção. Após o estômago abrem-se 5 túbulos de Malpighi, compostos de grandes células achatadas com grandes núcleos. O intestino posterior consiste na câmara pilórica, um íleo (ou intestino delgado), o reto (ou cólon) e um dueto anal28–31 (Figura 4).
Figura 4 - Sistema Digestivo de Larva de mosquito. Sg.: glândula saliva; g.2: sub-esofago; Mo: Boca; P: Faringe; g.1 Supra esôfago; Oe: esôfago; Pv: proventrículos Cs: cecos gástricos; Mt: túbulos de malpighi; Rc: reto; Co: Colón, IL: íleo; Mg: intestino médio.
Os três segmentos torácicos são identificáveis apenas pelos conjuntos de cerdas de cada um: Protórax (P), Mesotórax (M) e Metatórax (T). Numa larva, no final do quarto estágio podemos identificar as trompas respiratórias pupais em formação dentro do tórax. Os segmentos abdominais são facilmente identificáveis, sendo que os sete primeiros - segmentos I-VII - apresentam cerca de 13 pares de cerdas cada um 25.
O segmento X é também conhecido como lobo ou lóbulo anal, pois nele termina o tubo digestivo da larva. No ápice deste segmento, ao redor do ânus, encontram-se quatro processos com aparência de língua, chamados papilas anais. Ainda ligado ao segmento VIII acha-se o sifão respiratório, tubo na extremidade do qual se abrem os espiráculos25.
Embora aquáticas, as larvas de mosquitos respiram sempre o oxigênio do ar, necessitando para isso chegar à superfície da água ou ligar-se através de um sifão respiratório adaptado 25.Todas as larvas de mosquitos passam por 4 instares, sendo o
último destes o mais longo. Os machos têm, em média, um desenvolvimento larvário mais rápido do que as fêmeas25.
Em saúde pública, o papel do controle de vetores é prevenir a infecção mediante o bloqueio ou redução da transmissão. Hoje doenças, como a febre amarela, contam com vacinas eficazes, e a malária com medicamentos eficientes. Entretanto, o controle contra o vetor é indispensável para a prevenção de doenças como a dengue e para fazer parte de programas voltados à prevenção e controle da malária e das leishmanioses8.
1.1.2 Vetores
Os vetores são organismos que podem transmitir doenças infecciosas entre os seres humanos ou de animais para seres humanos. Muitos destes vetores são insetos hematófagos, que ingerem microorganismos, causadores de doença, durante o repasto sanguíneo de um hospedeiro infectado (humano ou animal) e depois injetá-lo em um novo hospedeiro durante o repasto subsequente. Os mosquitos são os vetores de doenças mais conhecidos. Outros incluem carrapatos, moscas, flebotomíneos, pulgas, triatomíneos e alguns caracóis aquáticos de água doce1.
Os mosquitos são uma ameaça fundamental para milhões de pessoas em todo o mundo, uma vez que eles atuam como vetores transmitindo parasitas e organismos 1,32. Eles apresentam grande adaptabilidade biológica, variabilidade
genética e ampla valência ecológica. Por possuir o maior número e o mais importante grupo de insetos hematófagos (apenas as fêmeas exercem hematofagia), a família Culicidae apresenta grande interesse em parasitologia médica, devido esta sua capacidade de transmitir patógenos. Os principais gêneros que possuem espécies de importância médica sanitária são Anopheles, Aedes, Haemagogus e
Culex, transmitindo patógenos capazes de causar doenças como a malária, febre
amarela, a dengue, vírus Chikungunya, encefalites, entre outras 23.
1.1.2.1 Arboviroses
As doenças virais que são transmitidas para o homem por artrópodes, são chamadas de arboviroses. Os arbovírus são vírus de RNA zoónoticos (Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae e Rhabdoviridae) que são mantidos na natureza como zoonoses e dependem dos artrópodes vetores para seu ciclo de vida1,4.
A transmissão dos microrganismos se dá quando estes vetores, principalmente mosquitos e carrapatos, alimentam-se de sangue de animal infectado. A transmissão vertical pode também ocorrer, através de uma via transovariana, em que a mãe artrópode transmite os arbovírus para a sua progénie. Os arbovírus possuem grande capacidade de evolução e adaptação, o que torna a emergência e reemergência destes agentes um fenômeno natural5.
Os arbovírus representam no mundo uma ameaça significativa para a saúde humana e veterinária6. As arboviroses são de grande relevância na saúde pública,
calcula-se que haja mais de 545 espécies de arboviroses, sendo que destas 150 estão relacionadas com doenças humanas, a maioria zoónotica33.
As arboviroses têm se tornado, importantes e constantes ameaças em regiões tropicais devido às rápidas mudanças climáticas, desmatamentos, migração populacional, ocupação desordenada de áreas urbanas, precariedade das condições sanitárias que favorecem a amplificação e transmissão viral34. O Brasil sendo um
grande país tropical (8.514,215km2) possui muitos ecossistemas que oferecem condições ideiais para a existência de muitos arbovírus. O IBGE estima que no Brasil
a uma população de 208 milhões de habitantes, a maioria vivendo em grandes cidades do nordeste e sudeste do país35. Além da existencia de grandes cidades
populosas, a infestação de mosquitos do gênero Culex e o antropofílico Ae. aegypti contribuem para o quadro de registro de arboviroses no Brasil, como o vírus da febre amarela (YFV), vírus da dengue (DENV),5,6 e, mais recentemente o Chinkungunya
(CHIKV) e o Zika Vírus4,7.
A Dengue, febre de Chikungunya e febre pelo vírus Zika são doenças de notificação compulsória, e estão presentes na Lista Nacional de Notificação Compulsória de Doenças, Agravos e Eventos de Saúde Pública do Brasil. A secretaria de vigilância em saúde, no boletim epidemiológico da semana epidemiológica (SE) 35 de 2017, publicou o número de casos prováveis , casos sobre investigação, casos de óbitos confirmados e sobre investigação, referentes a essas arboviroses, comparando com o mesmo período de 201636. A figura 5, mostra o número de casos prováveis
dessas arboviroses: apresentado no boletim epidemiológico. .
Figura 5- Número de casos prováveis de dengue, febre zika e febre chikungunya na Semana Epidemiológica 35 de 2016 e 2017.
Fonte: Adaptado de Ministério da Saúde36
A dengue reemergiu como um grande desafio para a saúde pública no mundo todo, com 2,5 bilhões de pessoas em risco de infecção, mais de 100 milhões de casos e 25.000 mortes sendo relatadas anualmente37. A dengue provoca febre com dor de
cabeça, erupção cutânea e debilitantes dores musculares. Embora a maioria dos 0 200.000 400.000 600.000 800.000 1.000.000 1.200.000 1.400.000 1.600.000
Febre Chikungunya Febre Zika Dengue
2016 2017 Nú mero d e ca so s prov áv eis Arboviroses
casos de dengue se desenvolve bem, complicações podem ocorrer em algumas pessoas que precisam ir a uma unidade de saúde para receber tratamento adequado38.
Em apenas um ano, a dengue custou ao Brasil cerca de R$ 2,7 bilhões. Com base em dados de 2.035 pacientes infectados pela doença em 2013, pesquisadores de dez instituições brasileiras e internacionais calcularam quanto a dengue pode custar para os sistemas de saúde público e privado, e para a população. De acordo com a pesquisa, os gastos dos sistemas de saúde ficam em torno de R$ 1 bilhão por ano, enquanto as despesas indiretas da população com a doença chegam a R$ 1,7 bilhão8.
Outra arbovirose que pode ser transmitida tanto pelo Ae. aegypti quanto pelo
Ae. albopictus (Skuse, 1894) é a febre chikungunya. Está arbovirose é causada pelo
vírus chikungunya (CHIK). 4, causando ao paciente infectado febre alta, dor severa,
erupção cutânea, dor de cabeça e muscular. Um caso em mil, pode ser considerado grave e que precisa de hospitalização, sendo que existem relatos de mortalidade devido ao vírus CHIK. Em pessoas com mais de 45 anos pode apresentar uma fase crônica da doença com dor nas articulações que pode durar meses ou anos1. Desde
que foi isolado pela primeira vez em 1952, o vírus foi detectado como o agente etiológico de epidemias esporádicas na África e na Ásia e, desde 2004, expandiu sua distribuição geográfica, encontrando-se hoje nas lhas do Oceano Índico, Ásia, Europa, e nas Américas, causando milhões de infecções humanas4.
O vírus Zika (ZIKV) também é um vírus transmitido por artrópodes, ele pertence ao gênero Flavivirus e a família Flaviviridae. Ele foi isolado pela primeira vez a partir de um primata não humano em 1947 e de mosquitos, em 1948, na África. O ZIKV normalmente é transmitido pela picada de mosquitos infectados39. O Zika
vírus, causa uma doença viral que envolve febre ligeira, erupção cutânea, dor de cabeça, mal estar e conjuntivite purulenta, que ocorre dentro de três a 12 dias após a picada do mosquito vetor. Os sintomas podem durar de dois a sete dias37.
Existem algumas informações preocupantes em relação ao atual estado do ZIKV, a recente descoberta de sua capacidade de ser transmitido sexualmente em humanos, à transmissão transplacentária, durante o parto e no período perinatal e possivelmente por transfusão de sangue e por saliva7. A infecção do ZIKV foi
em 2013 e 2014, quando foram relatadas complicações neurológicas graves, e o surgimento no Brasil de um aumento dramático de malformações congénitas graves (microcefalia) suspeitos de estarem associados com ZIKV. A apresentação clínica da febre Zika é inespecífica e pode ser diagnosticada como outras doenças infecciosas, especialmente as causadas por arbovírus como a dengue e chikungunya39. Até o
momento, não existe nenhuma vacina para a prevenção de Zika7.
A febre amarela é uma doença hemorrágica viral aguda causada por um vírus flavivírus, transmitido por mosquitos infectados do gênero Aedes, responsável pela transmissão da febre amarela urbana e o Haemagogus, pela transmissão da febre amarela silvestre40. Até 50% das pessoas gravemente afetadas sem
tratamento, morrem de febre amarela. No mundo, todo ano ocorrem cerca de 200 000 casos de febre amarela, causando 30 000 mortes41. O vírus é endêmico em zonas
tropicais da África e da América Latina, com uma população combinada de mais de 900 milhões de pessoas40. O número de casos de febre amarela tem aumentado ao
longo das últimas duas décadas, isso se deve à diminuição da imunidade da população à infecção, o desmatamento, a urbanização, os movimentos da população e as alterações climáticas41. Não há tratamento específico para a febre amarela, este
é apenas sintomático, destinada a reduzir os sintomas para o conforto do paciente. A vacinação é a medida preventiva mais importante contra a febre amarela, é segura, altamente eficaz e acessível, e uma dose única de vacina de febre amarela é suficiente para conferir imunidade por 10 anos40,42.
A partir da descoberta do papel de membros da família Culicidae (Diptera) na veiculação destas e de outras arboviroses, houve maior interesse em estudar mais detalhadamente sua bioecologia, a fim de descobrir nela os pontos vulneráveis para mais facilmente combatê-los1,25,32. A melhor prevenção da dengue, da chikungunya,
do Zika vírus e de outras arboviroses, é através do controle do vetor32. As arboviroses
têm representado um grande desafio à saúde pública, afetando cerca de metade da população do mundo. Os fatores ambientais, como as mudanças climáticas e os desmatamentos; e os sociais, como a globalização, facilidade de viagens e do comércio têm um impacto significativo sobre a transmissão da doença1.
O controle vetorial bem planejado tem uma contribuição significativa para a redução da transmissão de arboviroses, no entanto o poder preventivo do controle de vetores é grosseiramente subutilizado em saúde pública32. Como forma de prevenção,
é importante levar em consideração algumas medidas de proteção, que podem estar sendo adotadas pela população em geral, como por exemplo o uso de roupas que protejam pernas e braços contra a picada de insetos, instalação de telas em portas e janelas das residências, cobrir os recipientes onde é armazenada a água e não deixar água parada ou acumular lixo2.
Segundo a organização mundial da saúde as doenças transmitidas por vetores representam 17% de todas as doenças infecciosas, causando mais de um milhão de mortes anualmente23. Algumas dessas doenças, como a febre amarela, contam com
vacinas eficazes, e outras como a malária com medicamentos eficientes para o tratamento, mas o controle vetorial ainda é fundamental para a prevenção de doenças como a leishmioses, dengue, malária, febre Zika e febre Chikungunya6,43,44,
A prevenção e o controle destes vírus dependem do controle do mosquito
vetor32,43. Diferentes métodos de controle vêm sendo propostos. Uma das
metodologias mais adotadas para o controle de vetores com importância em saúde pública é uso de inseticidas de origem orgânica ou inorgânica45. Do mesmo modo,
existem métodos alternativos ao controle químico, que vem sendo estudados e muito utilizados. Estes podem ser controle ambiental, biológico, genético, pessoal e mecânico46, mas muito destes métodos estão limitados devido à microevolução dos
mosquitos45.
A proteção contra mosquitos vetores é baseada em três métodos essenciais de aproximação47–49:
(i) Proteção contra adultos, com base em mata-los, por meio de pulverização e utilização de inseticidas. Sendo uma maneira mais comum e eficiente de proteção das pessoas em suas casas.
(ii) Proteção baseada em impedir picadas dos insetos usando repelentes. Os repelentes são substâncias sintéticas (DEET) ou de origem natural (por exemplo, óleos essenciais) que repelem as fêmeas, evitando assim que elas suguem o sangue e, consequentemente a transmissão de possíveis patógenos. No entanto, embora relativamente eficiente e popular este método de proteção indireta geralmente oferece menor
eficácia, considerando a necessidade de repetir a aplicação repelente em intervalos regulares de horas.
(iii) Redução da densidade populacional de adultos. Como descrito na sessão “1.1”, o desenvolvimento, dos estágios imaturos de mosquitos ocorrem em água estagnada. Desta forma, representam um alvo mais fácil se comparado aos adultos devido à sua mobilidade reduzida. Além disso, o ambiente aquático permite o emprego de extratos de plantas bastante baratos, que pode ser prontamente preparado e empregado por populações pobres, sem custos extremamente elevados que caracterizem algumas ações de controle baseadas no emprego de produtos químicos ou pesticidas microbianos48,50,51 .
Entretanto, o controle químico é o mais empregado, estes, em sua maioria são de origem sintética. Quatro classes de inseticidas químicos ainda são os pilares dos programas de controle vetorial, são eles: os carbamatos, organoclorados, organofosforados e piretróides49. No entanto, a maioria dos inseticidas quando
aplicados não afetam exclusivamente os organismos alvos, também podem afetar organismos não-alvo, como plantas e animais, levando a perda de biodiversidade após a aplicação repetida. Muitos pesticidas não se degradam facilmente e podendo persistir no solo, infiltrar-se em águas subterrâneas e de superfície e contaminar de forma mais ampla o ambiente49,52. Desta forma, podem também influenciar na saúde
humana, porque dependendo das suas propriedades químicas, eles são capazes de entrar em um organismo e bioacumular em cadeias alimentares49.
Piretróides e organofosforados são geralmente utilizados para o controle de larvas de mosquitos53,54. Porém, com a ampla utilização destes, foram detectadas
populações resistentes de Ae. aegypti em inúmeros países11,54,55. No Brasil, diversos
estudos comprovam a resistência deste vetor frente aos inseticidas de origem sintética54,56,57. No processo de desenvolvimento de resistência pode ocorrer um
fenômeno denominado de “resistência cruzada” (proteção contra mais de um inseticida por apenas um mecanismo de ação, comum entre piretróides) e, dependendo do mecanismo envolvido, a resistência a um determinado inseticida pode levar também ao estabelecimento de resistência a inseticidas de outras classes, dificultando a substituição do produto58.
Torna-se evidente a necessidade do desenvolvimento de novas alternativas de controle, tanto para dengue como para outras arboviroses, que sejam biodegradáveis e que diminuem o processo de resistência59,60,13. Vários estudos
indicam que as plantas e compostos químicos derivados destas podem ser utilizadas como alternativa aos inseticidas, em que a seleção de indivíduos resistentes é difícil devido à grande quantidade de agentes ativos em uma única planta, além de permitir um controle de vetores rápido, seguro e sustentável13,14,17.
1.1.3 Piperina (Piper nigrum)
A Piper nigrum L. (figura 6) é uma planta conhecida popularmente como pimenta preta, é originária da Ásia e pertence à família Piperaceae61. O gênero Piper
abrange mais de mil espécies, sendo as mais conhecidas a P.nigrum, P. longum e P.
betle 16. A P. nigrum apresenta inflorescência em forma de espiga e é composta de pequenas flores desprovidas de cálice e corola. Os frutos são globosos, pequenos e indeiscentes, quando imaturos apresentam coloração verde-escura e quando maduros adquirem uma coloração vermelha62. As sementes encerram uma resina, à
qual se devem seu sabor picante e um óleo essencial de cheiro muito ativo com alto teor de uma substância chamada piperina (figura 7), a qual é um alcalóide e possui várias atividades biológicas, incluindo inseticida, nematicida e antiparasitária 16,61,63.
Figura 6 – P. nigrum.
Fonte: Plants of the World Online64
A piperina é o principal alcalóide responsável pela pungência da pimenta, demonstrou potencial inseticida para ser utilizada como agente larvicida contra o vetor Ae. aegypti15,17,63. Entretanto, por ser uma substância de origem vegetal, seu uso
pode se tornar limitado devido a sua baixa atividade residual18. Esta característica
pode ser corrigida por sistemas de liberação controlada, sendo uma alternativa atraente19.
Figura 7 – Estrutura do composto piperina; Fonte: adaptado de Ahmad (2012)65
Algumas opções farmacotécnicas, como a utilização de sistema de liberação controlada de substâncias ativas podem ser utilizadas para aumentar a disponibilidade das substâncias inseticidas aos vetores em contato com a água parada. Na área agrícola, sistemas deste tipo, como as microcápsulas ou hidrogéis já estão sendo utilizado com o objetivo de diminuir a toxicidade de pesticidas químicos ao meio ambiente e ao homem, assim como reduzir o número de aplicações dessas substâncias18,66.
1.1.5 Nanotecnologia
1.1.5.1 Breve histórico e aspectos gerais
A nanotecnologia pode ser definida como a tecnologia da produção e modificação de materiais, dispositivos e sistemas de dimensões na ordem dos nanômetros. Permitindo a modificação e optimização das propriedades físicas, químicas e biológicas das partículas e, portanto, pode ser aplicada em diversas áreas da Medicina, Farmacologia, Eletrônica, Química, Biologia, etc67, podendo desta forma,
oferecer uma contribuição significativa em diversas áreas da ciência e tecnologia. Uma revolução vem ocorrendo nessas duas áreas, desde o entendimento, de que materiais em escala nanométrica podem apresentar comportamentos e/ou propriedades diferentes daquelas que geralmente apresentam em escala macroscópia68.
Apesar de ser considerada uma ciência recente, a nanotecnologia já era utilizada no século IX pelos gregos, uma vez que nanopartículas de ouro e prata eram usadas nos vasos de cerâmica para produzir um efeito brilhante e decorativo69 No
entanto, a ideia de manipulação de átomos e/ou moléculas individuais em escala nanométrica foi apresentada pela primeira vez por Richard Feynman, em 29 de dezembro de 1959 em sua palestra “Há muito espaço na parte inferior”69,70. Nesta
palestra Feynman explicou que nanomateriais não se comportam da mesma maneira que materiais em escala macroscópica, e deste modo, trabalha-se com propriedades e comportamentos diferentes. Mas o termo nanotecnologia surgiu apenas em 1974, em um trabalho realizado por Taniguchi e colaboradores que o empregam a se referir a capacidade de se projetar materiais em níveis nanométrico70.
De acordo com Bhattacharyyal et al (2010), a palavra "Nano" é derivada do grego que significa "anão". Em termos mais técnicos a palavra nano, equivale a qualquer a partículas com dimensões na ordem dos nanômetros (1 a 1000nm, geralmente), sendo assim 1 nanômetro é equivalente a bilionésima parte de 1 metro71.
As nanopartículas são milhares de vezes menores que um fio de cabelo72, a figura 8
representa a escala nanométrica comparando o tamanho das nanopartículas com outras estruturas:
Figura 8 – Representação da escala nanométrica Fonte: Boisseau P, Loubaton B, 201172.
1.1.5.2 A formação dos nanomateriais
Apesar de o tamanho das partículas e das estruturas nanométricas serem consideráveis, o mais importante é a alteração das propriedades de um material ao atingir essa escala. Essas alterações se devem à combinação de fatores quânticos, os quais são melhores observados em escala nanométrica, e também dependem da razão entre a área superficial e volume de uma amostra73.
Do ponto de vista tecnológico o sistema nanoestruturados podem ser sintetizados de duas maneiras: pelo método top down (de cima para baixo) ou pelo método bottom up (de baixo para cima). A abordagem bottom-up consiste basicamente em construir estruturas átomo a átomo ou molécula por molécula. Já a
top down parte-se de um bloco sólido para se obter as nanoestruturas, do “macro
para o nano”74.
Todas as classes de materiais, como polímeros, vidros, cerâmicas, semicondutores e metais podem ser obtidos em escala nanométrica, através do controle e formato da partícula, sem alterar sua composição química e estrutura tridimensional. Como descrito anteriormente, quando se trabalha em escala nanométrica, as propriedades dos materiais são modificados, conferindo-lhe novas aplicações75.
As nanoestruturas poliméricas são sistemas coloidais sólidos, que apresentam aplicações promissoras76. A diferença estrutural nos diferentes tipos de
nanoestruturas está relacionada com o método empregue na sua preparação77. A
Figure 9 – Exemplos de sistemas nanométricos obtidos a partir de homo e copolímeros.
Fonte: Zepon, 201378.
As nanopartículas podem ser obtidas por meio de polímeros biodegradáveis, como a policaprolactona triol (PCL-T) e polímeros sintéticos, como por exemplo os Eudragit L100 76. A PCLT (figura 10) é um polímero obtido a partir da poli
(ε-caprolactona), de massa molar mais baixa, com três grupos hidroxilas terminais que conferem maior caráter hidrofílico a este polímero 79. O Eudragit L100 (figura 11) é um
copolímero entérico, cuja solubilidade dependente do pH, que possui grupos de ácido metacrílico (metacrilatos) na sua estrutura, sendo utilizado para administração oral e liberação controlada, uma vez que é insolúvel em soluções ácidas (pH < 3) e solúvel em soluções neutras ou alcalinas (6 < pH < 8) 80. A escolha destes materiais para
matrizes dessas nanopartículas dependem de fatores que se desejam obter como o tamanho das nanopartículas, solubilidade aquosa dos ativos; carga e permeabilidade da superfície, degradabilidade, toxicidade e perfil de liberação76.
Figura 10 - Estrutura química da poli (caprolactona triol) Fonte: Xu J, et al, 200681.
Figura 11 – Estrutura química do polímero Eudragit L100. Fonte: Oliveira, et al 201180.
Para obtenção de nanopartículas poliméricas pode-se utilizar diferentes métodos, no entanto, há alguns fatores que devem ser observados, como a toxicidade dos solventes empregados, a facilidade de aumento de escala e a eficiência do encapsulamento do material desejado76 . Os métodos para preparação as
nanopartículas podem ser divididos em duas classes: a primeira inclui os métodos que consistem em reações de polimerização, e a segunda baseia-se na precipitação interfacial de polímeros pré-formados82.
Nas indústrias farmacêuticas, a técnica de evaporação do solvente (Figura 12), é um exemplo de uma técnica amplamente utilizada na preparação de partículas, pois
esta facilita a liberação controlada de fármacos. Polímeros insolúveis em água são usados como matriz de encapsulamento usando esta técnica83. Independentemente
do método de preparação, os produtos são obtidos como suspensões coloidais aquosas82. Determinadas suspensões coloidais não possuem tendência a separar as
fases até alguns meses após seu preparo. Isto se deve a alta viscosidade do meio dispersante já que, o movimento Browniano é lento para partículas em escala nano. Porém, em função do tempo pode ocorrer a aglomeração e a sedimentação, indicando que o sistema desestabilizou 84.
Na ausência de um agente de repulsão a desestabilização se torna muito alta entre as cargas das nanopartículas em solução aquosa. Torna-se necessário criar uma força repulsiva para neutralizar a atração de Van de Waals (interpelações moleculares fracas). Os tensoativos carregados (que proporcionam estabilidade eletrostática, formando uma dupla camada de cargas) ou os não-iônicos (que proporcionam estabilidade esférica) podem ser utilizados para estabilizar as nanoemulsões85.
Os tensoativos não-iônicos são a maior classe de compostos empregados em sistemas farmacêuticos, possuem boa estabilidade e compatibilidade química, são menos sensíveis a variações de ph, possuem baixa toxicidade e podem ser empregados em formas de uso tópico, oral e parenteral. Exemplo de tensoativos não iônico são o polissorbatos: o monooleato de polioxietilenossorbitan (Tween 80) e o monolaurato de polioxietilenossorbitan (Tween 20)86.
Figure 12 - Representação esquemática do método empregado na preparação de nanopartículas baseado na precipitação do polímero pré-formado.
Na área farmacêutica o método para preparo de nanopartículas mais utilizado é a técnica de evaporação de solvente. Segundo e Sabry87, umas das formas
liberação mais populares de nanopartículas, que vêm sendo utilizadas em formulações controlada são as nanocápsulas e as nanoelmusões (Figura 13).
Figura 13 - Representação da nanocápsula e da nanoemulsão, respectivamente. Fonte: Villanova. 2010 88
As nanocápsula são sistemas caracterizados por apresentar um núcleo interno oleoso, onde o fármaco deve se encontrar preferencialmente dissolvido, revestido por uma membrana polimérica89. As nanocápsula isolam o fármaco na
cavidade central das partículas, conferindo uma maior proteção do princípio ativo frente à degradação no meio biológico, permitindo a veiculação de moléculas hidrofóbicas, além de reduzir o efeito de liberação inicial90.
As nanoemulsões: são sistemas constituídos de glóbulos de tamanhos reduzidos (20nm a 500nm). São transparentes e estáveis por tempo prolongado, podendo incorporar grande quantidade de substâncias lipofílicas e podem veicular princípios ativos nas fases interna e externa91. São frequentemente caracterizadas
como formulações do tipo óleo em água (O/A), sendo a fase interna (dispersa) oleosa e a fase externa aquosa. Essa abordagem permite o incremento na solubilidade em água de substâncias lipofílicas e a diluição das nanoemulsões em água e/ou outras soluções miscíveis neste líquido92.
Com base no que foi descrito, as nanopartículas são dispositivos com diâmetro menor que 1 µm,71 podendo ser formadas por vários materiais
biodegradáveis, como polímeros sintéticos ou naturais, lipídeos, fosfolipídios e até metais88. Devido este seu tamanho nanométrico e propriedades únicas associadas a
ele, que não são vistas em materiais de escala macrométrica, as nanopartículas podem ser aplicadas em diversas áreas que usam da nanotecnologia93.
1.1.5.3 Nanotecnologia aplicada a inseticidas
As nanopartículas são sistemas de liberação que oferecem inúmeras vantagens como carreadores de agentes ativos, como os fármacos, pesticidas, aromatizantes e extratos vegetais. Isso se deve à sua maior eficiência de encapsulação, melhor internalização celular, bem como direcionamento e modulação de liberação destes94.
A microencapsulação ou nanoencapsulação tem sido usada como uma ferramenta versátil para pesticidas hidrófobos, aumentando a sua dispersão em meios aquosos e permitindo uma liberação controlada do composto ativo, desta forma conferindo uma maior seletividade e levando a uma interação mais eficaz com o inseto alvos21, 22. Estas propriedades permitem o uso de menor quantidade de
composto ativo por área em um período de tempo mais longo. Como não há necessidade de reaplicações, acaba diminuindo também os custos e os danos ambientais para outros organismos não alvos22.
As nanoformulações têm os mesmos objetivos comuns, a outras formulações pesticidas. Consistem em aumentar a solubilidade aparente do ingrediente ativo; e liberar o ingrediente ativo de forma lenta e orientada, e/ou proteger o ingrediente ativo contra a degradação prematura89.
Atualmente, é crescente o interesse no desenvolvimento de produtos de nano-dimensões, como uma alternativa para o controle de vetores. O potencial de aplicação em diferentes estágios de desenvolvimento do inseto tem contribuído para este interesse94, e a combinação de produtos naturais e nanotecnologia vêm abrindo
um campo promissor para programas de controle integrado92. Podendo atuar, por
exemplo, como nanoformulações adulticida95, repelente96e agentes larvicidas97.
Com base no que foi descrito, fica evidente a importância de estudar novas metodologias para o controle do vetor Aedes aegypti. Desta forma o presente trabalho avaliou o efeito larvicida do ativo piperina, nanoencapsulado em diferentes
nanopartículas, em larvas de Aedes aegypti e seu efeito na morfofisiologia deste importante vetor.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da incorporação de ativo natural em diferentes tipos de nanopartículas sobre a atividade larvicida de larvas de Ae. aegypti (LINNAEUS, 1762)
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Produzir nanoemulsão e nanocápsula contendo no seu núcleo Piperina;
Determinar o tamanho das nanopartículas por Espalhamento dinâmico de luz (DLS);
Determinar as concentrações letais 50% para as diferentes nanoestruturas produzidas;
Determinar a atividade larvicida residual das nanopartículas em
Aedes aegypti;
Identificar alterações causadas pelas substâncias estudadas, na morfologia externa de larvas de Ae. Aegypti.
3. MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
A presente pesquisa se caracteriza como experimental. Este tipo de pesquisa visa identificar relações causais entre duas variáveis, através do método experimental70.
3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Os materiais para o preparo das soluções estudadas e para os bioensaios, foram adquiridos pelos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Tecnologia Farmacêutica (TecFarma) e Grupo de Pesquisa em Imunoparasitologia (IMPAR), ambos da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL) e localizados no Campus Tubarão, no Bloco C (bloco da saúde). Para a síntese das nanopartículas poliméricas todos os reagentes foram adquiridos como padrão analítico (P.A.)
Acetona P.A;
Água destilada;
Triglicerídeos de ácido caprílico;
Eudragit L100;
Polysorbate 80 (Tween 80);
SPAN 30;
Poliprolactona triol 900 (PCLT).
A piperina utilizada nos experimentos é proveniente da Sigma-Aldrich com pureza de 95,8%. Os equipamentos utilizados para preparação das substâncias estudadas foram: banho maria digital marca Dubnhoff modelo DB-100 microprocessado, rotaevaporador VV2000, ultrasson, agitador magnético AMF-410, balança analítica modelo AY220, Espalhamento dinâmico de Luz NanoBrook PALS (Brookhaven Instruments, Holtsiville, NY, USA). Os bioensaios foram acondicionados em câmara climatizada (B.O.D.) ELETROlab Modelo 132 FC.
Para realização dos ensaios, foram utilizadas larvas 3° instar final e/ou 4° instar inicial de Ae. aegypti, linhagem Rockefeller, recebidos da Fundação Nacional da Saúde – Brasília, mantidas há mais de 10 anos no laboratório de Imunoparasitologia (IMPAR). As larvas recebem como alimentação ração para gatos Purina® CatChow® triturada até seu desenvolvimento, sendo mantidas em uma temperatura de 25 ± 2 °C e 70-85% HU, e foto período de 14:10 claro: escuro.
3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Os procedimentos da metodologia estão apresentados, em resumo, no fluxograma representado pela Figura 14. Abaixo, cada procedimento foi descrito com maiores detalhes.
Figura 14: Fluxograma representando os tópicos dos procedimentos experimentais. Elaborado pelos autores.
3.5 ENSAIOS/TESTES/TÉCNICAS
3.5.1. Preparação solução com ativo Piperina Cortes histólogicos e análise na
morfofisiologia das larvas de Ae.
Aegypti expostas as substâncias
Experimento residual com
as Cl50 das substâncias
estudadas Caracterização das
nanopartículas (DLS)
Experimento larvicida para avaliar a mortalidade larval e
determinar as Cl 50
NC e NE: contendo em seu
núcleo piperina;
NC e NE: controle (sem o
ativo piperina);
Solução do ativo piperina não
nanoencapsulado Síntese das substâncias
A metodologia para preparação da solução piperina foi adaptada de Custódio et al (2016)17. Foi preparada uma solução principal a 75ppm, com ativo piperina não
nanoencapsulado. Para preparar esta solução foi adicionado 200mg de Tween 80 em 20ml de acetona contendo 15 mg do ativo piperina, a solução foi levada ao ultrassom e acrescida água purificada até completar 200ml de solução final. O controle da solução foi preparado usando a mesma metodologia, no entanto sem o ativo piperina. A solução principal foi diluída com água purificada, em concentrações variando de 1 a 20ppm, e o controle foi diluído a 20ppm.
3.5.2 Preparação das nanopartículas poliméricas
O método de preparo das nanopartículas adotado pelo presente trabalho foi o de nanoprecipitação 71, onde foi preparada uma fase oleosa (FO) que foi vertida em
uma fase aquosa (FA).
A FO da nanocápsula (NC) foi composta por 120 mg de eudragit, 27 mL de acetona, 39 mg de tensoativo (SPAN), 160µL de triglicerídeos de ácido cáprico/caprílico, 15mg de piperina. Esta fase foi vertida dentro de uma FA (Figura 15) composta por Tween 80 e 50 mL de água purificada e mantida sob agitação por 30 minutos. A suspensão obtida foi evaporada sob pressão reduzida a 27 °C até obtenção de um volume de 50 mL (Figura 15).
Os materiais e equipamentos utilizados para a preparação das nanopartículas serão disponibilizados pelo laboratório de Tecnologia Farmacêutica (TecFarma), da Universidade do Sul de Santa Catarina.
Figura 15 - A: Método de nanoprecitação, fase oleosa de nanopartícula contendo corante vermelho de Nilo, sendo vertida na fase aquosa. B: Solução de nanopartícula sendo evaporada em rotaevaporator.
Fonte: Elaborado pelos autores
Na nanoemulsão, a FO foi composta por 75mg mg de poliprolactrona triol (PCL-t), 27 mL de acetona, 15mg de piperina. A FO também foi vertida dentro de uma FA, composta por 76 mg de Tween 80 e 50 mL de água purificada e mantida sob agitação por 30 minutos. A suspensão obtida foi evaporada sob pressão reduzida a 27 °C até obtenção de um volume de 50 mL.
Para o preparo dos controles da NC e NE foi utilizado a mesma metodologia, no entanto não foram acrescidos o ativo piperina.
3.5.3 Determinação do tamanho médio de partícula e índice de polidispersidade
Espalhamento dinâmico de Luz (do inglês, Dynamic Light Scattering, DLS), é uma das técnicas mais utilizadas na determinação de tamanhos de nanopartículas em função de sua praticidade, facilidade de operação e velocidade na aquisição dos dados.
A medida de DLS foi realizada usando um goniômetro compacto ALV/CGS-3, equipado com um laser He-Ne com potência igual a 22 mW (λ = 633 nanômetros) como fonte de radiação. A função de correlação temporal foi analisada usando o correlator digital ALV 7004. As amostras foram previamente centrifugadas, diluídas em água deionizada e filtradas em filtro de celulose 0,2 µm. Em seguida, as amostras foram transferidas separadamente para um tubo cilíndrico e imersa num banho de
tolueno a 25 ± 0,50 C. As amostras foram submetidas à observação em apenas um ângulo de espalhamento (90 °) e o tempo de análise foi de 300 segundos. A distribuição do tempo de relaxação (τ) foi obtido através da análise de CONTIN da função de correlação temporal (g (2) -1). O índice de polidispersão das nanopartículas foi determinado usando o método de cumulantes de segunda ordem98.
3.5.4 Determinação do Potencial Zeta
O potencial Zeta reflete o potencial de superfície as nanoestruturas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com a solução dispersante, como resultado da dissociação de grupos funcionais que compõem a corona da nanoestrutura ou da adsorção de espécies iônicas presentes na solução dispersante98. A determinação do
valor de potencial Zeta das nanoestruturas obtidas foi feito por DLS.
3.5.5 Avaliação da atividade larvicida do ativo e incorporado nas nanoestruturas para determinação das concentrações letais 50 (CL50)
A avaliação do efeito larvicida, para determinação da concentração letal (CL50) foi realizada seguindo o método determinado pela OMS (1970)99.
As soluções preparadas das nanopartículas e da solução piperina (piperina, NE e NC) foram diluídas em concentrações variando entre 1 e 20ppm, tendo cada concentração 150ml. O experimento foi conduzindo em triplicata, ou seja, cada concentração continha três réplicas de 50 ml. Nessas réplicas foram adicionadas 25 larvas de Ae. aegypti, 3º instar final/4º instar inicial, que foram acondicionadas à temperatura de 25 °C com umidade relativa de 80% (±10%), em câmara climatizada. A mortalidade foi verificada após 24h, 48h e 72h de exposições às soluções, sendo consideradas mortas às larvas que não se mexiam quando tocadas. Desta forma, os Bioensaios foram divididos em 4 grupos diferentes (Figura 16):
As larvas que foram expostas apenas aos controles (C);
Larvas expostas à solução do ativo Piperina (P);
Larvas expostas a nanocápsula (NC), tendo o ativo Piperina incorporado e/ou corante vermelho de nilo;
Larvas expostas a nanoemulsão (NE), tendo o ativo Piperina incorporado;
