UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS
Rosemary Sousa Cunha Lima
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS: QUITOSANA / INSULINA
Campina Grande – Paraíba Dezembro/2010
Rosemary Sousa Cunha Lima
DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS: QUITOSANA / INSULINA
Trabalho de tese apresentado à banca examinadora do curso de Doutorado em Engenharia de Processos da Universidade Federal de Campina Grande, Área de Concentração: Desenvolvimento de Processos, como exigência final para obtenção do título de Doutor em Engenharia de Processos.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcus Vinícius Lia Fook 2º ORIENTADOR: Prof. Dr. José Alexsandro da Silva
Campina Grande – Paraíba Dezembro/2010
(VERSO)
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UFCG
L732d Lima, Rosemary Sousa Cunha.
Desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de fármacos: quitosana/insulina / Rosemary Sousa Cunha Lima. ─ Campina Grande, 2010. 110 f. : il. col.
Tese (Doutorado em Engenharia de Processos) – Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Ciências e Tecnologia.
Referências.
Orientadores: Prof. Dr. Marcus Vinícius Lia Fook, Prof. Dr. José Alexsandro da Silva.
1. Polissacarídeos. 2. Diabetes Mellitus. 3. Biofilmes. 4. Sistemas Matriciais. I. Título.
DEDICATÓRIA
Dedico aos meus filhos, Nicole e Aloysio, ao meu esposo Marcel e a minha mãe D. Guia.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus, por mais uma etapa vencida.
Ao Prof.Dr. Marcus Vinícius Lia Fook por todo apoio, acolhimento, orientação, amizade e convivência em todas as etapas do trabalho;
Ao Prof. Dr José Alexsandro da Silva pela colaboração;
Aos Professores Dra Eliana Rigo e Clodomiro Alves, examinadores externos pela disponibilidade em atender ao convite, em um período de tantos compromissos;
Às Professoras Drª Lisiane Navarro de Lima Santana e Dra.Líbia de Sousa Conrado examinadoras internas, pela gentileza e valiosas contribuições;
À Professora Iracilda Zeppone Carlos e sua equipe, pela ajuda e orientação nos testes de citotoxicidade e pela utilização do Laboratório de Imunologia Clínica e Biologia Molecular do Departamento de Análises Clínicas da UNESP, Araraquara – SP.
Ao Professor Flávio Honorato da Silva pelo apoio e colaboração ao longo do trabalho; Ao Departamento de Farmácia da UEPB pela liberação;
Ao corpo docente de Engenharia de Materiais e de Processos;
À coordenação do curso de Engenharia de Processos através do Prof. Antônio Gilson; Aos colegas do Grupo de Biomateriais da UFCG, especialmente Thiago, Rossemberg, João Ponciano, Carol, Adriana, Chirlaine, Andreas, Anna Sylvia, Greyce e tantos outros que tiveram participação efetiva neste trabalho;
À colega Lidiane Correia, pela participação;
Aos colegas do Doutorado de Engenharia de Processos pelo companheirismo e ajuda nas disciplinas, especialmente Rúbia, Chico, Moema, Vitória e Ivonete;
Aos funcionários de Engenharia de Materiais e de Processos: Violeta, Mila, André, Kátia, Sr. Fernandes, Geraldo, Márcia e todos os demais;
Aos alunos da iniciação científica Jéssica, Bruno e Diego (farmácia); Magna, Oscar (Engenharia de Materiais); Nathália (Engenharia Química), Adriana e Dayana (Pibic Jr.) e outros que tiveram participação efetiva neste trabalho.
AGRADECIMENTOS PESSOAIS
A Deus, Princípio, Meio e Fim;
A Nossa Senhora, pelas constantes interseções;
A minha mãe Guia, pelo incentivo, amizade, carinho e por tanto que tem feito por nós; Ao meu pai Antônio de Carvalho (in memorian), por tantas lições ao longo da vida; A minha sogra, D. Betinha, pela amizade;
Ao meu esposo Marcel, pela bela família que formamos;
Aos meus filhos Nicole e Aloysio pelo sentido, alegria e amor que trouxeram para minha vida;
Aos meus irmãos Marcos, Ana Lúcia, Alexandre, Magnólia e Ricardo pelos momentos de companheirismo e amizade desde a infância;
Aos cunhados Ilka, Marcus, Valéria, Harrison, Renata, Bertrand, René, Adriana e Arlene por complementarem nossa família;
Aos sobrinhos Christiano, Filipe, Pablo, André, Antônio Neto, Ana Maria, Ana Beatriz, Harrison Jr., Hugo, Haendel, Ana Rafaela, Larissa, Rebeca, Lis por aumentarem a alegria de minha vida;
“Tudo é do pai
Toda honra e toda glória É d’Ele a vitória
Alcançada em minha vida Tudo é do pai
Se sou fraco e pecador Bem mais forte é o meu Senhor
Que me cura por amor”.
RESUMO
A utilização de biomateriais surgiu em função de pessoas que nascem com problemas em órgãos/tecidos ou os adquirem por traumas. Sua demanda foi enfatizada pelo aumento da expectativa de vida dos seres humanos; recentemente, a área de biomateriais encampou muitos estudos, a exemplo da pesquisa com liberação controlada de fármacos, biosensores e dispositivos biomédicos. Uma das doenças crônicas de grande abrangência na contemporaneidade é o Diabetes mellitus tipo 1, cujo tratamento consiste em administração subcutânea diária de insulina. O objetivo deste trabalho foi desenvolver biofilmes compostos de quitosana e insulina, na perspectiva de administrar o fármaco por uma via alternativa a injetável, em sistemas de liberação controlada, contribuindo para uma maior adesão ao tratamento. Os biofilmes foram desenvolvidos a partir da quitosana adquirida em dois fornecedores diferentes e a insulina utilizada foi a NPH em duas concentrações diferentes. A caracterização foi feita pelas técnicas de Molhabilidade, Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Difração de Raios X (DRX), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Termogravimetria (TG), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Biodegradação Enzimática, Avaliação da Viabilidade Celular dos Macrófagos e Determinação da Produção de Óxido Nítrico. Foram constatadas pequenas diferenças de hidrofilicidade das amostras, através das análises de molhabilidade. Através dos resultados de FTIR e DRX foi evidenciada a formação do biofilme quitosana/insulina. A morfologia do biofilme não foi modificada consideravelmente, independentemente da presença da insulina, das concentrações e do tipo de quitosana utilizada, sendo a morfologia característica de polímeros de natureza fibrosa, típica da quitosana. Os ensaios realizados por DRX demonstraram variação da cristalinidade nas preparações sendo constatada maior cristalinidade para a preparação de quitosana a 1%, Sigma Aldrich®, GD 75% (B2.1) e menor para a preparação de quitosana a 1,5% Sigma Aldrich®, GD 85% / 50UI de insulina, (B1.4). O DSC acusou três eventos térmicos mostrando que a presença insulina nas preparações de baixa massa molar se equivaleu aos efeitos constatados nas preparações de alta massa molar. A TG constatou maior perda de massa nas preparações de quitosana sem insulina. Os ensaios de biodegradação foram aplicados aos biofilmes de quitosana Sigma Aldrich® a 1%, resultando numa maior degradação para a composição a 1% / 50 UI de insulina (B1.3) e menor para a composição de quitosana a 1 % sem insulina (B1.1). Os ensaios de toxicidade demonstraram nas composições B, a viabilidade da utilização deste sistema como alternativa viável para o tratamento do Diabetes mellitus.
Palavras-chave: 1. Polissacarídeos. 2. Biomateriais. 3. Diabetes Mellitus. 4. Biofilmes. 5. Sistemas Matriciais.
ABSTRACT
The use of biomaterials was induced to help people borned with problems in organs / tissue or people that acquired them by traumas. This demand was increased by the human beings prolonged life expectance. Recently in the area of biomaterials, many studies have been published, such as researches on drug delivery systems, biosensors and biomedical devices. One of the high incidences of chronic diseases in contemporary society is Diabetes mellitus type 1, which treatment consists of daily subcutaneous administration of insulin. The aim of this study was to develop biofilms composed of chitosan and insulin, towards an alternative to the injectable drug administration, using drug delivery systems to increase adherence to the treatment. Biofilms were developed from chitosan from two different suppliers and NPH insulin was used in two different concentrations. The films were characterized by the techniques of Wettability, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-ray Diffraction (XRD), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Thermogravimetry (TG), Scanning Electron Microscopy (SEM), Enzymatic Biodegradation, Assessment of Viability and Determination of Macrophage Nitric Oxide Production. We found small differences in hydrophilicity of the samples observing wettability analysis. The results of FTIR and XRD confimed the formation of biofilms chitosan / insulin. The biofilms morphology didn’t change substantially, regardless the presence of insulin concentrations and the type of chitosan used, presenting a nature fibrous polymer characteristic morphology, typical for chitosan. Tests conducted by XRD showed a variation of crystallinity in the samples. The highest crystallinity was found for the chitosan (1%), Sigma Aldrich ®, 75% GD (B2.1) preparation and lowest for the chitosan (1.5%), Sigma Aldrich ®, GD 85%, plus 50 IU of insulin, (B1.4) preparation. The DSC observed three thermal events showing that insulin presence in preparations of low molecular weight was equivalent to the effects of that in preparations of high molecular weight. The TG showed a higher weight loss for preparations of chitosan without insulin. The biodegradation tests were applied to chitosan from Sigma Aldrich® 1% biofilms, and showed the highest degradation for the composition of 1% / 50 IU of insulin (B1.3) and the lowest for the composition of chitosan 1% without insulin ( B1.1). The toxicity tests showed the feasibility to use this system as a viable alternative for the treatment of Diabetes mellitus.
Keywords: 1. Polysaccharides; 2. Biomaterials; 3. Diabetes mellitus; 4. Biofilms; 5. matrix systems
SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO 18 2 OBJETIVOS 20 2.1 Objetivo Geral 20 2.2 Objetivos Específicos 20 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21 3.1 Biomateriais 21
3.2 Liberação Controlada de Fármacos 23
3.2.1 Contexto histórico e classificação 24
3.2.2 Vantagens e Desvantagens 25
3.2.3 Taxa de Liberação e posologia. 26
3.2.4 Classificação da Liberação Controlada de Fármacos 28 3.2.5 Hidrogéis como sistema matricial para liberação controlada de fármacos 31 3.3 Polimerização e Biopolímeros: uso de polímeros na indústria farmacêutica. 32
3.4 Estrutura Polimérica dos Polissacarídeos. 36
3.5 Polímeros Naturais: Quitina e Quitosana 40
3.6 Quitosana 42
3.6.1 Origem 43
3.6.2 Estrutura e caracterização da quitosana 43
3.6.3 Propriedades físico-químicas 44
3.6.4 Propriedades Biológicas 45
3.6.5 A Quitosana como Biomaterial 46 3.6.6 Utilização da Quitosana na Engenharia de Tecidos
3.6.7 Utilização da quitosana na Liberação Controlada de Fármacos
46 47 3.6.8 Parâmetros que afetam as características de distribuição de fármacos em
microesferas de quitosana
47
3.7 Insulina 48
3.7.1 Distribuição e degradação da insulina 48
3.7.2 Efeitos da Insulina 49
3.7.4 Composição da insulina 54
3.7.5 Preparações de insulina 57
3.7.5.1 Injeção de insulina, insulina regular ou insulina cristalina-zinco 57 3.7.5.2 Preparações de ação ampliada a partir da interação entre a insulina e a
proteína básica, protamina
57
3.7.5.3 NPH ou isófana 58
3.7.5.4 Suspensão de insulina-protamina tamponada com acetato 58
3.7.5.5 Suspensão de insulina-zinco ampliada 58
3.7.5.6 Insulina semi-lenta 58 3.7.5.7 Suspensão de insulina-zinco 58 4 METODOLOGIA 59 4.1 Materiais 59 4.1.1 Biopolímero 59 4.1.2 Reagentes 59 4.1.2.1 Ácido acético 59 4.1.2.2 Hidróxido de Sódio 59 4.1.2.3 Insulina 59 4.2. Animais 60 4.3 Métodos 60
4.3.1 Obtenção do biofilme de quitosana 60
4.3.2 Tipos de biofilmes produzidos 61
4.3.3 Método de incorporação da insulina no biofilme 62
4.3.4 Caracterização dos filmes de quitosana/insulina 62
4.3.4.1 Tensão Superficial (TS) 62
4.3.4.2 Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
63
4.3.4.3 Difração de raios X (DRX) 63
4.3.4.4 Análise Térmica 64
4.3.4.4.1 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) 65
4.3.4.4.2 Estudo Termogravimétrico (TG) 65
4.3.4.6 Ensaio de biodegradação enzimática 66
4.3.4.7 Avaliação da Viabilidade Celular dos Macrófagos 67
4.3.4.7.1 Obtenção das células do Exsudado Peritonial 67
4.3.4.7.2 Avaliação da viabilidade celular de células peritoneais aderentes 68
4.3.4.8 Determinação da produção de óxido nítrico 69
4.3.4.9 Análise estatística 70
5 RESULTADOS 71
5.1 Tensão Superficial 72
5.2 Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier 74
5.2.1 Biofilmes A1 75
5.2.2 Biofilmes B1 77
5.2.3 Biofilmes B2 78
5.3 Espectroscopia por dispersão de Raios X 80
5.3.1 Difratogramas 80
5.3.2 Cálculo do Índice de Cristalinidade 82
5.4 Microscopia Eletrônica de Varredura 85
5.5 Análise Térmica 87
5.5.1 Calorimetria Exploratória Diferencial 87
5.5.2 Termogravimetria 90
5.6 Ensaios de Biodegradação. 93
5.7 Avaliação da Viabilidade Celular dos Macrófagos 95
5.7.1 Obtenção das células do Exsudado Peritoneal 95
5.7.2 Avaliação da Viabilidade Celular de Macrófagos 96
5.7.3 Determinação da produção de óxido nítrico 98
6 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS 101
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1. Esquema Cinético de Liberação Convencional 26
Figura 2. Esquema Cinético de Liberação Controlada 26
Figura 3. Perfil de liberação de fármacos convencional e controlada em função do tempo
27
Figura 4. Classificação da LCF e suas principais vias de Administração 29 Figura 5. Morfologia esquemática dos materiais amorfos: a) termoplástico
amorfo; b) termoplástico semi-cristalino; c) elastômero; d) termorrígido
35
Figura 6. D-glicose (aldohexose) e D-frutose (cetohexose) respectivamente 37 Figura 7. Diferenciação da D-glicose em α-D-glicopiranose e β-D-glicopiranose 38 Figura 8. Semelhança entre a estrutura química da glicose, da
β-D-glicosamina e da N-acetil-D-β-D-glicosamina
39
Figura 9. Ligação glicosídica entre monômeros da quitina 39
Figura 10. Estrutura química da Quitina e da Quitosana 41
Figura 11. Ação da insulina em transportadores de glicose 51
Figura 12. Sequência de aminoácidos da Pró-insulina humana 53
Figura 13. Esquema estrutural da pró-insulina humana 54
Figura 14. Aminoácidos mais frequentes nas proteínas, estrutura geral e estrutura química
55
Figura 15. Soluções poliméricas feitas com (a) quitosana Polymar (GD=86%) e (b) Sigma Aldrich® (GD=75% e 85%)
71
Figura 16. Biofilme confeccionado com quitosana Sigma Aldrich® a 1% e 100UI de Insulina
72
Figura 17. Valores de ângulo de contato obtidos a partir da medida do meio ângulo, de uma gota de água destilada gotejada, nas diferentes preparações
73
Figura 19. Espectro de Infravermelho das preparações Sigma Aldrich®, GD 85% 78 Figura 20. Espectro de Infravermelho das preparações Sigma Aldrich®B2 79
Figura 21. Difratogramas dos biofilmes Polymar 80
Figura 22. Difratograma dos biofilmes B1 81
Figura 23. Difratogramas dos biofilmes B2 82
Figura 24. Corte transversal de um biofilme de quitosana de baixo peso molecular 85 Figura 25. Corte transversal de um biofilme de quitosana de alto peso molecular a
1,5% com 50 UI de insulina
85
Figura 26. Corte transversal de um biofilme de quitosana Polymar a 1,5%, com 2.000 vezes.
86
Figura 27. Corte transversal de um biofilme de quitosana Sigma Aldrich® a 1%, com 2.000 vezes
87
Figura 28. Curvas calorimétricas referentes aos biofilmes de quitosana Sigma Aldrich® a 1%, GD 85%, baixa massa molar, sem insulina (B1.1), com 50UI de insulina (B1.3) e 100UI de insulina (B1.5).
Figura 29. Curvas calorimétricas referentes aos biofilmes de quitosana Sigma Aldrich® a 1%, GD 75%, alta massa molar, sem insulina (B2.1), com 50UI de insulina (B2.3) e 100UI de insulina (B2.5).
Figura 30. Curvas termogravimétricas referentes aos biofilmes de quitosana Sigma Aldrich® a 1%, GD 85%, baixa massa molar, sem insulina (B1.1), com 50UI de insulina (B1.3) e 100UI de insulina (B1.5)
88
89
91
Figura 31. Curvas termogravimétricas referentes aos biofilmes de quitosana Sigma Aldrich® a 1%, GD 75%, alta massa molar, sem insulina (B2.1), com 50UI de insulina (B2.3) e 100UI de insulina (B2.5)
92
Figura 32. Perda de massa expressa em percentual dos biofilmes submetidos à ação da lisozima (B1.1, B1.3 e B1.5) e ao Tampão PBS (B1.1T, B1.3T e B1.5T) Figura 33. Células obtidas do exsudato peritoneal de Camundongos Swiss após 3 dias de estimulação com inoculação peritoneal de 3 mL de tioglicolato de sódio
94
96
Figura 34. Viabilidade de macrófagos de camundongos Swiss na presença dos biofilmes B1.1, B1.5, B2.1e B2.5
97
Figura 35. Produção de óxido nítrico por macrófagos de camundongos Swiss na presença dos biofilmes B1.1, B1.5, B2.1e B2.5
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1: Categorias dos Sistemas de Liberação Modificada 24
Tabela 2. Vantagens e desvantagens do Sistema de Liberação Controlada de Fármacos
25
Tabela 3. Resumo das ações da insulina no metabolismo animal 50 Tabela 4. Distribuição dos aminoácidos da insulina Humana e classificação de
acordo com as propriedades de suas cadeias
56
Tabela 5.Biofilmes produzidos e suas composições 61
Tabela 6. Principais valores de absorbância detectados nos biofilmes de quitosana e quitosana/insulina.
75
Tabela 7. Índice de Cristalinidade (ICR) das amostras calculados a partir da Intensidade refratada relativa à região cristalina (Ic) e Intensidade refratada relativa à Região Amorfa (IA)
83
Tabela 8: Dados calorimétricos das preparações Sigma Aldrich de baixa e alta massa molar (B1 e B2) respectivamente, a razão de aquecimento 10ºC/min.
90
Tabela 9. Dados termogravimétricos dinâmicos das preparações B1.1, B1.3 e B1.5. 92 Tabela 10. Perda de massa percentual de biofilmes de quitosana e quitosana/insulina
submetidos a ensaios de biodegradação e respectivos desvios padrão
94
Tabela 11. Análise de Variância - ANOVA Teste de Tukey para os biofilmes testados confrontados com o padrão positivo e negativo.
LISTA DE SIGLAS
ASTM - American Society for Testing and Materials CAr - Campus de Araraquara
CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CLAE-UV
CME CMT CN
- Cromatografia líquida com detector espectrofotométrico na região do ultravioleta
- Concentração mínima eficaz - Concentração mínima tóxica - Controle negativo DNA DRX DSC DTG - Ácido Desoxirribonucleico - Difração de Raios X
- Calorimetria exploratória diferencial - Derivada termogravimétrica
FCF - Faculdade de Ciências Farmacêuticas
FTIR - Espectroscopia na região do Infravermelho com transformada de Fourier GA - Grau de acetilação GD GP GRAS - Grau de desacetilação - Grau de polimerização - Generally Regard As Safed Ia
IBGE Ic Icr iNOS
- Intensidade relativa à região amorfa
- Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - Intensidade relativa à região cristalina - Índice de cristalinidade
- enzima NO sintetase induzida LCF
LPS
- Liberação controlada de fármacos - Lipopolissacarídeos MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura
MO MTT - Microscópio Ótico - Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio NPH NO OMS
- Neutral Protamin Hagerdorn - Óxido Nítrico
- Organização mundial da saúde PBS
pH
- Phosphate buffered saline - Potencial Hidrogeniônico
PNAD - Pesquisa Nacional por Amostra em Domicílio ppm - Partes por milhão
SBCAL SBF
- Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório - Solution Body Fluid
TGA TS
- Análise termogravimetrica - Tensão Superficial
UFCG - Universidade Federal de Campina Grande UI - Unidade internacional
UNESP UNICAMP
- Universidade Estadual Paulista Prof. Júlio de Mesquita Filho - Universidade Estadual de Campinas
1 INTRODUÇÃO
A manutenção e reparação dos órgãos são fenômenos naturais em indivíduos saudáveis e jovens e o desenvolvimento de alguns destes indivíduos acontece, mesmo com dietas inadequadas, permanecendo saudáveis por algum tempo, quer sejam sedentários ou submetidos a rotinas extremas de exercícios. Seria bom se essa situação prevalecesse sob a humanidade, mas infelizmente isso não acontece. Algumas pessoas nascem com tecidos defeituosos ou órgãos que não funcionam bem; a maioria adquire problemas em consequência de traumas ou doenças; com a idade, perde-se progressivamente a habilidade para enfrentar os desafios físicos e curar as doenças (HASELTINE, 2002).
O aumento da expectativa de vida dos seres humanos tem trazido novos desafios às ciências em todas as áreas. Um destes desafios é a capacidade de convivência com a limitação, que ocorre em função da falência ou perda de órgãos e tecidos nos traz. Em documentos oficiais, o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) destaca o considerável aumento da população idosa. Em 2007, a Pesquisa Nacional por Amostra em Domicílio – PNAD apontava a existência no Brasil de quase 20 milhões de idosos, correspondendo a 10,5% do total da população (BRASIL, 2008). Segundo dados estatísticos apresentados na Europa em 2010, a população com idade superior a 60 anos é maior que a com menos de 20 anos. O número de indivíduos com mais de 50 anos, entre 1990 e 2020, deverá duplicar (RATNER; BRYANT, 2004).
O aumento da demanda de biomateriais, ocorrido nas últimas décadas, vem de encontro à necessidade originada pelo aumento da expectativa de vida e pelo atendimento de pacientes, após tratamentos médicos, devido a doenças sistêmicas ou tratamentos farmacológicos (RATNER et al. 1996). A utilização de biomateriais em pacientes acometidos por doenças crônicas pode ser de grande valia para pacientes e profissionais, facilitando o tratamento e consequentemente melhorando sua adesão, como é o caso do Diabetes mellitus.
O Diabetes mellitus, é uma doença crônica que ocorre quando o pâncreas não produz insulina suficiente (tipo 1), ou quando o corpo não pode usar efetivamente a insulina que ele produz (tipo 2), a qual atinge 246 milhões de pessoas no mundo. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), até 2020, o número de pessoas que vivem com diabetes deve chegar a 380 milhões, com alta incidência entre crianças. O Diabetes tipo 1,
no qual o paciente efetivamente depende da administração de insulina, cresce cerca de 3% ao ano entre crianças/adolescentes e cerca de 5% ao ano, entre crianças em idade pré-escolar. A incidência é maior em crianças do sudoeste da Ásia e da Europa. O Brasil ocupa a sétima posição no ranking de países com maior número de diabéticos, com 6,9 milhões de casos registrados. Em 2025, estima-se que o país passe a ocupar a quarta posição, com 17,6 milhões de pessoas com diabetes (BRASIL, 2008; RIBEIRO; FREUDENRICH, 2001).
O carreamento de fármacos por sistemas poliméricos, como é o caso da quitosana, é considerado uma promissora e valiosa técnica para otimizar a liberação controlada de fármacos, pois um sistema carreador deste tipo permite boa estabilidade, absorção e excelente transferência tissular quantitativa, bem como, a esperada atividade farmacodinâmica (LACAVA, 2006).
É necessário registrar que, o tratamento do Diabetes tipo 1 traz muitos incômodos, pois consiste na administração múltipla diária de insulina por via subcutânea. Diante do exposto, o desenvolvimento deste trabalho vem de encontro a essa demanda e abre uma perspectiva de minimização deste problema, uma vez que objetiva o desenvolvimento de um sistema que possa utilizar uma via de administração diferente da subcutânea, associando a aplicação deste biopolímero para a obtenção de um sistema de liberação controlada de fármaco, com potencial de real inovação tecnológica.
Por outro lado, é importante ressaltar que este trabalho enquadra-se dentro do conceito da biofarmacotécnica, área de atuação docente da autora deste trabalho, que, segundo autores, pode ser compreendida como a técnica de incluir ou veicular o fármaco em uma formulação estável, dando origem a uma forma farmacêutica adequada à via de administração proposta e ao objetivo terapêutico do medicamento (STORPIRTIS; GAI, 2009).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver um processo para obter um biomaterial constituído por uma matriz polimérica – quitosana, em forma de biofilme, e um fármaco - insulina, para potencial aplicação como sistema de liberação controlada de fármacos.
2.2 Objetivos Específicos
Obter biofilmes de quitosana incorporados com insulina.
Estudar a morfologia do biofilme de quitosana incorporado com insulina. Avaliar a molhabilidade dos biofilmes de quitosana e dos desenvolvidos com
quitosana/insulina.
Verificar a estabilidade do biofilme em condições de temperatura e de composição de fluidos biológicos.
Estabelecer perspectivas de liberação controlada da insulina, a partir do biofilme desenvolvido.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Biomateriais
Os biomateriais começaram a ser utilizados pela necessidade de repor, mesmo que em alguns casos, apenas esteticamente, seguimentos biológicos de variada complexidade. Desde então, tem-se observado uma evolução deste campo, que vai da remoção dos tecidos no passado, a substituição dos mesmos atualmente, até a regeneração dos tecidos que se constitui uma meta a ser alcançada em um futuro promissor (HENCH, 1998). A partir das idéias iniciais sobre biomateriais, muitos outros estudos foram sendo encampados a exemplo da pesquisa com liberação controlada de fármacos, biosensores e dispositivos biomédicos (RATNER, 1996).
Por conseguinte, a definição inicial que considerava os biomateriais como aqueles materiais capazes de tratar, aumentar ou substituir, qualquer tecido, órgão ou função do corpo está em constante evolução, agrupando as funções e conceitos que os novos campos propõem. No entanto, algumas características já foram delimitadas por diversos pesquisadores a exemplo da interdisciplinaridade, da afinidade que os cientistas da área devem demonstrar com as ciências dos materiais, do desenvolvimento dos dispositivos de biomateriais (envolvendo desde a identificação da necessidade, desenvolvimento, manufatura, implantação e remoção do dispositivo no paciente), da magnitude da necessidade e do campo comercial (que envolve questões comerciais e éticas pertinentes). Nesta linha de raciocínio, Ratner (1996) enfatiza que não é fácil encontrar a interligação entre esses componentes no campo chamado “ciências de biomateriais” e afirma que o traço comum é a interação entre sistemas biológicos e materiais sintéticos ou naturais.
Desta forma, considera-se pertinente a afirmação de que o arsenal de biomateriais, no caso de materiais poliméricos, inclui desde biopolímeros usados na liberação controlada de fármacos (LCF) às chapas biopoliméricas usadas para reparar ossos em dispositivos ortopédicos específicos, descritos em estudos de casos. Assim, neste tipo de estudo, é necessário integrar o conteúdo das ciências básicas da engenharia e a experiência médica (DEE, PULEO; BIZIOS, 2002).
Os requisitos que um biomaterial deve cumprir são: ser biocompatível, atóxico, não cancerígeno e quimicamente estável (exceto nos casos em que se objetive alcançar a biodegradabilidade); apresentar resistência mecânica adequada; apresentar peso, densidade e resistência à fadiga adequados; ter um desenho de engenharia adequado ao uso; ser
economicamente viável, reprodutível, fácil de fabricar e processar em grande escala (MORATO; NARVAEZ; TORIBIO, 2004). De acordo com a aplicação, a inércia química do biomaterial pode ser desejada, mas na maioria dos casos esta qualidade pode não ser um fator determinante na utilização deste tipo de material.
A escolha dos biomateriais influencia muito o planejamento e o sucesso da utilização de técnicas de liberação controlada de fármacos, em implantes e órgãos artificiais. Pesquisadores estão usando estratégias da engenharia para desenvolver polímeros inspirados para aplicação terapêutica e diagnóstica. O critério de planejamento para esses materiais está baseado em grandes limitações funcionais para regular atividades biológicas, de maneira controlada e biocompatível. Assim, novos polímeros estão em desenvolvimento para serem utilizados na adesão tecidual, recriando condições do corpo na superfície do polímero, evitando problemas pós-operatórios. Outra área de interesse é o uso de biomateriais para o planejamento de matrizes artificiais extracelulares que servem como suporte para aplicação na engenharia de tecidos. Estes suportes são projetados em formas tridimensionais complexas e permitem controlar certos sinais micro-ambientais como interações extracelulares e estímulos biomecânicos em nano, micro e macro-escala (BIOMATERIALS..., 2008; KOHN; WELSH; KNIGHT, 2007).
O termo biopolímeros é utilizado para descrever uma variedade de materiais classificados geralmente em duas categorias: (a) polímeros produzidos por sistemas biológicos como microrganismos, plantas e animais e (b) polímeros que são sintetizados quimicamente, mas são derivados de materiais biológicos iniciais, como aminoácidos, açúcares, gorduras naturais ou óleos (U.S.CONGRESS, 1993).
A quitosana é um biopolímero natural, abundante e atóxico e sua utilização tem sido proposta para usos diversos, seja na área de engenharia, biotecnologia, ciências farmacêuticas ou medicina. É obtida a partir da adequação da estrutura química de um polímero natural encontrado em diversas fontes: processo de desacetilação da quitina, que por sua vez é extraída das carapaças de alguns artrópodes, principalmente os crustáceos, através da reação de desacetilação. As suas indicações incluem meio complexante de íons metálicos, como elemento básico para a confecção de matrizes de liberação controlada de fármacos, entre outras. Há algum tempo, filmes finos de quitosana tem sido submetidos a avaliações práticas, sobretudo em decorrência de suas características físico-químicas, que resultam em propriedades como fácil formação de géis, capacidade filmogênica e boas propriedades mecânicas (ASSIS; SILVA, 2003).
A utilização de quitosana em desenvolvimento de sistemas de liberação transdérmica e a eficiência deste polímero em promover a penetração transepitelial, já foram demonstradas com vários agentes terapêuticos, como a insulina, a morfina, a heparina e a hidrocortisona (SILVA; SANTOS; FERREIRA, 2006). A liberação pulsátil baseada num sistema em gel foi desenvolvida e mostrou-se viável na distribuição modulada de insulina em resposta a mudança na concentração fisiológica da glicose (KASHYAP et al., 2007). No entanto, até o momento, desconhecem-se pesquisas que apresentem resultados com perspectivas concretas de se obter um material que possa promover a liberação da insulina em biofilmes de quitosana. Sendo assim, a efetivação deste estudo possibilitará o desenvolvimento de um biofilme que viabilizará uma opção ao tratamento do Diabetes mellitus com aplicação da insulina de maneira menos traumática aos pacientes.
O surgimento da engenharia de tecidos como disciplina acadêmica e da indústria global abriu oportunidades sem precedentes para o desenvolvimento de terapias avançadas para o tratamento de doenças congênitas ou adquiridas. A engenharia de tecidos fornece novas combinações de células, biomateriais, medicamentos, produtos de genes, ou genes que podem ser projetados, especificados, fabricados e fornecidos de forma simultânea ou sequencialmente, como agentes terapêuticos (BOYCE, 2002).
3.2 Liberação Controlada de Fármacos
Na terapia medicamentosa convencional, o fármaco é administrado através de uma forma farmacêutica e produz um nível tecidual (geralmente sanguíneo) do fármaco, que não se mantêm dentro da faixa terapêutica, por um período prolongado de tempo (LEE; ROBINSON, 2004). Desta forma, o êxito do tratamento vai depender de vários fatores como dosagens precisas e frequentes, em horários específicos pré-determinados e adesão do paciente à terapêutica, de modo que a não obediência ao esquema terapêutico pode resultar em utilização do fármaco em faixa não efetiva ou em níveis tóxicos.
O objetivo de qualquer sistema de administração de fármacos é liberá-lo ao organismo, dentro de uma distribuição espacial e temporal, ou seja, é fornecer o fármaco para o local apropriado do corpo, mantendo-o dentro da concentração desejada. Sendo assim, entende-se que um sistema de liberação controlada de fármacos, projetado de forma apropriada, constitui-se num importante avanço na direção da solução destes dois problemas (LEE; ROBINSON, 2004).
3.2.1 Contexto histórico e classificação
O conceito de um sistema de liberação controlada de fármacos teve início na Inglaterra na década de 1930. Em 1937, Deansley e Parkes apresentaram as suas conclusões na Royal Society of Medicine, em Londres. Em um experimento, eles descobriram que a implantação de estrogênio em aves do sexo masculino, resultou no aparecimento de características femininas nestas mesmas aves, em três meses. Em 1938, no Guy's Hospital, em Londres, Bispo apresentou pesquisa em seres humanos em que a implantação subcutânea de comprimidos de estrogênio limitou o número de sintomas apresentados pelas mulheres com menopausa prematura (SHALABY; SHALABY, 2005).
O desenvolvimento de formulações farmacêuticas para uso humano, baseado em sistemas de liberação de fármacos com taxas controladas, iniciou-se em 1970 e minibombas osmóticas são extensivamente utilizadas desde 1978, resultando em torno de 6000 publicações na literatura farmacológica, fisiológica e endocrinológica (URQHART, 2000).
A Liberação Controlada é uma das categorias de Liberação Modificada de Fármaco e como tal está descrita na Tabela 1.
Tabela 1. Categorias dos Sistemas de Liberação Modificada
Categoria Característica
Liberação Retardada Utiliza forma farmacêutica única com dosagens repetitivas e intermitentes de um fármaco.
Liberação Sustentada Inclui qualquer sistema de administração de fármacos, que promova sua liberação lenta, por um período de tempo prolongado.
Liberação Controlada Mantém o fármaco na concentração efetiva e direcionado para sítios específicos ou para receptores.
Fonte: Baseada em LEE; ROBINSON, (2004)
Um sistema ideal de distribuição de fármacos deve ser biocompatível, facilmente liberado, permitir um controle da taxa de distribuição de fármacos e não deve alterar a atividade do fármaco na distribuição. Os materiais naturais, incluindo polímeros como a quitosana têm sido aplicados topicamente nos sistemas de liberação de fármacos apresentando vantagens com relação aos materiais sintéticos, porque a degradação é controlada pelas células de acordo com mecanismos fisiológicos (FELDMAN et al., 2003).
O uso de biopolímeros para liberação controlada de fármacos pode minimizar reações teciduais, promover benefícios terapêuticos e, ao mesmo tempo, minimizar efeitos tóxicos (SINKO, 2008; HERDMAN,1993).
3.2.2 Vantagens e Desvantagens
Considera-se que a tecnologia da liberação controlada de fármacos apresenta sua contribuição enquanto ciência multidisciplinar; entretanto, como qualquer outra forma farmacêutica, estes sistemas têm várias vantagens e desvantagens, que estão resumidas na Tabela 2.
Tabela 2. Vantagens e desvantagens do Sistema de Liberação Controlada de Fármacos
VANTAGENS DESVANTAGENS
Os níveis plasmáticos do fármaco podem ser mantidos por um longo período de tempo, pela liberação progressiva e controlada do fármaco, proporcionando maior eficácia terapêutica.
Problemas de biocompatibilidade do implante ou dos solventes orgânicos residuais usados na síntese.
Diminuição da frequência da administração do medicamento e maior tempo de permanência na circulação.
Produção de produtos potencialmente nocivos se for empregado um sistema de polímero biodegradável (ou absorvível). Este não é o caso da quitosana.
A liberação sustentada pode conduzir a uma baixa dosagem do fármaco que é importante quando se lida com medicamentos que tem efeitos colaterais significativos ou toxicidade.
Implante cirúrgico e/ou remoção do sistema Acionamento de overdose involuntária (em sistemas defeituosos ou em caso de acidentes), nos casos de necessidade de implantar dispositivos.
A colaboração do paciente pode ser melhorada com administração segura e conveniente.
Incapacidade de ajustar a taxa de liberação do medicamento, se os efeitos se tornarem indesejáveis após o implante.
Fármacos com alto metabolismo de primeira passagem pelo fígado ou desativação pelo trato gastrointestinal podem ser efetivamente utilizado.
Variabilidade da absorção a partir do tecido subcutâneo devido a diferenças no suprimento sangüíneo local e da quantidade de gordura local.
Direcionamento a alvos específicos possibilidade de se incorporar substâncias hidrofílicas e lipofílicas, em determinados sistemas.
Taxa de penetração lenta, falta de flexibilidade na dosagem e/ou precisão, bem como uma restrição à relativamente baixa dosagem.
3.2.3 Taxa de Liberação e posologia.
Nas formas farmacêuticas convencionais tais como comprimidos, cápsulas, soluções, suspensões, entre outras, a liberação do fármaco ocorre de maneira mais rápida, facilitando a absorção.
A Figura 1 ilustra o esquema cinético referente a este tipo de liberação, onde Kr, Ka e Ke são constantes de relação de primeira ordem para liberação, absorção e eliminação total do fármaco, respectivamente.
Figura 1. Esquema Cinético de Liberação Convencional Fonte: Baseada em LEE; ROBINSON, (2004)
Na forma farmacêutica convencional kr é muito maior do que ka, ou seja, a absorção do fármaco através de uma membrana biológica é uma etapa limitadora da taxa de distribuição do fármaco para sua área-alvo.
Na liberação não-imediata o esquema cinético acima é simplificado, conforme está ilustrado na Figura 2.
Figura 2. Esquema Cinético de Liberação Controlada Fonte: Baseada em LEE; ROBINSON, (2004)
Neste caso, a fase de absorção torna-se insignificante em relação à fase de liberação da droga, ou seja kr é muito menor do que ka, ou seja, a liberação da droga a partir da forma farmacêutica é uma etapa limitadora da taxa. Desta maneira, o desenvolvimento de um sistema de liberação matricial, como é o caso do biofilme de quitosana, primariamente, deve tentar alterar a taxa de liberação, alterando o valor de kr.
Sendo assim, o objetivo inicial ideal de um sistema de liberação controlada é manter um nível constante do fármaco no sangue ou tecido-alvo, nos casos terapêuticos em que isto seja necessário ou desejável. A Figura 3 estabelece uma comparação entre o sistema convencional e o de liberação controlada.
Figura 3: Perfil de liberação de fármacos convencional e controlada em função do tempo Fonte: VITALINE (2010)
Considerando que cada fármaco possui uma faixa de ação terapêutica, acima da qual ela é tóxica e abaixo da qual é ineficaz, as dosagens administradas determinam os níveis plasmáticos. Observe-se que a concentração do fármaco na corrente sanguínea na administração convencional, apresenta um aumento na concentração, até atingir um pico máximo (Cmax) e então declina: neste momento, uma nova dose é necessária, para que a
concentração volte a subir. Quando a administração de doses não é rigorosamente seguida, a concentração pode ficar abaixo do valor terapêutico ideal, ou seja, abaixo da concentração mínima eficaz (CME) ou acima do valor terapêutico ideal, atingindo a Concentração Mínima Tóxica (CMT). Dessa maneira, no sistema de liberação controlada de fármacos ocorre a manutenção da concentração do fármaco em níveis eficazes por um tempo prolongado, utilizando-se de uma única administração (ALLEN JR., POPOVICH, ANSEL, 2007).
3.2.4 Classificação da Liberação Controlada de Fármacos
Em geral, a Liberação Controlada de Fármaco (LCF) utiliza como métodos de liberação a difusão, a dissolução e a osmose, nos quais quase sempre é possível utilizar o sistema de reservatório e o sistema matricial. A Figura 4 apresenta os principais itens de classificação da Liberação Controlada de Fármacos. No entanto, os comentários seguintes estão especialmente direcionados ao sistema matricial, no qual se pode incluir o objeto de estudo deste trabalho, ou seja, o biofilme quitosana/insulina.
No primeiro caso, a liberação da droga é determinada pela sua difusão através de um polímero insolúvel em água utilizando dois sistemas: em um deles, o fármaco é envolvido por uma membrana polimérica e no outro se utiliza uma matriz na qual o fármaco é dissolvido ou disperso uniformemente. Na prática, os sistemas de difusão também dependem da dissolução, para que ocorra a liberação.
A liberação de um fármaco, a partir de um dispositivo de reservatório, é regida pela primeira lei de difusão de Fick, ou seja
J = - DdCm/dx (1)
Onde J é o fluxo da droga através da membrana, na direção da concentração decrescente (quantidade/área-tempo);
D é o coeficiente de difusão da droga na membrana (área/tempo);
e dCm/dx é a variação da concentração da droga com a distância x (LEE; ROBINSON,
Figura 4. Classificação da LCF e suas principais vias de Administração Fonte: Própria
Em contrapartida, no sistema de matriz o fármaco é distribuído uniformemente em toda matriz polimérica, cuja liberação controlada ocorre através de uma série de interconexões tortuosas de canais que permitem, ou não, a libertação de macromoléculas, por longos períodos de tempo. Após a exposição ao meio biológico, a matriz intumesce, causando um aumento da distância entre as cadeias poliméricas facilitando, portanto, a liberação do fármaco a partir da matriz para o meio biológico, por escoamento ou a partir da degradação das cadeias do polímero, devido a ação dos fluidos biológicos (SHALABY; SHALABY, 2005).
Os sistemas de dissolução podem ser formados partindo do princípio de que um fármaco com dissolução lenta produzirá um nível sanguíneo sustentado e a preparação de produtos de liberação controlada é possível, controlando-se a taxa de dissolução dos fármacos que sejam altamente solúveis em água. A opção é preparar um sal ou derivado apropriado, revestindo-o com um material lentamente solúvel e incorporá-lo em um
comprimido com um carreador lentamente solúvel. A área de superfície disponível para dissolução tem que permanecer constante para alcançar uma taxa de liberação constante, situação que, na prática, é difícil de obter (LEE; ROBINSON, 2004).
A equação de Noyes-Whitney define a dissolução de uma partícula esférica e apresenta a velocidade de transferência de massa de moléculas ou íons de soluto por uma camada de difusão estática (dm/dt), como diretamente proporcional à área disponível para a migração molecular ou iônica (A) e a diferença de concentração (∆C), pela camada limítrofe, bem como é inversamente proporcional à espessura da camada (h). Essa relação pode ser visualizada na Equação 2.
dm/dt = k1A ∆C / h (2)
onde k1= coeficiente de difusão (m2s-1) (AULTON, 2005).
De uma forma geral, os sistemas que usam dissolução são dois tipos: a formulação encapsulada, na qual a liberação da droga é determinada pela espessura do polímero e a formulação matricial, na qual a liberação da droga é determinada pela taxa de dissolução do polímero (LEE; ROBINSON, 2004). Neste último caso, a matriz polimérica pode ser biodegradável oferecendo a vantagem de ser absorvida pelo organismo, eliminando, portanto, a necessidade de remoção cirúrgica do sistema e permitindo a difusão do fármaco para os tecidos circundantes. No entanto, é preciso ponderar esta vantagem com a possibilidade do potencial tóxico dos produtos da degradação do polímero (SHALABY; SHALABY, 2005).
Nos Sistemas Osmóticos, a pressão osmótica pode ser empregada como força de impulsão para gerar uma liberação constante de droga, desde que uma pressão osmótica constante seja mantida e outras variáveis sejam controladas. Para uma melhor compreensão deste sistema, considere-se um comprimido revestido por uma membrana semipermeável, contendo um pequeno orifício. Quando exposta à água ou a algum líquido do corpo, a membrana permitirá difusão livre de água, mas não do fármaco, resultando em sua entrada devido à diferença de pressão osmótica e a taxa de fluxo de volume de água. Portanto, a permeabilidade, a área e a espessura da membrana determinam a taxa de fluxo de volume da água para o interior do comprimido, resultando no bombeamento do fármaco para fora, através do orifício, em um ritmo controlado (LEE; ROBINSON, 2004).
3.2.5 Hidrogéis como sistema matricial para liberação controlada de fármacos
Hidrogéis são géis poliméricos especiais capazes de formar uma rede polimérica tridimensional e de absorver e reter diferentes quantidades de água e de fluidos biológicos. Podem ser sintetizados via monômeros bifuncionais e com agentes reticulantes multifuncionais. A princípio, qualquer polímero pode ser usado para se sintetizar uma rede polimérica, isto inclui polímeros biológicos como polissacarídeos (inclusive a quitosana) e proteínas (inclusive a insulina). Polímeros lineares solúveis em água podem ser usados para produzir um gel. A ligação cruzada pode ocorrer por meio de reação química, radiação ionizante (gerando radicais livres que podem-se recombinar formando junções entre as cadeias de polímeros) ou através de interações físicas como emaranhados e cristalitos. A hidrofilicidade vem da inclusão na rede de grupos como hidroxila, sulfonato, carboxilato e outros grupos que interagem suficientemente bem com a água. Um hidrogel pode ser convertido também de um tipo a outro através de reações químicas em seus grupos funcionais. Desse modo, pode-se obter uma infinidade de hidrogéis para todas as mais variadas características (BISPO, 2009).
Estes géis poliméricos intumescidos são reticulados para formar uma matriz porosa, tanto por métodos físicos como químicos; eles são macios, úmidos e mimetizam muitos tecidos naturais, que os habilitam na substituição de delicados tecidos vivos (COSTA JÚNIOR, 2008; SINKO, 2008; BATICH; LEAMY, 2003).
Polímeros naturais como quitosana, alginato e algarose favorecem a produção de sistemas de hidrogéis porque eles são macromoléculas solúveis em água que produzem géis físicos. Outros polímeros naturais como colágeno, gelatina e fibrina formam géis reticulados induzidos por agentes reticulantes, como transglutaminases. Dependendo da aplicação, hidrogéis naturais oferecem várias vantagens em relação a agentes sintéticos, incluindo aumento da hidrofilicidade e aumento da porosidade, (GINTY at al., 2006).
As propriedades físico-químicas, mecânicas e biológicas podem ser moduladas. Por exemplo, hidrogéis podem responder a estímulos do ambiente como temperatura, pH, luz e moléculas específicas. Estas propriedades interessantes tem tornado os hidrogéis comum
para várias aplicações variando de aplicações farmacêuticas, biomédicas e outras aplicações industriais (SINKO, 2008; JEONG; HUH; PARK, 2006).
Dentre as muitas aplicações de hidrogéis, a Liberação Controlada de Fármacos é uma das áreas nas quais eles têm desempenhado um papel vital. A matriz hidratada resulta em boa compatibilidade tanto com proteínas, como com células vivas e fluidos biológicos. Desde o primeiro relato de uso biomédico de hidrogéis em 1960, vários outros hidrogéis tem sido desenvolvidos para aplicações biomédicas e farmacêuticas particularmente para a distribuição de fármacos e substâncias bioativas (JEONG; HUH; PARK, 2006).
Assim, constata-se que a utilização dos hidrogéis na preparação de formas farmacêuticas permitem a liberação do fármaco após expansão, em contato com o meio de dissolução ou em resposta à estímulos fisiológicos como temperatura, pH, enzimas, biomoléculas (glicose, ureia, insulina), força iônica e oxidação (VILLANOVA; ORÉFICE; CUNHA, 2010). George e Abraham (2006) afirmaram que a quitosana apresenta propriedades como biocompatibilidade, biodegradabilidade, sensibilidade ao pH e mucoadesividade que favorecem sua utilização por farmacologistas como matriz na liberação controlada de fármacos, inclusive por via oral.
3.3 Polimerização e Biopolímeros: uso de polímeros na indústria farmacêutica.
Uma vez estabelecidas condições de reação, a união de monômeros por ligações covalentes origina polímeros. A condição primária para que determinada molécula possa polimerizar é conhecida como funcionalidade, a qual deve ser igual ou superior a dois (pontos reativos ≥2). Esta funcionalidade apresenta-se de três maneiras: presença de pelo menos dois grupos funcionais, presença de insaturação e moléculas cíclicas (3/4 átomos). O processo de transformação de moléculas monoméricas em moléculas poliméricas é conhecido como polimerização. Quanto à cinética de polimerização as reações podem ser em cadeia e em etapas ( FOOK, 2005; BATICH; LEAMY,2003).
Denominam-se homopolímeros aos polímeros formados a partir de um único monômero, em contraposição aos copolímeros ou heteropolímeros que são formados a partir de mais de um monômero. Os copolímeros podem ser alternados, aleatórios, ou em blocos (SINK, 2008). No caso dos copolímeros alternados, dois tipos de polímeros se
alternam sistematicamente. Para os copolímeros aleatórios os meros seguem uma seqüência aleatória dentro da cadeia. Já os copolímeros em bloco apresentam seqüências longas de um mesmo mero, alternando com seqüências de outro mero (SINKO, 2008). Sendo assim, pode-se dizer que a quitosana é um copolímero aleatório, cujas unidades monoméricas são a glicosamina e acetilglicosamina.
A maioria das técnicas de polimerização produz polímeros com cadeias de massas molares variadas. Desta maneira, a massa molar de um polímero é de grande interesse por afetar propriedades mecânicas solubilidade e ponto de fusão do polímero. A massa molar de um polímero pode ser diferenciado como massa molar numérica média (Mn) e massa
molar ponderada (Mw). A massa molar numérica avalia a massa molar sobre o número total
de moléculas (média aritmética), enquanto que a massa molar ponderada considera as proporções mássicas (FOOK, 2005; BATICH; LEAMY, 2003; CALLISTER JR., 2001). As Equações 3 e 4 apresentam as fórmulas das massas molares:
Mn= ∑NiMi/∑Ni (3)
Mw= ∑NiMi2/∑NiMi (4)
onde Ni é o número de cadeias poliméricas com massa molar Mi.
O mecanismo de polimerização é uma classificação usual porque indica a presença de agentes contaminantes de baixa massa molar, como oligômeros ou monômeros que não reagiram. Os polímeros de baixa massa molar apresentam maior mobilidade e solubilidade e mais facilidade de provocar efeitos fisiológicos (BATICH; LEAMY, 2003). O Grau de Polimerização ”n” é uma alternativa para avaliar o tamanho da cadeia polimérica, que representa o número médio de unidades monoméricas da cadeia (SINKO, 2008; CHANDA; ROY, 2006; CALLISTER JR., 2001).
No caso específico do polímero quitosana, cadeias com baixas massas molares e oligômeros podem ser conseguidas pela hidrólise das cadeias poliméricas e, para algumas aplicações específicas, estas pequenas moléculas têm sido utilizadas com mais facilidade. A despolimerização da quitosana pode ser conseguida quimicamente, enzimaticamente ou fisicamente. A despolimerização química pode ser feita por hidrólise ácida usando HCl ou
por reação oxidativa utilizando HNO2 e H2O2. Entre as enzimas, que são capazes de
despolimerizar a quitosana enzimaticamente, está a lisozima. A despolimerização física pode ser feita por radiação gama. O grau de polimerização (GP) é uma importante característica a ser fornecida pelos fabricantes do mercado atual (ARANAZ et al., 2009).
As cadeias poliméricas podem ser arranjadas de três maneiras: linear, ramificada e reticulada. Como todos os materiais as propriedades dos polímeros podem ser previstas e explicadas pelo entendimento da estrutura polimérica em escala atômica, microscópica e macroscópica podendo ainda ser classificados superficialmente em termoplásticos e termorrígidos. A cadeia polimérica da quitosana é do tipo ramificada e para determinadas aplicações ela tem sido reticulada por agentes reticulantes, como ácido sulfúrico, glutaraldeído, tripolifosfato, entre outros ( FIDÉLES, 2010; LAUS et. al., 2006; PIAI et al., 2006; TORRES et al., 2006).
Polímeros termoplásticos são constituídos de cadeias poliméricas individuais que são mantidas juntas por ligações relativamente fracas, como ligações dipolo-dipolo e forças de Van der Waals. Os termoplásticos amolecem quando são aquecidos e endurecem quando resfriados, processos totalmente reversíveis e que podem ser repetidos. A maioria dos polissacarídeos e proteínas é considerada termoplástica e pode ser processado por técnicas usuais, ser dissolvidos em solventes, formar filmes e outros dispositivos. Os termoplásticos são lineares ou ramificados. Já os polímeros termorrígidos são os que contêm reticulações entre as cadeias poliméricas e não estão sendo abordados neste trabalho (BATICH; LEAMY, 2003; CALLISTER JR.,2001).
Comparativamente, os polímeros não cristalizam na mesma intensidade que os metais, porque as cadeias poliméricas são grandes e de tamanhos variados. Os grupos terminais atuam como imperfeições cristalinas. Geralmente, os polímeros são classificados como semicristalinos, uma mistura de regiões cristalinas e amorfas (FOOK, 2005). No estado sólido os polímeros possuem variados graus de cristalinidade. Nenhum polímero apresenta cem por cento de cristalinidade, mas alguns são puramente amorfos (BATICH; LEAMY, 2003). As cadeias poliméricas podem apresentar regiões cristalinas e regiões amorfas interconectadas, conforme está sendo apresentado na Figura 5.
Figura 5. Morfologia esquemática dos materiais amorfos: a) termoplástico amorfo; b) termoplástico
semi-cristalino; c) elastômero; d) termorrígido
Fonte: Padilha (2000)
A cada uma destas regiões está associada uma temperatura de transição do estado sólido para o estado líquido. No caso da região amorfa, a mobilidade está restrita a vibrações de curta intensidade e é denominada temperatura de transição vítrea ou de segunda ordem (Tg). A temperatura associada à fusão da fase cristalina é denominada
temperatura de fusão cristalina (Tm). Estes casos compreendem os polímeros de cadeia
linear e ramificada. No caso de polímeros de cadeia reticulada não ocorre a presença de estruturas cristalinas (FOOK, 2005).
A quitosana tem sido descrita como semi-cristalina ou cristalina mostrando polimorfismo, dependendo do estado físico. A cristalinidade da quitosana também pode variar consideravelmente dependendo do tratamento do polímero durante a extração e da origem, sendo a cristalinidade da quitosana extraída da carapaça de caranguejo maior do que a extraída da carapaça de lagosta, que por sua vez é maior do que a de camarão (ARANAZ, 2009; RINAUDO, 2006). O primeiro requisito para a cristalinidade é a repetição ordenada da estrutura da cadeia. Por isso, polímeros estereoregulares são frequentemente cristalinos, enquanto que seus homólogos são amorfos (BATICH; LEAMY, 2003).
Os polímeros incluem-se dentre os materiais mais utilizados na indústria farmacêutica, dada a sua versatilidade quanto a aplicações e funcionalidades, especialmente na liberação controlada de fármacos (DEE, PULEO; BIZIOS 2002). Diante da importância dos polímeros na produção de medicamentos e cosméticos, faz-se necessário que os
farmacêuticos conheçam mais sobre estes componentes e, que os engenheiros de materiais reconheçam as necessidades específicas do setor (VILLANOVA; ORÉFICE, CUNHA, 2010).
Vários fatores que correlacionam às propriedades do princípio ativo, dos polímeros e dos demais componentes da formulação são determinantes na escolha deste polímero, que vão desde o tipo de formulação até o mecanismo de liberação pretendido (por exemplo, forma de dosagem parenteral ou entérica). Diante disto, os fabricantes procuram proporcionar polímeros com propriedades que possibilitem a sua aplicabilidade em determinadas formulações. Os sistemas de liberação poliméricos são ferramentas de grande importância na indústria farmacêutica utilizados principalmente para se conseguir um controle espacial ou temporal (OLIVEIRA; LIMA, 2006).
A quitosana tem sido utilizada pela indústria farmacêutica como excipiente, quer seja para a compressão direta de comprimidos, como desintegrante de comprimidos para a produção de sistemas de liberação controlada de fármacos ou pra promover a dissolução de fármacos. É evidente que, quando a quitosana é comparada com excipientes tradicionais, para determinados usos, ela tem demonstrado propriedades superiores e maior flexibilidade. Além do mais, quitosana tem sido usada para a produção de esferas e de micro-cápsulas em pesquisas na liberação controlada de fármacos de hormônios. Também tem sido utilizada para distribuição oral e nasal de fármacos polares incluindo peptídeos e proteínas e distribuição de vacinas. Estas propriedades, juntamente com a isenção da toxicidade, fazem da quitosana um promissor excipiente para indústria farmacêutica atual e do futuro (ILLUM, 2008).
3.4 Estrutura Polimérica dos Polissacarídeos
Segundo sua origem, os polímeros são classificados como naturais e sintéticos. Dentre os naturais, estão os polímeros a base de proteínas (colágeno, albumina e gelatina) e os polissacarídeos (quitosana, agarose, alginato, carragenina, ácido hialurônico, dextran e ciclodextrinas). Os polímeros sintéticos podem ser sub-classificados em biodegradáveis (poliéster, polianidrido, poliamidas, polímeros fosforosos e outros) e não biodegradáveis (silicones, acrílicos e outros). Alguns autores têm enfatizado a utilização da quitosana na
liberação controlada de fármacos, embora com enfoque diferenciado ao dado nesta abordagem (SINKO, 2008; OLIVEIRA; LIMA, 2006; TORRES et al.,2005; AGNIHOTRI MALLIKARJUNA; AMINABHAVI, 2004; SINHA et al., 2004). Os polissacarídeos e as proteínas tem sido utilizados extensivamente na liberação controlada de fármacos (OTTENBRITE; FADEEVA, 1994).
Para uma compreensão adequada da nomenclatura empregada na estrutura polimérica dos polissacarídeos, especialmente da quitina e da quitosana, considera-se pertinente um resgate de princípios fundamentais da bioquímica, associada ao assunto. Os monômeros que compõem a estrutura dos polissacarídeos são denominados monossacarídeos e que se caracterizam por serem aldeídos (H-C=O) ou cetonas (-C=O) derivados de polihidroxiálcoois de cadeia linear contendo pelo menos três átomos de carbono. Caso o grupo carbonila seja um aldeído, o composto é chamado de aldose e caso o grupo carbonila seja uma cetona, o composto é chamado cetose (CHAMPE; HARVEY; FERRIER, 2006). A D-Glicose é o exemplo mais conhecido das aldohexoses e a D-frutose é o principal exemplo das cetohexoses e suas respectivas estruturas químicas estão descritas na Figura 6.
Figura 6. D-glicose (aldohexose) e D-frutose (cetohexose) respectivamente Fonte: Adaptado de Ferreira, Rocha e Silva (2009)
De acordo com a convenção de Fischer, um composto é classificado como D, quando o centro assimétrico (quiral) mais afastado do grupo carbonila possui a mesma
configuração absoluta do D-gliceraldeído, ou seja, o –OH no C5 da D-glicose está à direita
na projeção de Fischer.
Na realidade, os monossacarídeos que possuam cinco ou mais átomos de carbono na cadeia, em geral ocorrem em soluções aquosas como estruturas cíclicas, nas quais o grupo carbonila forma uma ligação covalente com o oxigênio de um grupo hidroxila ao longo da mesma cadeia. Sendo assim o composto dá origem a compostos anômeros, ou seja, a um par de estereoisômeros que se diferem em configuração do carbono anomérico em α e β (FIGURA 7). O átomo de carbono carbonila (grupamento aldeídico) ou hemiacetal (grupamento cetônico) que reage com o grupamento álcool é denominado carbono anomérico (CHAMPE; HARVEY; FERRIER, 2006).
Figura 7. Diferenciação da D-glicose em α-D-glicopiranose e β-D-glicopiranose Fonte: Adaptado de Ferreira, Rocha e Silva (2009)
Para a formação do radical glicosamina a hidroxila em C2 do açúcar original é
substituída por um grupo amino, que pode condensar-se, ou não, com o ácido acético formando a N-acetilglicosamina. Desta maneira, fica explicada a estrutura monomérica da
quitina e da quitosana. A Figura 8 apresenta os monômeros glicose, da β-D-glicosamina e do N-acetil-D-β-D-glicosamina.
Figura 8. Semelhança entre a estrutura química da β-D-glicose, da β-D-glicosamina e da
N-acetil-D-glicosamina
Fonte: Adaptado de Ferreira, Rocha e Silva (2009)
Denomina-se ligação glicosídica a ligação covalente que une dois monossacarídeos a partir de um grupo hidroxila de um deles com o átomo de carbono anomérico do outro (FIGURA 9).
Figura 9. Ligação glicosídica entre monômeros da quitina Fonte: Adaptado de Ferreira, Rocha e Silva (2009)
Na nomenclatura dos polissacarídeos, algumas vezes é utilizada a letra “O” precedendo o nome do primeiro monossacarídeo, como lembrete que a união açúcar-açúcar é feita através do átomo de Oxigênio, como por exemplo no caso do O- α-D-glicopiranose (1 4) β-D-glicopiranose. O símbolo (1 4) indica que a ligação glicosídica ocorreu entre o C1 do primeiro monossacarídeo e o C4 do segundo monossacarídeo. As ligações
glicosídicas são facilmente hidrolisadas por ácido, mas resistem à clivagem por base.
No tópico a seguir, será feito um aprofundamento sobre os polímeros quitosana e seu precursor a quitina, para uma melhor compreensão do objeto de estudo do experimento que fundamenta este trabalho.
3.5 Polímeros Naturais: Quitina e Quitosana
O grande interesse de cientistas e tecnólogos pela quitina e a quitosana como materiais poliméricos, com aplicações na área biomédica, advém do fato de que estes polissacarídeos têm características tecnológicas e econômicas relevantes além de apresentarem propriedades biológicas adequadas: são atóxicos, biocompatíveis, biodegradáveis e produzidos por fontes naturais renováveis (DALLAN, 2005; FRAGA et al. 2006; SANTOS et al., 2003; CUI et al., 2008). São derivados de resíduos da indústria da pesca, produzidos a partir do processamento da carapaça dos crustáceos e apresentam um grande valor comercial devido à sua alta porcentagem de nitrogênio (6,89%), quando comparada à celulose substituída sinteticamente (1,25%), tornando-os agentes quelantes (DALLAN, 2005; CRINI; BADOT, 2007). Estima-se que, cerca de 10 bilhões de toneladas de quitina e seus derivados, são produzidos a partir e organismos vivos a cada ano (WONG, 2009).
A quitina e a quitosana podem ser empregadas como biomateriais sob a forma de biofilmes de recobrimento (membranas), soluções coloidais ou esponjas, no tratamento de ferimentos ou queimaduras; na área farmacêutica são bastante utilizados como carreadores de fármacos e na indústria de cosméticos; apresentam várias utilizações na agricultura e na indústria de alimentos. A quitina e/ou seus derivados estão disponíveis comercialmente principalmente para administração por via oral, no auxílio a processos de emagrecimento, o
que reforça seu caráter de baixa toxicidade (DALLAN, 2005; SILVA; SANTOS; FERREIRA, 2006).
A quitina e a quitosana são heteropolímeros ou copolímeros formados a partir dos monômeros (1,4)-2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose e β-(1,4)-2-acetoamino-2-desoxi-D-glicopiranose que se ligam entre si por ligações glicosídicas. A quitosana é obtida pela desacetilação da quitina, mais especificamente do carbono 2 do segundo monômero. Desta forma, quanto à estrutura química, a principal diferença entre a quitina e a quitosana diz respeito à presença do radical acetato, ligado ao radical amino, no carbono 2 que compõe o anel principal da estrutura (CAMPANA FILHO et al., 2007; KUMAR, 2000). Na Figura 10, esta diferenciação pode ser visualizada.
Figura 10. Estrutura química da Quitina e da Quitosana
Fonte: adaptado de CLEASEN, WILHELMS; KULICKE (2006)
Ambos os polímeros exibem propriedades fisico-químicas, biológicas e mecânicas bem interessantes, com grande potencial de aplicações. Várias destas propriedades são relatadas pelo Grau de N-acetilação - GA, que é o mais importante parâmetro de
