UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LETÍCIA DA SILVA PIRES
EFEITO DA INIBIÇÃO DO SGLT-2 PELA DAPAGLIFLOZINA NO CÉREBRO
E NA FUNCIONALIDADE HIPOTALÂMICA EM HUMANOS E
CAMUNDONGOS
CAMPINAS
LETÍCIA DA SILVA PIRES
EFEITO DA INIBIÇÃO DO SGLT-2 PELA DAPAGLIFLOZINA NO CÉREBRO
E NA FUNCIONALIDADE HIPOTALÂMICA EM HUMANOS E
CAMUNDONGOS
Orientador: BRUNO GELONEZE NETO
Coorientador: LÍCIO AUGUSTO VELLOSO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em
Ciências, na Área de Clínica Médica
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA
LETÍCIA DA SILVA PIRES, E ORIENTADA PELO
PROF. DR. BRUNO GELONEZE NETO E COORIENTADA
PELO PROF. DR. LÍCIO AUGUSTO VELLOSO.
CAMPINAS
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
LETÍCIA DA SILVA PIRES
ORIENTADOR: PROF. DR. BRUNO GELONEZE NETO
COORIENTADOR: PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
MEMBROS:
1. PROF. DR. BRUNO GELONEZE NETO
2. PROFª. DRA. MARCIANE MILANSKI FERREIRA
3. PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da
banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do
aluno.
Dedico este trabalho a todos que
são acometidos por alguma
doença metabólica e anseiam
por terapias mais eficazes e uma
melhor qualidade de vida.
Em especial, dedico ao meu avô
José
João
da
Silva
(in
memoriam) que padeceu do
diabetes.
“Vocês trabalham para quê?
Eu sustento que a única finalidade da ciência
está em aliviar a canseira da existência humana.”
(Bertold Brecht, A Finalidade da Ciência)
“Trago no sonho
e no sangue
Motivos para lutar (...)
O que eu sou,
eu sou em par.
Não cheguei sozinho.”
(Lenine, Castanho)
Agradecimentos
A Deus, que tornou tudo possível e sempre abençoa minhas escolhas e
meus caminhos.
Aos meus pais, Jorge e Vera, pelo apoio e incentivo de sempre. Por
serem meu porto seguro, por todo amor e por não medirem esforços para
permitirem que possa realizar meus sonhos.
As minhas irmãs, Fernanda e Marina, por estarem sempre ao meu lado,
dispostas a me ajudar e tornar a caminhada mais leve e feliz.
Ao meu namorado, Igor, por ter entrado em minha vida para somar e ser
companheiro em todos os momentos. Pelo cuidado, respeito, carinho e por ser
tão especial.
Aos meus professores Bruno, Lício e Ana Carolina pela oportunidade
que me concederam, pelos ensinamentos acadêmicos e de vida, pela
paciência e dedicação e por serem grandes exemplos e inspirações.
As minhas voluntárias que me confiaram o que têm de mais importante,
pela paciência e dedicação e por tornarem possível a concretização deste
trabalho.
Aos amigos de Franca, São Paulo e Campinas que mesmo distantes
acompanham meus passos, vibram com minhas conquistas e me fortalecem
nas dificuldades.
Ao Thiago Matos (Thi), por me acolher de forma tão especial, por ser
meu parceiro de trabalho e meu amigo querido. Pela troca de conhecimentos,
pela paciência e disposição em sempre me auxiliar. Tenho muito orgulho e
alegria de ser sua ―pupila‖.
À Daniela Razolli (parcera), pelo privilégio de poder ser tão presente na
sua vida, por tudo que fez e faz por mim, independente do que, onde e quando
seja, vc honra o título de ―parcera‖. Pelos ensinamentos científicos e de vida e
por ser tão querida e insubstituível.
À Daniella Regiani (amada) pelo carinho, por toda ajuda desde o
começo, pelos cafés, pelas conversas e por fazer parte da minha vida.
Aos amigos Guilherme Nogueira, Rodrigo Carraro, Joana Gaspar,
Juliana Faria, Natália Mendes e José Carlos pelo carinho e companheirismo
que vai além do cotidiano do laboratório e pelos momentos de alegria e
diversão.
Aos amigos Felipe Corrêa, Gabriela Souza, Lucas Nascimento e Letícia
Souza que ainda que nossa convivência não seja tão frequente e próxima,
vocês são pessoas incríveis e muito queridas, além de excelentes profissionais.
À Erika Anne, sempre muito solícita e querida, obrigada pela paciência,
pelo carinho e por me considerar sua ―filha‖.
Aos colegas do LabSinCel e do LIMED, cada qual com sua contribuição
e importância em minha vida profissional e pessoal.
Ao professor Fernando Cendes, pela gentileza e disponibilidade em
colaborar com minha pesquisa. Pela atenção e pelo cuidado que me
proporcionou quando precisei.
À Juliana Francischinelli e à Mônica Cordeiro, pelo auxílio e
comprometimento a cada domingo de exames e pela amizade construída.
Ao Brunno Campos, pelo árduo e impecável trabalho e pela paciência e
atenção.
Ao Márcio Cruz, pelo cuidado com os animais de experimentação e pela
agradável pessoa que é.
À UNICAMP, que me recebeu desde a graduação e tenho muito orgulho
de pertencer a essa instituição, pelos profissionais que tenho o prazer de
conhecer e/ou conviver, aprendendo sempre mais e desejando retribuir com
meu trabalho e conhecimento.
À FAPESP e à CAPES, pelo apoio financeiro durante a realização deste
projeto.
Resumo
O diabetes mellitus tipo 2 é uma das enfermidades cuja prevalência apresenta crescimento mais acelerado no mundo. Isso se deve em parte pelo aumento do número de pessoas obesas. Múltiplas alterações fisiopatológicas estão envolvidas nesse quadro e afetam diferentes órgãos, entre eles o cérebro. O equilíbrio entre comportamento alimentar e gasto energético é um processo biológico coordenado pelo cérebro e com o hipotálamo como principal estrutura envolvida, particularmente o núcleo arqueado, onde duas subpopulações de neurônios, NPY/AgRP e POMC/CART, respondem a sinais periféricos que informam a respeito da disponibilidade de energia no organismo. Variações nos níveis sanguíneos de glicose são rapidamente detectadas por neurônios hipotalâmicos gerando sinais que participam do controle da fome e do gasto energético. Os mecanismos envolvidos na resposta hipotalâmica à glicose ainda são pouco conhecidos, porém acredita-se que seus transportadores de membrana, GLUT e SGLT desempenhem papel importante neste processo. O co-transportador sódio-glicose tipo 2 (SGLT-2) é expresso no rim e no cérebro, incluindo regiões hipotalâmicas envolvidas no controle alimentar. Estudos mostram que a inibição do SGLT-2 acarreta em glicosúria e perda de calorias contribuindo para a diminuição no peso corpóreo. No entanto, não são conhecidos os detalhes mecanísticos deste fenômeno. Nesse trabalho, em camundongos, observamos por imunofluorescência que o SGLT-2 está presente no núcleo arqueado e colocaliza com neurônios POMC e NPY, sugerindo que o SGLT-2 participa do controle alimentar. Camundongos tratados com dapagliflozina apresentaram glicosúria acompanhada de melhora na glicemia de jejum, bem como da menor área sob a curva de glicose durante o teste de tolerância à glicose (GTT). Observamos ainda diminuição no peso corpóreo e discreta redução, porém não significativa, da massa adiposa epididimal. Em mulheres voluntárias eutróficas e normoglicêmicas, tratadas com dapagliflozina 10mg/dia por uma semana, observamos redução numérica, porém não significativa no índice de massa corporal (IMC), da circunferência da cintura e do diâmetro abdominal sagital. Houve melhor eficiência na resposta glicêmica e na sensibilidade à insulina. O uso da dapagliflozina pode alterar as conexões do hipotálamo com outras regiões do cérebro e ter um possível papel no controle da fome. As novas ações do fármaco aqui descritas podem contribuir para o avanço na compreensão de mecanismos hipotalâmicos envolvidos no controle alimentar e do gasto energético e criar novas perspectivas terapêuticas para a obesidade.
Abstract
Type 2 diabetes mellitus is one of the diseases with the fastest increasing prevalence in the world. This is mostly due to the increased prevalence of obesity. Multiple pathophysiological abnormalities are involved in this problem and affect different organs, including the brain. The balance between eating behavior and energy expenditure is a biological process that is coordinate by the brain and the hypothalamus as the main structure involved, particularly the arcuate nucleus, where two subpopulations of neurons, NPY/AgRP and POMC/CART, respond to peripheral signals that inform about the availability of energy in the body. Variations in blood glucose levels are rapidly detected by hypothalamic neurons generating signals that play a role in the control of hunger and energy expenditure. The mechanisms involved in the hypothalamic response to glucose are still poorly understood, but it is believed that their membrane transporters, GLUT and SGLT play an important role in this process. The sodium-glucose co-transporter type 2 (SGLT-2) is expressed in the kidney and brain, including hypothalamic regions involved in food control. Inhibition of SGLT-2 leads to glycosuria and caloric loss concomitant with a decrease in body weight. However, it is currently unknown the mechanistic details involved in this phenomenon. In this work, in mice, we observed by immunofluorescence that SGLT-2 is present in the arcuate nucleus and colocalize with POMC and NPY neurons, suggesting that SGLT-2 is involved in feeding control. Also, mice treated with dapagliflozin showed glycosuria, which was accompanied by improved fasting glycemia, as well as a reduction in the area under glucose curve during a glucose tolerance test (GTT). We also observed a decrease in body weight and a slight but not significant reduction in epididymal adipose mass. In the clinical intervention in eutrophic and normoglycemic women volunteers treated with 10 mg per day of dapagliflozin for one week, we observed a numerical reduction, although not significant, in body mass index (BMI), waist circumference and sagittal abdominal diameter. In addition, there was a better efficiency in glycemic response and insulin sensitivity. The use of dapagliflozin can alter the connections of the hypothalamus with other regions of the brain and play a possible role in food control. The new actions of the drug described here may contribute to the advancement in understanding the hypothalamic mechanisms involved in food control and energy expenditure and create new therapeutic perspectives for obesity.
Sumário
Introdução...12
Objetivos...17
Justificativa...17
Material e Métodos...18
Análise dos Resultados...26
Resultados e Discussão...26
Análises em Camundongos...26
Resumo dos resultados obtidos em camundongos...38
Análises em Humanos...38
Análise de correlação cruzada com região de interesse (hipotálamo)...53
Análise de conectividade...55
Resumo dos resultados obtidos em mulheres voluntárias...57
Conclusões...58
Referências...59
1. Introdução
A insulina é um hormônio produzido no pâncreas pelas células β e tem como função principal promover a entrada de glicose nas células do organismo fornecendo substrato energético para a maior parte das funções celulares. No entanto, alterações em sua ação e/ou secreção podem resultar em um excesso de glicose no sangue (hiperglicemia), com o subsequente desenvolvimento de diabetes. (SBEM, 2016).
O Diabetes mellitus (DM) tipo 2 é uma doença com várias etiologias e diversos distúrbios metabólicos que apresenta em comum a hiperglicemia, sendo atualmente uma condição de elevada prevalência em todo o mundo devido principalmente a sua associação frequente à obesidade. (SBD, 2016).
Segundo dados da Federação Internacional de Diabetes, em 2015 havia 415 milhões de pessoas com diabetes no mundo e a projeção para 2040 ultrapassava 640 milhões. Na América Central e do Sul, os números encontrados foram de quase 30 milhões em 2015 e 48.8 milhões para 2040. O Brasil é o 4º país com maior número de diabéticos, apresentando, em 2015, 14.3 milhões e para 2040, estima-se que serão acrescentados mais nove milhões de casos. (IDF, 2015).
Do ponto de vista mecanístico, considera-se que a resistência e a ação da insulina desempenham papel central na gênese do DM tipo 2. Entretanto, o quadro pode ainda ser agravado por diversos fatores. Além da diminuição relativa da secreção de insulina pelas células β pancreáticas, que corrobora para a hiperglicemia, há aumento da secreção de glucagon pelas células α do pâncreas; aumento da produção hepática de glicose; diminuição do efeito incretínico no intestino; diminuição da captação de glicose no músculo; aumento da lipólise no tecido adiposo; disfunção de neurotransmissores no cérebro; e aumento da reabsorção de glicose. (DeFronzo, 2009).
Esse complexo quadro desafia o tratamento do DM uma vez que, para que se restabeleça a homeostase da glicose, é necessário corrigir múltiplos distúrbios que se combinam para produzir o quadro clínico completo. Assim, foram utilizadas ao longo do tempo, abordagens comportamentais que incluem mudanças no estilo de vida, ajustes nutricionais e estímulo à prática de atividades físicas, aliados ao uso de vários fármacos que tem por objetivo aumentar a secreção de insulina, prevenir/reduzir a progressiva falência da célula β, reduzir a produção hepática de glicose, reduzir a
absorção intestinal de glicose e aumentar a captação de glicose por tecidos alvo. (DeFronzo, 2009).
O objetivo do tratamento farmacológico é restabelecer níveis de glicose sanguíneos próximo ao normal (< 100mg/dL em jejum) a fim de prevenir o desenvolvimento ou retardar a progressão de possíveis complicações micro e macrovasculares. As diferentes abordagens farmacológicas antidiabetes atualmente disponíveis têm muitas limitações, incluindo ocorrência de hipoglicemia (sulfonilureias, meglitinidas e insulina), ganho de peso (sulfonilureias, meglitinidas, tiazolidinedionas e insulina), insuficiência cardíaca (tiazolidinedionas), efeitos gastrointestinais adversos (inibidores da α-glicosidase, metformina) e necessidade de múltiplas injeções e/ou auto-monitoramento (insulina, miméticos de amilina e análogos de GLP-1). Além disso, devido à natureza progressiva da doença, muitos pacientes requerem múltiplos tratamentos antidiabetes para atingir os alvos de controle glicêmicos. Portanto, fica claro que ainda há a necessidade de se desenvolver novos fármacos que produzam um impacto sustentável no controle glicêmico com baixo risco para hipoglicemia e perda de peso e a mínima auto-monitorização. (SBD, 2016; White, 2014).
Ao longo da história do desenvolvimento dos medicamentos para o diabetes, muito se evoluiu e aprimorou. Alguns marcos desta evolução são: a 1ª administração de insulina exógena em humanos, em 1922; introdução da metformina em 1959 como um agente antihiperglicêmico, sendo aprovado nos EUA apenas nos anos 90; e, mais recentemente (2013), aprovação do 1º inibidor de SGLT-2, canagliflozina, pela Food
and Drug Administration (FDA). (White, 2014).
Existem atualmente 11 diferentes classes de medicamentos antihiperglicemiantes disponíveis para tratar o diabetes, visando terapias mais variadas e eficazes, com o objetivo de reduzir a morbidade e a mortalidade, além de aumentar a expectativa de vida dos pacientes diabéticos. A classe desenvolvida mais recentemente é a dos inibidores de SGLT-2 (co-transportador de sódio-glicose tipo 2) que atuam reduzindo a capacidade máxima de reabsorção renal com o objetivo de promover glicosúria e assim diminuir a glicotoxicidade. Além disso, não causam hipoglicemia; reduzem hemoglobina glicada (HbA1c) e pressão arterial; promovem perda de peso; e melhoram o controle glicêmico. (White, 2014; Fioretto e cols., 2015).
Os SGLTs são proteínas multifuncionais ligadas à membrana que podem atuar no co-transporte de sódio para acoplamento de açúcares, monocarboxilatos, aminoácidos, vitaminas e íons; no uniporte de sódio; nos canais de ureia e água; e na
detecção de glicose. Eles são codificados pelos genes SLC5, sendo 12 identificados no genoma humano e estão expressos no cérebro, intestino e rim. (Santer e Calado, 2010). Há pelo menos dois co-transportadores de sódio-glicose, SGLT-1 e SGLT-2, que desempenham um importante papel no túbulo proximal do rim. Eles são responsáveis pela reabsorção renal de glicose, com o SGLT-2 realizando a maior parte dessa tarefa (90%) e o restante pelo SGLT-1. No entanto, quando os níveis plasmáticos de glicose excedem a capacidade máxima de reabsorção deste sistema, ocorre glicosúria (DeFronzo; Davidson; Prato, 2012; Chao e Henry, 2010).
A expressão e a atividade do SGLT-2 estão aumentadas no DM tipo 2, o que resulta em uma reabsorção de glicose pelos rins acima do normal, contribuindo para a manutenção da hiperglicemia. Uma alternativa para proteger contra este efeito é promover a excreção do excesso de glicose na urina. Portanto, bloquear a atividade de SGLT-2 para induzir uma glicosúria terapêutica, constitui-se numa estratégia interessante para o tratamento do diabetes (DeFronzo; Davidson; Prato, 2012; Ferrannini e cols., 2014).
O primeiro inibidor de SGLT foi um flavonoide com sabor amargo, isolado em 1835 da casca da raiz de macieiras e nomeado florizina (em grego: φλοιός = casca, ρίζα = raiz). E, em 1886, foi descrito que doses de florizina acima de 1g causa glicosúria em humanos. Entretanto foi somente em 1942 que se determinou a estrutura completa da florizina e, devido as suas propriedades antipiréticas, passou-se a utilizá-la no tratamento de febre e doenças infecciosas, como malária. Todavia, foram por meio de vários estudos com a florizina, realizados ao longo do tempo, que foi possível concluir que a glicosúria, poliúria e perda de peso causada por esse flavonoide em animais era semelhante ao quadro de glicosúria, poliúria e perda de peso presente no diabetes em humanos. Assim, a florizina tornou-se foco de intensos estudos que tinham por objetivo definir os efeitos do fármaco na função dos rins. (Blaschek, 2017).
Com o passar dos anos, descobriu-se que a florizina apresentava algumas desvantagens em seu uso na terapia de diabetes. Esse flavonoide não era específico para a isoforma 2; acarretava problemas gastrointestinais, como diarreia; e, por ser degradado no estômago, precisava ser administrado endovenosamente, não levando-o para a prática clínica. Nlevando-o entantlevando-o, a fllevando-orizina flevando-oi e é levando-o clevando-omplevando-ostlevando-o principal para levando-o desenvolvimento de análogos sintéticos com melhor biodisponibilidade, estabilidade e seletividade para o SGLT-2. Nesse sentido, mais recentemente, alguns fármacos
como a canagliflozina e a dapagliflozina foram desenvolvidos e estão disponíveis para uso clínico (Ferrannini e cols., 2014). A dapagliflozina foi o primeiro inibidor de SGLT-2 aprovado no Brasil pelos órgãos Food and Drug Administration (FDA), European
Medicines Agency (EMA) e Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
(DeFronzo; Davidson; Prato, 2012).
O mecanismo de ação da dapagliflozina independe da insulina para remover o excesso de glicose. Em indivíduos diabéticos, melhora o controle glicêmico; diminui a glicemia de jejum e pós-prandial; reduz hemoglobina glicada, peso corporal e pressão arterial sistólica; aumenta a produção hepática de glicose e a secreção de glucagon. Apresenta um bom perfil de segurança e tolerabilidade, com baixos riscos de hipoglicemia e os eventos adversos incluem infecções do trato urinário e infecções geniturinárias fúngicas. (Merovci e cols., 2014; Chao e Henry, 2010; Hummel e cols., 2012).
É sabido que a inibição do SGLT-2 diminui o limiar para glicosúria, induzindo à redução nos níveis de glicose que não depende da ação da insulina nem sobrecarrega a célula-β, o que é uma forma vantajosa de atenuar a glicotoxicidade e, concomitantemente, há perda de calorias, uma vez que 1g de glicose corresponde a uma redução de 4 calorias (kcal) e a perda de peso estimada com o uso dos inibidores de SGLT-2 é de 2 a 3kg. Entretanto, estudos realizados até o momento observaram que a perda de peso obtida é bem menor que a esperada, ademais há aumento da ingestão alimentar, seja em modelo experimental ou em humanos. Portanto, é possível que haja uma ativação de neurônios envolvidos no controle do apetite. (Devenny e cols., 2012; Ferranini e cols., 2015).
O equilíbrio entre consumo alimentar e gasto energético é um processo biológico que tem o cérebro como coordenador central. Evidências de que o cérebro poderia atuar no controle do peso corporal e, consequentemente, da obesidade e do diabetes remontam à década de 1950, quando os núcleos hipotalâmicos lateral e ventromedial foram identificados como importantes áreas envolvidas no controle da ingestão de alimentos e o gasto de energia. O hipotálamo, especialmente o núcleo arqueado (ARC), é o local de integração nutricional, onde se encontram duas subpopulações de neurônios, NPY/AgRP e POMC/CART, capazes de receber os sinais oriundos da periferia e determinar, assim, tanto o aumento quanto a diminuição da ingestão alimentar (Velloso e Schwartz, 2011; Damiani; Damiani; Menezes Filho, 2010).
A modulação da atividade neuronal requer substratos como glicose, ácidos graxos e aminoácidos para controlar as vias de sinalização que se integram com sinais gerados por hormônios para garantir o equilíbrio entre aquisição e gasto de energia (Velloso, 2011). A glicose é a principal fonte de energia para o cérebro, o qual requer 125g/dia em humanos. Esse nutriente consegue entrar nas células por meio de seus transportadores de membrana plasmática, podendo realizar transporte facilitado (GLUT) ou co-transporte dependente de sódio (SGLT) (Yu e cols., 2012).
O cérebro necessita de ambos os tipos de transportadores, pois os GLUTs apresentam uma constante de afinidade por glicose (Km) menor, quando comparado com os SGLTs (40 e 10mmol/L, respectivamente). (Marsenic, 2009). Já os SGLTs podem trabalhar contra o gradiente de concentração para obter glicose (Yu e cols., 2012). Este mecanismo apresenta uma maior versatilidade e, portanto, pode ser eficiente mesmo em situações que há níveis elevados de glicose e possível saturação do metabolismo, como na obesidade e no diabetes (Gonzàlez; Reimann; Burdakov, 2009).
Os SGLTs são essenciais para a sobrevivência do neurônio em condições de baixas concentrações de glicose ou anoxia, como nos casos de isquemia e acidente vascular cerebral (AVC). (Yu e cols., 2010). A expressão dos SGLTs no hipotálamo pode ser importante na detecção de glicose, além de poder desempenhar um papel na liberação de hormônios e na regulação do sono e do apetite por meio de neurônios estimulados pela glicose. Tais neurônios estão envolvidos no controle do comportamento alimentar e da homeostase da glicose podendo, assim, ser um alvo terapêutico para diabetes e obesidade. (Gonzàlez; Reimann; Burdakov, 2009; O’Malley e cols., 2006).
Ainda que os estudos clínicos realizados até o momento sejam promissores, pouco se sabe sobre como os inibidores de SGLT-2 funcionam em nível molecular, quais seriam os possíveis efeitos da utilização prolongada de tais fármacos sobre o cérebro e por quais mecanismos a glicosúria indica ao sistema nervoso central para alterar a regulação do apetite. Neste sentido, esse trabalho visa investigar, em camundongos e humanos, a possível relação da inibição do SGLT-2, pela dapagliflozina, na funcionalidade hipotalâmica, nos aspectos fisiológicos e no comportamento alimentar.
2. Objetivos
2.1 Geral
2.1.1 Avaliar o efeito da inibição do SGLT-2 pela dapagliflozina no hipotálamo e caracterizar a expressão e a funcionalidade desse co-transportador nos camundongos.
2.1.2 Em humanos, avaliar os efeitos metabólicos e as alterações hipotalâmicas decorrentes da inibição do SGLT-2.
2.2 Específicos
Em camundongos:
2.2.1 Avaliar o impacto do uso de dapagliflozina sobre a expressão hipotalâmica de neurotransmissores envolvidos com a regulação da ingestão alimentar e gasto energético.
2.2.2 Estudar o potencial efeito da inibição do SGLT-2 no hipotálamo de camundongos sobre o peso corporal, o consumo alimentar, homeostase glicêmica e na metabolização de substratos energéticos.
Em humanos:
2.2.3 Avaliar os parâmetros envolvidos na homeostase da glicose: sensibilidade e secreção de insulina, produção de glucagon e glicosúria frente ao uso da dapagliflozina
2.2.4 Estudar o potencial efeito da inibição do SGLT-2 na composição corporal, no consumo alimentar e avaliar gasto energético por meio da calorimetria indireta. 3. Justificativa
Os efeitos benéficos propiciados pela inibição do SGLT-2 no controle glicêmico em indivíduos diabéticos já estão bem estabelecidos. Contudo, é necessário promover avanço na caracterização de sua ação na regulação do peso. Existe uma discordância entre a perda de glicose e a perda de peso, sugerindo que mecanismos compensatórios entrem em ação após algum tempo de uso de fármacos dessa classe. A caracterização dos mecanismos envolvidos nesta resposta compensatória pode
contribuir para avanços na caracterização dos mecanismos hipotalâmicos de controle da fome e do gasto energético.
4. Material e Métodos
4.1 Modelo animal
A linhagem utilizada foi de camundongos C57BL/6, machos, obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP), com quatro semanas de vida. Os animais foram acondicionados em ambiente mantido a 25ºC, com ciclos escuros – claros fixos (12/12 horas), recebendo água potável e ração ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UNICAMP, sob o protocolo 3781-1.
4.2 Protocolos experimentais
4.2.1 Evolução Ponderal e Ingestão Alimentar
Todos os animais tiveram o peso corpóreo aferido para a separação dos grupos (Controle/Veículo; dapagliflozina 1mg/kg; dapagliflozina 5mg/kg; e dapagliflozina 10mg/kg) antes, durante e ao final do tratamento. O consumo de ração também foi mensurado nos dias 0, 7 e 14 da intervenção e foi considerado o somatório da ingestão dos grupos, cada qual com 4 ou 5 animais..
4.2.2 Tratamento Farmacológico
O tratamento com dapagliflozina ou veículo (salina) foi feito por meio de gavagem diária durante duas semanas, com doses crescentes do fármaco (1, 5 ou 10mg/kg). O volume administrado para cada animal foi de 100uL/dia.
4.2.3 Volume Urinário e Glicosúria
Os animais foram alocados em gaiolas metabólicas durante os dias 0, 7 e 14 do tratamento para mensuração do volume urinário. Houve aclimatação dos animais no dia que antecedeu cada aferição. Ao final do tratamento com veículo ou dapagliflozina,
no momento do sacrifício, foi coletada a urina dos animais para posterior dosagem de glicose por meio do kit Glicose HK Liquiform (ref. 137-2/100, Labtest).
4.2.4 Consumo de O2 e produção de CO2
O consumo de O2, produção de CO2 e Quociente Respiratório (RQ) foram
determinados através do analisador de gases LE405 Gas Analyser (Panlab – Harvard
Apparatus). Para análise do consumo de O2 e produção de CO2 o ar foi direcionado a
uma coluna contendo ascarite e gel sílica para remoção do CO2 e da água,
respectivamente, antes de chegar a um distribuidor com múltiplas saídas, o qual dividia o fluxo total em quatro canais (um para cada animal). O fluxo de ar de cada respirômetro é periodicamente checado por um fluxímetro modelo Air Suplly &
Switching (Panlab – Harvard Apparatus) para detecção de oscilações menores que 1%
durante as medições. Cada um dos 4 canais de fluxo alimentou um respirômetro, sendo que um deles fez tomadas do ar ambiente, como referência basal. Os dados coletados foram analisados através do software Metabolism 2.2v. Antes do início do experimento, os animais foram estabilizados nas câmaras durante 30 minutos e as primeiras duas horas de medidas foram descartadas. As análises foram realizadas em um período de 24 horas, com fluxo de ar de dez vezes o peso de cada camundongo. Os VO2 e VCO2 foram calculados pelo programa Metabolism 2.2v baseados na
equação de Withers e foram expressos como mL.h-1.g-1. O quociente respiratório (QR) foi calculado como VCO2/VO2. Durante o mesmo período, a atividade locomotora
voluntária foi medida em unidades arbitrárias.
4.2.5 Teste de Tolerância à Glicose (GTT)
Durante o tratamento, os animais dos quatro grupos estudados foram submetidos ao GTT. Após jejum overnight, realimentação com ração por 2h e jejum de 4h, foi feita a coleta de sangue para dosagem de glicose basal (tempo 0). Foi feito um tratamento agudo com veículo ou Dapagliflozina e aferiu-se a glicemia pós-gavagem. Após 30 minutos, os animais receberam glicose a 20% intraperitonealmente na dose de 1g/kg. A partir dessa injeção, foram coletadas amostras de sangue nos tempos 15, 30, 60 e 120 minutos para a dosagem da glicemia.
4.2.6 Extração de tecido adiposo e hipotálamo
Após duas semanas de tratamento, os animais foram submetidos ao protocolo de jejum estabelecido e anestesiados com injeção intraperitoneal de tiopental sódico (15
mg.kg-1). A perda dos reflexos pedioso e corneano foi utilizada para avaliação da eficiência da anestesia. Confirmada a eficácia anestésica, os animais foram eutanasiados por decapitação. Após a abertura do crânio, o hipotálamo foi retirado e homogeneizado para quantificação de RNA mensageiro de neurotransmissores hipotalâmicos por RT-PCR. Foi feita a extração do tecido adiposo epididimal para determinação da massa.
4.2.7 Imunofluorescência
A fim de analisar a distribuição espacial do SGLT-2 no cérebro, bem como em quais neurônios este co-transportador está expresso, foram utilizados animais Swiss, cedidos pelo grupo de pesquisa, apenas para a realização desta técnica. Os camundongos estavam em dieta ração e não foram submetidos a nenhum tratamento, pois o intuito era analisar a expressão do SGLT-2 em condições fisiológicas normais e sem interferentes. Os animais foram perfundidos com salina e solução de paraformaldeído 4%, pH 7,4. Os cérebros foram retirados e permaneceram em paraformaldeído por 24 horas. Em seguida, foram transferidos para solução contendo 30% (g/mL) de sacarose, onde permaneceram por 48 horas. Os cérebros foram cortados em criostato, produzindo cortes de 20μm em secção coronal e colocados em lâminas silanizadas para microscopia. Os cortes foram lavados em tampão PBS 0,1molar e depois ficaram imersos em solução de peróxido de hidrogênio 3% por cinco minutos, e, novamente lavados em PBS 0,1molar. Após a lavagem, os cortes foram incubados com solução de bloqueio contendo 5% de soro donkey (#D9023, Sigma-Aldrich, Inc.) diluído em tampão PBS-T (0,2% of Triton x-100) por 1 hora em temperatura ambiente, seguido de incubação overnight com os anticorpos primários contra NPY, IGFBP-2, GLTU-2 e SGLT-2 (#sc133080, #sc365368, 7580 e #sc-98975, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), POMC (#ab14064, AbCam, Cambridge, UK) e NeuN (#MAB377, Millipore, Temecula, CA, USA), diluídos na mesma solução de bloqueio (1:100). No dia seguinte, os cortes foram incubados com anticorpos secundários conjugados com FITC/Alexa Fluor 488 ou Cy3 (#sc2777; #sc2092, Santa
Cruz Biotechnology, CA, USA). Em seguida os cortes foram lavados, imersos em
solução contendo o marcador nuclear Topro3 (#T3605, Life Technologies) e as lâminas foram cobertas com ProLong (Life Technologies) como meio de montagem. As imagens foram obtidas usando um Microscópio Confocal a laser (LSM510, Zeiss, New York, NY).
As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems), que foi constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Foram utilizados os primers para os genes que codificavam os neurotransmissores NPY, AgRP, POMC, TRH, CRH e MCH, Mm00445771_m1, Mm00475829_g1, Mm00435874_m1, Mm01963590_s1, Mm01293920_s1, Mm01242886_g1.
O gene GAPD (TaqManTM - Applied Biosystems) foi escolhido como controle endógeno da reação, o qual serviu para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD estava marcada com o fluoróforo VIC. Antes de iniciar o experimento de quantificação relativa da expressão dos genes acima foi feita a validação do sistema para os mesmos e para o controle endógeno (GAPD), para verificar se as eficiências de amplificação serão semelhantes e próximas a 100%.
Para a quantificação relativa do gene em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 3 μL de TaqMan Universal PCR Master Mix 2x, 0,25 μL da solução de oligonucleotídeo e sonda, 2,75 μL de água e 4,0 μL de cDNA, sendo que o controle negativo foi realizado com 4,0 μL de água, ao invés do cDNA. Os ciclos utilizados no termociclador foram: 50ºC por 2 minutos, 95ºC por 10 minutos, 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
4.3 Análises em Humanos
4.3.1 Recrutamento das voluntárias
Foram selecionadas para participar deste estudo mulheres eutróficas (IMC entre 18,5 e 24,9 Kg/m²), com tolerância normal à glicose e idade entre 19 e 37 anos. As voluntárias foram recrutadas entre novembro de 2015 e fevereiro de 2017, totalizando 20 mulheres, estudantes da Universidade Estadual de Campinas, que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (CAAE: 38488714.8.0000.5404).
4.3.2 Avaliação Antropométrica e da Composição Corporal
Na coleta de dados inicial (basal), foram aferidos peso; altura; perímetros da cintura e do quadril; diâmetro abdominal sagital; e pressão arterial. O peso foi aferido
em balança eletrônica digital e a estatura em estadiômetro fixo na parede. Então, foi calculado o Índice de Massa Corporal (IMC) pela fórmula: peso (kg) / altura(m)² e a classificação do estado nutricional utilizará o critério da WHO (2000).
O diâmetro abdominal sagital foi aferido com um caliper abdominal (Holtain Kahn
Abdominal Caliper®) de haste móvel e subdivisão de 0,1 cm. No momento da
avaliação, a voluntária esteve em posição supina e com os joelhos flexionados em uma mesa examinadora de superfície firme. A medida foi aferida ao nível umbilical e as leituras foram realizadas no milímetro mais próximo, quando a haste móvel do caliper tocou o abdômen ligeiramente, sem compressão, após a expiração normal (Ohrvall e cols., 2000).
A composição corporal foi avaliada por meio do método de bioimpedância elétrica tetrapolar, utilizando o equipamento Bioimpedance Analyzer - BIA 310®, seguindo os critérios de Lukaski et al, 1986 e Biodynamics Corporation (Lukaski e cols., 1986). Foi solicitada a retirada de todos os adornos de metal, como anéis, cordões, relógios e outros. A voluntária permaneceu deitada por 5 minutos, antes da execução do teste, sobre uma superfície não condutora, em decúbito dorsal, com os braços e pernas estendidas e separadas, sem contato entre as pernas e as coxas, e entre os braços e o tronco. Realizou-se uma limpeza prévia da pele com auxílio de algodão embebido em álcool. Foram posicionados dois conjuntos de eletrodos, sendo um na mão direita (eletrodo distal na base do dedo médio e eletrodo proximal um pouco acima da linha da articulação do punho, coincidindo com o processo estilóide) e outro no pé direito (eletrodo distal na base do dedo médio e eletrodo proximal um pouco acima da linha da articulação do tornozelo, entre os maléolos medial e lateral). Conectou-se o cabo sensor no monitor e suas extremidades nos eletrodos. Os clipes pretos do cabo sensor foram colocados nos eletrodos distais e os clipes vermelhos nos eletrodos proximais. Foi solicitado que a voluntária estivesse em jejum de alimentos, bebidas e água por 4 horas antes do teste; não fizesse uso de nenhum diurético nos 7 dias anteriores ao teste; não consumisse bebidas alcoólicas nas últimas 48 horas; não realizasse atividade física extenuante nas 24 horas anteriores ao teste; urinasse pelo menos 30 minutos antes da avaliação; permanecesse em silêncio; e que não estivesse menstruada no dia do teste.
A pressão arterial (PA) foi aferida pelo método auscultatório, com esfigmomanômetro de coluna de mercúrio e manguito com bolsa de borracha de
tamanho adequado à circunferência do braço da voluntária, seguindo as normas propostas pela Sociedade Brasileira de Cardiologia (2016).
Foi realizada uma anamnese para coleta de dados demográficos, estilo de vida, uso de medicamentos, história médica pregressa e antecedentes familiares de doenças de interesse: obesidade, diabetes tipo 2, hipertensão arterial, infarto agudo do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral e dislipidemias. Também foram coletadas informações referentes a prática de exercício físico (modalidade, frequência e duração) e consumo de bebida alcoólica.
As análises descritas acima foram feitas novamente após a intervenção com dapagliflozina.
4.3.3 Intervenção medicamentosa
As voluntárias receberam o medicamento (dapagliflozina 10mg) e iniciaram a intervenção no mesmo dia da ressonância magnética funcional basal. Foi administrado um comprimido por dia, durante uma semana. Ao final do tratamento, foi solicitada a devolução do blister para garantir que todos os comprimidos foram ingeridos. Em caso de esquecimento, as voluntárias foram orientadas a não tomar e deixar o comprimido no blister.
4.3.4 Teste de Tolerância Oral à Glicose (TTOG)
O TTOG foi realizado em dois momentos, antes e após o tratamento. Para a realização do teste, foi solicitado jejum de 12 horas e foram feitas coletas de sangue nos tempos -15 e 0 minutos. Em seguida, a voluntária ingeriu uma solução de glicose (75g em 300mL - GLUC UP 75, Newprov) e deu-se prosseguimento ao exame com coletas nos tempos 10, 20, 30, 60, 90 e 120 minutos. No Quadro 1 estão apresentados os pontos de corte para o diagnóstico.
Quadro 1 – Valores de glicemia de jejum e pós-prandial para o diagnóstico de normalidade
Categoria Jejum 2h após 75g de glicose
Glicemia normal (mg/dL) < 100 < 140
4.3.5 Ressonância Magnética Funcional
Para avaliar a ativação de áreas cerebrais frente ao estímulo com glicose, foi realizada ressonância magnética funcional no início e no final do tratamento. As voluntárias estavam em jejum (12 horas) e permaneceram na mesa radiográfica em posição supina com imobilização da cabeça. Foi posicionada na cavidade oral das participantes, a extremidade de um equipo (utilizado para infusão parenteral) para permitir a posterior ingestão da solução de glicose. Após 10 minutos do início da aquisição das imagens funcionais, as voluntárias iniciaram a ingestão de 75g de glicose diluídos em 300mL de água (GLUC UP 75, Newprov). As imagens continuaram a ser captadas durante e após o término da ingestão da glicose, totalizando 1 hora e 10 minutos de exame.
As imagens de ressonância magnética foram adquiridas em um aparelho de 1,5T GE (GE Healthcare, Waukesha, WI). Dois tipos de sequências de pulso foram utilizados, sendo o primeiro para obter dados estruturais do cérebro das participantes e o segundo para se observar aspectos da dinâmica cerebral. Durante o exame, foram obtidos 600 volumes de forma contínua e ininterrupta. Cada volume foi composto por 20 cortes sagitais e matriz de 64 x 64. A espessura de cada corte funcional foi de 5mm com intervalo de 1mm entre os cortes consecutivos. O tamanho do voxel em cada volume foi de 3,75 x 3,75 x 6 mm. O software MATLAB/SPM (Statistical Parametric
Mapping) foi utilizado para demarcar as imagens estruturais e funcionais, tendo como
ponto de referência a comissura anterior. Já o processamento das imagens foi feito por meio do software UF²C toolbox (User Friendly Functional Connectivity). (de Campos e cols., 2016).
4.3.6 Calorimetria Indireta
No dia seguinte à ressonância, foi realizada a calorimetria indireta para medir o consumo de oxigênio e de produção de dióxido de carbono por minuto, através de um espirômetro. Para tanto, as voluntárias foram orientadas a não beber bebidas alcóolicas, a não realizar atividade física extenuante 48 horas antes do teste e a realizar, na noite anterior ao teste, uma refeição padronizada contento macarrão, queijo e suco de laranja (18% proteína, 22% de gorduras e 60% de carboidrato), seguida de jejum de 12 horas.
O teste foi realizado com a utilização do equipamento Vmax™ Encore Metabolic
antes do exame para estabilização e foi calibrado com gás de concentração conhecida, antes de cada determinação. As participantes chegaram ao laboratório às 8h00 com o mínimo de esforço, sendo transportadas de carro ou ônibus até o local. As voluntárias foram pesadas e permaneceram em repouso na posição supina por 30 minutos até o início das avaliações.
A avaliação do metabolismo energético foi realizada pela determinação da taxa metabólica de repouso (TMR), do quociente respiratório (QR) e pela taxa de oxidação de substratos (TOS) aferidos por um período de 30 minutos, após o repouso inicial. Durante a avaliação não foi permitido dormir (Lorenzen e cols., 2012).
O exame foi realizado em dois momentos da intervenção com Dapagliflozina, após a primeira e a última doses.
4.3.7 Registro alimentar
A avaliação do consumo alimentar foi feita por meio do Registro Alimentar por Peso de 3 dias, realizado na semana que antecedeu ao tratamento e nos últimos dias da intervenção (dias 5, 6 e 7). Cada participante recebeu informações verbais e por escrito a respeito do preenchimento deste registro, o qual consistiu em anotar e pesar todos os alimentos e bebidas consumidos dentro e fora do domicílio, de forma detalhada. Fornecemos uma balança para a voluntária realizar a pesagem antes do consumo e, no caso de haver sobras, estas também deveriam ser pesadas. Após o preenchimento, fizemos a avaliação quantitativa do registro alimentar, calculando o consumo energético total e dos macronutrientes. Para tal, utilizamos o software
Dietpro versão 5i que disponibiliza 16 tabelas de composição química de alimentos,
como a Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2006) e a Tabela de Composição de Alimentos do Estudo Nacional da Despesa Familiar (IBGE, 1999).
4.3.8 Ensaios Biológicos
Foram mensurados nas amostras de sangue das coletas inicial e final, os seguintes parâmetros bioquímicos: glicose, insulina, peptídeo C, hemoglobina glicada; colesterol total; HDL; LDL; triglicerídeos; ácido úrico; uréia; creatinina; gama glutamiltransferase (GGT); aspartato aminotransferase (AST); alanina aminotransferase (ALT); hormônio estimulante da tireoide (TSH); e tiroxina 4 livre (T4 livre). As dosagens foram realizadas no Hospital das Clínicas da UNICAMP ou no Laboratório Franceschi – Unidade UNICAMP. Os ácidos graxos livres (FFA), a
adiponectina e o glucagon foram dosados ao final da coleta de todas as voluntárias, por meio de kits específicos.
5. Análise dos resultados
5.1 Análise estatística e apresentação dos resultados
Todos os valores obtidos na análise experimental com camundongos foram expressos como média ± desvio padrão. Os dados foram avaliados por teste T (quando 2 grupos) ou análise de variância (One-wayANOVA) seguida por teste de significância (Bonferroni test), comparando grupos experimentais. O nível de significância utilizado para analisar os resultados foi p<0,05.
Na estudo com humanos, foi construído um banco de dados e análises estatísticas por meio do programa IBMSPSS - Statistical Package for the Social Science - versão 20.0. Os dados foram apresentados em média ± desvio padrão e avaliados por teste T para comparar o efeito do tratamento com o inibidor de SGLT-2.
6. Resultados e Discussão
Análises em Camundongos
6.1 Caracterização do SGLT-2
É sabido que o co-transportador de sódio-glicose tipo 2 está expresso no rim e no hipotálamo. (Yu e cols., 2010). Com o intuito de confirmar a expressão do SGLT-2, utilizamos camundongos C57BL/6 em ração, não tratados com dapagliflozina, para fazer a caracterização do SGLT-2, por RT-PCR, nos seguintes tecidos: rim, hipotálamo, córtex, hipocampo e cerebelo. (Figura 1).
Figura 1. Quantificação do SGLT-2 em diferentes tecidos, por PCR em tempo real, de camundongos em dieta padrão sem tratamento com veículo ou fármaco. (n=12).
O SGLT-2 está expresso no rim, córtex, hipocampo, cerebelo e, em menor quantidade, no hipotálamo. A menor expressão no hipotálamo, comparada com os outros tecidos analisados, sugere que o SGLT-2 possa estar expresso em populações neuronais específicas. (Fig. 1).
A fim de caracterizarmos em mais detalhe a expressão do SGLT-2 no hipotálamo, utilizamos a técnica de imunofluorescência.
6.2 Expressão do SGLT-2
Fizemos imunomarcações a fim de analisar a expressão do SGLT-2 no hipotálamo de camundongos magros, alimentados com ração e não submetidos a qualquer tratamento. A expressão de SGLT-2 foi detectada de forma discreta em neurônios (marcação com Neu-N) e particularmente em neurônios POMC e NPY. O SGLT-2 foi também detectado em tanicitos β1 (IGFBP-2), células que compõem a interface da barreira hematoencefálica próximo a eminência mediana no hipotálamo. Nestas células a marcação para SGLT-2 foi bastante intensa. (Figuras 2 – 6).
Rim Hipo tála mo Córtex Hipo cam po Cereb elo 0.0 0.5 1.0 1.5 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m
Figura 2. Imunofluorescência com marcação de NeuN (marcador neuronal) com SGLT-2 no 3V de camundongos em dieta padrão. A. Imagens observadas na objetiva de 20x. B. Imagens observadas na objetiva de 63x.
Figura 3. Imunofluorescência com marcação de POMC com SGLT-2 no 3V de camundongos em dieta padrão. A. Imagens observadas na objetiva de 20x. B. Imagens observadas na objetiva de 63x.
Figura 4. Imunofluorescência com marcação de NPY com SGLT-2 no 3V de camundongos em dieta padrão. A. Imagens observadas na objetiva de 20x. B. Imagens observadas na objetiva de 63x.
Figura 5. Imunofluorescência com marcação de IGFBP-2 (marcador de tanicito β1) com SGLT-2 no 3V de camundongos em dieta padrão. A. Imagens observadas na objetiva de 20x. B. Imagens observadas com zoom na objetiva de 20x.
Figura 6. Imunofluorescência com marcação de GLUT-2 com SGLT-2 no 3V de animais em dieta padrão. A. Imagens observadas na objetiva de 20x. B. Imagens observadas com zoom na objetiva de 20x.
Observamos pela imunomarcação que o SGLT-2 encontra-se na região do terceiro ventrículo (3V), colocalizando-se com neurônios POMC e NPY (Fig. 3 e 4). Tais evidências apontam para uma possível participação do SGLT-2 no controle alimentar. Houve colocalização com NeuN (Fig. 2), indicando que o SGLT-2 está presente em alguns neurônios maduros, e apresenta localização semelhante aos tanicítos β1 indicando também presença em células envolvidas com a estrutura e função da barreira hematoencefálica (Fig. 5). Observamos ainda que o GLUT-2 está localizado predominantemente na eminência mediana, parecendo haver colocalização com as células marcadas com SGLT-2 (Fig. 6).
6.2. Inibição farmacológica do SGLT-2
Camundongos C57BL/6, com 8 semanas de vida, receberam por gavagem veículo ou dapagliflozina nas doses de 1mg/kg, 5mg/kg ou 10mg/kg, durante duas semanas. O tratamento foi diário e realizado por volta das 16h00 (ZT 10). O horário foi definido com base na literatura que demonstra haver maior expressão do SGLT-1 no ZT9 (final do período claro) e no ZT12 (início do período escuro). Devido ao fato de não haver muitos estudos específicos para a isoforma 2 e por serem da mesma
família, optamos por manter esse intervalo de tempo para tratar os camundongos. (Tavakkolizadeh e cols., 2001).
Ao longo do tratamento (dias 0, 7 e 14) aferimos peso corpóreo; ingestão alimentar e volume urinário de 24h. Além disso, mensuramos glicemia, durante o GTT; consumo de O2 e produção de CO2; e massa adiposa epididimal.
6.2.1. Evolução Ponderal e Massa Adiposa Epididimal
Os camundongos tiveram seu peso mensurado antes de iniciar o tratamento (dia 0), durante (dia 7) e ao final do experimento (dia 14). No momento do sacrifício, foi extraído o tecido adiposo epididimal para determinação da massa. (Figuras 7 e 8).
Figura 7. Evolução ponderal de camundongos submetidos ao tratamento com veículo ou dapagliflozina (DAPA). A. Peso corpóreo durante o tratamento com inibidor de SGLT-2. B. Delta peso dos 4 grupos de estudo. (n≥4; *p<0,05).
Figura 8. Massa adiposa epididimal de camundongos submetidos a duas semanas de tratamento com veículo ou dapagliflozina. (n≥13).
Tecido Adiposo Epididimal
CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DAP A 10 mg/k g 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 p = 0,1325 m a s s a a d ip o s a ( g ) Peso Corpóreo 22 24 26 28 30 CTL DAPA1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 0 7 14 P e s o ( g ) Dia A Delta Peso -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 CTL DAPA1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg * De lt a P e s o ( g ) B
A inibição farmacológica do SGLT-2 na dose de 10mg/kg promoveu uma redução significativa no ganho de peso em camundongos (Fig. 7B), acompanhado por uma tendência de diminuição da massa adiposa epididimal (Figura 8).
6.2.2. Teste de Tolerância à Glicose (GTT)
Com o objetivo de demonstrar o efeito hipoglicemiante do inibidor de SGLT-2, realizamos uma gavagem aguda antes do início do GTT. Aferimos a glicemia basal de jejum, tratamos os animais com veículo ou dapagliflozina e mensuramos a glicemia após a gavagem. (Figura 9).
Figura 9. Glicemia após tratamento agudo com veículo ou dapagliflozina. A. Perfil glicêmico dos grupos de estudo antes e após administração do inibidor de SGLT-2. B. Representação dos valores de glicemia aferidos nos dois momentos propostos. (n=4; *p<0,05).
Após 30 minutos da gavagem aguda, deu-se prosseguimento ao GTT. As coletas de sangue foram realizadas por meio da cauda dos animais para dosagem de glicemia nos tempos 15, 30, 60 e 120 minutos. (Figura 10).
0 50 100 150 CTL DAPA 1 mg DAPA 10 mg DAPA 5 mg * * * * Glicemia pré e pós-gavagem g lic e m ia ( m g /d L ) B A Glicemia pré e pós-gavagem 50 100 150 200 250 CTL DAPA 1 mg DAPA 10 mg DAPA 5 mg g lic e m ia ( m g /d L ) B A GTT 100 200 300 400 500 CTL DAPA 1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 0 15 30 60 120 Tempo (minutos) g lic e m ia ( m g /d L ) AUC CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DA PA 10 mm g/kg 0 10000 20000 30000 40000 50000 * * *
Figura 10. Teste de Tolerância à Glicose realizado durante o tratamento com veículo ou dapagliflozina. A. Curva glicêmica dos 4 grupos estudados. B. Área sob a curva obtida no GTT. (n≥4; *p<0,05).
O resultado obtido por meio da gavagem aguda com o inibidor de SGLT-2 sugere que o fármaco é rapidamente absorvido e desempenha sua função de reduzir a glicemia, observado em todos os grupos tratados, de forma significativa, quando comparado aos animais que receberam apenas salina.
Houve redução da glicemia de jejum, bem como uma melhor eficiência no decaimento da curva glicêmica propiciada pelo tratamento com dapagliflozina. Tal evidência foi observada em todas as doses propostas (Fig. 10).
6.2.3. Ingestão Alimentar, Volume Urinário e Glicosúria
Mensuramos o consumo alimentar e o volume urinário em 3 momentos: antes (dia 0), durante (dia 7) e ao final do tratamento (dia 14). (Figuras 11 e 12).
Figura 11. Ingestão alimentar de camundongos de cada grupo de estudo, submetidos à dieta padrão e ao tratamento com veículo ou dapagliflozina. (n≥4).
Para aferir o volume urinário, os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas por 24h, após aclimatação.
Volume Urinário 24h 0 1 2 3 4 5 CTL DAPA 1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 0 7 14 Dia V o lu m e U ri n á ri o (m L) B Volume Urinário 24h CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DAP A 10 mg/k g 0 2 4 6 V o lu m e U ri n á ri o (m L) A Ingestão Alimentar 0 10 20 30 CTL DAPA1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 0 7 14 Dia In g e s tã o A lim e n ta r ( g /2 4 h )
Figura 12. Volume urinário de camundongos tratados com inibidor de SGLT-2. A. Volume urinário total baseado na média dos valores encontrados. B. Excreção urinária antes e ao longo do tratamento com dapagliflozina. (n=4).
A partir da urina coletada, mensuramos a glicose excretada ao final do tratamento com veículo ou inibidor de SGLT-2. (Figura 13).
Figura 13. Glicosúria aferida ao final do tratamento com veículo ou dapagliflozina. (n≥4; *p<0,05).
A ingestão alimentar não se alterou de forma significativa entre os grupos, durante o período analisado (Fig. 11). Em relação ao volume urinário, observamos um aumento na média, mas não foi significativo (Fig. 12). Ademais, observamos glicosúria nos grupos tratados, sendo a glicose mais excretada na urina dos animais que receberam o inibidor de SGLT-2 nas doses de 5 e 10mg/kg (Fig. 13).
6.2.4. Consumo de O2 e produção de CO2
Os animais tiveram seu metabolismo energético avaliado por meio das variações nas taxas de consumo de O2 e produção de CO2, quociente respiratório
(RQ) e atividade locomotora. A respirometria foi iniciada logo após a gavagem diária permanecendo por 24 horas em avaliação. Os dados coletados foram analisados através do software Metabolism 2.2v. (Figura 14).
Glicosúria CTL DA PA 1m g DA PA 5m g DA PA 10 mg 0 500 1000 1500 * * G lic o s e ( m g /d L ) B VO2 Light/Dark 0 5 10 15 20 Light Dark CTL DAPA 10mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 1mg/kg VO 2 ( mL /m in) VO2 10 20 CTL DAPA 1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 6 18 Tempo (horas) VO 2 ( mL /m in) A
Figura 14. Metabolismo energético dos animais submetidos ao tratamento com veículo ou dapagliflozina. A. Consumo de O2 em mL/min ao longo de 24 horas
(período escuro corresponde à parte hachurada do gráfico). B. Consumo de O2 em
mL/min de cada grupo nos períodos claro e escuro. C. Produção de CO2 em mL/min
ao longo de 24 horas D. Produção de CO2 em mL/min de cada grupo nos períodos
claro e escuro. E. Quociente Respiratório (VCO2/VO2) ao longo de 24 horas. F.
Quociente Respiratório em mL/min de cada grupo nos períodos claro e escuro. G. C VCO2 10 20 CTL DAPA 1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 18 6 Tempo (horas) V CO 2 ( mL /m in) D VCO2 Light/Dark 0 5 10 15 20 Light Dark CTL DAPA 10mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 1mg/kg * * V CO 2 ( mL /m in) E RQ 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 CTL DAPA 1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg 6 18 Tempo (horas) V CO 2 /V O2 ( mL /m in) F RQ Light/Dark 0.0 0.5 1.0 Light Dark CTL DAPA 10mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 1mg/kg * * V CO 2 /V O2 ( mL /m in) G Activity 0 20 40 60 CTL DAPA 1mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 10mg/kg A rb ita ry Un its 6 18 Tempo (horas) H Activity Light/Dark 0 5 10 15 20 Light Dark CTL DAPA 10mg/kg DAPA 5mg/kg DAPA 1mg/kg A rb ita ry Un its
Atividade locomotora em unidades arbitrárias ao longo de 24 horas. H. Atividade locomotora em unidades arbitrárias de cada grupo nos períodos claro e escuro. (n=3; *p<0,05).
O tratamento com inibidor de SGLT-2 não exerceu efeito sobre o consumo de O2 e
a atividade locomotora,pelo menos durante o período analisado (Fig. 14A e B e 14G e H). Entretanto, foi observada uma menor produção de CO2 e uma diminuição do
quociente respiratório (RQ), principalmente nas doses de 5 e 10mg/kg (Fig. 14C-F). O fato de o quociente respiratório ter reduzido, indica que houve um discreto aumento da oxidação preferencial de ácidos graxos, o que pode contribuir para a possível redução da adiposidade. (Fig. 8).
6.2.5. Real Time PCR
Após duas semanas de tratamento com veículo ou dapagliflozina, no momento do sacrifício, retiramos e processamos o hipotálamo para quantificação de RNA mensageiro de neuropeptídeos hipotalâmicos, tanto orexigênicos (NPY, AgRP, Orexina e MCH) quanto anorexigênicos (POMC, CART, TRH e CRH). (Figuras 15 e 16). C D B A NPY CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DA PA 10 mg/k g 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A AgRP CTL DAP A 1m g/k g DAP A 5m g/k g DAP A 10 mg /kg 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 * Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A Orexina CTL DA PA 1m g/k g DA PA 5m g/k g DA PA 10 mg /kg 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A MCH CT L DA PA 1m g/kg DA PA 5m g/kg DA PA 10 mg /kg 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A
Figura 15. Expressão gênica de neuropeptídeos orexigênicos de camundongos em dieta ração submetidos ao tratamento com veículo ou inibidor de SGLT-2. A. Neuropeptídeo Y (NPY). B. Peptídeo Relacionado ao Gene Agouti (AgRP). C. Orexina ou hipocretina. D. Hormônio de Concentração dos Melanócitos (MCH). (n≥4; *p<0,05; normalização por GAPDH).
Figura 16. Expressão gênica de neuropeptídeos anorexigênicos de camundongos em dieta ração submetidos ao tratamento com veículo ou inibidor de SGLT-2. A. Pró-Ópio Melanocortina (POMC). B. Transcrito Regulado por Cocaína e Anfetamina (CART). C. Hormônio Liberador de Tireotrofina (TRH). D. Hormônio Liberador de Corticotrofina (CRH). (n≥4; normalização por GAPDH).
Houve aumento significativo na expressão de AgRP após tratamento com 1mg/kg de dapaglifozina, sugerindo que tal dose pode apresentar efeitos
POMC CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DAP A 10 mg /kg 0.0 0.5 1.0 1.5 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A A CART CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DAP A 10 mg/k g 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A B TRH CTL DAP A 1m g/kg DAP A 5m g/kg DA PA 10 mg /kg 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A C CRH CTL DA PA 1m g/kg DA PA 5m g/kg DAP A 10 mg /kg 0.0 0.5 1.0 1.5 Re la ti v e q u a n ti fi c a ti o n o f m R N A D
estimuladores de apetite (Fig. 15B). Em relação aos neurotransmissores anorexigênicos, não observamos nenhuma alteração significativa (Fig. 16).
6.3. Resumo dos resultados obtidos em camundongos
A análise em camundongos nos permitiu demonstrar que o co-transportador de sódio-glicose tipo 2 (SGLT-2) está expresso no cérebro, incluindo as regiões córtex, hipocampo, cerebelo e hipotálamo. Neste, o SGLT-2 se distribui de forma mais específica, encontrando-se no hipotálamo médio-basal e colocalizando-se com neurônios POMC e NPY, além dos tanicítos β1. Após realizar o tratamento com dapagliflozina por duas semanas, notamos que a inibição do SGLT-2 não alterou a massa adiposa epididimal; melhorou a tolerância à glicose; aumentou o volume urinário e promoveu glicosúria; além de ter reduzido a produção de CO2 e o coeficiente respiratório; e estar envolvida no controle alimentar e no dispêndio energético.
Análises em Humanos
Foram analisadas 20 voluntárias eutróficas, não diabéticas, que receberam dapagliflozina 10mg por uma semana.
6.4. Antropometria e Composição Corporal
As medidas antropométricas incluem peso, altura, perímetros da cintura e do quadril, diâmetro abdominal sagital e pressão arterial. Calculamos o Índice de Massa Corporal (IMC) pela fórmula: peso (kg) / altura(m)² e a composição corporal foi avaliada por meio da bioimpedância elétrica tetrapolar. Tais aferições ocorreram antes e após a intervenção com dapagliflozina. (Figura 17).
Peso Corpóreo Inici al Fina l 0 20 40 60 80 P e s o ( k g ) A B
Índice de Massa Corpórea
Inici al Fina l 0 5 10 15 20 25 IMC ( k g/m ²) C Massa Adiposa Inici al Fina l 0 10 20 30 40 G o rd u ra ( % ) D Massa Magra Inici al Fina l 0 10 20 30 40 50 M a s s a m a g ra ( k g )
Figura 17. Antropometria e composição corporal das voluntárias do estudo antes e após a intervenção com dapagliflozina. A. Peso corpóreo. B. Índice de Massa Corporal (IMC). C. Porcentagem de gordura. D. Massa magra. E. Circunferência da cintura (CC). F. Circunferência do quadril (CQ). G. Relação cintura quadril (CC/CQ). H. Diâmetro abdominal sagital (DAS). I. Pressão sistólica. J. Pressão diastólica.
Para melhor representar e compactar os dados encontrados, foi preparada a Tabela 1 contendo as médias de cada medida antropométrica e da composição corporal. Circunferência Cintura Inici al Fina l 0 20 40 60 80 100 Ci rc u n fe rê n c ia c in tu ra ( c m ) Circunferência Quadril Inici al Fina l 0 50 100 150 Ci rc u n fe rê n c ia q u a d ri l ( c m ) Inici al Fina l 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 C. Ci n tu ra /C. Q u a d ri l
Diâmetro Abdominal Sagital
Inici al Fina l 0 5 10 15 20 D A S ( c m ) Pressão Sistólica Inici al Fina l 0 50 100 150 P A S ( mm H g) I Pressão Diastólica Inici al Fina l 0 20 40 60 80 P A D ( mm H g) J
Medidas Inicial (média±DP) Final (média±DP) p valor
Peso (kg) 58,5 ± 5,8 57,9 ± 6,3 0,073 IMC (kg/m²) 21,7 ± 2,0 21,5 ± 2,0 0,054 Massa Adiposa (%) 28,4 ± 6,3 27,6 ± 4,0 0,465 Massa Magra (kg) 42 ± 4,2 42,4 ± 4,2 0,598 Circ. Cintura (cm) 75,3 ± 5,7 74,4 ± 6,2 0,058 Circ. Quadril (cm) 98,1 ± 4,2 98,0 ± 5,3 0,790 RCQ 0,7 ± 0,04 0,7 ± 0,04 0,179 DAS (cm) 15,1 ± 1,1 14,7 ± 1,2 0,056 PAS (mmHg) 103 ± 9,7 102 ± 10,4 0,706 PAD (mmHg) 64 ± 7,5 65 ± 6,1 0,804
Parâmetros Bioquímicos Inicial (média±DP) Final (média±DP) p valor Referência
Glicemia (mg/dL) 75 ± 6,9 71 ± 6,7 0,025 74 a 99 mg/dL
Insulina basal (mUI/mL) 5,7 ± 3,6 3,9 ± 3,5 0,052 1,9 a 23,0 mUI/mL
Peptídeo C (ng/mL) 1,1 ± 0,3 1,2 ± 0,3 0,173 0,8 a 4,2 ng/mL
Hemoglobina Glicada (%) 5,17 ± 0,3 5,14 ± 0,2 0,657 4 a 5,6 %
Creatinina (mg/dL) 0,72 ± 0,08 0,74 ± 0,08 0,044 0,66 a 1,09 mg/dL
Uréia (mg/dL) 27 ± 6,8 23,9 ± 6,3 0,017 17 a 43 mg/dL
Ácido Úrico (mg/dL) 3,8 ± 0,6 3,1 ± 0,5 0,001 2,6 a 6 mg/dL
ALT ou TGP (U/L) 12,3 ± 5,5 12,1 ± 4,5 0,905 < 35 U/L
AST ou TGO (U/L) 15,6 ± 2,7 17,3 ± 3,0 0,048 < 35 U/L
GGT (U/L) 11,7 ± 4,4 11,5 ± 4,7 1,000 < 38 U/L Albumina (g/dL) 4,0 ± 0,2 4,1 ± 0,3 0,476 3,5 a 5,2 g/dL Colesterol (mg/dL) 169,2 ± 26,1 174,4 ± 29,8 0,341 < 200 mg/dL HDL (mg/dL) 60,2 ± 12,3 61,1 ± 11,5 0,936 ≥ 50 mg/dL LDL (mg/dL) 90,3 ± 20,9 100,5 ± 26,2 0,065 < 100 mg/dL Triglicérides (mg/dL) 93,5 ± 49,5 80,9 ± 31,4 0,072 < 150 mg/dL TSH (uUI/mL) 2,8 ± 1,5 2,3 ± 0,9 0,279 0,41 a 4,20 uUI/mL T4 livre (ng/dL) 1,26 ± 0,1 1,27 ± 0,1 0,984 0,90 a 1,8 ng/dL FFA (mmol/L) 0,5 ± 0,2 0,6 ± 0,3 0,023 Adiponectina (ug/mL) 3,2 ± 1,4 5,7 ± 3,3 0,024 Glicosúria (mg/dL) 584,9 (mín.=7 e máx.=4368) < 20 mg/dL
Tabela 1. Média dos valores obtidos na antropometria e na bioimpedância realizadas na análise basal (inicial) e após a intervenção com dapagliflozina (final) em mulheres voluntárias.
O inibidor de SGLT-2 tendeu a uma redução do índice de massa corporal (IMC), da circunferência da cintura e do diâmetro abdominal sagital e apresenta uma discreta diminuição numérica no peso corpóreo (Tabela 1). Apesar de ser um período curto de intervenção, pudemos observar tais tendências às reduções que vão além da perda de peso por apenas uma perda de líquidos, a qual é proporcionada pelo medicamento. Assim, podemos inferir que o SGLT-2 pode estar envolvido no controle alimentar e energético.
6.5. Parâmetros Bioquímicos
A partir do material biológico coletado no OGTT inicial e final, foram feitas análises dos seguintes parâmetros: glicose, insulina, peptídeo C, hemoglobina glicada; colesterol total; HDL; LDL; triglicerídeos; ácido úrico; uréia; creatinina; gama glutamiltransferase (GGT); aspartato aminotransferase (AST); alanina aminotransferase (ALT); hormônio estimulante da tireoide (TSH); e tiroxina 4 livre (T4 livre). A glicosúria foi dosada apenas ao final da intervenção. (Tabela 2).
Tabela 2. Parâmetros bioquímicos analisados antes e após a intervenção com dapagliflozina, em mulheres voluntárias, juntamente com seus respectivos valores de referência.
Observamos alterações significativas na glicemia, insulina, creatinina, uréia, aspartato aminotransferase (AST), adiponectina, no ácido úrico e nos ácidos graxos livres (FFA). Para melhor demonstrar tais alterações, fizemos a representação gráfica dos parâmetros que tiveram algum efeito após a intervenção com o inibidor de SGLT-2. (Figuras 18 - 23).
Figura 18. Níveis de glicose plasmática antes e após intervenção com inibidor de SGLT-2 (dapagliflozina) em mulheres voluntárias. (*p<0,05; teste de Wilcoxon).
