2. OBJETIVOS
3.5 ENSAIOS/TESTES/TÉCNICAS
3.5.1. Preparação solução com ativo Piperina Cortes histólogicos e análise na
morfofisiologia das larvas de Ae.
Aegypti expostas as substâncias
Experimento residual com
as Cl50 das substâncias
estudadas Caracterização das
nanopartículas (DLS)
Experimento larvicida para avaliar a mortalidade larval e
determinar as Cl 50
NC e NE: contendo em seu
núcleo piperina;
NC e NE: controle (sem o
ativo piperina);
Solução do ativo piperina não
nanoencapsulado Síntese das substâncias
A metodologia para preparação da solução piperina foi adaptada de Custódio et al (2016)17. Foi preparada uma solução principal a 75ppm, com ativo piperina não
nanoencapsulado. Para preparar esta solução foi adicionado 200mg de Tween 80 em 20ml de acetona contendo 15 mg do ativo piperina, a solução foi levada ao ultrassom e acrescida água purificada até completar 200ml de solução final. O controle da solução foi preparado usando a mesma metodologia, no entanto sem o ativo piperina. A solução principal foi diluída com água purificada, em concentrações variando de 1 a 20ppm, e o controle foi diluído a 20ppm.
3.5.2 Preparação das nanopartículas poliméricas
O método de preparo das nanopartículas adotado pelo presente trabalho foi o de nanoprecipitação 71, onde foi preparada uma fase oleosa (FO) que foi vertida em
uma fase aquosa (FA).
A FO da nanocápsula (NC) foi composta por 120 mg de eudragit, 27 mL de acetona, 39 mg de tensoativo (SPAN), 160µL de triglicerídeos de ácido cáprico/caprílico, 15mg de piperina. Esta fase foi vertida dentro de uma FA (Figura 15) composta por Tween 80 e 50 mL de água purificada e mantida sob agitação por 30 minutos. A suspensão obtida foi evaporada sob pressão reduzida a 27 °C até obtenção de um volume de 50 mL (Figura 15).
Os materiais e equipamentos utilizados para a preparação das nanopartículas serão disponibilizados pelo laboratório de Tecnologia Farmacêutica (TecFarma), da Universidade do Sul de Santa Catarina.
Figura 15 - A: Método de nanoprecitação, fase oleosa de nanopartícula contendo corante vermelho de Nilo, sendo vertida na fase aquosa. B: Solução de nanopartícula sendo evaporada em rotaevaporator.
Fonte: Elaborado pelos autores
Na nanoemulsão, a FO foi composta por 75mg mg de poliprolactrona triol (PCL-t), 27 mL de acetona, 15mg de piperina. A FO também foi vertida dentro de uma FA, composta por 76 mg de Tween 80 e 50 mL de água purificada e mantida sob agitação por 30 minutos. A suspensão obtida foi evaporada sob pressão reduzida a 27 °C até obtenção de um volume de 50 mL.
Para o preparo dos controles da NC e NE foi utilizado a mesma metodologia, no entanto não foram acrescidos o ativo piperina.
3.5.3 Determinação do tamanho médio de partícula e índice de polidispersidade
Espalhamento dinâmico de Luz (do inglês, Dynamic Light Scattering, DLS), é uma das técnicas mais utilizadas na determinação de tamanhos de nanopartículas em função de sua praticidade, facilidade de operação e velocidade na aquisição dos dados.
A medida de DLS foi realizada usando um goniômetro compacto ALV/CGS-3, equipado com um laser He-Ne com potência igual a 22 mW (λ = 633 nanômetros) como fonte de radiação. A função de correlação temporal foi analisada usando o correlator digital ALV 7004. As amostras foram previamente centrifugadas, diluídas em água deionizada e filtradas em filtro de celulose 0,2 µm. Em seguida, as amostras foram transferidas separadamente para um tubo cilíndrico e imersa num banho de
tolueno a 25 ± 0,50 C. As amostras foram submetidas à observação em apenas um ângulo de espalhamento (90 °) e o tempo de análise foi de 300 segundos. A distribuição do tempo de relaxação (τ) foi obtido através da análise de CONTIN da função de correlação temporal (g (2) -1). O índice de polidispersão das nanopartículas foi determinado usando o método de cumulantes de segunda ordem98.
3.5.4 Determinação do Potencial Zeta
O potencial Zeta reflete o potencial de superfície as nanoestruturas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com a solução dispersante, como resultado da dissociação de grupos funcionais que compõem a corona da nanoestrutura ou da adsorção de espécies iônicas presentes na solução dispersante98. A determinação do
valor de potencial Zeta das nanoestruturas obtidas foi feito por DLS.
3.5.5 Avaliação da atividade larvicida do ativo e incorporado nas nanoestruturas para determinação das concentrações letais 50 (CL50)
A avaliação do efeito larvicida, para determinação da concentração letal (CL50) foi realizada seguindo o método determinado pela OMS (1970)99.
As soluções preparadas das nanopartículas e da solução piperina (piperina, NE e NC) foram diluídas em concentrações variando entre 1 e 20ppm, tendo cada concentração 150ml. O experimento foi conduzindo em triplicata, ou seja, cada concentração continha três réplicas de 50 ml. Nessas réplicas foram adicionadas 25 larvas de Ae. aegypti, 3º instar final/4º instar inicial, que foram acondicionadas à temperatura de 25 °C com umidade relativa de 80% (±10%), em câmara climatizada. A mortalidade foi verificada após 24h, 48h e 72h de exposições às soluções, sendo consideradas mortas às larvas que não se mexiam quando tocadas. Desta forma, os Bioensaios foram divididos em 4 grupos diferentes (Figura 16):
As larvas que foram expostas apenas aos controles (C);
Larvas expostas à solução do ativo Piperina (P);
Larvas expostas a nanocápsula (NC), tendo o ativo Piperina incorporado e/ou corante vermelho de nilo;
Larvas expostas a nanoemulsão (NE), tendo o ativo Piperina incorporado;
Figura 16 - Representação dos Bioensaios. A: Soluções principais (SP) do ativo Piperina (P) e das nanoestruturas (NC e NE), diluídas em concentrações variando de 1 a 20 ppm, feitas em triplicatas. B: Representação dos controles diluídos nas concentrações máximas, feitas em triplicatas.
Fonte: Elaborado pelos autores.
3.5.6 Estudo da atividade larvicida residual
A mortalidade das larvas nos bioensaios foi avaliada a cada 48 horas, sendo contada as larvas mortas. A cada 24h as larvas foram trocadas, sendo acrescentadas larvas novas e descartadas as que estavam nos bioensaios. Quando necessário foi acrescentada água filtrada e a avaliação da atividade de cada produto terminou quando não se obteve mortalidade.
3.5.7 Avaliação do comportamento e aspecto das larvas durante os bioensaios
Durante os bioensaios foram avaliados os aspectos das larvas e comportamento. As larvas mortas expostas aos bioensaios foram fotografadas em câmera (Opticam LOPT140003 14.0 Mega Pixels), acoplada em microscópio óptico (Opticam O400S BIOLÓGICO 17S850), para visualizar as diferenças morfológicas das larvas submetidas ao controle.
NC 1 NE 2 P 1 NE 1 P 2 P 3 NE 3 NC 2 NC 3 NC SP NE SP P SP C P C NC C NE C 1 C 2 C 3 A B