DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO LETAL E RESULTADOS DA

A avaliação do efeito larvicida das nanopartículas e da solução piperina , para determinação da concentração letal (CL50), ou seja, a concentração do ativo

necessária para causar a mortalidade de 50% das larvas, foi realizada seguindo o método da Organização Mundial da Saúde99_{. A tabela 3 está apresentado a}

mortalidade em diferentes concentrações das larvas expostas as soluções piperina, NC e NE, em diferentes tempos. E a figura 18 faz uma melhor elucidação sobre a diferença na mortalidade causada pelas diferenças substâncias estudadas nas primeiras 24 horas.

Tabela 3 – Resultados dos testes de mortalidade das soluções produzidas, relacionando a concentração com a % de larvas mortas em diferentes tempos (24, 48 e 72 horas).

NANOCÁPSULA NANOEMULSÃO PIPERINA

Concentração

% larvas mortas % larvas mortas % larvas mortas

24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 2 ppm 1% 5% 6% 1% 8% 12% 0% 1% 2% 4 ppm 3% 17% 23% 6% 24% 29% 3% 4% 6% 6 ppm 7% 26% 32% 12% 43% 49% 7% 23% 28% 8 ppm 8% 35% 46% 14% 52% 61% 11% 58% 58% 10 ppm 9% 41% 58% 14% 63% 75% 18% 68% 77% 12 ppm 16% 49% 70% 20% 70% 79% 18% 74% 84% 14 ppm 20% 65% 83% 40% 86% 90% 48% 95% 100% 16 ppm 27% 65% 84% 42% 90% 95% 89% 99% 100%

Figura 18 - Resultados dos testes de mortalidade das soluções produzidas, relacionando a concentração com a % de larvas mortas em 24h de exposição. NC: Nanocápsula; NE: nanoemulsão; e Piper: piperina.

Como observado na tabela 2 e na figura 18, tanto nas nanopartículas (NC e NE) como na solução piperina, a mortalidade aumentou em função da concentração e do tempo de exposição das larvas. É perceptível também que tanto nas nanopartículas, como na solução piperina, o efeito de mortalidade já se apresentava a partir da concentração de 2ppm e no primeiro tempo de exposição. No entanto, a porcentagem de mortalidade de larvas diferiu, sendo maior na piperina, seguida da nanoemulsão e nanocápsula. Isso se deve ao efeito da nanoencapsulação, que causa um efeito tardio na liberação inicial do ativo ao meio biológico. Ghosh E Chandrasekaran (2013)97 _{avaliaram o efeito do extrato do manjericão incorporado a}

nanoemulsões em larvas de Ae. aegypti, os resultados também demonstraram que a atividade larvicida depende da dose e do tempo de exposição. E Chowdhury, et al (2009) avaliaram a atividade larvicida de extrato de Solanum villosums em larvas de

Anopheles subpictus Grassi, onde os valores de CL50, apresentaram diferença em

relação ao tempo de exposição. Onde em 24 de exposição as CL50 para todos os

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm 10 ppm 12 ppm 14 ppm 16 ppm NC NE Piper M o rt ali d ade la rv al em %

instares foram de 24,20 e 33,73ppm, após 24h, e entre 23,47 e 30,63ppm após 48h de exposição

As nanopartículas e a solução piperina apresentaram CL50 de 14,50ppm,

22,8ppm e 34,8ppm para piperina, nanoemulsão e nanocápsula, respectivamente (gráfico 2). Esse resultado corrobora com o que foi dito anteriormente, sobre o efeito da liberação de ativos por sistemas nanoestruturados, sendo possível observar uma diferença das CL50 entre as substâncias (NE, NC e Piper), essa comprovada

estatisticamente e sendo significativa (p=0.0001). A CL50 encontrada para a solução

piperina teve um resultado semelhante ao obtido por Gulzar (2013)63_.

NE

NC

_PIP

0

10

20

30

40

Substâncias testadas - 24h

CL

Figura 19 – Concentração letal 50% (CL50) das substâncias estudadas. Onde NE é

nanoemulsão, NC nanocápsula e PIP a solução piperina não nanoencapsulada.

O tempo de exposição (24h, 48h e 72h) das larvas aos bioensaios influenciou nas CL50, sendo que com o aumento do tempo, ocorreu uma diminuição das

concentrações. A piperina apresentou CL50 de 14,5ppm (24h), 6,05ppm (48h) e

5,48ppm (72h); a nanocápsula CL50 de 34,59ppm (24h), 12,14ppm (48h) e 8,28ppm

diferença de concentração entre os tempos foi avaliada estatisticamente, sendo para Piperina: de 24h para 48h o valor de p foi <0,01; de 48h para 72h, p< 0,05 e de 24h para 72h, p<0,01. A nanocápsula e a nanoemulsão apresentaram o mesmo valor de

p, sendo de 24h para 48h <0,001; de 48h para 72h, p< 0,05 e de 24h para 72h <0,00.

NE

NC

PIPER

0

10

20

30

40

50

24

48

72

Substância

CL

Figura 20 - Concentração letal das soluções de piperina. NC- Nanocápsula; NE- nanoemulsão; e Piper – solução piperina não incorporada, em relação ao tempo (24, 48 e 72 horas) de exposição.

As nanocápsulas delongaram a liberação do ativo incorporado, promovendo assim uma menor mortalidade nas primeiras horas de experimento. Comparando as nanopartículas com a piperina não nanoencapsulada, em 24 horas de experimento a piperina já havia alcançado uma mortalidade próxima a de 100%, enquanto a nanoemulsão chegou próxima a 40% e a nanocápsula a 30%. Esse resultado sugere que a nanoencapsulação é uma alternativa eficiente para aumentar a atividade residual do ativo larvicida, fazendo com que seu efeito seja prolongado no meio ambiente.

Os resultados encontrados para NE indicam que houve mortalidade mais rápida se comparado ao ativo incorporado na NC, fato este que ocorre por que as nanocápsulas possuem uma membrana polimérica única, ausente nas nanoemulsões, que retarda o efeito de liberação inicial. O encapsulamento prolonga o período de eficácia de ativos de origem botânica, permitindo liberação gradual das substâncias ativas no mesmo tempo104_.

Existem outros trabalhos que avaliaram a associação de plantas (e seus compostos) a nanopartículas no controle do Ae. Aegypti, e outros vetores. A grande maioria destes trabalhos utilizaram nanopartículas de prata 105,106_{. Alguns avaliaram a}

associação de nanoemulsões a óleos essenciais de plantas, isso porque esses óleos, apesar de apresentarem atividade larvicida, têm pouca solubilidade em água. As nanoemulsões associadas a esses óleos também apresentaram potencial larvicida107,108_.

A aplicação do potencial larvicida, de produtos naturais pode ser obtida considerando os níveis de mortalidade das larvas após 48h de tratamento com amostras a 250ppm, como: promissor (> 75%), parcialmente promissor (> 50% e <75%), fracamente promissor (> 25% e <50%) e inativo (<25%)109_{. Neste contexto, os}

sistemas nanoestruturados estudados no presente trabalho, contento o ativo piperina incorporado, podem ser considerados promissores como agentes larvicidas, visto que em concentrações inferiores a 250ppm mantiveram uma mortalidade superior a 75% após 48h de tratamento (Tabela 2).

Diferentes metabólitos secundários obtidos de várias espécies de plantas, vem sendo estudados como larvicidas de Aedes aegypti. Entretanto nas classes das amidas tem-se observado valores baixos de CL50, o que caracteriza maior atividade

larvicida e, portanto, um produto com maior potencial para o emprego como agente para o controle do Ae. aegypti110_{. O nível de atividade larvicida que o extrato da}

planta Piper nigrum tem apresentado, deve-se principalmente aos efeitos associados à presença da amida piperina 102,110–112. Os extratos de P. nigrum já foram avaliados em diferentes vetores de doenças, como Trypanossoma cruzi (doença de Chagas)113_, Anopheles stephensi, (malária)114 _{e também contra diferentes mosquitos, Culex} pipiens pallens e Ae. aegypti (dengue e febre amarela)102_{. Em alguns desses}

estudo, contudo vale ressaltar que a atividade larvicida do extrato não se deve apenas a piperina, mas também ao sinergismo de outros derivados.

4.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO RESIDUAL DAS NANOPARTÍCULAS E SOLUÇÃO