UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
BRUNO DO ROSÁRIO CRESPO
Diferenciação genética de populações de Utetheisa ornatrix (Lepidoptera:
Erebidae: Arctiinae)
CAMPINAS
2019
BRUNO DO ROSÁRIO CRESPO
Diferenciação genética de populações de Utetheisa ornatrix (Lepidoptera:
Erebidae: Arctiinae)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do titulo de Mestre em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução.
Este arquivo digital corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno Bruno Do Rosário Crespo e orientado pela prof. Dra. Vera Nisaka Solferini.
Orientadora: Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini
CAMPINAS
2019
Campinas, 25 de julho de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini
Prof. Dr. André Victor Lucci Freitas
Dr. Diomar Verçosa
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradecimentos
Em primeiro lugar, a Deus, que me deu o dom da vida e me chamou à vida intelectual, onde aprendo a amar o conhecimento.
À minha eterna cúmplice, Jessica, por todo o apoio e por me incentivar a buscar meus sonhos, independentemente das dificuldades. É ela meu amparo e minha companheira de todas as horas, que sempre ouve com muita boa vontade minhas histórias sobre o mundo da biolgia e nunca me xingou por criar lagartas em nosso armário.
À minha filha, Maria Teresa, por ser a alegria de meus finais de tarde após os dias de trabalho mais cansativos.
Aos meus pais, Antonio e Célia, pela educação que me proporcionaram desde sempre, pelo incentivo a dedicar minha vida fazendo o que gosto e por terem me apresentado o reino animal. Aos meus irmãos, Mariane e Mateus, com quem divido momentos maravilhosos.
Aos meus padrinhos Cacilda e Pedro, pelo exemplo que me deram desde a infância, e a Luís Fernando, pelos bate-papos e por me ensinar a apreciar o estudo.
Aos meus amigos Bruno, Felipe, Teresa, Rafael, João, Francisco e Josemaria, por seu grande exemplo de vida e por todo apoio que deram, muitas vezes sem nem me esperar procura-los.
Aos meus companheiros do Centro Cultural Castelo, por me ensinarem o verdadeiro valor do trabalho e do estudo.
À Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini, por me aceitar como seu aluno e me orientar nestes anos, dando-me a oportunidade de crescer profissionalmente numa das melhores instituições de ensino e pesquisa do país.
Ao Prof. Dr. José Roberto Trigo (in memoriam), por ter lançado as ideias iniciais para este trabalho e por gentilmente oferecer a estrutura de seu laboratório para a criação dos indivíduos e identificação das plantas hospedeiras.
Aos membros da banca examinadora de minha qualificação e desta defesa, por toda a contribuição dada a este trabalho.
Ao Prof. Dr. André Victor Lucci Freitas, por ter me estimulado desde o primeiro semestre de minha graduação a me aprofundar em meus estudos. Seus ensinamentos estarão sempre gravados em minha memória.
Aos colegas do Laboratório de Diversidade Genética e do Laboratório de Ecologia Química pelos anos de amigável convivência, pelos bate-papos e conselhos. Em especial, agradeço ao Dr. Diomar Verçosa pelo auxílio nas coletas, e à Ma. Wendy Yohana Arroyo Pérez pelo auxílio prestado na análise dos resultados e pela paciência demonstrada ao me ensinar mesmo as coisas mais básicas.
À Célia Bresil por todo o suporte técnico prestado, por sua disponibilidade e paciência e pelas agradáveis conversas do dia-a-dia, que tornaram a rotina de laboratório muito mais leve.
Ao Prof. Dr. Márcio José da Silva, pelo sequenciamento de todas as amostras analisadas.
Agradeço, por fim, a todos que, direta ou indiretamente, também contribuíram com este trabalho e colaboraram para sua realização.
“Há quem busque o saber pos si mesmo, conhecer por conhecer: é uma indigna curiosidade. Há quem busque o saber só para poder exibir-se: é uma indigna vaidade. Estes não escapam à mordaz sátira que diz: ‘Teu saber nada é, se não há outro que saiba
que sabes’. Há quem busque o saber para vendê-lo por dinheiro ou por honras: é um indigno tráfico. Mas há quem busque o saber para edificar, e isto é amor. E há quem
busque o saber para se edificar, e isto é prudência.” (São Bernardo de Claraval)
Resumo
Existem dois mecanismos principais que levam à diferenciação populacional em insetos fitófagos: diferenciação ecológica, associada ao uso e escolha de plantas hospedeiras, e diferenciação geográfica, associada à distância entre as populações no espaço, bem como à existência de barreiras geográficas. Pouco se sabe sobre o papel destas duas fontes de diferenciação, sobretudo na região neotropical. O objetivo desta pesquisa foi obter dados sobre a influência dos fatores ecológicos e geográficos na diferenciação populacional de insetos fitófagos da região neotropical, utilizando
Utetheisa ornatrix (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae) como modelo para os estudos,
devido à sua capacidade de utilizar várias espécies de plantas hospedeiras e sua ampla distribuição geográfica. Indivíduos de U. ornatrix foram coletados no estágio larval e a região mitocondrial COI de 36 indivíduos de 7 localidades foi sequenciada, bem como a região nuclear ITS2 de 30 indivíduos, também em 7 localidades. Foram realizadas análises para avaliar os índices de diversidade e estruturação genéticas, inferir rede de haplótipos, investigar a ocorrência de expansão populacional e comparar grupos genéticos diferentes. Observou-se alta diversidade haplotípica e baixa diversidade nucleotídica na maior parte das populações de U. ornatrix. As redes de haplótipos para ambos os marcadores revelaram um padrão em comum, com um haplótipo central e abundante e outros mais raros, provavelmente derivados deste. Quatro grupos genéticos foram observados, apresentando estruturação genética associada a diferenças na vegetação do litoral e entornos e do interior, que afetam a abundância de plantas hospedeiras nas duas regiões. Não foi encontrada correlação entre as distâncias genéticas e geográficas, indicando que U. ornatrix possui grande capacidade de dispersão. Os testes de neutralidade indicam expansão demográfica recente em U.
ornatrix. Análises de correlação entre distância genética e uso diferencial de plantas
hospedeiras foram positivas apenas para o gene nuclear. Nossos resultados sugerem que
Utetheisa ornatrix passou por expansão populacional acelerada e recente e que, apesar
da grande capacidade de dispersão da espécie, a conectividade entre as populações está condicionada à abundância de plantas hospedeiras em rotas de dispersão.
Abstract
There are two main mechanisms that lead to population differentiation in phytophagous insects: ecological differentiation, which is associated with the use and choice of host plants, and geographic differentiation, which is associated with the distance between populations in space, as well as with the existence of geographical barriers. Little is known about the role of these sources of differentiation, especially in the neotropical region. The aim of this research has been to obtain data about the influence of ecological and geographic factors on the population differentiation of phytophagous insects in the neotropical region, using Utetheisa ornatrix (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae) as a model for the studies due its ability to use several species of host plants and their wide geographic distribution. Individuals of U. ornatrix species were collected in the larval stage and the mitochondrial region COI of 36 individuals from 7 localities were sequenced, as well as the nuclear region ITS2 of 30 individuals, also from 7 localities. Analyses were performed to evaluate genetic diversity and structure indexes, infer haplotype network, investigate the occurence of population increase and compare different genetic groups. High haplotypic diversity and low nucleotide diversity were observed in most of U. ornatrix populations. The haplotype networks from both markers revealed a common pattern, with a central and abundant haplotype and other rare ones, probably derived from the first one. Four genetic groups were observed, presenting genetic structure associated with differences in vegetation on the coast and inland, affecting the abundance of host plants in both regions. No correlation was found between genetic and geographic distances, indicating that U.
ornatrix has great dispersion. Neutrality tests indicate recent demographic range in U. ornatrix. Correlation analyses between genetic distance and differential use of host
plants were positive only for the nuclear gene. Our results suggest that Utetheisa
ornatrix has undergone rapid and recent population increase and, despite the great
dispersion capacity of the species, the connectivity between populations is conditioned by the abundance of host plants on dispersion routes.
Lista de Ilustrações
Figura 1: Indivíduos de Utetheisa ornatrix 16 Figura 2: área de estudo onde foram amostrados os indivíduos de U. ornatrix 20 Figura 3: mapa com os haplótipos encontrados para a região COI nas populações
amostradas 26
Figura 4: mapa com os haplótipos encontrados para o gene ITS2 nas populações
amostradas 26
Figura 5: grupos genéticos inferidos para o gene COI dos indivíduos de
U. ornatrix 27
Figura 6: rede de haplótipos para o marcador COI montada a partir dos grupos
genéticos identificados por análise Bayesiana 27
Figura 7: distribuição dos grupos genéticos para o gene COI nas populações
amostradas 28
Figura 8: grupos genéticos inferidos para o gene ITS2 dos indivíduos de
U. ornatrix 28
Figura 9: rede de haplótipos para o marcador ITS2 montada a partir dos grupos
genéticos identificados por análise Bayesiana 29
Figura 10: distribuição dos grupos genéticos para o gene ITS2 nas populações
amostradas 30
Lista de Tabelas
Tabela 1: número de indivíduos de Utetheisa ornatrix coletados em cada
localidade amostrada 21
Tabela 2: primers utilizados na amplificação das regiões COI e ITS2 22 Tabela 3: índices de diversidade para a região COI 24 Tabela 4: índices de diversidade para a região ITS2 24 Tabela 5: número de indivíduos por haplótipo para os marcadores COI e ITS2 25 Tabela 6: resultados da AMOVA realizada para os quatro grupos indicados
para cada gene através da análise Bayesiana 30
Tabela 7: FST par a par para a região COI nas populações amostradas 31 Tabela 8: FST par a par para a região ITS2 nas populações amostradas 31 Tabela 9: testes de neutralidade para as populações analisadas 33 Tabela 10: testes de neutralidade para os grupos genéticos 34 Tabela 11: resuldados da AMOVA realizada para indivíduos coletados
Sumário
1. INTRODUÇÃO 13
1.1. Diferenciação genética em insetos fitófagos 13
1.2. Espécie estudada: Utetheisa ornatrix 15
2. OBJETIVOS 19
3. MATERIAL E MÉTODOS 19
3.1. Área de estudo 19
3.2. Coleta dos indivíduos 20
3.3 Análise do DNA 21
3.3.1. Extração de DNA total 21
3.3.2. Marcadores utilizados e amplificação dos genes 22
3.3.3. Sequenciamento das regiões COI e ITS2 22
3.4. Análise dos resultados 22
4. RESULTADOS 23
4.1. Diversidade Intrapopulacional 23
4.2. Relações entre os haplótipos 25
4.2.1. Distribuição dos haplótipos nas populações amostradas 25 4.2.2. Análise Bayesiana, AMOVA e Redes de Haplótipos 27
4.3. Estruturação genética interpopulacional 30
4.4. Correlação entre distância genética e distância geográfica 31
4.5. Testes de Neutralidade 32
4.6. Correlação entre distância genética e uso de diferentes espécies de
hospedeiras 34
5. DISCUSSÃO 35
5.1. Diversidade Intrapopulacional 35
5.2. Relações entre os haplótipos 35
5.3. Estrutura Genética Interpopulacional 36
5.4. Correlação entre distância genética e distância geográfica 37
5.5. Testes de Neutralidade 37
5.6. Correlação entre distância genética e uso de diferentes espécies de
hospedeiras 38
6. CONCLUSÕES 39
7. REFERÊNCIAS 40
8. ANEXOS 58
Anexo 1 - Declaração de Bioética e Segurança 58
1. INTRODUÇÃO
1.1. Diferenciação genética em insetos fitófagos
Mecanismos que regulam a diferenciação populacional são um assunto de grande interesse, em especial em populações de insetos fitófagos, uma vez que muitos grupos destes animais constituem pragas agrícolas, além de apresentarem especializações por micro habitats (Price, 1980; Strong et al., 1984; Mitter et al., 1988).
A correspondência taxonômica entre insetos herbívoros e suas plantas hospedeiras foi verificada em uma série de estudos. Além disso, existe uma conexão entre insetos fitófagos e defesas químicas de plantas, que pode ser mais intensa do que a correspondência taxonômica (Janz, 2011; Pyron et al., 2015; Farrel e Mitter, 2017).
Tais padrões seriam consequência de eventos de mudança de hospedeiro, onde alguns indivíduos passam a se alimentar sobre outras espécies de hospedeiras, devido principalmente à pressão exercida por inimigos naturais e competição (Agosta, 2006; Matsubayashi et al., 2010; Zvereva et al., 2010; Takagi, 2014). A partir destes eventos, diferenças em características químicas, ecológicas, morfológicas e fenológicas entre as diferentes plantas utilizadas exerceriam diferentes pressões seletivas sobre os insetos (Via et al., 2000; Funk et al., 2002; Nyman et al., 2010; Ferrari et al., 2012), levando ao isolamento reprodutivo, que eventualmente pode originar espécies distintas, cada uma associada a uma planta diferente (Egan e Funk, 2009; Peccoud et al., 2009; Hendry, 2016; Forbes et al., 2017).
Esta hipótese de diversificação, denominada diferenciação associada ao hospedeiro (HAD), foi verificada em uma série de estudos (Darwell et al., 2014; Leppänen et al., 2014; Medina et al., 2014; Antwi et al., 2015; Zhong et al., 2017; Angelella et al., 2019), dentre eles recebendo atenção os que tratam do díptero
Rhagoletis pomonella e suas plantas hospedeiras (Feder et al., 2003; Velez et al., 2006;
Xie et al., 2008; Rull et al., 2010; Powell et al., 2012, 2014; 2017; Ragland et al., 2015; Mattsson et al., 2015). Tais estudos demostraram um evento de HAD ocorrido em um período de poucas décadas, a partir da introdução de cultivares de maçã na América do Norte, fazendo com que R. pomonella rapidamente se tornasse uma praga agrícola, encontrando-se atualmente em avançado estágio de especiação simpátrica.
Uma segunda hipótese acerca da diferenciação genética em populações de insetos fitófagos, menos discutida, sugere que também podem ser fonte de diferenciação
os fatores geográficos, isto é, as barreiras à dispersão dos indivíduos e a distância geográfica, pois podem restringir o acesso de indivíduos migrantes a determinadas populações, reduzindo o fluxo gênico e promovendo adaptações a condições locais, além de favorecer a deriva genética (Hewitt, 1996; Keller, Nentwig e Largadièr, 2004; Nilce et al., 2019). Nyman et al. (2010) encontraram evidências de que aproximadamente metade dos eventos de especiação em himenópteros da subordem Symphyta envolvem somente eventos de diferenciação geográfica.
O isolamento geográfico pode também determinar diferenças nos processos demográficos experimentados por populações em diferenciação. Quando a imigração é reduzida, pode ocorrer decréscimo no tamanho efetivo da população, levando a um aumento na influência da deriva genética (Gavrilets e Hastings, 1996; Blanquart et al., 2012). Nestes casos, o grau de endogamia será elevado, podendo gerar combinações de alelos e variações fenotípicas que, em populações maiores, seriam eliminados via seleção natural (Flatt, 2005).
Modelos em genética de populações sugerem também que populações geograficamente isoladas e historicamente recentes, ou que tenham passado por intensa redução, podem experimentar mudanças em interações epistáticas entre loci gênicos (Coyne e Orr, 2004; Templeton, 2008). Além disso, observa-se baixa diversidade genética nestas populações, que somente pode aumentar caso ocorram taxas de dispersão e migração.
Todos estes modos não ecológicos de diferenciação provavelmente estão entre as causas da rápida irradiação de certas linhagens de insetos fitófagos, sem que sejam acompanhadas por diferenciação em suas plantas hospedeiras (Lopez-Vaamonde et al., 2006; Menken et al., 2009). Um estudo feito por Imada et al. (2011) utilizando lepidópteros da família Micropterigidae detectou correlação entre diferenciação de linhagens distintas e distância geográfica no Japão, sem quaisquer influências das plantas hospedeiras.
Atualmente, a diferenciação geográfica tem sofrido grande influência da fragmentação de hábitats terrestres, uma vez que esta resulta em perda da conectividade entre populações vizinhas (Saunders et al., 1991; Haila, 2002; Fischer e Lindenmayer, 2007). Insetos especialistas tendem a ser mais sensíveis à variação ambiental (Brouat et
al., 2004), o que faz com que a extensão da fragmentação tenha efeito pronunciado
generalistas tendem a ser mais adaptáveis a tais mudanças e podem não apresentar resposta significativa à fragmentação de seu hábitat original.
No entanto, verificar e quantificar estes efeitos em populações de insetos fitófagos pode ter suas dificuldades, devido principalmente ao tamanho reduzido dos indivíduos, ciclos de vida curtos e comportamentos de dispersão complexos. O uso de marcadores moleculares e inferências genéticas tornaram-se ferramentas populares na investigação de fatores históricos e de padrões de dispersão nestes animais (Brown et
al., 2004; Lawson Handley et al., 2011; Zhong et al., 2017).
Variações na estrutura genética surgem à medida que novas populações são fundadas durante eventos de expansão (Ibrahim et al., 1996) e são moldadas pela migração de indivíduos entre populações diferentes. A variabilidade genética em populações recentes depende do número e origem dos indivíduos fundadores e imigrantes subsequentes (Le Corre e Kremer, 1998; Dlugosch e Parker, 2008; Kaňuch
et al., 2014). Além disso, variações posteriores na diversidade genética entre e dentro de
populações são influenciadas tanto pelo comportamento de dispersão da espécie quanto por fatores ambientais. Se determinada espécie se dispersa de forma gradual e segundo um modelo de “alpondras” (stepping-stone), espera-se encontrar correlação entre a distância geográfica que separa as populações e a distância genética estimada a partir de marcadores genéticos.
Por outro lado, comportamentos de dispersão mais complexos tendem a resultar em um baixo isolamento por distância e uma estrutura genética espacialmente complexa. Isso ocorre, por exemplo com a combinação de eventos raros de dispersão por longa distância, os quais geram populações com baixa diversidade, e eventos frequentes de dispersão por curta distância, como já foi observado em certas espécies que apresentam indivíduos alados e sem asas (Roff, 1986; Nichols e Hewitt, 1994).
1.2. Espécie estudada: Utetheisa ornatrix
Há várias espécies de insetos fitófagos que poderiam contribuir para estudos sobre o tema na região tropical. Utetheisa ornatrix (Figura 1) é um lepidóptero pertencente à família Erebidae, subfamília Arctiinae, tribo Arctiini (Zahiri et al., 2011), encontrada em áreas abertas desde o sul dos Estados Unidos até grande parte da América do Sul (Bezzerides et al., 2004), utilizando diversas espécies de plantas do gênero Crotalaria (Fabaceae) como hospedeiras na região neotropical (Cogni, 2010;
Cogni et al., 2011; Martins et al. 2015), sendo Crotalaria pallida sua principal hospedeira em grande parte de seus locais de ocorrência (Eisner e Meinwald, 1995; Ferro et al., 2006; Cogni et al., 2011).
A. B.
Figura 1: indivíduos de Utetheisa ornatrix. A: larva sobre fruto de Crotalaria pallida; foto: Diomar
Verçosa. B: adulto; foto: Maury J. Heiman, retirada de http://bugguide.net/node/view/358968/bgimage.
O ciclo de vida de U. ornatrix é bem estudado e a espécie tem sido utilizada como modelo para estudos de seleção sexual. Os indivíduos de ambos os sexos dependem de alcaloides pirrolizidínicos (APs) para completar seu desenvolvimento (Eisner e Meinwald, 1995), os quais as larvas obtêm através da alimentação, que consiste em folhas e sementes de suas plantas hospedeiras. Estes alcaloides, somados a outros fatores, possuem efeito tóxico em herbívoros generalistas (Macel, 2010; Trigo, 2010; Cogni e Trigo, 2016), mas U. ornatrix é capaz de metabolizá-los, utilizando-os como defesa contra predadores em todos os estágios do ciclo de vida (Trigo, 2000, 2010; Nishida, 2002; Opitz e Müller, 2009) e na produção de feromônios de corte em machos (Eisner e Menwald, 1995; Conner, 2009; Cogni et al., 2012; Hoina et al., 2012). As fêmeas selecionam as plantas sobre as quais irão ovipor de acordo com a quantidade de APs nas mesmas, pois a capacidade de metabolizá-los varia entre os indivíduos da população (Sourakov e Locascio, 2013). Os ovos recebem APs tanto da fêmea quanto dos machos com quem ela copulou (Dussourd et al., 1988), tornando-se protegidos contra formigas (Hare e Eisner, 1993), besouros coccinelídeos (Dussourd et
Ao nascer, as larvas alimentam-se de folhas até o terceiro instar, quando migram para o interior de frutos verdes e passam a se alimentar das sementes até chegar ao estágio de pupa, sendo que o tempo transcorrido desde o nascimento até a pupa varia de acordo com a quantidade de APs obtidos através da alimentação (Ferro et al., 2006). Além disso, a quantidade de alcaloides obtidos também influencia na eficiência da defesa de larvas e adultos contra predadores (Martins et al., 2015).
Muitos trabalhos utilizam U. ornatrix como organismo modelo para estudos de seleção sexual, devido às complexas estratégias reprodutivas utilizadas pela espécie. Fêmeas são poliândricas, copulando até 22 vezes durante suas três ou quatro semanas de vida adulta (LaMunyon e Eisner, 1993; Iyengar et al., 2001; Long e Sourakov, 2017). Sabe-se que o grau de poliandria das fêmeas é herdável, e que os genes envolvidos nesta característica estão localizados no cromossomo Z e não estão ligados aos que determinam a poliginia nos machos, que também é bastante comum (Iyengar e Reeve, 2010).
Fêmeas atraem os machos utilizando um feromônio próprio. Estes, ao se aproximar, liberam outro feromônio produzido a partir de seus próprios APs, chamado hidroxidanaidal (Iyengar et al., 2001). Além disso, cada macho apresenta à fêmea um espermatóforo contendo nutrientes e APs em quantidade proporcional ao tamanho do corpo (Dussourd et al., 1991; LaMunyon e Eisner, 1994). No entanto, após uma cópula, o macho leva seis ou sete dias para produzir um espermatóforo com quantidade máxima, fazendo com que machos virgens menores possam competir com machos maiores que tenham copulado poucos dias antes.
Fêmeas utilizam tanto os feromônios do macho quanto o espermatóforo como indicativos de seus níveis de APs, selecionando aqueles com os níveis mais altos para copular (Dussourd et al., 1991). Egan et al. (2015) sugerem que, quando fêmeas se acasalam com múltiplos machos, a probabilidade de que seus ovos sejam fecundados por espermatozoides que carreguem genes para um sequestro mais eficiente de APs é maior, ao mesmo tempo em que a característica poliândrica também é transmitida à geração seguinte, resultando em um processo coevolutivo que favorece características reprodutivas de ambos os sexos.
Outro fator que explicaria a poliandria das fêmeas de U. ornatrix, pode ser a incapacidade destas distinguirem machos aparentados de não aparentados (Bezzerides, 2004), bem como machos com quem já acasalaram de machos com quem não
acasalaram (Bezzerides et al., 2008), características que ajudam a explicar a elevada endogamia encontrada por Bezzerides et al. (2004) no primeiro trabalho sobre a estrutura genética da espécie. Assim sendo, quando a fêmea se acasala múltiplas vezes, a probabilidade de que pelo menos um de seus ovos seja fecundado pelo espermatozoide de um indivíduo não aparentado é maior.
Populações de U. ornatrix possivelmente possuem estruturação instável. Em um estudo com microssatélites, Cogni et al. (2011) encontraram diferenciação populacional em amostragem realizada no ano de 2005. No entanto, ao realizar nova amostragem em 2008, não foi detectada nenhuma diferenciação, sendo que nesta última foi feita maior amostragem com o mesmo número de alelos por locus gênico. Mesmo populações amostradas nos dois períodos apresentaram diferenciação somente em 2005. Segundo os autores, isto poderia ser resultado de processos de extinção e recolonização local causados por instabilidades nas populações de Crotalaria pallida, principal hospedeira utilizada por U. ornatrix, que possui distribuição disjunta e está sujeita à ação do fogo e de diversos distúrbios causados por seres humanos. Dessa forma, populações mais recentes de U. ornatrix teriam sua estruturação genética determinada pelos indivíduos fundadores. Com o passar do tempo, a migração de indivíduos entre estas populações e populações mais antigas tenderia a diminuir o grau de diferenciação, tornando as populações como um todo mais homogêneas.
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve por objetivo testar as hipóteses geográfica e ecológica de diferenciação de populações de insetos fitófagos na região neotropical, utilizando
Utetheisa ornatrix, espécie com ampla distribuição e que utiliza várias espécies de
hospedeiras, como modelo para o estudo.
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
1- Investigar, por meio de marcadores mitocondriais e nucleares, a variabilidade genética entre e dentro de populações de Utetheisa ornatrix se alimentando como larva de Crotalaria pallida e Crotalaria vitellina, coletadas nos estados de Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro e São Paulo.
2- Inferir relações entre os haplótipos obtidos e: (1) sua distribuição geográfica e (2) uso diferencial de plantas hospedeiras.
3- Inferir os processos responsáveis pela distribuição atual dos haplótipos na região estudada.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Área de estudo
As plantas hospedeiras de U. ornatrix ocorrem em áreas abertas, estendendo-se por todo o território brasileiro. Os indivíduos foram coletados em oito localidades de uma área entre 18º55’04’’ e 23º13’18’’ de latitude e 57º40’43’’ e 46º46’50’’ de longitude (Figura 2), que compreende regiões do Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro e São Paulo.
Figura 2: área de estudo onde foram amostrados os indivíduos de U. ornatrix. 1 – Paraty (PY); 2 –
Ubatuba (UB); 3 – Pindamonhangaba (PA); 4 – Itanhaém (IM); 5 – Campinas (VG); 6 – Duartina (DT); 7 – Nova Alvorada do Sul (NA); 8 – Campo Grande (CG)
3.2. Coleta dos indivíduos
Os indivíduos de U. ornatrix foram coletados no estágio larval, sobre folhas de
Crotalaria e no interior de seus frutos verdes. Em seguida, foram criados no laboratório,
à base de folhas da planta hospedeira, até seu quinto instar, quando foram colocados no freezer e armazenados em álcool 95% à temperatura de -18ºC por 12 horas e após isso seu DNA foi extraído. A data e número de indivíduos utilizados em cada localidade encontram-se listados na Tabela 1.
Tabela 1: número de indivíduos de Utetheisa ornatrix coletados em cada localidade amostrada.
Localidade Código Número de
Indivíduos
Data da Coleta
Campo Grande – MS CG 12 Mai.2014
Nova Alvorada do Sul – MS NA 12 Mai.2014 Paraty – RJ PY 12 Fev.2014 Campinas – SP VG 11 Mai.2014 Duartina – SP DT 12 Mai.2014 Itanhaém – SP IM 12 Fev.2014 Pindamonhangaba – SP PA 12 Mai.2014 Ubatuba – SP UB 12 Mai.2014 3.3 Análise do DNA
3.3.1. Extração de DNA total
Utilizou-se o protocolo de extração por fenol-clorofórmio, que nos testes apresentou os melhores resultados. Inicialmente o tórax foi macerado individualmente em 600µl de solução de lise e permaneceu em banho-maria a 65ºC por 2 horas. Foram acrescentados então 600µl de solução de fenol e clorofórmio e o produto foi centrifugado a 13500 G por 10 minutos a 24ºC. Este procedimento foi realizado por até três vezes, trocando o fenol + clorofórmio. Foi acrescentado 10µl de acetato de sódio 3M e álcool isopropílico na proporção de 0,54 vezes o volume da solução. O produto final foi deixado a -20ºC overnight. Em seguida, os tubos foram deixados em temperatura ambiente até descongelarem e centrifugados a 13000 G por 6 minutos a 4ºC. Após o descarte do sobrenadante, foram adicionados 600µl de álcool etílico 70% à solução, que foi então centrifugada a 13000 G por 6 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado resultante foi seco em temperatura ambiente e reidratado com 50µl de solução de reidratação de DNA. Após 15 minutos o DNA purificado foi armazenado a -18ºC para evitar degradação do material.
3.3.2. Marcadores utilizados e amplificação dos genes
As análises foram realizadas utilizando-se um marcador mitocondrial (Citocromo Oxidase I – COI) e um nuclear (Internal Transcribed Subunit II, ITS2), de forma a amostrar diferentes porções do genoma.
Para o COI foram utilizadas as combinações de primers listadas na Tabela 2, universais para a amplificação desta região em invertebrados, descritos por Folmer et al. (1994). Os primers escolhidos para o ITS2 foram utilizados com sucesso por Wiemers
et al. (2010) em Lepidoptera.
Tabela 2: primers utilizados na amplificação das regiões COI e ITS2
Gene Nome do primer Sequência do primer Referência
COI LCO1490(f) TAA ACT TCA GGG TGA CCA
AAA AAT CA
Folmer et al. (1994)
HCO2198(r) GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G
ITS2 ITS3 (f) GCA TCG ATG AAG AAC GCA
GC
Wiemers et al (2010)
ITS4 (r) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
3.3.3. Sequenciamento das regiões COI e ITS2
Foram selecionados até seis indivíduos de cada uma das amostras com sucesso na amplificação dos genes e enviados para sequenciamento no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – CBMEG/UNICAMP. Cada uma foi sequenciada no sentido forward e reverse (ver primers na Tabela 2).
3.4. Análise dos resultados
O programa MEGA6 (Tamura et al., 2013) foi utilizado para alinhar as sequências obtidas e também para os cálculos sobre diversidade intra e
interpopulacional, distância genética média e entre pares de populações. Os cálculos de diversidade intrapopulacional, valores de FST geral e a listagem de haplótipos foram feitas utilizando o software DnaSP v5 (Librado e Rozas, 2009). Os índices de diversidade (número de haplótipos, número de sítios polimórficos, diversidade haplotípica e nucleotídica) e FST par a par foram feitos no Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier e Lischer, 2010).
A rede de haplótipos para cada região foi inferida através do algoritmo TCS
Networks (Clement et al. 2002) implementado no programa PopArt 1.6 beta
(http://popart.otago.ac.nz).
A análise Bayesiana de estruturação populacional foi realizada com o programa BAPS 6.0 (Corander e Tang, 2007; Corander et al., 2008). A partir dos grupos genéticos identificados pelo programa realizou-se a análise de variância molecular (AMOVA) através do programa Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier e Lischer, 2010).
O teste de Mantel (1967) foi utilizado para verificar se existe correlação entre as distâncias genéticas e geográficas das populações, utilizando para isso os valores de FST par a par e as coordenadas geográficas de cada localidade.
A análise de alterações demográficas nas populações de U. ornatrix foi feita a partir dos testes de neutralidade D de Tajima (Tajima, 1989) e FS de Fu (Fu, 1997), ambos utilizando o programa Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier e Lischer, 2010).
Para analisar a influência do uso de diferentes plantas hospedeiras na diferenciação genética de U. ornatrix, comparou-se a população de Ubatuba (coletada sobre Crotalaria vitellina) com as demais. A partir dos dados, foi realizada a análise de variância molecular (AMOVA) através do programa Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier e Lischer, 2010).
4. RESULTADOS
4.1. Diversidade Intrapopulacional
As sequências alinhadas finais do marcador COI apresentaram 631 bp, enquanto as do ITS2 apresentaram 313 bp. A maioria das populações apresentaram polimorfismos, com grande frequência de haplótipos exclusivos, sendo 5 o número máximo de haplótipos por população para ambos os marcadores. Foi amostrado um
total de 16 haplótipos para o COI e 13 para o ITS2. Os dados obtidos encontram-se sumarizados nas tabelas 3 e 4.
Das populações amostradas no Mato Grosso do Sul, foram obtidos resultados satisfatórios de amplificação em apenas uma localidade para cada gene estudado: Nova Alvorada do Sul para o COI, Campo Grande para o ITS2. Dessa forma, as análises de cada gene levaram em conta apenas uma população deste estado cada.
Tabela 3: índices de diversidade para a região COI. N = tamanho amostral; H = número de haplótipos; HE = número de haplótipos exclusivos; S = número de sítios polimórficos; Hd = diversidade haplotípica; π = diversidade nucleotídica; .
População N H HE S Hd π PY 6 4 3 9 0,796 0,0076 UB 5 2 0 1 0,600 0,0009 PA 5 5 4 4 1,000 0,0038 IM 5 5 5 22 1,000 0,0173 VG 5 3 1 5 0,700 0,0021 DT 5 1 0 0 0,000 0,0000 NA 5 3 1 2 0,700 0,0013 TOTAL 36 16 14 36 0,748 0,0069
Tabela 4: índices de diversidade para a região ITS2. N = número amostral; H = número de haplótipos; HE = número de haplótipos exclusivos; S = número de sítios polimórficos; Hd = diversidade haplotípica; π = diversidade nucleotídica;
População N H HE S Hd π PY 4 4 3 4 1,000 0,0069 UB 3 2 2 2 0,660 0,0043 PA 5 2 1 3 0,400 0,0038 IM 4 1 0 0 0,000 0,0000 VG 4 3 2 9 0,833 0,0144 DT 5 4 3 35 0,900 0,0537 CG 5 2 1 29 0,400 0,0460 TOTAL 30 13 12 49 0,685 0,0307
4.2. Relações entre os haplótipos
4.2.1. Distribuição dos haplótipos nas populações amostradas
Foram amostrados 16 haplótipos para o marcador COI, nomeados de HM1 a HM16 (Figura 3). O haplótipo HM2 é o mais abundante, ocorrendo em todas as populações, com exceção de Itanhaém. O haplótipo HM5 ocorre em três populações relativamente distantes entre si (Ubatuba, Campinas e Nova Alvorada do Sul), sendo o segundo haplótipo com maior distribuição geográfica. Os catorze haplótipos restantes possuem distribuição geográfica mais restrita, cada um ocorrendo em apenas uma população.
Para o marcador ITS2, foram amostrados 13 haplótipos, nomeados de HN1 a HN13 (figura 4). O haplótipo HN2 foi o mais abundante, ocorrendo em todas as populações, com exceção de Ubatuba. Cada um dos demais haplótipos possui distribuição restrita, ocorrendo em apenas uma população.
O número de indivíduos para cada haplótipo de ambos os marcadores encontra-se listado na tabela 5.
Tabela 5: número de indivíduos por haplótipo para os marcadores COI e ITS2
COI ITS2
Haplótipo Nº de indivíduos Haplótipo Nº de indivíduos
HM1 1 HN1 1 HM2 18 HN2 17 HM3 1 HN3 1 HM4 1 HN4 1 HM5 4 HN5 2 HM6 1 HN6 1 HM7 1 HN7 1 HM8 1 HN8 1 HM9 1 HN9 1 HM10 1 HN10 1 HM11 1 HN11 1 HM12 1 HN12 1 HM13 1 HN13 1 HM14 1 - HM15 1 - HM16 1 - Total 36 Total 33
Figura 3: mapa com os haplótipos encontrados para a região COI nas populações amostradas. À direita,
rede de haplótipos.
Figura 4: mapa com os haplótipos encontrados para o gene ITS2 nas populações amostradas. À direita,
4.2.2. Análise Bayesiana, AMOVA e Redes de Haplótipos
A análise Bayesiana de estruturação populacional agrupou os haplótipos do gene COI em quatro grupos (GM1, GM2, GM3 e GM4) (Figura 7).
Figura 5: grupos genéticos inferidos para o gene COI dos indivíduos de U. ornatrix (K = 4; p = 0,9897).
As cores representam os diferentes grupos (GM1 – vermelho; GM2 – verde; GM3 – azul; GM4 – amarelo) e
cada célula representa um indivíduo.
Figura 6: rede de haplótipos para o marcador COI montada a partir dos grupos genéticos identificados
por análise Bayesiana. Cada traço representa um passo mutacional. A área dos círculos é proporcional à frequência dos haplótipos. 1ind. = 1 indivíduo; 10ind. = 10 indivíduos.
A rede de haplótipos com os grupos inferidos (figura 6) mostra que GM1 possui posição central, tendo inclusos os haplótipos H2 e H5, que são os que apresentam maior distribuição geográfica (figura 3).
A figura 7 representa a distribuição geográfica dos grupos. GM1 é o grupo com maior amplitude geográfica, ocorrendo em todas as populações amostradas, com exceção de Itanhaém. GM2 e GM3 estão restritos a Itanhaém. GM4 abrange apenas alguns indivíduos da população amostrados em Paraty.
Figura 7: distribuição dos grupos genéticos para o gene COI nas populações amostradas.
Para o gene ITS2, a análise Bayesiana também agrupou os haplótipos em quatro grupos genéticos (GN1, GN2, GN3 e GN4) (Figura 8).
Figura 8: grupos genéticos inferidos para o gene ITS2 dos indivíduos de U. ornatrix (K = 4; p = 0,9999).
As cores representam os diferentes grupos (GN1 – roxo; GN2 – marrom; GN3 – laranja; GN4 – azul) e cada
Figura 9: rede de haplótipos para o marcador ITS2 montada a partir dos grupos genéticos identificados
por análise Bayesiana. Cada traço representa um passo mutacional. A área dos círculos é proporcional à frequência dos haplótipos. 1ind. = 1 indivíduo; 10ind. = 10 indivíduos.
A rede de haplótipos com os grupos inferidos (figura 9) mostra que o haplótipo H2, que possui maior distribuição geográfica, pertence a dois grupos distintos (GN1 e GN2). Estes dois grupos não estão separados em ramos diferentes da rede de haplótipos, porém encontram-se geograficamente bem separados. GN3 e GN4 representam linhagens genéticas bem distantes, sendo que o primeiro possui distribuição geográfica bastante restrita.
A figura 10 representa a distribuição geográfica de cada grupo. GN1 abrange todos os indivíduos amostrados em Paraty, Pindamonhangaba e Itanhaém, localidades próximas à Serra do Mar. GN2 e GN4 ocorrem somente nas populações do interior (Campinas, Duartina e Campo Grande). GN3 ocorre somente na população de Ubatuba.
Figura 10: distribuição dos grupos genéticos para o gene ITS2 nas populações amostradas.
Para estudar os grupos genéticos foi realizada uma AMOVA no programa Arlequin, com as configurações padrão e 10000 repetições. Os resultados para os dois marcadores apontam que a maior parte da variabilidade encontra-se entre linhagens genéticas distintas (Tabela 6).
Tabela 6: resultados da AMOVA realizada para os quatro grupos indicados para cada gene através da análise Bayesiana.
Fonte da Variação COI (%) ITS2 (%)
Entre os grupos 80,41 88,77
Entre as populações dentro dos grupos -0,15 0,92
Dentro das populações 19,74 10,31
4.3. Estruturação genética interpopulacional
A estruturação entre as populações foi estimada de acordo com o parâmetro FST. O valor geral foi 0,26072 para o gene COI e 0,46405 para o ITS2, indicando que, em uma macroescala, as populações encontram-se geneticamente bem estruturadas. Os valores par a par encontram-se nas tabelas 7 e 8.
Tabela 7: FST par a par para a região COI nas populações amostradas. Valores significativos em negrito. PY UB PA IM VG DT NA PY 0,0000 UB 0,1750 0,0000 PA 0,2364 0,1279 0,0000 IM 0,3925 0,3933 0,3191 0,0000 VG 0,1336 -0,0484 0,1406 0,3798 0,0000 DT 0,1608 0,2500 0,3333 0,4388 0,0000 0,0000 NA 0,1150 -0,0937 0,1837 0,3980 -0,0606 0,0000 0,0000
Tabela 8: FST par a par para a região ITS2 nas populações amostradas. Valores significativos em negrito. PY UB PA IM VG DT CG PY 0,0000 UB 0,9294 0,0000 PA 0,1074 0,9526 0,0000 IM 0,1333 0,9792 -0,0526 0,0000 VG -0,0256 0,8827 -0,0022 0,0000 0,0000 DT -0,0659 0,5725 -0,0090 -0,0526 -0,0502 0,0000 CG -0,0436 0,6111 0,0000 -0,0526 -0,0338 -0,2264 0,0000
Os valores significativos foram obtidos ao comparar-se populações próximas à Serra do Mar com as demais, indicando baixo fluxo gênico nesta região.
4.4. Correlação entre distância genética e distância geográfica
A fim de testar o efeito da distância geográfica na estruturação genética das populações, realizou-se o Teste de Mantel através do programa Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010). Para isso, construiu-se matrizes de distância genética (dada por valores de FST) pela distância geográfica para ambos os genes. Os gráficos resultantes não indicaram tendência significativa (Figura 11).
Figura 11: gráfico do teste de Mantel. Região COI: R2 = -0,147092, p = 0,635 Região ITS2: R2 = -0,286690, p = 0,971.
4.5. Testes de Neutralidade
Os testes D de Tajima (Tajima, 1989) e FS de Fu (Fu, 1997) foram realizados
com a finalidade de verificar se a evolução das populações se dá de acordo com modelos neutros (Tabela 9).
Os valores significativos indicam que as populações podem ter passado por expansão recente.
Tabela 9: testes de neutralidade para as populações analisadas. D = Teste de Tajima, FS = Teste de Fu. Valores significativos em negrito.
Região População D de Tajima (p) FS de Fu (p)
COI Paraty 1,2971 (0,92) 1,1013 (0,68) Ubatuba 1,2247 (0,95) 0,6261 (0,51) Pindamonhangaba 1,6407 (0,97) -2,6799 (0,009) Itanhaém 0,3090 (0,65) -0,2131 (0,26) Campinas -1,1240 (0,07) 0,6435 (0,60) Duartina 0,0000 0,0000
Nova Alvorada do Sul -0,9726 (0,09) -0,8292 (0,10) Total -1,7730 (0,02) -4,1450 (0,06) ITS2 Paraty -0,0650 (0,57) -1,7409 (0,04) Ubatuba 0,0000 (1,00) 1,0609 (0,59) Pindamonhangaba -1,0485 (0,08) 1,6876 (0,77) Itanhaém 0,0000 0,0000 Campinas -0,8294 (0,11) 1,3431 (0,71) Duartina -1,2502 (0,005) 2,4706 (0,84) Campo Grande -1,2451 (0,01) 8,1221 (1,00) Total -0,8979 (0,18) 1,2540 (0,74)
Os testes também foram realizados dentro dos grupos genéticos identificados pela análise Bayesiana (tabela 10). Resultados negativos significativos foram encontrados nas linhagens GM1, GN1 e GN2, indicando expansão recente nas três.
Tabela 10: testes de neutralidade para os grupos genéticos. D = Teste de Tajima, FS = Teste de Fu. Valores significativos em negrito.
Região População D de Tajima (p) FS de Fu (p)
COI GM1 -0,7893 (0,25) -6,8394 (0,00) GM2 0,0000 (1,00) 1,9459 (0,53) GM3 0,0000 (1,00) 0,9008 (0,42) GM4 0,0000 (1,00) 0,0000 (0,24) ITS2 GN1 -1,7664 (0,03) -1,2906 (0,14) GN2 -1,8935 (0,01) -0,2373 (0,41) GN3 0,0000 (1,00) 1,0609 (0,61) GN4 0,0000 (1,00) 1,0986 (0,43)
4.6. Correlação entre distância genética e uso de diferentes espécies de hospedeiras Para testar a hipótese de diferenciação ecológica em U. ornatrix, foi realizada uma AMOVA no programa Arlequin, com as configurações padrão e 10000 repetições, considerando as duas espécies de hospedeiras coletadas (C. pallida e C. vitellina) como grupos distintos. Apenas os resultados para o ITS2 sugeriram grande variação entre as duas espécies, enquanto para o COI não foi detectada estruturação entre elas, estando a maior parte da variação contida dentro das populações (Tabela 11).
Tabela 11: resultados da AMOVA realizada para indivíduos coletados sobre C. pallida e C. vitellina.
Fonte da Variação COI (%) ITS2 (%)
Entre as plantas hospedeiras -30,30 77,07
Entre as populações dentro das plantas hospedeiras 45,28 -1,15
5. DISCUSSÃO
5.1. Diversidade Intrapopulacional
A maioria das populações de U. ornatrix amostradas apresentaram altos índices de diversidade haplotípica nos genes estudados (tabelas 3 e 4). O número de sítios polimórficos, bem como a diversidade nucleotídica foram mais elevados na população de Itanhaém, para a região COI, e nas de Duartina e Campo Grande, para o ITS2.
Estes dados podem ser explicados pelo fato de que populações de U. ornatrix passam por sucessivos efeitos fundadores devido às variações demográficas de
Crotalaria pallida, sua principal planta hospedeira (Cogni et al., 2011). O surgimento
de novos haplótipos por mutação levaria a um aumento na diversidade haplotípica, mas os sucessivos efeitos fundadores dificultariam o acúmulo de grandes diferenças entre as sequências, o que explicaria a baixa diversidade nucleotídica encontrada na maior parte das populações amostradas.
5.2. Relações entre os haplótipos
As análises de ambos os marcadores revelaram um padrão em comum, apresentando um haplótipo central mais abundante, com ocorrência na maioria das populações, e outros mais raros, geralmente exclusivos e geneticamente semelhantes a este (figuras 3 e 4). Tais resultados são semelhantes aos obtidos em outros estudos sobre lepidópteros (Vandewoestijne et al., 2004; Marques et al., 2014), e indicam que a espécie passou por expansão recente a partir de um pequeno número de fundadores. Segundo esta hipótese, o haplótipo mais comum provavelmente seria o mais antigo, com os outros menos frequentes derivando deste.
No caso de Utetheisa ornatrix, este resultado pode ser reflexo das variações demográficas de suas plantas hospedeiras por fatores tanto ambientais como humanos, uma vez que os hábitats destas, que incluem pastos, terrenos baldios e acostamentos de estradas, estão sujeitos a cortes e queimadas. Isto tornaria processos de extinção, colonização e recolonização bastante frequentes e a espécie passaria por sucessivos efeitos fundadores (Cogni et al., 2011).
A análise Bayesiana identificou quatro grupos genéticos distintos para cada marcador utilizado (figuras 5 e 8). Em ambos, observa-se a ocorrência de grupos restritos a populações litorâneas ou a seu entorno, com os restantes se estendendo desde
o interior do estado de São Paulo até Mato Grosso do Sul (figuras 7 e 10). Os resultados da AMOVA apontam que a maior parte da variabilidade genética da espécie encontra-se entre os grupos genéticos, com pouca variabilidade entre e dentro de populações do mesmo grupo (tabela 6).
Estes resultados podem ser explicados pela diferença entre a vegetação do litoral e entornos e do interior, que levaria a uma diferença na abundância de plantas hospedeiras entre as duas regiões. Segundo dados do IBGE (2012), a região que se estende desde o litoral até o Vale do Paraíba possui vegetação formada por florestas ombrófilas densas, caracterizadas por árvores emergentes de até quarenta metros de altura, densa vegetação arbustiva e elevados índices termo-pluviométricos, diferente do hábitat ocupado por Crotalaria, constituído por campos abertos e ambientes ruderais, o que reduz a disponibilidade de hospedeiras para U. ornatrix nesta região. Isso levaria os indivíduos a apresentar taxas de dispersão e migração mais baixas, gerando grupos genéticos mais restritos.
Por outro lado, a ocorrência de ambientes perturbados em acostamentos de estradas poderia criar rotas de dispersão para U. ornatrix, mesmo no litoral, além de favorecer a dispersão passiva através de veículos, o que poderia explicar a ampla extensão geográfica de GM1, por exemplo. A hipótese de dispersão passiva de lepidópteros já foi hipotetizada em estudos sobre Grapholita (=Cydia) molesta na África do Sul (Timm et al., 2008) e América do Sul (Fuentes-Contreras et al., 2008), sendo esta também uma espécie comumente encontrada em beiras de estradas.
5.3. Estrutura Genética Interpopulacional
Observou-se estruturação geográfica em U. ornatrix, porém é possível que isto seja efeito de variações temporais nas populações de suas plantas hospedeiras, não possuindo relação com a capacidade de dispersão dos indivíduos. Cogni et al. (2011) obervaram estruturação temporária em populações desta espécie, possivelmente determinada pela fundação de novas populações após eventos de extinção local, seguida por migração entre seus indivíduos.
As análises de FST pareados (tabelas 7 e 8) não encontraram muitos valores significativos, indicando que a maioria das populações está conectada por eventos de dispersão. Estudos envolvendo diversas espécies de lepidópteros obtiveram dados semelhantes e a hipótese mais aceita para estes dados é a alta capacidade de dispersão
destes organismos através do voo, o que permitiria intenso fluxo gênico entre as populações (Endersby et al., 2006).
Levando em conta que U. ornatrix possui capacidade de voo e tempo de vida reprodutiva relativamente longo, é possível que alguns indivíduos migrem por longas distâncias. Plantas do gênero Crotalaria ocorrem em manchas que se distribuem por grande parte do território brasileiro, possibilitando a existência de vários locais para oviposição dispersos por uma grande extensão geográfica.
Os valores significativos de FST par a par foram obtidos nas populações de Itanhaém, Pindamonhangaba (ambas pela região COI) e Ubatuba (ITS2), mesmo quando comparadas a localidades próximas. Como já foi discutido, estas localidades encontram-se em regiões de floresta ombrófila densa, onde a disponibilidade de plantas hospedeiras para U. ornatrix é menor. Com isso, os indivíduos tenderiam a se manter nas imediações de sua população de origem, raramente migrando por distâncias maiores.
Maxwell et al. (2014), em um estudo sobre populações do díptero Rhagoletis
indifferens, encontraram padrão semelhante, o qual atribuíram não só à migração de
indivíduos somente entre populações próximas, mas também ao tempo de vida relativamente longo e rápido aumento populacional, fatores estes observados também em U. ornatrix (Bezzerides e Eisner, 2002; Cogni et al., 2011), que favoreceriam a dispersão por longas distâncias em regiões onde há abundância de plantas hospedeiras.
5.4. Correlação entre distância genética e distância geográfica
As análises realizadas por meio do teste de Mantel não encontraram correlação entre a distância genética e geográfica nas populações amostradas (Figura 11). Estes dados, em conjunto com os resultados para o FST entre pares de populações dão suporte à hipótese de que U. ornatrix, da mesma forma que muitas espécies de lepidópteros, possui grande capacidade de dispersão, mantendo a conectividade entre suas populações.
5.5. Testes de Neutralidade
Os valores totais do teste D de Tajima para ambos os marcadores genéticos foram negativos (tabela 9), sendo que apenas o valor da região COI foi significativo, indicando que houve expansão demográfica recente, o que apoia o resultado das
relações encontradas na rede de haplótipos. Marques et al. (2014), em um estudo sobre
Euproctis chrysorrhoea, lepidóptero aparentado a Utetheisa ornatrix, encontrou
resultados semelhantes, inclusive para a rede de haplótipos, chegando às mesmas conclusões.
Analisando-se os grupos genéticos obtidos pela análise Bayesiana (tabela 10), obteve-se resultado semelhante para aqueles com maior extensão geográfica (GM1, GN1 e GN2). As redes de haplótipos nas figuras 6 e 9 mostram que estes grupos incluem o haplótipo mais frequente de cada marcador, além dos haplótipos mais próximos a ele, padrão que indicaria expansão demográfica destes grupos.
Poucos valores significativos foram obtidos por população. Tendo em vista que populações de U. ornatrix possuem estrutura genética instável ao longo do tempo, é possível que algumas populações sejam mais recentes do que outras, o que pode ter gerado uma interferência nas análises.
5.6. Correlação entre distância genética e uso de diferentes espécies de hospedeiras Apenas os resultados para o gene ITS2 indicaram grande variação entre as duas espécies de planta hospedeira (Tabela 11). Porém, todos os indivíduos coletados sobre
Crotalaria vitellina pertencem à população de Ubatuba, onde a vegetação local limita a
capacidade de dispersão de U. ornatrix, tornando possível que a variação encontrada não tenha relação com o uso diferencial de espécies de hospedeiras.
Estes dados são muito semelhantes aos encontrados nas análises do gene COI na população de Itanhaém (Figura 7), com a diferença de que, nesse caso, os indivíduos foram coletados sobre C. pallida, fortalecendo esta última hipótese.
Além de C. pallida e C. vitelina, há várias outras espécies do gênero ocorrendo no Brasil, e sabe-se que determinadas espécies geram defesas mais eficientes contra a predação nos adultos de U. ornatrix (Martins et al., 2015). Dessa forma, mais estudos comparando distância genética e uso de diferentes espécies de Crotalaria por U. ornatrix são necessários para que se tenha dados mais conclusivos sobre a diferenciação associada ao hospedeiro nesta espécie.
6. CONCLUSÕES
As análises de diversidade intrapopulacional, bem como as relações entre os haplótipos e os testes de neutralidade, permitem concluir que Utetheisa ornatrix provavelmente sofreu expansão populacional recente de forma acelerada a partir de um pequeno tamanho efetivo. É possível que este tipo de evento seja comum na espécie, devido às variações demográficas em suas plantas hospedeiras, o que faz com que ocorram sucessivos processos de extinção, colonização e recolonização. Tais conclusões são suportadas por dados de estudos ecológicos sobre a espécie e também sobre outros insetos fitófagos cuja estrutura populacional sofre influência de suas hospedeiras.
Assim como outras espécies de lepidópteros, Utetheisa ornatrix provavelmente possui grande capacidade de dispersão, porém os resultados da AMOVA e FST entre pares de populações mostram que a conectividade entre populações diferentes varia em função da disponibilidade de plantas hospedeiras nas rotas de dispersão. Dessa forma, em ambientes propícios para o crescimento de Crotalaria, as populações de U. ornatrix tendem a estar conectadas por grandes distâncias. Por outro lado, em locais pouco propícios ou altamente sujeitos a distúrbios, a baixa disponibilidade de plantas hospedeiras pode reduzir a conectividade entre as populações, aumentando a diferenciação entre elas. Dessa forma, populações próximas à região litorânea tenderiam a possuir maior grau de diferenciação em relação às demais. Tal fenômeno já foi documentado para outras espécies de insetos fitófagos que possuem características de história de vida semelhantes às de U. ornatrix.
Não foi possível concluir se ocorre diferenciação ecológica em U. ornatrix a partir deste estudo, pois os dados podem ter sofrido influência de fatores geográficos, levantando questões que podem ser respondidas em trabalhos posteriores que analisem populações coletadas sobre uma maior variedade de plantas hospedeiras, incluindo as que compartilham as mesmas localidades que Crotalaria pallida, como Crotalaria
micans e Crotalaria lanceolata .
Outra sugestão para um trabalho futuro é analisar populações em uma extensão geográfica mais ampla para avaliar a influência de fatores geográficos em uma escala maior. Sabe-se que Utetheisa ornatrix já foi coletada em estados da região Sul do Brasil, bem como no Nordeste, porém não há dados comparando populações dentro e entre estas localidades.
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