UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ILKA MARA BORGES BOTELHO
VITAMINA D EM DOENÇAS TIREOIDIANAS AUTOIMUNES E RELAÇÃO COM PERFIL HORMONAL TIREOIDIANO E ATIVIDADE INFLAMATÓRIA DE CÉLULAS
Th1, Th2 e Th17
VITAMIN D IN THYROID AUTOIMMUNE DISEASES AND RELATIONSHIP WITH THYROID HORMONE PROFILE AND INFLAMMATORY ACTIVITY OF TH1, TH2
AND TH17 CELLS.
CAMPINAS 2018
ILKA MARA BORGES BOTELHO
VITAMINA D EM DOENÇAS TIREOIDIANAS AUTOIMUNES E RELAÇÃO COM PERFIL HORMONAL TIREOIDIANO E ATIVIDADE INFLAMATÓRIA DE CÉLULAS
Th1, Th2 e Th17
VITAMIN D IN THYROID AUTOIMMUNE DISEASES AND RELATIONSHIP WITH THYROID HORMONE PROFILE AND INFLAMMATORY ACTIVITY OF TH1, TH2
AND TH17 CELLS.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para obtenção de título de Doutora em Ciências na área de concentração Clínica Médica.
Thesis presented to the Graduate Program in Medical Clinic, School of Medical Sciences from State University of Campinas for obtaining the title of PhD degree in the concentration Area Medical Clinic.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. DENISE ENGELBRECHT ZANTUT WITTMANN COORIENTADORA: PROFA. DRA. SARAH MONTE ALEGRE
Este arquivo digital corresponde à versão final da tese de doutorado defendida pela aluna Ilka Mara Borges Botelho sob orientação da Profa. Dra. Denise Engelbrecht Zantut Wittmann.
CAMPINAS 2018
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ILKA MARA BORGES BOTELHOORIENTADORA: PROFA. DRA. DENISE ENGELBRECHT ZANTUT WITTMANN COORIENTADORA: PROFA. DRA. SARAH MONTE ALEGRE
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. DENISE ENGELBRECHT ZANTUT WITTMANN
2. PROFA. DRA. MARIA DE FÁTIMA BORGES
3. PROFA. DRA. ELISABETE APARECIDA MANTOVANI RODRIGUES DE RESENDE
4. PROFA. DRA. MARIA CANDIDA RIBEIRO PARISI
5. PROF. DR. HERALDO MENDES GARMES
Programa de Pós-Graduação em Doutorado da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
“O jeito mais eficiente de fazer algo é fazendo.” Amelia Earhar
Agradecimentos
À Profa. Dra. Denise Engelbrecht Zantut Wittmann pelos ensinamentos, paciência e compromisso.
Ao Prof. Dr. Heraldo Mendes Garmes, Profa. Dra. Maria Cândida Ribeiro Parisi e aos demais professores da Disciplina de Endocrinologia da Unicamp pelo aprendizado e generosidade.
À Profa. Dra. Maria de Fátima Borges pelas lições de vida e conduta profissional.
À Profa. Dra. Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende pelo exemplo de dedicação e solidariedade e às demais professoras da Disciplina de Endocrinologia da UFTM pela ajuda e presença constante em todos os momentos do meu aprendizado.
À Profa. Dra. Sarah Monte Alegre e toda equipe do Laboratório de Unidade Metabólica pelo incentivo e apoio no laboratório.
À Laurione, à Conceição e à equipe do Laboratório de Fisiologia pelo empenho e dedicação na realização da parte laboratorial.
Aos residentes e alunos dos ambulatórios da Endocrinologia da Unicamp. A todos os pacientes e voluntários que consentiram em colaborar com este trabalho.
À FAPESP pelo financiamento concedido em forma de auxílio regular de apoio à pesquisa.
Aos meus pais, Vilma e José, pelo amor e incentivo constantes. À minha irmã Bruna e meu sobrinho Lucas pelo carinho e alegrias. Ao Henrique pelo companheirismo e compreensão inquestionáveis. Aos amigos queridos, em especial à Vivian, pelo apoio e leveza.
RESUMO
Introdução: O papel imunomodulador da vitamina D tem sido amplamente pesquisado. Estudos recentes demonstram haver relação entre insuficiência de vitamina D e presença de doenças tireoideanas autoimunes (DTAs) como Tireoidite de Hashimoto (TH) e Doença de Graves (DG). É possível que a vitamina D promova inibição do processo autoimune em diferentes estágios destas doenças. Nossos objetivos foram estudar a prevalência de insuficiência de vitamina D e a relação de suas concentrações séricas com marcadores de função tireoidiana e atividade inflamatória de linfócitos Th1, Th2 e Th17.
Material e métodos: Amostras de sangue foram coletadas de 88 pacientes com TH, 105 pacientes com DG seguidos em hospital universitário e 71 indivíduos sem DTAs, com idade entre 18 e 65 anos. Foram realizadas dosagens de vitamina D total (25OHD), tireotrofina (TSH), tiroxina livre (T4L), triiodotironina livre (T3L), cálcio,
fósforo, paratormônio (PTH), anticorpo antitireoperoxidase (AcTPO), anticorpo antitireoglobulina (AcTG) e antirreceptor de TSH (TRAb), além de citocinas produzidas por células Th1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α), Th2 (IL-4, IL-5) e Th17 (IL-17). O volume tireoidiano foi estimado por ultrassonografia. Dados sobre peso, altura, índice de massa corporal, paridade e tempo de diagnóstico dos pacientes foram coletados diretamente por entrevista. O nível de significância estatística adotado foi 5%.
Resultados: Maior prevalência de insuficiência de vitamina D foi encontrada em pacientes com DG comparativamente aos controles (p = 0.0078), associando-se ao uso de tionamidas e a menores concentrações de IFN-γ e T4L, além de maiores volumes tireoideanos. No grupo TH não houve diferença entre as concentrações da vitamina comparado aos controles (p = 0.1024). Houve uma correlação positiva entre níveis de vitamina D e concentrações de interleucinas TNF-α, IL-5 e IL-17 nos pacientes do grupo TH.
Conclusões: Demonstramos maior prevalência de insuficiência de vitamina D em pacientes com DG em relação a indivíduos de um grupo controle saudável, o que
não ocorreu no grupo TH quando comparado ao grupo controle. Associação com tionamidas sugere envolvimento da insuficiência de vitamina D na atividade de doença. Menores concentrações de T4 livre, ainda que dentro dos valores de referência, se evidenciaram como fator preditor de insuficiência de vitamina D, indicando a importância da manutenção do eutireoidismo no adequado status de vitamina D tanto em DG quanto em TH. Apenas nos pacientes e não no grupo de controle houve relação entre vitamina D e interleucinas, indicando o envolvimento entre a vitamina e o processo imunológico nas DTAs.
ABSTRACT
Introduction: The immunomodulatory role of vitamin D has been extensively researched. Recent studies have demonstrated a relationship between vitamin D insufficiency and the presence of autoimmune thyroid disease (AITDs) such as Hashimoto's Thyroiditis (HT) and Graves' Disease (GD). It is possible that vitamin D promotes inhibition of the autoimmune process at different stages of these diseases. Our objectives were to study the prevalence of vitamin D insufficiency and the relation of its serum concentrations with markers of thyroid function and inflammatory activity of Th1, Th2 and Th17 lymphocytes.
Material and methods: Blood samples were collected from 88 patients with HT, 105 patients with GD followed in a university hospital and 71 individuals without AITDs, aged between 18 and 65 years. It was performed measurements of serum total 25OH vitamin D, thyrotropin (TSH), free thyroxine (FT4), free triiodothyronine (FT3), calcium, phosphorus, parathyroid hormone (PTH), thyroid peroxidase antibodies (TPOAb), thyroglobulin antibodies (TGAb) in addition to cytokines produced by Th1 (IL-2, IFN- γ,TNF-α), Th2 (IL-4, IL-5), and Th17 cells (IL-17). Thyroid volume was estimated by ultrasonography. Data on weight, height, body mass index, parity and time of diagnosis of the patients were collected directly by interview. The level of statistical significance was 5%.
Results: Higher prevalence of vitamin D insufficiency was found in patients with GD compared to controls (p = 0.0078) associated with the use of thionamides and lower concentrations of IFN-γ and FT4 in addition to higher thyroid volumes. In the HT group there was no difference between vitamin concentrations compared to controls (p = 0.1024). There was a positive correlation between vitamin D levels and concentrations of interleukins TNF-α, IL-5 and IL-17 in HT patients.
Conclusions: We demonstrated a higher prevalence of vitamin D insufficiency in patients with GD in relation to individuals from a healthy control group, which did not occur in the HT group when compared to the control group. Association with thionamides suggests involvement of vitamin D insufficiency in disease activity. Lower concentrations of free T4, although within the reference values, were
evidenced as a predictor of vitamin D insufficiency, indicating the importance of maintaining euthyroidism in the adequate vitamin D status in both GD and HT. There was a relationship between vitamin D and interleukins only in the patients and not in the control group, indicating the involvement between the vitamin and the immune process in the AITDs.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Síntese e metabolismo da vitamina D. ... 29 Figura 2: Doses mensais de UVB modeladas eficazes para a síntese de
precolecalciferol em Tromsø, Noruega (latitude 698 N), República da Irlanda (latitude 51–548 N) e Atenas, Grécia (latitude 388 N) ... 30 Figura 3: Níveis séricos de vitamina D de acordo com a latitude e no inverno em 3741 mulheres pós-menopausa em 6 continentes. ... 32 Figura 4: Efeitos imunomodulatórios do calcitriol. ... 33
LISTA DE ABREVIATURAS
AcTG: Anticorpo antitireoglobulina AcTPO: Anticorpo antitireoperoxidase APC: Célula apresentadora de antígeno Ca: Cálcio
DBP: Proteína de Ligação da vitamina D DG: Doença de Graves
DM-1: Diabetes Mellitus tipo 1 DM-2: Diabetes Mellitus tipo 2
DTA: Doença Tireoideana Autoimune
FGF-23: Fator de Crescimento de fibroblastos 23 IL: Interleucina
IMC: Índice de Massa Corporal P: Fósforo
PTH: Paratormônio
T4 livre: Hormônio tiroxina livre TCD4+: Linfócito T CD4 TCD8+: Linfócito T CD8 TG: Tireoglobulina TH: Tireoidite de Hashimoto Th: Linfócito T helper TPO: Tireoperoxidase
TRAb: Anticorpo antirreceptor de TSH Treg: Linfócito T regulador
TSH: Tireotrofina (Hormônio estimulador da tireoide) TSH-R: Receptor de TSH
25OHD: 25-hidroxi-vitamina D; calcidiol
1,25(OH)2D: 1,25-dihidroxi-vitamina D; Calcitriol VDR: Receptor de Vitamina D
SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO GERAL ... 16 INTRODUÇÃO ... 18 1. Autoimunidade tireoidiana ... 18 1.1 Fisiopatologia ... 18 2. Imunidade e citocinas ... 203. Doenças tireoidianas autoimunes ... 22
3.1 Tireoidite de Hashimoto ... 22 3.1.1 Definição ... 22 3.1.2. Diagnóstico ... 24 3.1.3. Tratamento ... 25 3.2 Doença de Graves ... 25 3.2.1 Definição ... 25 3.2.2. Diagnóstico ... 26 3.2.3. Tratamento ... 26 4. Vitamina D ... 27
4.1 Sistema Imune e Vitamina D... 27
4.2 Dosagem sérica de Vitamina D ... 33
4.3 Doenças Tireoidianas autoimunes e Vitamina D ... 35
HIPÓTESE: ... 37 OBJETIVOS: ... 38 1. Geral: ... 38 2. Específicos: ... 38 METODOLOGIA: ... 39 1. Desenho do estudo: ... 39 1.1 Critérios de inclusão ... 39 1.2 Critérios de exclusão ... 40
2. Avaliação laboratorial do status hormonal tireoidiano e de vitamina D ... 40
3. Avaliação das citocinas ... 41
5. Metodologia estatística ... 42
PUBLICAÇÕES ... 43
Artigo I: Relevancy of thyroid hormone profile and thionamides in status of Vitamin D, inflammatory markers and autoimmunity in Graves’ disease ... 43
Artigo II: Vitamin D in Hashimoto’s thyroiditis and its relationship with thyroid function and inflammatory status. ... 63
DISCUSSÃO: ... 83 CONCLUSÕES: ... 86 1. Grupo Graves ... 86 2. Grupo Hashimoto: ... 86 3. Contribuições do estudo: ... 87 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 88 ANEXOS ... 96
ANEXO 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Pesquisa em Seres Humanos ... 96
ANEXO 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Pesquisa em Seres Humanos ... 98
ANEXO 3: Parecer consubstanciado do CEP ... 100
ANEXO 4: Endocrine Journal Editorial Office ... 102
APRESENTAÇÃO GERAL
A vitamina D exerce suas principais ações no metabolismo do cálcio e na saúde óssea. Nos últimos anos, muitos estudos evidenciaram o papel da vitamina D na fisiopatologia de doenças autoimunes, cuja incidência vem aumentando continuamente. A deficiência de vitamina D associa-se às principais doenças autoimunes como Diabetes Mellitus tipo 1, Esclerose Múltipla, Artrite Reumatoide, Lupus Eritematoso, Doenças Tireoidianas Autoimunes, entre outros. A associação com neoplasias e Diabetes Mellitus tipo 2 também tem sido estudada.
A causa da perda da tolerância imunológica a autoantígenos ainda não está bem esclarecida. Sabe-se que fatores ambientais assim como polimorfismos genéticos, entre outros, favorecem o surgimento de doenças autoimunes em indivíduos suscetíveis, mas o evento que desencadeia tais patologias ainda não está bem definido.
A deficiência de vitamina D vem sendo apontada como um fator ambiental atuante no aumento da prevalência de doenças autoimunes agindo na sua patogênese. Estudos realizados em modelos animais demonstraram que administração de análogos da vitamina D exerceriam ação preventiva capaz de modificar a incidência ou o curso de doenças autoimunes. Porém, existem poucos estudos no homem evidenciando a obtenção de melhor controle metabólico realizados em pacientes com Diabetes Mellitus tipo 1 que receberam vitamina D. Há estudos correlacionando influência de altos níveis de vitamina D na redução da incidência de Esclerose Múltipla. Ainda são necessários estudos randomizados e controlados para se avaliar o melhor componente e dose a ser administrada para obter a eficácia clínica desejada no controle da autoimunidade, além de tempo de suplementação e efeitos colaterais envolvidos.
Considerando-se o fato de Tireoidite de Hashimoto (TH) e Doença de Graves (DG) estarem entre as doenças endócrinas autoimunes mais comuns e que a relação entre função tireoidiana e insuficiência de vitamina D ainda não está completamente elucidada, desenvolvemos um estudo com objetivo de comparar níveis de vitamina D em pacientes com DG, TH e um grupo de controle correlacionando as concentrações da vitamina a testes de função tireoidiana,
concentrações de interleucinas Th1, Th2, Th17 e autoanticorpos antitireoide. O presente trabalho visa contribuir com o fornecimento de dados para o desenvolvimento de novos estudos sobre possíveis tratamentos futuros.
INTRODUÇÃO
1. Autoimunidade tireoidiana
1.1 Fisiopatologia
As doenças tireoidianas autoimunes (DTAs) são representadas sobretudo pela Tireoidite de Hashimoto (TH) e pela Doença de Graves (DG), principais responsáveis pela disfunção tireoidiana clínica ou subclínica. O ataque autoimune da tireoide ocorre através da infiltração da glândula por linfócitos T e B com a participação já bem documentada de citocinas inflamatórias e presença de anticorpos antitireoidianos circulantes (1-6).
Nas DTAs há quebra de tolerância aos autoantígenos tireoidianos. A autoimunidade desenvolve-se através da quebra de tolerância a um autoantígeno, resultando no desenvolvimento de resposta imune. Vários são os fatores associados a esta quebra de tolerância como infecção, predisposição genética, drogas como alguns quimioterápicos, influências do meio ambiente, concentração de iodo e de selênio, entre outros. Na glândula tireoide existem alguns antígenos envolvidos na autoimunidade dentre os quais destacam-se a tireoglobulina (TG), tireoperoxidase (TPO) e receptor de TSH (5,7-10).
O ataque imune nas DTAs se dá através da interação entre imunidade celular e imunidade humoral em que uma delas prevalece. O tipo de apresentação do antígeno, a diferenciação específica em células T ou B, a ação do linfócito T regulador além da interação com componentes ambientais e genéticos define o padrão de doença estabelecida (11 - 16).
Na TH ocorre um defeito genético na função da célula T supressora (Treg) e as células T CD4 + (auxiliares/helper) tipo 2 (Th2) não são inativadas, tornando-se livres para promover a ativação de linfócitos B responsáveis pela produção de anticorpos contra o tecido tireoideano. Concomitantemente, as células Th (helper/auxiliares) tipo 1 (Th1) e tipo 2 (Th2) produzem citocinas que induzem os tireocitos a expressarem antígenos de superfície HLA-DR tornando-os
apresentadores de antígenos e suscetíveis ao ataque imunológico. A reação imune mediada por linfócitos T citotóxicos e macrófagos é predominante na TH, observando-se presença marcante de citocinas Th1 como IL-2; IFN-γ e TNF-α além de IL-17, pertencente ao grupo Th17. Há destruição direta com apoptose das células foliculares e acúmulo local de linfócitos T e B associado à fibrose do tecido (Figura 1) (1, 2, 6, 13, 17).
A Doença de Graves (DG) decorre principalmente da ativação da imunidade humoral via células Th2 com presença marcante das citocinas IL-4 e IL-5, produção de anticorpos antirreceptor de TSH (TRAb) estimuladores levando à proliferação e hipertrofia celular tireoidiana e hipertireoidismo (Figura 1) (1, 4, 7, 11, 13).
As DTAs ocorrem com frequência significativamente maior no sexo feminino em proporção de 5 até 10 mulheres para cada homem. Vários estudos foram desenvolvidos para explicar tal prevalência. A relação da paridade com maior incidência de DTAs, além da presença de microquimerismo fetal no sangue e tecido tireoidiano de mulheres com DTAs são apontados como possíveis responsáveis por este aumento de prevalência no sexo feminino (9, 18).
Sabe-se que o microquimerismo fetal resulta da persistência de tecidos fetais na circulação materna após o parto comportando-se como autoantígenos que estimulam a resposta imune materna podendo então deflagrar doenças autoimunes na mãe. Há estudos indicando que a inativação do cromossomo X pode ocorrer no sexo feminino durante a embriogênese, levando possivelmente à inativação de genes codificadores de determinados autoantígenos relacionados ao desenvolvimento de autotolerância que estariam associados a este cromossomo sexual (9,18).
Há estudos que citam a desregulação no receptor de vitamina D (VDR) presente no endométrio. Evidências demonstram o importante papel de alguns fatores como a vitamina D na programação do metabolismo e da resposta imunológica em períodos críticos do desenvolvimento fetal e pós-natal. Alterações permanentes em muitos processos fisiológicos nesta fase podem modificar padrões de expressão gênica com influência em fenótipos (mecanismos epigenéticos) e com consequente risco para o desenvolvimento de fenótipos de doenças. Porém, ainda
se desconhece a real dependência destas alterações ao tempo de exposição a um ambiente materno com deficiências como a hipovitaminose D (9,18 - 20).
Figura 1: Principais mecanismos envolvidos no desenvolvimento da doença tireoidiana autoimune.
(Fonte: Adaptado de Ramos-Leví et al, 2016)
2. Imunidade e citocinas
Os linfócitos T são subdivididos de acordo com sua função em linfócitos T citotóxicos (TCD8), que expressam em sua superfície a proteína CD8, T-helper ou auxiliar (TCD4), que expressam em sua superfície a proteína CD4, e linfócitos T reguladores (T-reg). As células T são ativadas após exposição a antígenos específicos sofrendo posterior diferenciação no timo que através de mecanismos
Imunidade Celular Imunidade Humoral Célula T imatura Antígeno e citocinas Regulação CD4+ CD25+ FOXp3 Inflamação Não patogênico Hashimoto/ Graves DM1 Esclerose M. Graves / Hashimoto LES AR
APC: Célula apresentadora de antígeno; Treg: Linfócito T regulador; Th1: Linfócito T helper tipo 1; Th2: Linfócito T helper tipo 2; Th17: Linfócito T helper tipo 17
centrais de imunotolerância detecta linfócitos T autorreativos. Em alguns indivíduos predispostos, certos linfócitos escapam deste controle tímico, proliferando-se normalmente na circulação e posteriormente deflagrando resposta autoimune. As células apresentadoras de antígenos são representadas normalmente por células dendríticas, macrófagos e de modo aberrante na DTA por células foliculares da tireoide, associando-se assim ao desenvolvimento da DG e da TH (1,4,5,7,11).
As células T reguladoras, também denominadas linfócitos T supressores, têm como função impedir o ataque do sistema imune a autoantígenos. Estas células atuam sobre os linfócitos TCD8 e TCD4. As células TCD4 auxiliam outras células como os linfócitos TCD8, macrófagos ou linfócitos B na resposta imune. As células TCD8 são responsáveis pela destruição direta dos patógenos através do ataque a células infectadas pelos mesmos, estando envolvidas na resposta imune a infecções virais, ataque a células tumorais e rejeição a transplantes (1,4).
As células T-helper (Th) participam de todas as respostas imunes antígeno específicas. O microambiente em que as células Th não ativas se desenvolverão determina o tipo de resposta imune predominante: Th1 ou Th2, e eles se autorregulam. As células Th1 secretam citocinas inflamatórias como o interferon-γ (IFN-γ), a interleucina-2 (IL-2) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), essenciais para a resposta imune mediada por células. As células Th2 secretam as citocinas inflamatórias IL-4 e IL-5, importantes para a resposta imune mediada por anticorpos. Outro subtipo de células Th, as células Th-17, também composto por linfócitos T CD4 +, mostra envolvimento na fisiopatologia de doenças autoimunes e secretam as interleucinas IL-17 e IL-23. Adicionalmente, há o grupo de células definido como Th0, que produz tanto citocinas de Th1 quanto de Th2 (1,2,4,6,11-14).
Os linfócitos B participam ativamente do processo de autoimunidade através da produção de anticorpos, a chamada imunidade humoral. Sintetizam anticorpos contra antígenos específicos reconhecidos via indução decorrente da apresentação de fragmentos destes antígenos aos linfócitos T (1,4).
As Doenças Tireoidianas Autoimunes (DTAs) são marcadas tanto pela presença de imunidade celular com infiltração e destruição da glândula por linfócitos T quanto por imunidade humoral com a presença de linfócitos B ativos produzindo anticorpos específicos contra os tecidos tireoidianos. O envolvimento das citocinas
Th1, Th2 e Th17 na fisiopatologia das DTAs encontra-se bem estabelecido, além da evidente redução da atividade dos linfócitos T reguladores com consequente prejuízo nos mecanismos de autotolerância nestas doenças (1,2,4,6,7,11-15).
Estudos mostram que a presença de concentrações elevadas de autoanticorpos contra antígenos tireoidianos desempenha um papel importante no estímulo da produção de citocinas por linfócitos T e monócitos nas DTAs, além de facilitar a proliferação de células TCD4 nestes indivíduos. As células T regulatórias assim como algumas células B e monócitos produzem citocinas específicas, como IL-10, que exercem efeito protetor no desenvolvimento da autoimunidade (1,4,7,11).
3. Doenças tireoidianas autoimunes
3.1Tireoidite de Hashimoto 3.1.1 Definição
Tireoidite crônica de Hashimoto (TH), igualmente conhecida como tireoidite crônica autoimune ou tireoidite linfocítica crônica, foi descrita em 1912 por Hakaru Hashimoto e caracteriza-se por infiltrado linfocitário difuso na glândula tireoide. Principal causa de hipotireoidismo em áreas suficientes em iodo, tem sua incidência estimada em 0.3 a 1.5 casos/1000 pessoas/ano, sendo mais freqüente no sexo feminino e com incidência mais alta entre 45 e 65 anos de idade. Apresenta etiologia multifatorial, notando-se ativação de genes específicos, alterações imunológicas marcadas pela produção de autoanticorpos reativos a antígenos tireoidianos, ativação de grupos específicos de citocinas, além de influências do meio ambiente. A disfunção da glândula tireoidiana pode apresentar-se como clínica ou subclínica, de acordo com o grau de comprometimento do parênquima (1, 2, 6, 17, 21).
A glândula exibe textura heterogênea à ultrassonografia e pode apresentar padrão com bócio difuso ou sem bócio, de acordo com o grupo de citocinas e genes envolvidos (1, 3, 16, 22).
Nos pacientes portadores de TH, os nucleotídeos tireoperoxidase e tireoglobulina, integrantes ativos do processo de síntese hormonal nos tireocitos, são alvos de ataque de autoanticorpos. Altos títulos de anticorpos antitireoperoxidase (AcTPO) são encontrados em 90 a 95% dos pacientes, com presença de anticorpos
antitireoglobulina (AcTG) em 20 a 50% dos pacientes. Eventualmente, encontra-se anticorpos antirreceptor de TSH (TRAb) com efeito bloqueador do estímulo (1, 3, 22).
A reação imune na TH decorre principalmente da resposta imune mediada por células com infiltração de células inflamatórias, causando destruição gradual com consequente dano na função da glândula, manifestando-se por hipotireoidismo clínico ou subclínico associado à atrofia glandular ou bócio, de acordo com o tipo de interleucinas e genes presentes (1, 3, 4, 15 – 17).
Os fatores ambientais funcionam como gatilhos para ativação das reações autoimunes em indivíduos suscetíveis. O contato prévio com radiação está associado a maior prevalência de autoanticorpos além de maior risco para desenvolvimento de disfunções tireoidianas, desenvolvimento de nódulos benignos ou malignos. Concentrações de iodo tanto em excesso quanto em deficiência do mesmo modo associam-se às tireoidopatias autoimunes. Adicionalmente, concentrações adequadas de selênio são necessárias para o controle da resposta imunológica, crescimento celular e funcionamento adequado da tireoide, pois relaciona-se diretamente à ativação das desiodases, enzimas responsáveis pela síntese de hormônios tireoidianos. Tabagismo é citado como fator protetor para TH, pois reduz o risco de ativação de AcTPO e AcTG, além de relatos de presença de receptores nicotínicos em células do sistema imune exercendo inibição de respostas via Th1 e Th17. Porém, tal efeito protetor desaparece em poucos anos após a cessação do tabagismo. Infecções por alguns vírus como parvovírus B-19, vírus C, HIV associam-se ao estímulo de autoimunidade tireoidiana. Drogas imunomoduladoras, interferon-α, amiodarona, exposição a produtos químicos como organoclorados, alguns metais pesados como manganês e cádmio são ainda responsáveis por disfunções tireoidianas. Há relatos de alterações na composição da microbiota associadas ao desenvolvimento das DTA. A ligação da vitamina D com as DTAs vem sendo amplamente estudada em função dos efeitos adicionais anti-inflamatórios e imunomodulatórios desta vitamina confirmados em numerosos estudos que relatam o papel do calcitriol em potencializar a resposta do sistema imune inato e inibir o sistema imune adaptativo (8-10, 24-27).
Muitos estudos demonstraram que células do sistema imune como macrófagos, células dendríticas, linfócitos T e B expressam tanto o receptor de vitamina D quanto 1 alfa hidroxilase (enzima conversora da vitamina D em calcitriol, sua forma ativa). A vitamina D possui efeitos regulatórios diretos na função dos linfócitos T através da inibição da síntese de citocinas Th1 e estimulação da síntese de citocinas Th2 por ação direta em linfócitos TCD4 nativos. Age estimulando a produção de células T regulatórias que por intermédio da síntese de IL-10 bloqueiam desenvolvimento de células Th1 e inibem a secreção de IL-17 pelas células T efetoras. Além disso, o calcitriol exerce efeitos diretos sobre as células B inibindo sua proliferação, diferenciação e síntese de imunoglobulinas (17, 21, 28 - 35).
Adicionalmente, a vitamina D tem efeito inibitório sobre a maturação das células dentríticas impedindo sua diferenciação em monócitos e reduzindo a síntese de citocinas inflamatórias pelas mesmas. Atua regulando a diferenciação de monócitos em macrófagos bloqueando a liberação de citocinas inflamatórias por estas células diminuindo assim a sua capacidade de apresentar antígenos aos linfócitos em função da redução da expressão de moléculas MHC-II em sua superfície. Uma vez que as células dendríticas exercem função crucial no desenvolvimento e manutenção da autotolerância, o papel da deficiência de vitamina D na ação destas células e consequentemente no desenvolvimento de doenças autoimunes tem sido amplamente abordado (27, 29, 30, 36-38).
3.1.2. Diagnóstico
TH apresenta evolução clínica variável desde função tireoidiana normal até hipotireoidismo subclínico e posterior disfunção clínica com elevação dos níveis de TSH associado à queda das concentrações de T4. Nota-se presença marcante de autoanticorpos AcTPO, AcTG e TRAb. Este último em menor frequência e, quando presente, tem efeito bloqueador associando-se ao desenvolvimento da forma sem bócio. A captação tireoidiana de iodo pode variar de diminuída a elevada e não é utilizada para fins diagnósticos (13, 22, 23, 39).
3.1.3. Tratamento
Pacientes que evoluem para hipotireoidismo clínico devem ser tratados com reposição de levotiroxina. Nos casos de hipotireoidismo subclínico, devem ser seguidos os critérios específicos para tratamento.
Estudos mostraram mudanças significativas no padrão de marcadores inflamatórios em pacientes com TH, além de queda nas concentrações de autoanticorpos no decorrer do tratamento (13, 22, 23, 39).
3.2 Doença de Graves 3.2.1 Definição
Doença de Graves (DG) é a causa mais comum de hipertireoidismo em áreas suficientes em iodo com incidência anual de 14 casos a cada 100.000 indivíduos. Sua etiologia é multifatorial, havendo associação com ativação de genes específicos (CD40; FCRL3, PTPN22, CTLA-4), fatores ambientais e imunológicos, estes representados pela alta concentração de citocinas inflamatórias específicas além de perda de imunotolerância associada ao desenvolvimento de autoanticorpos. Além das manifestações tireoidianas, caracteristicamente exibe comprometimento do tecido conjuntivo levando ao desenvolvimento de oftalmopatia quando acomete a região retro-orbitária, mixedema localizado frequentemente pré-tibial e acropatia (40,41).
A presença de autoanticorpos estimuladores das células foliculares através da ligação ao receptor de TSH na célula (TRAb) é definidora na DG. A consequência de sua ação leva à hiperfunção e ao aumento de volume da glândula. Observa-se, pouco menos frequentemente, níveis elevados de outros autoanticorpos como AcTPO e AcTG (3, 40, 41).
A DG decorre principalmente da ativação da imunidade humoral via linfócitos Th2 com presença marcante das citocinas IL-4 e IL-5, produção de TRAb levando à proliferação celular e ao hipertireoidismo. Há estudos evidenciando presença de citocinas dos grupos Th17 e Th22 em altas concentrações no sangue periférico de pacientes com DG que apresentam altos níveis de TRAb. Há também relato de altas
concentrações de IL-17 nos tireócitos de pacientes com DG de difícil controle (1, 12-14, 42, 43).
Dentre os fatores ambientais associados à DG pode-se citar o tabagismo como fator de risco importante tanto para o desenvolvimento de tireotoxicose quanto para oftalmopatia de maior gravidade. Oferta excessiva de iodo pode deflagrar tireoideopatia autoimune. Existem relatos de associação entre DG e estímulos virais, drogas como amiodarona e interferon-α, deficiência de selênio, exposição a produtos químicos, metais pesados e alterações de microbiota. A participação da vitamina D no desenvolvimento da DG vem sendo objeto de estudos, sendo apontada como importante fator na alteração da autotolerância por agir diretamente em células ligadas à resposta autoimune inibindo a proliferação de linfócitos assim como a secreção de citocinas inflamatórias. Em modelos animais, a administração de vitamina D preveniu doenças tireoidianas autoimunes. Em humanos, estudos demonstraram concentrações de vitamina D significativamente mais baixas em hipertireoidismo autoimune comparado ao não autoimune (8,9, 24, 25).
3.2.2. Diagnóstico
A DG caracteriza-se por baixas concentrações de TSH associadas a altas concentrações de T4 livre, T3 livre ou total associados à presença de TRAb. Eventualmente, realiza-se a cintilografia de tireoide com iodo para melhor definição diagnóstica da DG, que evidenciará hipercaptação difusa. A ultrassonografia demonstra bócio difuso associado à hipervascularização da glândula ao Doppler (40,41).
3.2.3. Tratamento
Há três formas de tratamento utilizadas para DG: drogas antitireoidianas, radioidoterapia (RIT) e tireoidectomia. As três opções têm sua eficácia comprovada.
Os antitireoidianos, medicamentos da classe das tionamidas, são representados por propiltiouracil e thiamazol. O mecanismo de ação baseia-se na inibição da organificação do iodo por bloqueio da ação da tireoperoxidase no interior da célula tireoidiana. Inibem o acoplamento das iodotirosinas impedindo assim a
formação de T3 e T4. Propiltiouracil em altas doses apresenta a ação adicional de inibição da conversão de T4 em T3 nos tecidos periféricos. Utiliza-se ainda, betabloqueadores para o controle dos sintomas de tireotoxicose (40, 41).
Em situações de falência terapêutica com antitireoidianos após 12 a 18 meses de tratamento podem ser indicados tratamento ablativo como radioiodoterapia (RIT) ou tireoidectomia total (40, 41, 44-46).
Dados epidemiológicos sugerem que a deficiência de vitamina D agiria como um fator de risco para o desenvolvimento de doenças tireoidianas autoimunes. Estudos indicam que o calcitriol exerceria papel modulador tanto no sistema imune inato quanto no adaptativo, isto é, várias linhagens de células de defesa estariam sob efeito e ações da vitamina D. A suplementação de vitamina D com o objetivo de tratamento e até mesmo a prevenção das doenças tireoidianas autoimunes ainda é objeto de muito estudo em seres humanos, uma vez que parece promissor em modelos animais (21, 24, 27, 28, 33, 47 – 57).
4. Vitamina D
4.1 Sistema Imune e Vitamina D
Grande parcela da população mundial apresenta baixos níveis de vitamina D e a insuficiência da vitamina é apontada como um problema de saúde pública em muitos países. Mais de 50% da população da América do Sul tem níveis de vitamina D abaixo de 20 ng/ml no inverno assim como a população do Ocidente Europeu. Esta porcentagem é menor na América do Norte e maior na África do Sul, ficando entre 20% a 50% na Oceania. Concentrações de vitamina D abaixo de 10 ng/ml são encontradas em maior prevalência no Oriente Médio e em vários países asiáticos como India e China (58-61).
Vitamina D3 (25OHD) ou colecalciferol, embora descrita inicialmente como uma “vitamina”, é considerada um hormônio, conhecida primeiramente por seu papel na regulação da homeostase cálcio-fosfato atuando ativamente na transmissão neuromuscular e na mineralização óssea. A vitamina D é obtida primariamente através da alimentação (vitamina D2 e D3) ou através da exposição da pele à radiação UVB (vitamina D3), sendo esta sua principal fonte. A Vitamina D é
sintetizada na pele como pré-vitamina D tendo como precursor 7-dehidrocolesterol após exposição a raios ultravioleta-B (UVB); em seguida, liga-se à proteína transportadora de vitamina D (DBP), chegando ao fígado, onde sofre a primeira hidroxilação por ação da enzima 25-vitaminaD- 1-α-hidroxilase (mecanismo dependente do citocromo P-450) originando a 25-hidroxi-vitamina D [25(OH)D], principal forma circulante, porém, com baixa atividade biológica. Posteriormente sofre a segunda hidroxilação por ação enzimática (1-α-hidroxilase) em nível renal, sendo então convertida à sua forma ativa, calcitriol (1,25(OH)2D). Os níveis
circulantes de calcitriol são regulados por vários fatores. A ação da 1-α-hidroxilase é estimulada por PTH e calcitonina e inibida pelos níveis de cálcio (hipercalcemia) e da própria 1,25(OH)2D (Figura 2) (19, 58 - 64).
Figura 1: Síntese e metabolismo da vitamina D. (Fonte: Urrutia-Pereira M e cols, 2015)
25(OH)D: calcidiol 1,25(OH)2D: calcitriol; HPO4: Fosfato; Ca 2+: cálcio; FGF23: Fator de crescimento de fibroblastos 23;
A eficácia da síntese de vitamina D depende de exposição adequada da pele aos raios UVB de forma que a latitude, estação do ano, hora do dia, além da utilização de protetores solares ou até mesmo maior quantidade de melanina na pele interferem nesta síntese. O envelhecimento da pele com a idade diminui a disponibilidade cutânea de 7-dehidrocolesterol. A ingestão reduzida de vitamina D contribui para a queda em seus níveis séricos. São poucos os alimentos que contêm quantidades significativas de vitamina D, dentre os quais podemos citar alguns peixes como bacalhau e salmão fresco, gema de ovo e alguns produtos lácteos enriquecidos com vitamina D. Obesidade igualmente é fator contribuinte para deficiência da vitamina D, pois ficaria retida na gordura corporal uma vez que é lipossolúvel. Doenças que prejudicam absorção de gorduras como Doença Celíaca e Doença de Chron têm seu papel, além de algumas medicações que ativam o citocromo P-450 em nível hepático, aumentando assim o catabolismo da vitamina como anticonvulsivantes, glicocorticoides e antirretrovirais (Figuras 3 e 4) (19, 61-63).
Figura 2: Doses mensais de UVB modeladas eficazes para a síntese de
precolecalciferol em Tromsø, Noruega (latitude 698 N), República da Irlanda (latitude 51–548 N) e Atenas, Grécia (latitude 388 N)
A enzima 1-α-hidroxilase encontra-se igualmente em várias outras células que expressam receptores de vitamina D como ossos, medula óssea, cérebro, pulmão, músculo, coração e células de defesa. A forma ativa da vitamina D se liga a seu receptor nuclear (VDR), o qual está expresso em várias células do sistema imunológico como monócitos, macrófagos, células dentríticas, linfócitos T e B, promovendo ações imunomodulatórias. Baixas concentrações de vitamina D associaram-se à predisposição a várias doenças autoimunes como diabetes mellitus tipo 1, artrite reumatóide, esclerose múltipla e doenças tireoidianas autoimunes (DTAs). Há relatos da associação entre baixos níveis de vitamina D e presença de anticorpos anti-TPO, assim como a associação a polimorfismos do gene de VDR em pacientes portadores de DTAs (30, 31, 65 - 70).
A expressão de VDR em células do sistema imune e a presença da enzima 25 (OH)D-hidroxilase em células dendríticas e macrófagos sugere que 1,25(OH)2D3
(calcitriol) possui propriedades de regulação hormonal local. A vitamina D ativa (calcitriol) age nas células apresentadoras de antígenos como células dendríticas e macrófagos, inibindo a expresssão de antígenos MHC classe II em sua superfície e impedindo a maturação das células dendríticas com redução da apresentação de antígenos e consequente redução na ativação de linfócitos T (28-32,55).
Calcitriol modula a resposta imune por influenciar a atividade das células T reguladoras, inibindo a produção e ativação de citocinas e a transformação de um estado pró-inflamatório em status de imunotolerância decorrente da capacidade da vitamina D em suprimir o sistema imune adaptativo. Ainda, promove diminuição da proliferação de células Th1, Th17 e aumento da concentração de células Th2. A expressão de VDR aumenta cinco vezes em relação à ativação de células T latentes. O aumento de células T reguladoras causado pelo calcitriol in vitro e in vivo, aparentemente é o responsável pela supressão do processo de autoimunidade. Vitamina D é responsável por inibir a proliferação e a secreção de anticorpos pelas células B, além de induzir apoptose das mesmas (Figura 5) (21,30 - 32, 48, 55).
Os mecanismos fisiopatológicos que envolvem a ação da vitamina D ainda estão longe de serem elucidados. Vários questionamentos foram levantados sobre o papel da mesma na prevenção de doenças crônicas, como doenças autoimunes,
diabetes mellitus tipo 2 e doenças cardiovasculares, porém, ainda são necessários muitos ensaios clínicos para esclarecer seu verdadeiro papel (71-74).
Figura 3: Níveis séricos de vitamina D de acordo com a latitude e no inverno em 3741 mulheres pós-menopausa em 6 continentes.
Figura 4: Efeitos imunomodulatórios do calcitriol. (Fonte: Vanherwegen et al. 2017)
4.2 Dosagem sérica de Vitamina D
Concentrações de 25OHD (calcidiol) circulante representam o melhor indicador do status de vitamina D (58).
As metodologias de dosagem de vitamina D utilizadas em laboratórios clínicos incluem os ensaios competitivos de proteína de ligação à vitamina D (CPBA), imunoensaios, cromatografia líquida de alta performance (HPLC), cromatografia e
IL:interleucina; 1,25(OH)2D3: Calcitriol; CD4+T Cell: linfócito TCD4+; B Cell: Linfócito B; Th: Linfócito T helper; Treg: Linfócito T regulador
espectrometria de massa em tandem com líquido (LC-MS/MS). As amostras devem ser cuidadosamente armazenadas em recipientes sob o abrigo da luz (29, 58, 75).
Embora as metodologias de testes de 25OHD tenham se aprimorado significativamente, ainda existe um viés considerável entre os diferentes métodos e laboratórios. Portanto, a padronização de um método faz-se necessária. Os níveis ideais de 25OHD devem ser determinados com base neste método padronizado. Há interferência também quando os ensaios são realizados por diferentes laboratórios. As dosagens de vitamina D são realizadas habitualmente pelas técnicas de imunoensaios, cromatografia líquida e espectometria de massa em tandem (LC-MS/MS), sendo os dois últimos mais precisos nas dosagens. A cromatografia líquida, padrão ouro, também permite diferenciar as concentrações dos metabólitos 25(OH)D2 e 25(OH)D3, porém, a maioria dos estudos tem trabalhado na prática com ensaios quimioluminescentes (CLIA) ou radioimunoensaios (RIA) (29, 58, 75,76).
Um importante fator presente no soro humano e que pode ser responsável pela alteração nas dosagens da 25OHD é o C-3 epímero da vitamina D (3-epi-25(OH)D3). O epímero tem o mesmo peso molecular da vitamina e ambos diferem apenas na estereoquímica do grupo hidroxila na posição 3. Trata-se de um substrato para a enzima 1α- hidroxilase sendo convertido em 3-epi-1,25 dihidroxivitamina D3 e capaz de ligar-se ao receptor de vitamina D, porém sua importância fisiológica ainda permanece incerta (77,78).
As opiniões divergem a respeito de concentrações ideais de vitamina D. De acordo com a Endocrine Society, concentrações normais seriam estabelecidas acima de 30 ng/ml. De acordo com o Instute of Medicine (IOM), em Washington, que criou um comitê para avaliar os valores de referência baseados em uma revisão atualizada utilizando as referências de consumo dietético, o valor de corte seria 20 ng/ml, de forma que valores abaixo deste nível seriam considerados como insuficiência e valores abaixo de 10 ng/ml como deficiência (58-60).
Em nosso meio, a Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial (SBPC/ML) anunciou a mudança do valor de referência da vitamina D. Segundo nota publicada pelas Sociedades, até então o valor de referência era acima de 30 ng/mL. Porém, desde dezembro de 2017 estão sendo aceitos valores a partir de 20 ng/mL. De acordo com o posicionamento da Sociedade Brasileira de
Endocrinologia e Metabologia (SBEM) lançado no ano de 2017, valores entre 30 e 60 ng/mL são recomendados para grupos de risco como idosos, gestantes, pacientes com osteomalácia, raquitismos, osteoporose, hiperparatireoidismo secundário, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, renal crônica e pós-bariátricos (79).
4.3 Doenças Tireoidianas autoimunes e Vitamina D
Baixas concentrações de vitamina D associam-se a maior incidência de doenças autoimunes em geral em função de suas ações imunomodulatórias como a redução da síntese de marcadores inflamatórios. Redução das concentrações de vitamina D ao mesmo tempo associam-se a doenças cardiovasculares, infecções e neoplasias, inclusive a tireoidiana. Vários autores ressaltam o papel da vitamina D no desenvolvimento de autoimunidade tireoidiana, relatando a associação entre polimorfismos no gene de VDR e presença de autoanticorpos tireoidianos. Diferentes graus de redução nas concentrações de vitamina D correlacionam-se com tempo de doença, títulos de autoanticorpos e volume tireoidiano. Sabe-se que o receptor VDR, assim como a enzima 1-α-hidroxilase, estão presentes em várias células do sistema imunológico desde células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas e macrófagos, até linfócitos B e T (21, 48, 55, 70, 73, 80, 81).
As DTAs resultam de predisposição genética associada a influências ambientais e alterações imunológicas caracterizadas por infiltração linfocítica na glândula e produção de autoanticorpos específicos associados ao desequilíbrio entre as respostas imunes Th1 e Th2, resultando em reação autoimune mediada por células via Th1 predominantemente com destruição de tireocitos e hipofunção na TH e em um predomínio de resposta humoral via Th2 produzindo TRAb estimuladores levando ao hipertireoidismo na DG. Ambos os grupos de linfócitos T, além do grupo Th17, têm participação em diferentes graus em ambas as doenças (3, 4, 6, 8, 12-14).
Muitos estudos evidenciaram redução dos títulos de autoanticorpos em pacientes portadores de TH em terapia substitutiva com levotiroxina ou portadores de DG em tratamento com antitireoidianos com concentrações normais de vitamina
D sugerindo que a mesma possa potencializar o tratamento dessas doenças. Contudo, outros autores discordam desta associação. Há relatos de maior taxa de recorrência de DG em pacientes com baixas concentrações de vitamina D no momento em que o tratamento com tionamidas foi descontinuado (21, 54, 82).
A vitamina D poderia agir aprimorando o sistema imunológico inato e regulando o sistema imunológico adaptativo, promovendo tolerância imunológica e contribuindo assim para diminuir a probabilidade de desenvolver doenças auto-imunes. Apesar de vários autores apontarem benefícios no tratamento com vitamina D ainda são necessários grandes estudos prospectivos multicêntricos para que se possa chegar a uma conclusão definitiva liberando sua utilização para tratamento de doenças tireoidianas autoimunes na prática clínica (21, 27, 48, 55, 83, 84).
HIPÓTESE:
Insuficiência de vitamina D está associada a doenças tireoidianas autoimunes, atividade de doença e alterações de marcadores imunológicos.
OBJETIVOS:
1. Geral:
Estudar a prevalência de insuficiência da vitamina D e a relação de sua concentração com perfil hormonal tireoidiano, marcadores séricos de autoimunidade tireoidiana e de atividade inflamatória em pacientes com DG e TH.
2. Específicos:
1. Avaliar a prevalência de insuficiência de vitamina D em pacientes com doença tireoidiana autoimune divididos em 2 grupos: pacientes com DG e pacientes com TH comparados a indivíduos sem doença tireoidiana (grupos de controle);
2. Correlacionar o perfil de atividade inflamatória obtido por intermédio da avaliação de interleucinas Th1, Th2 e Th17 com valores de vitamina D nos 2 grupos de pacientes e no grupo de controle;
3. Avaliar a associação entre concentrações de vitamina D com aspectos laboratoriais da função e autoimunidade tireoidianas, assim como de tratamento nos 2 grupos de pacientes;
METODOLOGIA:
1. Desenho do estudo:
Estudamos pacientes com TH e DG em relação ao status de vitamina D e marcadores de autoimunidade da tireoide, bem como a relação com citocinas produzidas pelas células Th1, Th2 e Th17.
A análise interina foi realizada para avaliar o poder estatístico da correlação entre hormônios tireoidianos, vitamina D e os marcadores de autoimunidade tireoidiana, resultando em um mínimo de 193 pacientes.
Para testar nossa hipótese, desenvolvemos um estudo envolvendo 88 pacientes com TH, 105 pacientes com DG seguidos em hospital universitário e 71 indivíduos sem DTA, com idade entre 18 e 65 anos.
Foram coletadas amostras de sangue dos 3 grupos para dosagem de vitamina D total (25OHD), tireotrofina (TSH), tiroxina livre (T4L), cálcio, fósforo,
paratormônio (PTH), anticorpo antitiroperoxidase (AcTPO), anticorpo antitireoglobulina (AcTG) e antirreceptor de TSH (TRAb). As citocinas produzidas por células Th1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α), Th2 (IL-4, IL-5) e Th17 (IL-17) foram dosadas em todos os participantes. O volume de tireoide nos pacientes foi estimado por ultrassonografia. Dados sobre peso, altura, índice de massa corporal, paridade e tempo de diagnóstico dos pacientes foram coletados diretamente por entrevista.
O consentimento pós-informado por escrito foi obtido de cada indivíduo após explicação completa da finalidade e da natureza de todos os procedimentos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade (CAAE 03330912.3.0000.5404).
1.1 Critérios de inclusão
Somente pacientes com diagnóstico de TH e DG foram incluídos no estudo. O diagnóstico de disfunção tireoidiana foi baseado em concentrações de TSH e T4L alteradas. No momento da coleta, todos os pacientes com TH estavam
em terapia de reposição com levotiroxina. Os pacientes com DG foram divididos em dois grupos de acordo com a função tireoidiana. Grupo sem tionamidas: pacientes em eutireoidismo ou hipotireoidismo sob reposição com levotiroxina. Grupo com tionamidas: pacientes em atividade de doença sob tratamento com tionamidas, em eutireoidismo ou hipertireoidismo. Apenas pacientes com altos níveis de anticorpos antitireoidianos confirmando a etiologia de DTA foram incluídos.
Todos os indivíduos do grupo de controle eram clínica e laboratorialmente eutireoideos com concentrações de AcTPO, ACTG e TRAb indetectáveis e foram selecionados entre os acompanhantes dos pacientes e funcionários do hospital.
1.2 Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão foram: história prévia de tireoidectomia, pacientes com doenças agudas, doença maligna ou inflamatória ativa, uso de amiodarona, esteróides, cálcio e/ou vitamina D, uso de contraste iodado em período inferior a 3 meses antes do início do estudo, insuficiência cardíaca (classe III ou IV da NYHA), doença hepática grave (albumina reduzida ou INR aumentado), doença renal avançada (estágio 4 ou 5), pacientes em hemodiálise e aqueles soropositivos para HIV e hepatite C, além de outras doenças autoimunes associadas.
2. Avaliação laboratorial do status hormonal tireoidiano e de
vitamina D
Para avaliar os níveis hormonais de pacientes e grupo de controle, utilizamos as concentrações de TSH medido por eletroquimioluminescência (Roche Cobas Elecsys - valores de referência VR de 0,41 a 4,5 μUI / mL). O coeficiente de variação intra-teste (CV) foi de 5%; faixa de medição 0,01-100 μUI / ml, sensibilidade analítica 0,01 pg / mL e sensibilidade funcional 0,014μUI / ml com CV inter-ensaio de 20%. T4L dosado por imunoensaio competitivo de quimioluminiscência Elecsys FT4 II (VR 0,9 a 1,8 ng / ml). Para o intervalo de T4L foi utilizado entre 0,02 a 7,76 ng / dl, CV intra-teste de 5%, sensibilidade analítica 0,023 ng / ml e funcional 0,39 ng / ml com CV 20% inter-ensaio.
Os anticorpos AcTPO e o AcTg foram medidos pelo teste imunométrico quimioluminescente Elecsys com valores de referência até 34UI/ml para AcTPO e até 115 UI/ml para AcTG. Para o AcTPO, o intervalo de medição foi de 5,0 a 600,0 UI/ml, CV 5%, sensibilidade analítica 5,0 UI / ml e funcional 34 UI/ml. Para o intervalo de medição de ACTG estava entre 10,0 a 4000,0 UI/ml (5% CV); sensibilidade analítica 10 UI/ml e sensibilidade funcional 34 UI/ml. As concentrações de TRAb foram mensuradas por imunoensaio de eletroquimioluminescência competitivo usando receptores de Elecsys TRAb TSH com valores de referência de até 1,22 UI/L; intervalo de medição de 0,3 a 40,0 UI/L, CV 5%; sensibilidade analítica de 0,3 UI/L e sensibilidade funcional de 0,9 UI/L.
A vitamina D total (25OHVitD) foi dosada pelo teste LIAISON® 25 OH Vitamina D TOTAL utilizando a tecnologia de imunoensaio quimioluminescente (CLIA) para a determinação quantitativa de 25-hidroxivitamina D e outros metabolitos hidroxilados de vitamina D em soro humano, plasma ou EDTA com lithium heparin utilizando a avaliação da quantidade de vitamina D com a família dos analisadores LIAISON®. As concentrações de vitamina D abaixo de 30 ng/ml e acima de 20ng/ml foram classificadas como insuficiência, enquanto concentrações acima de 30 ng/ml até 100 ng/ml foram classificadas como vitamina D suficiente. As concentrações de vitamina D abaixo de 10 ng/ml foram classificadas como deficientes, embora alguns autores considerem como deficiência valores de inferiores a 20 ng/ml. Para o presente estudo, valores de vitamina D abaixo de 30 ng/ml foram adotados como insuficiência da vitamina.
3. Avaliação das citocinas
As citocinas foram mensuradas pela técnica de imunoensaio do Milliplex Map com base na tecnologia Lumomex Xmap. Luminex usa técnicas próprias para código de coloração interna de microesferas com dois corantes fluorescentes. Através de concentrações precisas destes corantes, os grânulos de cor distintamente criados estabelecem microesferas de poliestireno ou microesferas magnéticas, cada um dos quais é revestido com um anticorpo de captura específico.
Os valores de referência das citocinas foram: IL-2 VR 1.0-1.6 pg/ml; INF-γ VR 0.8-1.1 pg/ml; TNF-α VR 0.7-1.1 pg/ml; IL-4 VR 4.5-7.1 pg/ml; IL-5 VR 0.5-0.7 pg/ml; IL-17 VR 0.7-1.2 pg/ml.
4. Avaliação ultrassonográfica da tireoide
O volume total tireoidiano foi determinado em mililitros (ml) pelo produto dos diâmetros longitudinal, transversal e anteroposterior multiplicados por uma constante de 0,52; somando-se os volumes dos lobos direito, esquerdo e istmo. Valores entre 6 e 15 ml (10-11 ± 3-4 ml) foram considerados normais para adultos. Os valores foram obtidos de avaliações de rotina que constavam dos prontuários dos pacientes (85).
5. Metodologia estatística
Foi realizada análise exploratória de dados através de medidas resumo (frequência, porcentagem, média, desvio padrão, mínimo, mediana e máximo). Os grupos foram comparados através do teste de Kruskal-Wallis, Qui-Quadrado ou exato de Fisher. A correlação da Vitamina D e Interleucinas com as demais variáveis foi avaliada através do coeficiente de Spearman ou do teste de Mann-Whitney. Os fatores associados à deficiência de Vitamina D foram avaliados através de regressão logística com o critério stepwise de seleção de variáveis. O nível de significância estatística para a análise estatística foi 5% (86-88).
PUBLICAÇÕES
Artigo I: Relevancy of thyroid hormone profile and thionamides in
status of Vitamin D, inflammatory markers and autoimmunity in
Graves’ disease
Running head: Vitamin D and thionamides in Graves’disease
Botelho, IMB*; Moura Neto, A*; Tambascia, MA*; Monte Alegre, S**; Zantut-Wittmann, DE*.
*Endocrinology Division, **Metabolic Unit, Department of Internal Medicine, Faculty of Medical Sciences – University of Campinas, Campinas, SP, Brazil. 13081-970
Correspondence to: Botelho, IMB, Endocrinology Division, Faculty of Medical Sciences – University of Campinas Campinas, SP, Brazil. 126 Tessália Vieira de Camargo St, Campinas, SP
13083-887, Brazil
Phone number: 55-19-3521-7178/55-19-3521-7755 Corresponding author e-mail: ilkamara@hotmail.com
Abstract:
Background/Aims: Graves' disease (GD) may be associated with vitamin D insufficiency and the lower rate of remission after cessation of treatment with thionamides. Methods: Cross-sectional study, 105 patients GD, 70 controls. Vitamin D concentrations, thyroid and immunological profile were studied. Results: Vitamin D insufficiency was found in 59.1% of the controls, lower than in GD (78.1%, p = 0.028). Comparing GD with (GDT) or without thionamides , IL-4 and TNF-α were lower in GDT. There was higher levels of IL-2 and lower levels of IFN-γ, IL-5, IL-17 in the GD without thionamides when compared to controls. Vitamin D levels did not differ between GDT and without. However, when these two subgroups were compared to controls, lower concentrations of vitamin D were observed in the GDT. There was no difference in levels of FT4, TPOAb, TGAb between GDT or without. Conclusions: We demonstrated higher prevalence of vitamin D insufficiency in GD, especially GDT, in relation to the controls, emphasizing the importance of maintaining adequate concentrations of FT4 for the vitamin D status in GD. There is strong evidence for the relationship between GD pathogeny with vitamin D insufficiency. Additional studies are warranted to clarify the role of vitamin D in GD.
INTRODUCTION:
Graves'disease (GD) mainly results from the activation of humoral immunity via Th2 cells with marked presence of IL-4 and IL-5, production of TSH receptor stimulating antibodies (TRAb) leading to cell proliferation and hyperthyroidism. Some studies report the presence of IL-17 and IL-22 in high serum concentrations in patients with GD [1-4].
Several authors highlight the role of vitamin D in triggering thyroid autoimmunity. Its active form (1,25 (OH)2VitD3) binds to the nuclear vitamin D
receptor (VDR), which is expressed in various immune cells such as monocytes, macrophages, dendritic cells, B and T lymphocytes, promoting immunomodulatory actions. There are reports on the association between low vitamin D levels and the presence of anti-TPO antibodies as well as the association of polymorphisms in the VDR gene with ATDs [5-16].
The VDR expression in immune cells and the presence of the enzyme 25(OH)D-1α-hydroxylase in dendritic cells and macrophages suggests that 1,25(OH)2D3 has a local hormonal regulation properties. The active vitamin D
modulates the immune response by influencing regulatory T cell activity, inhibiting cytokine production and activation. Consequently, there is decreased proliferation of Th1, Th17 cells and increased concentration of Th2 cells. The increase in regulatory T cells caused by 1,25(OH)2D3, both in vitro and in vivo has been suggested as
responsible for autoimmunity suppression [7,10,11,13,14,17,18].
Many studies have shown less intense autoimmune reaction and reduction of thyroid autoantibodies in patients with normal levels of vitamin D combining with anti-thyroid drugs. However, other authors not agree with this association. Additionally 1,25(OH)2D3 acts in the reduction of the synthesis of TRAb by suppression of the B
cells, thus contributing to the remission of the GD. There are studies correlating lower concentrations of vitamin D at the time of thionamides discontinuation with the higher recurrence rate of the disease [5,17-20].
Considering the possible role of Vitamin D in thyroid autoimmunity, our aims were to study the relationship of serum vitamin D with thyroid hormone status, serum markers of thyroid autoimmunity and inflammation in patients with GD.
MATERIAL AND METHODS: Study design
We studied GD patients regarding vitamin D status and thyroid autoimmunity markers as well as the relationship with cytokines produced by Th1, Th2 and Th17 cells.
Interim analysis was conducted to evaluate the statistical power of correlation between thyroid hormone, vitamin D and thyroid autoimmunity markers resulting in minimum of 105 patients. We set up a study involving 105 patients with GD followed in our university hospital and 70 individuals without AITD, all aged 18 to 65 years. Blood samples were collected from the 2 groups for measurements of serum total 25OH vitamin D, calcium, phosphorus, parathormone (PTH), thyrotropin (TSH), free thyroxine (FT4), anti-thyroperoxidase antibody (TPOAb), anti-thyroglobulin antibody (TGAb) and anti-TSH receptor antibody (TRAb). Cytokines produced by Th1 cells (IL-2, IFN-γ, TNF-α), Th2 (IL-4, IL-5) and Th17 (IL-17) were measured in all participants. Thyroid volume in patients was estimated by ultrasound. Data on weight, height, body mass index, parity and time since diagnosis were collected from patients’ records or by direct interview.
Written informed consent was obtained from each patient or subject after full explanation of the purpose and nature of all procedures. The University Ethics in Research Committee approved the study (CAAE: 03330912.3.0000.5404).
Inclusion criteria
Only patients with the diagnosis of GD were included in the study. The diagnosis of autoimmune hyperthyroidism was based on low concentrations of TSH and high FT4 with detectable levels of antithyroid antibodies. All subjects in the control group were clinical and laboratory euthyroid, TPOAb, TGAb and TRAb undetectable and were selected from patient’s companions or hospital staff.
Exclusion criteria
Exclusion criteria were: previous history of thyroidectomy, acutely ill patients, active malignant or inflammatory disease, use of amiodarone, steroids, calcium and / or vitamin D, use of iodinated contrast less than 3 months before the start of the
study, heart failure (class III or IV NYHA), severe liver disease (reduced albumin or increased INR), advanced kidney disease (stage 4 or 5), patients under hemodialysis and those known to be seropositive for HIV and hepatitis C.
Laboratory evaluation of thyroid and vitamin D status
TSH was measured by eletrochemiluminescence (Roche Cobas Elecsys - reference values: 0.41 to 4.5 μUI / mL) The intra-assay coefficient of variation (CV) was 5%; measuring range 0.01-100 μUI / ml, analytical sensitivity 0.01 pg / mL and functional sensitivity μUI 0,014 / ml with inter-assay CV of 20%. FT4 by competitive chemiluminescence immunoassay Elecsys FT4 II (RV 0,9 to 1,8 ng / ml). For FT4 measurement interval was used between 0.02 to 7.76 ng / dl, intra-assay CVs of 5% analytical sensitivity 0.023 ng / ml and functional 0.39 ng / ml and inter-assay CV 20%.
TPOAb (RV up to 34UI/ml) and TGAb (RV up to 115 IU/ml) were measured by chemiluminescent immunometric assay Elecsys. For TPOAb, measurement interval was 5.0 to 600.0 IU / ml, CV 5% analytical sensitivity 5.0 IU / ml Functional 34 IU / ml. For TGAb measurement interval was between 10.0 to 4000.0 IU / ml (5% CV); analytical sensitivity 10 IU / ml and functional sensitivity 34 IU / ml. TRAb was measured by competitive electrochemiluminescence immunoassay using Elecsys TRAb TSH receptors (RV up to 1.22 IU /L); measurement interval range from 0.3 to 40.0 IU / L, CV 5%; analytical sensitivity of 0.3 IU / L and functional sensitivity of 0.9 IU / L.
Total vitamin D (25OHVitD) was measured by The test LIAISON® 25 OH Vitamin D TOTAL using chemiluminescent immunoassay technology (CLIA) for the quantitative determination of 25-hydroxyvitamin D and other hydroxylated metabolites of vitamin D in human serum, plasma or EDTA plasma with lithium heparin using the evaluation of the amount of vitamin D using the family LIAISON® analyzers. Vitamin D concentrations below 30 ng / ml and above 20ng/ml were classified as insufficiency, while concentrations above 30 ng/ml until 100 ng/ml were classified as vitamin D sufficient. Vitamin D concentrations below 10 ng/ml were classified as deficient although some studies consider as deficiency values below 20 ng/ml.
Cytokines evaluation
Cytokines were measured by the immunoassay technique of Milliplex Map based on the Luminex Xmap technology. Luminex uses proprietary techniques to internally color-code microspheres with two fluorescent dyes. Through precise concentrations of these dyes, distinctly colored bead sets polystyrene microspheres or magnetic microspheres can be created, each of which is coated with a specific capture antibody. RV: IL-2 : 1.0-1.6 pg/ml; INF-γ : 0.8-1.1 pg/ml; TNF-α : 0.7-1.1 pg/ml; IL-4 : 4.5-7.1 pg/ml; IL-5 : 0.5-0.7 pg/ml; IL-17 : 0.7-1.2 pg/ml.
Thyroid ultrasound evaluation
The total thyroid volume was determined in milliliters (ml) by the product of the longitudinal, transverse and anteroposterior measurements multiplied by the constant 0.52, adding up the volumes of the right and left lobes and isthmus. Values between 6 and 15 ml (10-11 ± 3-4 ml) were considered normal for adults [21].
Statistical Methods:
Exploratory data analysis was performed through summary measures (frequency, percentage, mean, standard deviation, minimum, median and maximum). The groups were compared using Kruskal-Wallis, Qui-Square or Fisher's exact test. The
correlation of Vitamin D and Interleukins with the other variables was evaluated using the Spearman coefficient or the Mann-Whitney test. Factors associated with vitamin D deficiency were assessed through logistic regression using the stepwise selection criteria. The significance level for statistical analysis was 5% [22-24].
RESULTS:
The study included 175 participants, 105 patients with GD, of which 87 were female (82%) and 70 subjects in the control group, 61 female (85.9%). Mean time of diagnosis was 8 years (range 1-33 years). Among the patients, 25 (23.8%) were in remission (without medication), 29 (27.6%) were on thionamide and 51 (48.5%) were on levothyroxine treatment. Of the 105 patients, 83 were in euthyroidism and 4 in clinical hyperthyroidism. All subjects in the control group were euthyroid.
