Helena Debiazi Zomer
DERME VERSUS TECIDO ADIPOSO: INFLUÊNCIA DA FONTE DE CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS EM ENGENHARIA DE TECIDOS PARA O REPARO CUTÂNEO
Tese submetida ao Programa de Biologia Celular e do
Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutora em Biologia Celular e do
Desenvolvimento.
Orientadora: Prof ª. Drª. Andrea Gonçalves Trentin
Coorientadora: Drª. Talita da Silva Jeremias
Florianópolis 2018
A todos os animais que nasceram e morreram pelo progresso da ciência e da medicina.
AGRADECIMENTOS
Estes 4 anos de doutorado envolveram muito trabalho, esforço e dedicação. Nem por isso, considero que foi um período difícil da minha vida. Graças às pessoas que, de alguma forma, colaboraram com esta pesquisa, o tempo passou rápido, leve e feliz. A orientação da Prof. Dra. Andrea Trentin foi, sem dúvida, fundamental para este sentimento de prazer e satisfação do dever cumprido; primeiro, por ser um exemplo para nós, jovens pesquisadoras ambiciosas, que buscamos fazer ciência e inovação de impacto e qualidade, inspirando, com a sua energia, criatividade, liderança e mente empreendedora; segundo, por estabelecer, no LACERT, um ambiente de trabalho saudável, amigável e motivo de orgulho para todos nós, orientandos; e terceiro, pelo seu estilo de orientação que direciona e impulsiona, permitindo-nos ser livres e independentes. Por isto, sou grata a ela e sinto-me preparada para deixar o LACERT e buscar novos desafios. Foi ótimo fazer parte da sua equipe e espero continuar esta colaboração de forma próspera.
Agradeço, também, à minha coorientadora Dra. Talita Jeremias pelas discussões científicas e sugestões durante o desenvolvimento deste projeto. Ao Prof. Dr. Ricardo Garcez, pelas contribuições durante os seminários do LACERT, e aos colegas Priscilla Barros Delben, Débora Oslon, Diana Heck, Bianca Teixeira, Juliano Tibola, Gabriel Petry, Gisele Varela, Maiara Marques, Camila Acorde, Michele Rode e Rafaela Grecco Machado, por toda a ajuda e companhia nestes anos.
Às estagiárias no projeto de extensão sobre o armazenamento de sangue de cordão umbilical, Ana Júlia Gonçalves, Jéssica Andrade e Amanda Martins, e à colaboração do Dr. Aloísio Benedetti. Tenho muito orgulho por ter idealizado, e com a ajuda de vocês, desenvolvido este projeto, o qual tem me ensinado tanto sobre liderança e trabalho em equipe.
Às estagiárias internacionais, Tânia, do México, Mariana e Afrodite, da Grécia, e Maria Carmona, de Portugal, as quais tive o prazer de supervisionar, aprendendo muito sobre suas culturas e apresentando-lhes um pouco da nossa rotina no LACERT.
Agradeço ao apoio técnico do Laboratório Central de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal de Santa Catarina (LCME, UFSC) e do Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB, UFSC), pelas pessoas que lá trabalham e sempre nos atendem com um sorriso no rosto, sempre dispostas a ajudar: Demétrio Alves, Chirle Ferreira, Emily dos Santos, Denis Dall Agnolo e Vanessa Silva da Silva. Agradeço também ao apoio do Instituto Carlos Chagas
(Fiocruz-PR) e ao Dr. Marco Stimamiglio, pela colaboração na análise proteômica e à Dra. Débora Cornélio, pelo treinamento em citogenética.
Aos membros da banca de defesa desta tese, Prof. Dr. Geison Izídio da UFSC, Prof. Hernandes Carvalho (UNICAMP) e em especial, à Dra. Gabriella Di Giunta Funchal, do Departamento de Patologia do Hospital Universitário (HU, UFSC), por disponibilizar o seu tempo, conhecimento, livros e equipamentos para as análises histopatológicas da pele.
Às doadoras anônimas, que disponibilizaram as amostras de pele e tecido adiposo para desenvolvimento deste estudo, aos médicos Prof. Dr Jorge Bins Ely, Dr. Maurício Pereima, Dr. Dilmar Leonardi e Dimitri Cardoso Dimatos e aos residentes do HU, UFSC, Gustavo Walter, Miguel Rodrigues e Diego Silvano, pelo auxílio na obtenção das amostras de tecido e Integra.
Às veterinárias Luciana Honorato e Profa. Dra. Maria Alcina Martins, pelo esclarecimento de dúvidas em relação aos cuidados com os animais de laboratório utilizados nesta pesquisa, e ao Prof. Dr. Jamil Assreuy e Prof. Dr. Paulo Dias por disponibilizarem materiais fundamentais para o projeto.
Ao Prof. Dr. Buddy Ratner, por me receber atenciosamente em seu laboratório na University of Washington (UW), em Seattle, primeiro para uma visita, e depois, como estagiária pelo PDSE. Por separar tempo na sua concorrida agenda, para ouvir e orientar cada um dos seus estudantes. Por me permitir ter a experiência de fazer pesquisa em um centro de inovação de referência mundial e por me mostrar o meu valor, financiando a extensão da minha estadia no seu laboratório. Agradeço também aos colegas e professores daquele laboratório que me acolheram e que tanto me ensinaram, em especial ao Le Zhen, Sharon Creason e Nancy Cooper. Serei eternamente grata por esta oportunidade.
Fora do laboratório, a minha estadia em Seattle foi marcada por anjos que me ajudaram e tornaram o meu dia-a-dia mais fácil e feliz. A Profa. Christina Pettan-Brewer foi um destes anjos. Ela foi uma grande incentivadora durante o meu período na UW e se tornou uma grande amiga. Agradeço, ainda, aos anjos Susan Shepard, que me abrigou em sua casa durante os seis meses nos Estados Unidos e aos vizinhos Laurie Sommerville, High e Rose Williamsom e Ann Cope Sibborn, que me acolheram e me ajudaram tantas vezes e de tantas formas.
Agradeço às minhas amigas-irmãs, Maíra Castro de Sá e Marina Rosa da Fonseca e Sousa, por serem minhas companheiras da vida toda e tornarem os meus dias mais felizes. Às amigas da Equipe Falcão, Gabriela Nardelli, Flávia Brandini e Bruna Salvato, e as amigas Gabriela
Garrido e Debora Schaefer que estão sempre dispostas a me ouvir e ajudar.
Agradeço à minha amada família, por me apoiar e me fazer sentir amada. Em especial, aos meus pais Antonio e Rose, por garantirem o meu conforto e saúde. Aos meus irmãos (de sangue e de coração) Clarissa e Marcelo, por me darem o melhor presente que eu poderia imaginar: ser tia-madrinha do Gabico, e ao Ricardo e Helena, por me fazerem sentir em casa em Brasília. Ao meu marido e melhor amigo, Ronald, por se fazer sempre presente e disposto a me ouvir, entender e auxiliar; por me acompanhar nesta jornada e me fazer crescer; por aguentar comigo os momentos difíceis e vibrar junto nas minhas vitórias. Formamos o melhor time. Agradeço, ainda, ao meu pai e ao meu marido por revisarem a escrita da minha tese e contribuírem com críticas e sugestões. Eu tenho muita sorte e sou muito abençoada por ter esta família em minha vida.
Por fim, agradeço a Deus por todas estas pessoas maravilhosas que Ele colocou em meu caminho, as quais permitiram que esse trabalho fosse possível.
Agradeço pelo apoio financeiro concedido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES), para a bolsa de doutorado e pelo Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE) e Center for Dyalisis Inovation (CDI), para os projetos desenvolvidos durante o estágio na University of Washington, em Seattle, EUA.
RESUMO
Feridas extensas levam a desordens secundárias e até a morte se não estabilizadas rapidamente. Além disso, o processo de cicatrização restaura a homeostase tecidual, mas não a sua funcionalidade. Assim, novas estratégias em engenharia de tecidos são necessárias para acelerar o fechamento de feridas e melhorar a qualidade da cicatrização. As células estromais mesenquimais (MSC, do inglês mesenchymal stromal
cells) obtidas a partir de diferentes tecidos compartilham as
características básicas das células-tronco, como auto-renovação, potencial de diferenciação e imunofenótipo, porém, podem apresentar algumas propriedades distintas. Dessa forma, estudar as diferentes fontes de MSC é importante para o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas. O objetivo desse estudo foi investigar comparativamente a derme e o tecido adiposo como fontes de MSC para uso na cicatrização da pele. As MSC derivadas da derme (DSC, do inglês dermal stromal cells) e do tecido adiposo (ASC, do inglês
adipose stromal cells) foram obtidas a partir de descartes de
abdominoplastias humanas, caracterizadas in vitro e associadas ao substituto dérmico (SD) Integra(Integra Lifesciences) para o tratamento de feridas cutâneas em camundongos C57BL/6. O processo de cicatrização foi clínica e histologicamente avaliado. Depois, os meios condicionados das DSC e ASC (mcDSC e mcASC, respectivamente) foram coletados, caracterizados e testados na cicatrização da pele, comparando os mcDSC e mcASC entre si e com as suas células-fonte. Os resultados demonstraram que o isolamento das ASC tem rendimento cem vezes maior do que o das DSC, entretanto, as últimas apresentam maior potencial proliferativo e de fechamento de lesões in vitro. Ambas compartilham similar imunofenótipo e potencial de diferenciação mesodermal e mantêm uma baixa frequência de alterações nucleares ao longo do tempo em cultura. Tanto as DSC quanto as ASC podem ser adequadamente associadas ao SD Integra e aceleram o fechamento de feridas de pele em camundongos, em comparação com o Integra sem células (controle). Além disso, ambas reduzem a inflamação por meio da polarização de macrófagos e estimulam a angiogênese e o remodelamento da matriz extracelular, levando a cicatrizes de melhor qualidade e mais semelhantes à pele íntegra. Entretanto, o tratamento com DSC se destaca por apresentar melhores resultados em relação ao controle do que as ASC, o que pode estar relacionado à secreção diferencial de proteínas envolvidas no reparo. Embora os mcDSC e mcASC possuam quantidade equivalente de proteínas totais e grande
semelhança na sua composição, o mcDSC apresentou potencial superior de fechamento de lesões in vitro. Já nos ensaios pré-clínicos, ambos os meios condicionados apresentaram potencial equivalente entre si, entretanto, quando comparados às DSC e ASC, eles apresentaram maturação e qualidade geral da cicatrização inferior. Em conjunto, os resultados obtidos demonstraram que as DSC e ASC promovem efeito terapêutico melhor que os seus meios condicionados e que a sua fonte interfere no potencial sobre o reparo cutâneo, todavia, o uso de ambas as MSC é vantajoso em relação ao controle. Assim, as ASC são mais indicadas para tratar feridas agudas graves devido ao seu maior rendimento inicial, enquanto as DSC devem ser consideradas para feridas disfuncionais ou cicatrizes retraídas, por seu melhor potencial de cicatrização. Além disso, o futuro desenvolvimento de bancos alogênicos pode viabilizar o uso das DSC também em casos agudos. .
Palavras-chave: Células-tronco mesenquimais. MSC. Cicatrização. Pele.
ABSTRACT
Dermis versus adipose tissue: influence of the source of mesenchymal stromal cells in tissue engineering for skin wound healing. Extensive wounds lead to secondary disorders and even death if not quickly stabilized. In addition, the healing process restores tissue homeostasis but not its functionality. Thus, new strategies in tissue engineering are needed to accelerate the wound closure and improve the quality of healing. The mesenchymal stromal cells (MSC) isolated from different tissues share the basic characteristics of stem cells, such as self-renewal, differentiation potential and immunophenotype, however, they may have distinct properties. Thus, studying the different sources of MSC is important for the development of future therapeutic strategies. The aim of this study was to comparatively investigate dermis and adipose tissue as sources of MSCs for use in skin wound healing. MSC derived from the dermis (DSC) and adipose tissue (ASC) were obtained from discards of human abdominoplasty, characterized in vitro and associated with the dermal substitute Integra (Integra Lifesciences) for the treatment of cutaneous wounds in C57BL/6 mice. The healing process was clinically and histologically evaluated. Then, the DSC and ASC conditioned medium (mcDSC and mcASC, respectively) were collected, characterized and tested on skin wound healing by comparing the mcDSC and mcASC with each other and with their derived cells. The results demonstrated that the ASC isolation is 100-fold more efficient than the DSC, however, the latter have a higher proliferative and wound closure potential in vitro. Both share the basic characteristics of MSC such as immunophenotype and mesodermal differentiation potential and remain with a low frequency of nuclear alterations over time in culture. Both DSC and ASC were properly associated with the Integra and accelerate the closure of skin wounds in mice compared to Integra without cells (control). In addition, both DSC and ASC reduce inflammation through macrophage polarization and stimulate angiogenesis and remodeling of the extracellular matrix, leading to scars of better quality and more similar to intact skin. However, DSC treatment stands out due to its improved results in relation to the control than the ASC, which can be explained by the differential secretion of proteins involved in the repair. Although mcDSC and mcASC have equivalent amount of total protein and great similarity in their composition, mcDSC induced superior wound closure in vitro. In the pre-clinical trial, both conditioned medium presented equivalent potential, however, when compared to DSC and ASC, they presented
lower maturation and general quality of healing. Taken together, the results demonstrate that DSC and ASC promote improved therapeutic effect than their conditioned medium and their source interferes in the potential of cutaneous repair. However, the use of both MSC is advantageous in relation to the control. In conclusion, the ASC are suggested for treating critical acute wounds due to their greater isolation efficiency, while DSC should be considered for dysfunctional wounds or retracted scars due to their improved healing potential. In addition, the future development of alogenic banks may allow the use of DSC in acute wounds.
Keywords: Mesenchymal stem cells. MSC. Cutaneous repair.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fases do reparo tecidual. ... 31
Figura 2: Particularidades interespecíficas da pele em humanos e camundongos.. ... 35
Figura 3: Mecanismos de ação das MSC no reparo tecidual cutâneo.. . 43
Figura 4: Avaliação clínica e histopatológica da cicatrização. ... 63
Figura 5: Avaliação clínica e histopatológica do ensaio pré-clínico II.. 71
Figura 6: Isolamento das DSC e ASC. a) Esquema representativo do isolamento das DSC e ASC. ... 74
Figura 7: Unidades formadoras de colônias.. ... 75
Figura 8: Perfil proliferativo das DSC e ASC.. ... 76
Figura 9: Perfil fenotípico. ... 78
Figura 10: Potencial de diferenciação adipogênico, osteogênico e condrogênico.. ... 79
Figura 11: Estabilidade genética das DSC e ASC. ... 80
Figura 12: Ensaio de fechamento de lesões in vitro. ... 81
Figura 13: Associação das DSC e ASC ao Integra. ... 82
Figura 14: Variação do peso ao longo do processo de cicatrização. ... 84
Figura 15: Avaliação clínica do fechamento das lesões.. ... 86
Figura 16: Infiltração celular no SD e bordos da lesão. ... 87
Figura 17: Rastreamento das células transplantadas. ... 89
Figura 18: Tecido de granulação.. ... 90
Figura 19: Angiogênese. ... 91
Figura 20: Reepitelização. ... 93
Figura 21: Degradação do Integra.. ... 94
Figura 22: Deposição e organização de colágeno. ... 95
Figura 23: Proporção de colágenos I e III. ... 97
Figura 24: Fibras elásticas. ... 98
Figura 25: Presença de apêndices cutâneos. ... 99
Figura 26: Macrófagos totais aos 3 e 21 dias. ... 100
Figura 27: Imunohistoquímica fluorescente para macrófagos M1. ... 101
Figura 28: Imunohistoquímica fluorescente para macrófagos M2.. .... 102
Figura 29: Polarização de macrófagos.. ... 103
Figura 30: Esquema representativo sumarizando os resultados obtidos no ensaio pré-clínico I. ... 105
Figura 31: Obtenção e quantificação proteica dos meios condicionados. ... 107
Figura 32: Análise proteômica.. ... 108
Figura 33: Heatmaps da intensidade LFQ de proteínas nos mcDSC e mcASC. ... 111
Figura 34: Indução do fechamento de lesões in vitro por mcDSC e
mcASC. ... 113
Figura 35: Variação do peso ao longo do processo de cicatrização. ... 114
Figura 36: Avaliação clínica do fechamento das lesões. ... 116
Figura 37: Aspecto do enxerto. ... 117
Figura 38: Infiltração celular no SD... 118
Figura 39: Espessura e homogeneidade da neoepiderme. ... 119
Figura 40: Degradação do SD. ... 120
Figura 41: Presença de apêndices cutâneos. ... 121
Figura 42: Esquema representativo sumarizando os resultados obtidos no ensaio pré-clínico II. ... 122
Figura 43: Hipótese do mecanismo de ação das MSC via polarização de macrófagos.. ... 142
Figura 44: Resumo do estudo comparativo das DSC e ASC in vitro e in vivo. ... 143
Figura 45: Esquema representativo da possível relação entre diferentes dados. ... 151
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Principais fatores conhecidos com ação sobre o reparo tecidual cutâneo, secretados por ASC e DSC... 44 Quadro 2: Informações sobre os anticorpos utilizados. ... 57 Quadro 3: Corantes e marcadores utilizados para análises
histopatológicas. ... 64 Quadro 4: Informações sobre os anticorpos utilizados em
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Delineamento experimental I. ... 62 Tabela 2: Delineamento experimental II. ... 71 Tabela 3: Proteínas diferencialmente expressas no mcDSC ou mcASC
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3D Tridimensional
3T3 Linhagem de fibroblastos embrionários murinos A2M Alfa-2-Macroglobulina
ABI3BP Proteína de ligação ao membro 3 da família ABI ANGPT1 Angiopoietina-1
ANGPTL2 Proteína relacionada à angiopoeitina-2 ANOVA Análise de variância
ANXA Anexina A
ASC Células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo
BCA Ácido bicinconínico
BMP Proteína morfogenética óssea
CAPES Coordenação de Pessoa de Nível Superior
CCBE1 Proteína 1 contendo o colágeno e cálcio ligado ao EFG CDI Center for Dyalisis Inovation
CFL1 Cofilina-1
CFU Formação de colônias fibroblastóides CHI3L1 Proteína semelhante a quitinase-3 1
COL15A1 Cadeia de colágeno alfa-1 (XV) - Restina 1,2,3,4 COL5A1 Cadeia de colágeno alfa-1 (V)
COMP Proteína oligomérica de matriz de cartilagem CSF-1 Fator estimulador de colônias de macrófagos 1 CTE Células-tronco embrionárias
Cyr61 Proteína rica em cisteína DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol DDX42 RNA helicase dependente de ATP DECTs γδ Células dendrítica epidermais T γδ
DMEM Dulbecco modification of Minimum Essential Media DMSO Dimetilsulfóxido
DP Desvio padrão
DSC Células estromais mesenquimais derivadas da derme ECM2 Proteína de matriz extracelular 2
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EGF Fator de crescimento epidermal
EIF3D Fator 3 subunidades D de iniciação da translação eucariótica
FERMT2 Homólogo 2 da família da fermitina FGF Fator de crescimento de fibroblastos FITC Isotiocianato de fluorosceína
GFP Proteína verde fluorescente GREM1/2 Gremlin ½
HDGF Fator de crescimento hepatoma-derivado HE Hematoxilina e eosina
HGF Fator de crescimento de hepatócitos HSPG2
Proteína do núcleo proteoglicano de heparansulfato específico da membrana
de base / endorepellina HU Hospital Universitário
HUVEC Células endoteliais de veia umbilical humana
IFN Inferferon
IGF Fator de crescimento semelhante à insulina
IGFBP Proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante a insulina
IL Interleucina
IL4I1 L-aminoácido oxidase iNOS Óxido nítrico sintase induzida iPS Células de pluripotência induzida
IQGAP2 Proteína do tipo ativadora de Ras GTPase ISCT International Society for Cellular Therapy KGF Fator de crescimento de queratinócitos
LACERT Laboratório de células-tronco e regeneração tecidual LAMA1 Laminina subunidade alfa 1
LAMEB Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia LCME Laboratório Central de Microscopia Eletrônica LFQ Label free quantification
LIF Fator inibitório da leucemia
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno mcASC Meio condicionado de ASC
mcDSC Meio condicionado de DSC
MCP Proteína quimioatrativa de monócitos MEC Matriz extracelular
MHC Complexo principal de histocompatibilidade MMP Metaloproteinase de matriz
MMR Receptor de manose de macrófagos MSC Células estromais mesenquimais
MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil bromo tetrazólico MYDGF Fator de crescimento mieloide-derivado
NIH National Institute of Health
NOV Nefroblastoma superexpresso, também conhecido como IGFBP-9
PARP1 Poli [ADP-ribose] polimerase 1 PBS Solução salina fosfatase PCDH7 Protocaderina-7
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
PDGFRA Receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas
PDGFRB Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas
PDSE Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior
PE Ficoeritrina
PE-Cy5 Ficoeritrina-cianina
PerCP Proteína peridinina-clorofila PGE2 Prostaglandina E2
PLAU Ativador do plasminogênio do tipo uroquinase PTGIS Prostaciclin sintase
RARRES Proteína de resposta ao receptor de ácido retinoico
SBSN Suprabasina
SEMA7A Semaforina-7ª
SERPINA1 Inibidor de proteinase alfa 1 SERPINB1 Inibidor da elastase de leucócitos SERPINB2 Inibidor do ativador do plasminogênio 2 SERPINB6 Serpina B6
SERPINB7 Serpina B7
SERPINE1 Inibidor do ativador do plasminogênio 1 SERPINE2 Nexina derivada da glia
SERPINF1 Fator derivado do epitélio pigmentar SERPING1 Inibidor de protease plasmática C1 SFB Soro fetal bovino
SLIT2 Proteína homóloga a SLIT 2 SPARC Osteonectina
STAT1 Transdutor de sinal e ativador de transcrição TGF Fator de crescimento transformador
TGFBI Proteína indutora do fator de crescimento transformador beta
TGFBR3 Receptor do fator de crescimento transformador beta tipo 3
THBS2 Trombospondina 2
TIMP Inibidora de metaloproteínase TNF Fator de necrose tumoral TNFAIP6 ou
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina VCAN Proteína do núcleo do versican
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 29 1.1 PELE E CICATRIZAÇÃO ... 29
1.2 O CAMUNDONGO COMO MODELO EXPERIMENTAL DE
REPARO CUTÂNEO ... ...34 1.3 ENGENHARIA DE TECIDOS PARA A REGENERAÇÃO
DA PELE ... 36 1.4 CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS ... 38 1.5 MEIO CONDICIONADO DE CÉLULAS ESTROMAIS
MESENQUIMAIS ... 43 2. HIPÓTESE ... 47 3. OBJETIVOS ... 49 GERAL ... 49 ESPECÍFICOS ... 49 4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 51 5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 53 OBTENÇÃO DAS CÉLULAS ... 53 EXPANSÃO CELULAR ... 54 CRIOPRESERVAÇÃO ... 54 RENDIMENTO DE ISOLAMENTO ... 55 PERFIL MORFOLÓGICO E CLONOGÊNICO ... 55 PERFIL PROLIFERATIVO ... 55 PERFIL FENOTÍPICO ... 56 POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO ... 57 Diferenciação adipogênica... 57 Diferenciação osteogênica ... 57 Diferenciação condrogênica ... 58 ESTABILIDADE GENÉTICA ... 58 POTENCIAL DE CICATRIZAÇÃO DE LESÕES IN VITRO .. ...59 ASSOCIAÇÃO DAS DSC E ASC AO INTEGRA ... 59 Adesão e morfologia ... 59 Migração celular ... 60 Viabilidade celular ... 60 Retenção celular ... 61 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS ... 61 INDUÇÃO DA LESÃO E TRATAMENTOS ... 61 AVALIAÇÃO CLÍNICA DO REPARO TECIDUAL ... 62 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO REPARO
Infiltração celular ... 64 Rastreamento das células transplantadas ... 64 Espessura do tecido de granulação ... 65 Angiogênese ... 65 Reepitelização ... 66 Degradação do SD ... 66 Organização e deposição de colágeno ... 66 Proporção de colágenos I e III ... 67 Fibras elásticas ... 67 Presença de apêndices cutâneos ... 67 Polarização de macrófagos ... 67 OBTENÇÃO DOS MEIOS CONDICIONADOS ... 68 QUANTIFICAÇÃO DOS MEIOS CONDICIONADOS ... 68 PROTEÔMICA ... 69 INDUÇÃO DE FECHAMENTO DE LESÕES IN VITRO PELOS MEIOS CONDICIONADOS ... 70 EFEITO DOS MEIOS CONDICIONADOS NO REPARO CUTÂNEO ... 70 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 71 6. RESULTADOS ... 73
O ISOLAMENTO DAS ASC É MAIS EFICIENTE DO QUE O DAS DSC ... 73 DSC E ASC SÃO EQUIVALENTES QUANTO À
MORFOLOGIA E POTENCIAL CLONOGÊNICO ... 75 AS DSC SÃO MAIS PROLIFERATIVAS DO QUE AS ASC
IN VITRO ... 75
AS DSC E ASC SÃO EQUIVALENTES QUANTO AO PERFIL FENOTÍPICO... 77 AS DSC E ASC SÃO EQUIVALENTES QUANTO AO POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO ... 78 AS DSC E ASC APRESENTAM BAIXA FREQUÊNCIA DE ALTERAÇÕES NUCLEARES ... 79 AS DSC APRESENTAM POTENCIAL DE FECHAMENTO DE LESÕES IN VITRO MAIOR DO QUE AS ASC ... 80 O INTEGRA SUPORTA A ADESÃO E PROLIFERAÇÃO DAS DSC E ASC ... 81 ENSAIO PRÉ-CLÍNICO I ... 83 6.9.1 Os tratamentos não interferem no peso dos animais ... 83 6.9.2 As DSC e ASC aceleram o fechamento de feridas ... 84 6.9.3 Grupos tratados com DSC ou ASC apresentam maior
6.9.4 Rastreamento das células transplantadas ... 88 6.9.5 Animais tratados com DSC desenvolvem tecido de
granulação mais espesso do que os controles ... 90 6.9.6 As DSC e ASC estimulam a angiogênese ... 91 6.9.7 Grupos tratados com DSC e ASC apresentam neoepiderme
semelhante à epiderme íntegra ... 92 6.9.8 As DSC aceleram a degradação do Integra ... 94 6.9.9 Animais tratados com DSC apresentam organização e
deposição de colágeno semelhante à pele íntegra ... 94 6.9.10 Animais tratados com DSC e ASC apresentam proporção
de colágenos I e III semelhante à pele íntegra ... 96 6.9.11 Animais tratados com DSC ou ASC apresentam mais fibras elásticas que o controle ... 97 6.9.12 As DSC estimulam o desenvolvimento de apêndices
cutâneos...98 6.9.13 DSC e ASC reduzem a inflamação e influenciam a
polarização de macrófagos ... 99 6.9.14 Resumo dos resultados obtidos no ensaio pré-clínico I. ... 104 OS MCDSC E MCASC APRESENTAM CONCENTRAÇÃO VARIADA DE PROTEÍNAS TOTAIS ... 106 OS MCDSC E MCASC APRESENTAM COMPOSIÇÃO SEMELHANTE, MAS COM ALGUMAS
PARTICULARIDADES ... 107 O MCDSC APRESENTA POTENCIAL DE FECHAMENTO DE LESÕES IN VITRO MAIOR DO QUE O MCASC E O CONTROLE ... 112 ENSAIO PRÉ-CLÍNICO II ... 113 Os tratamentos não interferem no peso dos animais ... 113 Os mcDSC e mcASC possuem potencial de fechamento de feridas semelhante entre si e inferior aos das respectivas células-fonte ... 115 O aspecto dos enxertos foi semelhante entre todos os grupos ... 116 O número de células infiltradas no SD na fase inflamatória foi maior nos animais tratados com o mcASC do que naqueles tratados com o mcDSC ... 117 Grupos tratados com os meios condicionados apresentam neoepiderme semelhante entre si e mais espessa que os tratados com as suas respectivas células-fonte ... 118 Grupos tratados com os meios condicionados apresentam degradação semelhante do SD, mas inferior às células .... 120
A presença de apêndices cutâneos foi semelhante entre os grupos ... 121 Resumo dos resultados obtidos no ensaio pré-clínico II. .. 121 7. DISCUSSÃO ... 123 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS MSC ... 123 ESTUDO FUNCIONAL IN VITRO ... 127 ENSAIO PRÉ-CLÍNICO I ... 129 Avaliação clínica ... 129 Fase inflamatória ... 131 Fase proliferativa ... 133 Fase de remodelamento ... 134 Polarização de macrófagos ... 139 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS MEIOS
CONDICIONADOS ... 143 ESTUDO FUNCIONAL DOS MEIOS CONDICIONADOS IN
VITRO ... 146
ENSAIO PRÉ-CLÍNICO II ... 147 Avaliação clínica ... 147 Avaliação histopatológica ... 148 RELAÇÕES ... 150 LIMITAÇÕES, QUESTIONAMENTOS E PERSPECTIVAS CLÍNICAS ... 151 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 157 REFERÊNCIAS ... 159 APÊNDICE A – MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 183 APÊNDICE B – ENSAIO PILOTO ... 185 APÊNDICE C - PROTOCOLO DE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA POLARIZAÇÃO DE MACRÓFAGOS ... 187 APÊNDICE D - PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS NO MCDSC OU MCASC ... 191 APÊNDICE E - PRODUÇÃO CIENTÍFICA ... 193 ANEXO A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM SERES HUMANOS ... 197 ANEXO B - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS...201
1. INTRODUÇÃO
1.1 PELE E CICATRIZAÇÃO
A pele recobre todo o corpo humano, consistindo na primeira barreira de proteção do organismo. Ela é responsável pela defesa do corpo contra atritos, lesões e penetração de agentes injuriantes, além de evitar a perda de água, auxiliar na termorregulação, auxiliar na transmição de sensações recebidas do ambiente para o sistema nervoso central e realizar a proteção contra os raios ultravioleta, absorvendo-os e sintetizando vitamina D (VOLK; IQBAL; BAYAT, 2013; ELDER, 2014) Desta forma, a manutenção de sua integridade é fundamental para garantir a homeostase do organismo, além de evitar a entrada de microrganismos e a perda de líquidos essenciais (KIM et al., 2011; BADDOUR; SOUSOUNIS; TSONIS, 2012; VOLK; IQBAL; BAYAT, 2013).
A pele é constituída externamente pela epiderme e internamente pela derme. A epiderme é composta por queratinócitos que formam um epitélio estratificado pavimentoso, além de melanócitos e células de Langerhans e de Merkel. A epiderme é delimitada pela lâmina basal, que une a epiderme à derme. A derme consiste em uma camada de tecido conjuntivo, composta principalmente por fibroblastos e uma matriz extracelular rica em colágeno (ELDER, 2014). Na região da derme, encontram-se vasos sanguíneos e linfáticos, glândulas sebáceas e sudoríparas e terminações nervosas, além de folículos pilosos originados a partir de invaginações da epiderme. Assim, a derme confere integridade estrutural, elasticidade e nutrição para a pele (SUPP; BOYCE, 2005). Logo abaixo da pele, encontra-se a tela subcutânea, composta por tecido conjuntivo frouxo e tecido adiposo (KAMEL et al., 2013).
Durante o desenvolvimento, o folheto germinativo ectodérmico dá origem à epiderme, enquanto o folheto mesodérmico origina a derme e a tela subcutânea. Existe uma exceção em algumas regiões da cabeça e pescoço, onde células da crista neural dão origem à derme e tela subcutânea (DANI; BILLON, 2012).
A pele, por estar exposta ao meio ambiente, é constantemente desafiada por uma ampla variedade de fatores externos, sendo altamente susceptível a traumas(KIM et al., 2011). Neste contexto, um complexo mecanismo intra e intercelular de proteção e de recuperação da
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homeostasia tecidual é desencadeado quando ocorrem danos a sua estrutura (LEAVITT et al., 2016).
O reparo tecidual pode ocorrer por meio do processo de regeneração, com a recomposição da funcionalidade do tecido, ou de cicatrização, com o restabelecimento da sua homeostasia, porém com perda de atividade funcional. A regeneração da pele, em humanos, é descrita apenas em estágio fetal EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014; HU et al., 2014). A capacidade regenerativa fetal ainda é pouco explicada, entretanto, sugere-se que a ausência da inflamação no ambiente intrauterino seja relevante para esse desfecho (HU et al., 2014). Em adultos essa capacidade é limitada, possivelmente, pela rápida deposição de tecido fibrótico no sítio de injúria, desencadeada pela inflamação local (EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014). Sugere-se que para o processo de reparo resultar em regeneração, ao invés de cicatrização, a rápida resposta fibrótica precisa ser retardada, para permitir que células-tronco multipotentes e progenitoras, presentes no tecido, possam efetuar a regeneração (GURTNER et al., 2008). De qualquer forma, acredita-se que o rápido desenvolvimento da cicatriz confere uma vantagem de sobrevivência pela prevenção de infecções sistêmicas (KISHI et al., 2012).
Dessa forma, a reparação tecidual envolve uma cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a repavimentação e a reconstituição do tecido, consistindo em três fases distintas, porém parcialmente sobrepostas: inflamação, proliferação e remodelamento (Figura 1) (CHERUBINO et al., 2011). Alguns autores dividem o processo em quatro partes, adicionando, inicialmente, uma fase de homeostase tecidual (CHEN et al., 2015).
O primeiro estágio do reparo se inicia logo após o dano tecidual, envolvendo a cascata de coagulação sanguínea, vias inflamatórias e sistema imune. Inicialmente, a homeostasia do tecido é alcançada pela formação de um plug plaquetário, seguido pelo desenvolvimento de uma matriz de fibrina, que consiste na primeira estrutura por onde as células inflamatórias vão se infiltrar (GURTNER et al., 2008; EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014). As plaquetas liberam fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de necrose tumoral α (TNF-α), e interleucina 1 (IL-1), que atuam recrutando neutrófilos para o sítio de lesão, iniciando o debridamento e regulando a expressão de moléculas de adesão. Após 2 a 3 dias, monócitos vindos da circulação chegam ao local e se diferenciam em macrófagos, e associados aos macrófagos teciduais reforçam o debridamento e liberam mais citocinas, como o
fator estimulador de colônias de macrófagos 1 (CSF-1), TNF-α e PDGF (HU et al., 2014).
Figura 1: Fases do reparo tecidual. O gráfico mostra os estágios do reparo tecidual: inflamação, proliferação e remodelamento, desde o estabelecimento da lesão até total cicatrização, no decorrer do tempo. As linhas pontilhadas mostram a participação de plaquetas, colágeno e células durante o processo. Abaixo do gráfico encontra-se a representação das fases do reparo, ressaltando os fatores secretados pelas células envolvidas na cicatrização.
Adaptado a partir de Zomer e Trentin, (2018).
Siglas e abreviações: TGF: fator de crescimento transformador; PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas, TNF-α: fator de necrose tumoral α, IL-1: interleucina 1, CSF-1: Fator estimulador de colônias de macrófagos 1; VEGF: fator de crescimento vascular endotelial, EGF: fator de crescimento epidermal, IGFs: fator de crescimento semelhante à insulina, IFNs: interferons, HGFs: fator de crescimento de hepatócitos, FGFs: fator de crescimento de fibroblastos, MMPs: metaloproteinases, TIMPs: inibidoras de metaloproteinases.
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O segundo estágio do reparo, proliferação, ocorre entre 2 e 10 dias após a lesão, sendo caracterizado pela proliferação e migração de diferentes tipos celulares. Estimulados por fatores como o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2) e fator de crescimento epidermal (EGF), queratinócitos dos bordos da lesão começam a proliferar e migrar sobre a derme afetada (EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014; LI et al., 2017). Novos vasos sanguíneos se formam por um processo chamado de angiogênese, o qual é regulado pelo fator de crescimento vascular endotelial A (VEGF-A), FGF-2 e outros. Os capilares neoformados se espalham, levando nutrientes e oxigenação para fibroblastos e macrófagos, os quais substituem a matriz de fibrina por um tecido de granulação, formando um substrato para a migração dos queratinócitos, até que estes restaurem a barreira epitelial, processo chamado de reepitelização (GURTNER et al., 2008).
Em um estágio mais tardio da fase proliferativa, fibroblastos atraídos a partir dos bordos da lesão e derivados de células-tronco são estimulados por TGF-β e outros fatores secretados por macrófagos a se diferenciarem em miofibroblastos (KIM; MUSTOE; CLARK, 2015). Os miofibroblastos são células contráteis que atuam unindo os bordos da lesão. Tanto os fibroblastos como os miofibroblastos interagem produzindo matriz extracelular, principalmente na forma de colágeno III (GURTNER et al., 2008).
A terceira fase do reparo tecidual, o remodelamento, se inicia entre 2 e 3 semanas após a injúria, e pode perdurar por mais de um ano. Nesse processo, os macrófagos dão suporte à maturação dos tecidos por meio da reorganização da matriz extracelular e vasos e da formação do tecido cicatricial(SICA et al., 2015). As metaloproteínases (MMPs) e suas inibidoras (TIMPs) atuam remodelando a matriz cicatricial, substituindo o colágeno III, característico da cicatriz imatura, por colágeno I, mais resistente e predominante na cicatriz madura (CHENG et al., 2011; WANG et al., 2017). Durante esse estágio, todos os processos ativados após a lesão diminuem e cessam. A maioria das células endoteliais, macrófagos e miofibroblastos entram em apoptose ou deixam o local, resultando em uma massa fibrótica caracterizada por colágeno e outras proteínas de matriz extracelular, contendo apenas poucas células (GREAVES et al., 2013).
Os macrófagos, componentes fundamentais da imunidade inata, desempenham múltiplas funções durante todas as fases do reparo tecidual(HU et al., 2010). Apesar de serem essenciais para o correto desfecho do processo de cicatrização, a sua presença em longo prazo ou
desregulação funcional pode resultar em falhas no reparo ou fibroses (SUSSMAN et al., 2014; SICA et al., 2015). Essas consequências são explicadas pela alta plasticidade dos macrófagos, que podem desempenhar funções de inibição ou de estímulo à proliferação celular e reparo tecidual, dependendo da situação(WANG; LIANG; ZEN, 2014). Essa heterogeneidade funcional não resulta, apenas, de diferenças morfológicas, mas, principalmente, da expressão diferencial de genes, induzidos pela sinalização local (SICA et al., 2015). Os principais padrões descritos (ou polarizações) são os fenótipos M1 (ativação clássica, pró-inflamatória) e M2 (ativação alternativa, pró-reparo) (BARROS et al., 2013). Durante as diferentes fases do reparo, os macrófagos passam por mudanças dinâmicas: macrófagos M1 são essenciais para iniciar a resposta inflamatória após uma lesão, entretanto, a diferenciação para o fenótipo M2 parece ser fundamental para a resolução da inflamação e a regeneração dos tecidos lesados (GORDON, 2003; BROWN et al., 2012).
Dessa forma, o processo de reparo é extremamente complexo, contando com a participação de inúmeros fatores e células. Embora já se conheçam muitas biomoléculas, grande parte dos processos moleculares envolvidos no reparo permanece pouco compreendido (EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014). Cada peça desse quebra-cabeça é importante e precisa funcionar adequadamente para que a cicatrização ocorra. Alterações nesse processo podem resultar, por exemplo, em feridas disfuncionais ou cicatrizes hipertróficas. Até mesmo um pequeno atraso no tempo de cicatrização é suficiente para desencadear infecções, hemorragias, desidratação ou a morte (ITO; COTSARELIS, 2008). Ainda que todo o processo ocorra de forma adequada, o resultado, em humanos adultos, é um tecido cicatricial afuncional, com baixa elasticidade e ausente de apêndices cutâneos, como folículos pilosos e glândulas sebáceas (HU et al., 2014).
Lesões extensas, profundas e/ou em locais de articulação, como, por exemplo, as queimaduras de terceiro grau, provocam grandes danos à estrutura da pele e correspondem a uma das principais causas de morte por acidentes em crianças e idosos, sendo uma importante causa de morbimortalidade em todo o mundo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). A mortalidade está associada, principalmente, ao desenvolvimento de infecções, que podem evoluir para sepse e outras consequências sistêmicas, como complicações renais, adrenais, cardiovasculares, pulmonares, musculoesqueléticas, hematológicas e gastrointestinais (GERVASI; TIBOLA; SCHNEIDER, 2014).
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Assim, diversas pesquisas vêm sendo desenvolvidas buscando novas estratégias terapêuticas para os grandes queimados e outras lesões extensas de pele (HU et al., 2010; PESSOLATO et al., 2011; KARIMI et al., 2014). Com essas pesquisas, visa-se a melhora na qualidade da cicatrização e a diminuição no tempo de tratamento, fatores que interferem, não apenas na qualidade de vida dos pacientes, mas também nos custos governamentais. Nesse contexto, a engenharia de tecidos e a terapia celular emergem como alternativas terapêuticas experimentais promissoras.
Além disso, é importante destacar que a cascata de eventos que segue uma lesão na pele é muito similar aos eventos desencadeados após um infarto do miocárdio ou uma injúria na medula espinhal. A formação de cicatrizes ocorre de maneira semelhante, independente do tecido atingido (GURTNER et al., 2008). Pela sua acessibilidade, a pele consiste em um dos melhores modelos para o estudo dos mecanismos de reparo aos danos teciduais. Assim, o estudo da cicatrização e regeneração da pele tem contribuído para o desenvolvimento de novas estratégias em medicina regenerativa para diversos tecidos epitélio-mesenquimais, como o intestino, o pulmão e o fígado (EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014).
1.2 O CAMUNDONGO COMO MODELO EXPERIMENTAL DE REPARO CUTÂNEO
Novos conceitos e tecnologias em reparação tecidual enfrentam alguns desafios na translação da ciência para a medicina. Embora a pele tenha estrutura semelhante entre os mamíferos, não existe um modelo experimental ideal para a pele humana. Essa realidade dificulta e atrasa a ponte entre estudos básicos, pré-clínicos e clínicos (EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014).
Entre os modelos animais, a pele humana se assemelha mais a de suínos, do que a de camundongos (LINDBLAD, 2008; WONG et al., 2011). Entretanto, suínos são mais heterogêneos e difíceis de manipular geneticamente e procedimentos anestésicos e cirúrgicos são mais complicados (FANG; MUSTOE, 2008). Além disso, são mais custosos e exigem mais espaço do que camundongos ou ratos (CIBELLI et al., 2013). Por outro lado, camundongos se reproduzem rapidamente, são de fácil manutenção e podem ser manipulados e padronizados geneticamente (WONG et al., 2011). Assim, a maioria dos estudos dos mecanismos moleculares da reparação tecidual cutânea é desenvolvida em modelos murinos.
Como qualquer outro modelo, o reparo cutâneo em camundongos não é um espelho perfeito do que ocorre em humanos. Particularidades estruturais e fisiológicas interespecíficas promovem consequências no processo de cicatrização (Figura 2) (ZOMER; TRENTIN, 2018). Por exemplo, ao contrário da humana, a pele murina é solta e desconectada de tecidos subjacentes, o que pode interferir diretamente na resposta de reepitelização e contração da ferida (WONG et al., 2011; ABDULLAHI; AMINI-NIK; JESCHKE, 2014). Além disso, a pele dos camundongos possui uma camada muscular, o panniculus carnosus, que promove um fechamento importante - de até 90% - por contração e aproximação dos bordos, o que não ocorre em grandes lesões em humanos(FANG; MUSTOE, 2008; LINDBLAD, 2008). Dessa forma, enquanto as feridas de camundongos cicatrizam, principalmente, por contração, nos humanos a cicatrização ocorre por meio da formação do tecido de granulação (ABDULLAHI; AMINI-NIK; JESCHKE, 2014). Figura 2: Particularidades interespecíficas da pele em humanos e camundongos. A pele humana é mais espessa, possui mais camadas epidérmicas e é aderida aos tecidos subjacentes. As cristas epidérmicas, glândulas sudoríparas e defensinas de neutrófilos estão presentes apenas na pele humana. Por outro lado, a pele murina é mais rica em folículos pilosos, apresenta células dentrídicas epidermais T γδ (γδ DETCs) e o panniculus carnosus, uma camada muscular com grande potencial de contração.
Adaptado a partir de Zomer e Trentin, (2018).
Outra diferença importante está relacionada aos nichos de células-tronco. Enquanto a pele murina é mais rica em folículos pilosos, a pele humana apresenta glândulas sudoríparas, estruturas virtualmente ausentes em camundongos (RITTIÉ et al., 2013; PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014). Assim, as células-tronco derivadas de
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folículos pilosos e de glândulas sudoríparas desempenham papéis diferentes no reparo entre as espécies.
O potencial de regeneração das estruturas da pele também é distinto. Em camundongos, uma população específica de células dendríticas epidermais (DECTs γδ), ausente em humanos, secreta FGF-9 na lesão, o que ativa WNT e induz a secreção de mais FGF-9 por fibroblastos dermais, culminando na regeneração dos folículos pilosos (GAY et al., 2013). Assim, a regeneração destes apêndices é observada em camundongos, mas não em humanos. Ainda, as fibras elásticas, importantes para a elasticidade da pele, reaparecem no tecido cicatricial de camundongos, mas estão ausentes em cicatrizes humanas (SCHWARTZ, 1977; GAY et al., 2013).
Apesar das diferenças da cicatrização da pele em humanos e camundongos, este modelo permanece útil para o desenvolvimento de novas terapias e esclarecimento de mecanismos. Diversas estratégias podem ser utilizadas para superar as dificuldades encontradas, como a adaptação de metodologias para indução da ferida, por exemplo, utilizando barreiras físicas para evitar a contração da pele, ou o uso e desenvolvimento de animais geneticamente modificados ou modelos humanizados (CIBELLI et al., 2013; PARK et al., 2015). De qualquer forma, deve-se ter consciência das limitações do modelo para a correta interpretação e translação dos resultados. Este assunto foi amplamente discutido na revisão publicada pela autora no Journal of Dermatological
Science, onde mais detalhes podem ser encontrados (ZOMER;
TRENTIN, 2018).
1.3 ENGENHARIA DE TECIDOS PARA A REGENERAÇÃO DA PELE
A engenharia de tecidos consiste nas estratégias terapêuticas envolvendo (1) materiais que promovem uma estrutura para a adesão e proliferação celular e tecidual, (2) células e (3) moléculas bioativas ou estímulos biofísicos para direcionar a proliferação e diferenciação de células no material (MURPHY et al., 2013). Juntos, estes três fatores são conhecidos como a tríade da engenharia de tecidos, e podem ser utilizados combinados ou separadamente no desenvolvimento de terapias em medicina regenerativa.
Nos casos de lesões de pele extensas, como em grandes queimados, a recuperação do paciente é diretamente dependente da proteção do organismo com auto-enxertos de pele ou com materiais substitutos. A enxertia é limitada à disponibilidade de pele não afetada no paciente e, às vezes, pode não ser suficiente (SUPP; BOYCE, 2005).
Neste contexto, muitas pesquisas têm trabalhado na criação de materiais para a reconstituição da pele (DIECKMANN et al., 2010; KAMEL et al., 2013).
Recentemente, tem se tornado claro que a matriz extracelular (MEC) consiste em uma estrutura bioativa que controla o comportamento celular por meio de sinais químicos e mecânicos (EMING; MARTIN; TOMIC-CANIC, 2014). A MEC é fundamental para o ancoramento e migração celular durante o reparo tecidual, sendo evidente o seu papel como uma das protagonistas do processo cicatricial (VOLK; IQBAL; BAYAT, 2013). Devido a sua importância, diversos materiais foram desenvolvidos buscando substituir a MEC, promovendo um ambiente favorável para a proliferação e migração celular, resultando em um reparo tecidual de maior qualidade (SUPP; BOYCE, 2005; CHENG; GARCÍA, 2013). A maioria desses produtos são constituídos por colágeno ou fibrina de origem animal, entretanto, uma grande variedade de matérias-primas vem sendo testadas, como celuloses bacterianas e carragenanas derivadas de algas marinhas (CZAJA et al., 2006; CHENG; GARCÍA, 2013; KAMEL et al., 2013; RODE, 2015).
Entre os materiais já utilizados na rotina clínica, destaca-se o Integra (Integra LifeSciences), que constitui uma barreira eficaz contra infecções e perdas de líquidos. O Integra é composto por uma camada de matriz porosa de colágeno bovino e glicosaminoglicanos (condroitin-6-sulfato), com função de substituir a derme, e uma camada superficial temporária, composta por silicone sintético, que mimetiza o papel da epiderme(FORMIGLI et al., 2015; WOSGRAU et al., 2015). Enquanto protege a superfície corporal lesada, o Integra promove uma estrutura tridimensional (3D) para onde as células do paciente migram e proliferam. O colágeno do biomaterial é gradativamente degradado e substituído por colágeno sintetizado pelo organismo (SUPP; BOYCE, 2005). Entretanto, a terapia com o Integra não exclui a necessidade de um enxerto de epiderme, o qual precisa ser realizado após a integração do substituto dérmico (SD) ao paciente. O resultado é um tecido cicatricial de maior qualidade, principalmente pela maior elasticidade da pele (WOOD et al., 2007; FORMIGLI et al., 2012; FOUBERT et al., 2015). Apesar de melhorar o aspecto da cicatriz, a terapia com o Integra não resulta em uma pele íntegra e funcional, isto é, em tecido regenerado.
Assim, estudos recentes em engenharia de tecidos vêm buscando a associação de diferentes tipos celulares a biomateriais acelerando, assim, o processo de reparo pela diminuição do tempo necessário para
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que as células do paciente povoem a matriz implantada (CHENG; GARCÍA, 2013; KAMEL et al., 2013). Neste contexto, tem-se demonstrado que o uso de matrizes colonizadas com células-tronco acelera e melhora a qualidade da regeneração tecidual (FORMIGLI et al., 2012; REICH et al., 2012; RODRIGUES et al., 2014).
1.4 CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS
De maneira geral, o termo célula-tronco refere-se a células capazes de se auto-renovar, originando células-filhas iguais a elas, e de se diferenciar em células especializadas quando em condições apropriadas (MEIRELLES; CHAGASTELLES; NARDI, 2006; DOMINICI et al., 2006). Durante o desenvolvimento, as células-tronco pluripotentes dão origem a todas as células do organismo (YU; THOMSON, 2008). Em adultos, as células-tronco multipotentes estão distribuídas em todos os órgãos e tecidos, contribuindo para a homeostase tecidual (MEIRELLES; CHAGASTELLES; NARDI, 2006; ZOMER et al., 2015).
Entre as células-tronco adultas, as células estromais mesenquimais (MSC, do inglês, mesenchymal stromal cells)1 se destacam pelo seu potencial terapêutico, amplamente descrito na literatura (KORDELAS et al., 2014; RIBEIRO et al., 2014; MARIA et al., 2016). As MSC são capazes de se diferenciar em tecidos derivados do folheto germinativo mesodérmico, como ósseo, adiposo, cartilaginoso e muscular(SACHS et al., 2012). Embora a diferenciação em células de outras origens embrionárias tenha sido alcançada em alguns estudos, como neurônios e queratinócitos, (origem ectodérmica) e hepatócitos, (origem endodérmica), a diferenciação em tecidos não mesodérmicos permanece controversa, devido à falta de resultados funcionais e in vivo (AURICH et al., 2009; STRIOGA et al., 2012; CHAVEZ-MUNOZ et al., 2013).
Apesar de as MSC possuírem capacidade de diferenciação mais restrita do que células-tronco pluripotentes como as células-tronco embrionárias (CTE) e as células de pluripotência induzida (iPS), a utilização das MSC evita questões éticas e religiosas, relacionadas à destruição de embriões, etapa necessária para se obter as CTE (revisado em ZOMER et al., 2015). Além disso, as MSC não possuem potencial tumorigênico, característico em células pluripotentes (revisado em
1Siglas consagradas em inglês foram mantidas na língua original para
ZOMER et al., 2015). Estas características das MSC as destacam como candidatas promissoras para transplantes.
No organismo, as MSC respondem a estímulos específicos, apresentando funções de manutenção da homeostase tecidual e substituição de células mortas, sendo específicas para cada tecido em que se encontram (WANG et al., 2014). Elas estão envolvidas no processo de reparação tecidual por meio de diferenciação celular e de efeitos parácrinos - pela secreção de fatores de crescimento e citocinas (BAHN et al., 2012). Pequenos reparos são realizados por células-tronco locais, mas, em lesões extensas, outras células-tronco podem ser recrutadas, como as provenientes da medula óssea (GURTNER et al., 2008). No entanto, é necessário um tempo maior para que estas migrem do sítio de origem para o local afetado, através da circulação (VERSTAPPEN et al., 2009). Assim, diversas pesquisas têm utilizado o transplante de MSC visando, primeiro, a ampliação dos seus efeitos por meio da redução no tempo de migração das células até o sítio de injúria e, segundo, a disponibilidade de um maior número de MSC envolvidas no reparo(MEIRELLES; CHAGASTELLES; NARDI, 2006; SACHS et al., 2012).
As MSC expressam nível intermediário de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) I e não expressam o MHC-II e algumas moléculas coestimuladoras do sistema imune (LI; EZZELARAB; COOPER, 2012; LIN; LIN; LUE, 2012; GUTIERREZ-FERNANDEZ et al., 2015). Essas particularidades evitam a ativação halo-reativa de células T, responsável pela rejeição após transplantes halógenos, permitindo a sobrevivência das células transplantadas por longos períodos no hospedeiro (AGGARWAL; PITTENGER, 2009).
A interação das MSC com o sistema imune não se resume a baixa imunogenicidade. Por meio de efeitos parácrinos, as MSC possuem um papel importante de imunomodulação de ambientes inflamatórios (WANG et al., 2014). As principais moléculas secretadas pelas MSC, descritas como envolvidas na imunomodulação, são a prostaglandina E2 (PGE2) e interleucinas 4 e 10 (IL-4 e IL-10) (AGGARWAL; PITTENGER, 2009; WANG et al., 2014). Dessa forma, as MSC interagem com as células do sistema imune, como linfócitos T, células
natural killers e dendríticas, inibindo vias inflamatórias e estimulando
vias anti-inflamatórias (AGGARWAL; PITTENGER, 2009). Entretanto, ainda pouco se conhece sobre a interação das MSC com os macrófagos. Recentemente, foi demonstrado que as MSC são capazes de polarizar os macrófagos para um fenótipo M2 in vitro e in vivo (MAGGINI et al., 2010; ZHANG et al., 2010; ZHENG et al., 2015). Esses achados
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sugerem que os macrófagos podem ser reprogramados para um fenótipo pró-reparo sob influência das MSC no contexto de uma lesão tecidual cutânea, levando à melhora no processo de reparo tecidual.
Para que sejam efetivas, é fundamental que as MSC permaneçam em contato com o leito da ferida e se mantenham viáveis neste microambiente hostil(FALANGA et al., 2007). As células podem ser transplantadas sistemicamente por via intravenosa ou arterial, por injeção no local de lesão ou com o auxílio de matrizes, isto é, estruturas que mantém as células aderidas ao sítio alvo (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016). No entanto, parece não haver um consenso, até o momento, sobre a via de aplicação mais eficaz. Lam e Longaker (2012), afirmam que células injetadas se dissipam ou morrem no organismo, sendo que a adesão das células está diretamente relacionada à sua proliferação e diferenciação (LAM; LONGAKER, 2012). Deste modo, o desenvolvimento de estratégias em engenharia de tecidos, associando as MSC a matrizes, consiste em tecnologias promissoras para se atingir melhores resultados.
As MSC podem ser isoladas a partir de diversos tecidos, como gordura, medula óssea, cordão umbilical, polpa dentária, músculo e pele (KERN et al., 2006; ESLAMINEJAD et al., 2010; KISIEL et al., 2012; TAKEMITSU et al., 2012; JEREMIAS et al., 2014). Pela sua heterogeneidade, a International Society for Cellular Therapy (ISCT) definiu um conjunto de atributos que caracterizam essa população, entre eles, a aderência ao plástico, morfologia fibroblastóide, capacidade de formação de colônias e potencial de diferenciação para pelo menos três fenótipos de origem mesodérmica(DOMINICI et al., 2006). Ainda não se conhecem marcadores moleculares específicos de MSC, entretanto, o perfil de expressão de um grupo de proteínas de superfície ajuda a diferenciar as MSC de outras células, incluindo a expressão positiva de CD44, CD73, CD90, CD105, e negativa de CD14, CD34 e CD45 (HORWITZ et al., 2005; DOMINICI et al., 2006; AGGARWAL; PITTENGER, 2009).
As MSC ideais para transplantes devem ser acessíveis, isto é, ser facilmente coletadas e prontamente disponíveis em grandes quantidades (GUPTA; AJAY, 2015). Além disso, é esperado que mantenham seu potencial de diferenciação e estabilidade genética após cultivo in vitro (AZIZI et al., 1998). A fonte de obtenção das MSC pode interferir nessas características, de forma que MSC derivadas de variados tecidos podem apresentar diferentes potenciais terapêuticos. Nesse contexto, é descrito em literatura que o isolamento de MSC derivadas do tecido adiposo (ASC, do inglês adipose stromal cells) resulta em cem vezes
mais células que o isolamento a partir da medula óssea (DEY; EVANS, 2011). Além disso, o procedimento para coleta do tecido adiposo é menos doloroso para o doador (SACHS et al., 2012). Dessa forma, o tecido adiposo se destaca pela acessibilidade e segurança na coleta e abundância de células isoladas (HOUSMAN et al., 2002; CHERUBINO et al., 2010; KIM et al., 2011; LAM; LONGAKER, 2012).
As ASC são alvo de extensiva pesquisa, tendo sido caracterizadas pela primeira vez em 2001 por Zuk e colaboradores, a partir de lipoaspirados humanos (ZUK et al., 2001). Desde então, as ASC têm sido descritas em diversos modelos animais, como cães, coelhos, ovinos, camundongos e equinos (KISIEL et al., 2012; ARRIGONI et al., 2013; CARRADE; BORJESSON, 2013; HILLMANN et al., 2016). Da mesma forma, o seu potencial terapêutico foi avaliado para diversas afecções, em estudos in vitro, pré-clínicos e clínicos (BIANCO et al., 2008).
Também no ano de 2001, MSC derivadas da derme (DSC, do inglês dermal stromal cells) foram isoladas por três grupos de pesquisa independentes, a partir da pele de camundongos e humanos(TOMA et al., 2001; SHI; CHEN, 2001; YOUNG et al., 2001). Embora tenham sido descritas no mesmo ano que as ASC, as DSC receberam menos enfoque desde então, havendo muitas questões desconhecidas sobre seu nicho e características. Atualmente, acredita-se que existam vários nichos de MSC na pele, como por exemplo, associadas à papila dérmica e difundidas pela MEC (WONG et al., 2012). Por sua localização, sugere-se que as DSC participem ativamente do reparo da pele após injúrias (CHEN; WANG; SHI, 2014), consistindo em uma promissora fonte de MSC para futuras terapias.
No contexto de cicatrização da pele, MSC obtidas de variadas fontes vêm sendo testadas quanto a sua eficácia terapêutica em vários estudos in vitro e in vivo (FALANGA et al., 2007; CHERUBINO et al., 2011; LEONARDI et al., 2012). Estudos realizados de forma independente com ASC murinas e DSC humanas em modelos murinos demonstraram que ambos os tipos celulares atuam no reparo tecidual cutâneo, por meio da secreção de citocinas e fatores de crescimento, indução da proliferação e diferenciação em fibroblastos e queratinócitos, aumento da angiogênese e formação de apêndices cutâneos, além da inibição da resposta inflamatória (RIGOTTI et al., 2007; KIM et al., 2011; CHEN; WANG; SHI, 2014). Nas feridas tratadas com essas MSC, são descritas, ainda, maior reepitelização, formação de tecido de granulação e deposição colágena e menor colonização bacteriana (CHERUBINO et al., 2011; LEONARDI et al., 2012).
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Os resultados descritos na literatura demonstram que as DSC e ASC participam ativamente do reparo de feridas cutâneas e aumentam a qualidade das cicatrizes. Entretanto, antes que resultados pré-clínicos possam ser utilizados na rotina clínica, diversas questões abertas precisam ser elucidadas. Por exemplo, sabe-se que a fonte de MSC pode interferir em suas características, porém, estudos comparativos entre DSC e ASC no reparo cutâneo nunca foram realizados. Além disso, os mecanismos de ação das MSC continuam pouco esclarecidos.
Inicialmente, acreditava-se que quanto maior o potencial de diferenciação de uma célula-tronco, maior o seu potencial de uso para múltiplas aplicações terapêuticas (BYDLOWSKI et al., 2009; MAHLA, 2016). Entretanto, a análise da ação das MSC levanta um paradoxo, já que muitos dos efeitos descritos não estão relacionados às suas características-tronco (PROCKOP, 2007). Além disso, os ensaios pré-clínicos apresentam resultados contrastantes. Enquanto alguns estudos mostram que as células transplantadas se diferenciam em células da pele, permanecendo estruturalmente no tecido, outros sugerem que o efeito das MSC se dá, principalmente, de forma parácrina, pois a sobrevida das células no local da lesão nem sempre pode ser detectada poucos dias após o transplante (FALANGA et al., 2007; ALLARD et al., 2014; CLOVER et al., 2014; SABAPATHY et al., 2014; LIM et al., 2016). É provável que os efeitos das MSC sejam resultado de uma combinação de ambas as ações, mas o papel e a importância de cada mecanismo permanecem obscuros (Figura 3).
Figura 3: Mecanismos de ação das MSC no reparo tecidual cutâneo. As MSC se diferenciam em células da pele, como fibroblastos, miofibroblastos, queratinócitos e células endoteliais. No caso dos queratinócitos, os resultados são controversos devido a sua origem não-mesodermal. Além da diferenciação, as MSC atuam de forma parácrina, pela secreção de fatores de crescimento e citocinas, que atuam estimulando as células endoteliais a formar novos vasos, inibem a ação inflamatória de neutrófilos e macrófagos e estimulam a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos e a sua atividade de deposição de matriz extracelular.
Fonte: do autor.
Siglas e abreviações: EGF: fator de crescimento epidermal; IL-8: Interleucina 8; IL-10: Interleucina 10; TGF-β: fator de transformação do crescimento β; VEGF: fator de crescimento vascular endotelial; PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas; IGF: fator de crescimento semelhante à insulina.
1.5 MEIO CONDICIONADO DE CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS
Os baixos níveis de células enxertadas após transplantes sugerem que os efeitos das MSC se devem aos seus fatores parácrinos secretados (PROCKOP, 2007; TAMAMA; KERPEDJIEVA, 2012). Neste contexto, estudos in vitro e in vivo têm sugerido que a secreção das MSC em seu meio de cultivo, isto é, o meio condicionado, permite que
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este possa ser utilizado terapeuticamente (WALTER et al., 2010; SHOHARA et al., 2012; YU; ZHANG; LI, 2014).
Os principais componentes do meio condicionado de MSC são as microvesículas extracelulares e os fatores solúveis, consistindo em uma ampla variedade de moléculas bioativas (ZHAO et al., 2013). Muitas citocinas e fatores de crescimento secretados pelas ASC e DSC têm importante papel regulador durante o processo de reparo tecidual (Quadro 1).
Quadro 1: Principais fatores conhecidos com ação sobre o reparo tecidual cutâneo, secretados por ASC e DSC.
Fator ASC DSC
PGE2 + (AGGARWAL; PITTENGER, 2009) ?
EGF + (ZHAO et al., 2013) ?
KGF + (ZHOU et al., 2013) ?
IL-8 + (HSIAO et al., 2012) + (HSIAO et al.,
2012)
TGF-β + (ZHOU et al., 2013) ?
VEGF + (HSIAO et al., 2012; ZHAO et al., 2013) + (HSIAO et al., 2012) PDGF + (HSIAO et al., 2012; ZHAO et al., 2013) ?
IGF + (ZHAO et al., 2013; EDWARDS et al., 2014) ? HGF + (HSIAO et al., 2012; EDWARDS et al., 2014) ? FGF-2 + (HSIAO et al., 2012; ZHAO et al., 2013) ?
MMP-1 + (ZHAO et al., 2013) ?
MMP-9 + (EDWARDS et al., 2014) ?
TIMP-1 + (ZHAO et al., 2013) ?
Angiogenina + (HSIAO et al., 2012) + (HSIAO et al., 2012) Siglas e abreviações +: secreção descrita em literatura; ?: não descrita ou não encontrada. PGE2: prostaglandina E2; EGF: fator de crescimento epidermal;
KGF: fator de crescimento de queratinócitos; IL: Interleucina TGF: fator de crescimento transformador; VEGF: fator de crescimento vascular endotelial; PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas; IGF: fator de crescimento semelhante à insulina; HGF: fator de crescimento de hepatócitos; FGF: fator de crescimento de fibroblastos; MMP: metaloproteinase de matriz; TIMP: inibidora de metaloproteinase.
Como o meio condicionado é constituído por componentes acelulares, a sua manipulação clínica é mais simples do que células vivas e, consequentemente, tem aplicação terapêutica facilitada pela menor imunogenicidade (TAMAMA; KERPEDJIEVA, 2012). Outra vantagem dessa estratégia é a segurança, visto que mutações malignas durante a expansão in vitro ou após o transplante de MSC constituem um potencial problema associado à terapia com células-tronco (TAMAMA; KERPEDJIEVA, 2012). Por outro lado, ainda existem muitas questões abertas acerca da utilização terapêutica dos meios
condicionados. Por exemplo, sabe-se que as MSC secretam proteínas em resposta aos estímulos específicos emitidos pelo seu microambiente (VIDANE et al., 2013). Nesse contexto, a secreção das MSC nas condições padrão de cultivo in vitro pode não refletir aquela secretada numa lesão in vivo. De qualquer forma, o microambiente in vitro poderia ser estrategicamente adaptado para modular a secreção de proteínas de interesse clínico pelas MSC (KWON et al., 2013; JUN et al., 2014). Entretanto, estudos com o meio condicionado ainda são escassos e carecem de informações detalhadas a respeito da sua produção, qualidade e forma mais eficaz de utilização.
No contexto da cicatrização tecidual cutânea, tem-se descrito que os meios condicionados de MSC derivadas do cordão umbilical e da medula óssea induzem a proliferação e migração de fibroblastos e queratinócitos, o aumento da angiogênese e a diminuição da inflamação (YEW et al., 2011; EDWARDS et al., 2014; SHABBIR et al., 2015). Entretanto, a grande maioria dos estudos disponíveis tem comparado a ação dos meios condicionados a um controle sem tratamento, sendo a comparação da utilização das MSC pouco explorada. Além disso, ainda se desconhece a influência da fonte de MSC sobre o potencial terapêutico dos seus meios condicionados.
2. HIPÓTESE
A fonte de MSC (derme ou tecido adiposo) influencia na sua eficácia terapêutica em engenharia de tecidos para a cicatrização da pele e os meios condicionados das MSC têm efeito equivalente ao das células no reparo cutâneo.
