Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
Instituto Biomédico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Curso de Ciências Biológicas
Caracterização dos Rotavírus
Associados à Diarréia Grave em
Crianças no Rio de Janeiro em 2005 e
2006.
Adriana Rodrigues Pedro
Rio de Janeiro 2006
ii
Caracterização dos Rotavírus Associados à Diarréia Grave em
Crianças no Rio de Janeiro em 2005 e 2006.
Monografia apresentada à Disciplina de Microbiologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção de grau de Bacharel em
Ciências Biológicas (Modalidade Biológica).
Orientador Científico:
Vera de Souza Gouvea
Orientador Acadêmico:
Carmen Saramago
Rio de Janeiro
Ficha Catalográfica
Pedro, Adriana Rodrigues 1980 –
Caracterização dos Rotavírus Associados à Diarréia Grave em Crianças no Rio de Janeiro em 2005 e 2006.
Rio de Janeiro, UNIRIO – Departamento de Microbiologia e Parasitologia, 2006.
XVI, 54
Monografia: Bacharel em Ciências Biológicas
1. Rotavírus 2. Epidemiologia de rotavírus 3. Eletroferotipos de rotavírus 4.Gastroenterite infantil. I. Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro. Bacharelado em Ciências Biológicas. II. Título.
iv
Adriana Rodrigues Pedro
Caracterização dos Rotavírus Associados à Diarréia Grave em Crianças no Rio de Janeiro em 2005 e 2006.
Monografia apresentada à disciplina de Microbiologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção de grau de Bacharel em Ciências Biológicas (Modalidade Biológica).
Rio de Janeiro, 20 de setembro de 2006.
Drª. Carmen Saramago, Prof. Adjunto, Responsável pela Disciplina de Microbiologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, IB – UNIRIO
Drª. Vera de Souza Gouvêa, Prof. Titular do Instituto de Microbiologia – UFRJ
Drª. Alexsandra Rodrigues de Mendonça Favacho, Instituto OswaldoCruz – FIOCRUZ
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O presente estudo foi realizado no Laboratório de Virologia Molecular e Tropical do Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, sob orientação da Professora Doutora Vera de Souza Gouvêa, com o auxílio de bolsa de iniciação científica PIBIC/UFRJ.
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Aos meus pais por sempre
acreditarem que eu poderia ir além.
E especialmente a Deus por seu
amor sublime e incomensurável.
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“Quem a Deus tem nada lhe falta,
só Deus basta!”
viii
Ao concluir este trabalho, agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida e pela graça de poder cursar o ensino superior em uma Universidade Federal.
À professora Vera de Souza Gouvêa, minha orientadora, pelo
acolhimento, apoio, aprendizado, dedicação, confiança e amizade durante todo este tempo de estágio;
Aos amigos e colegas do LVMT, Alexsandra Favacho, André Luiz, Felipe Naveca, Giselda Matos, Paulo França, Elisa Fishman, Giselly e Sandra, pelas contribuições no meu aprendizado e pelos bons momentos de alegria
proporcionados;
Aos meus amigos de curso, Daniella Consentino, Karina Rebello, Thays Paes, Luiz Rafael, Hugo Souza, Carolina Barboza e Raquel Senna, pelo apoio, pelas rizadas, pelos “lembretes”, pelas chopadas, enfim, por fazerem minha vida acadêmica ser mais “tranqüila” do que deveria;
Aos meus amados amigos, Flávia e Eduardo Ribeiro, Elaine e Viviane Lemos e Francisco José pelos ouvidos emprestados e pela compreensão nos momentos em que tempo para vê-los era artigo de luxo;
Aos meus pais, Antonio e Zélia, por buscarem comigo a realização deste sonho e mais uma vez comprarem uma briga que não era deles;
Às minhas irmãs Aline e Aldine, pelo apoio, paciência, carinho e pela compreensão na partilha do computador; e aos meus cunhados Fábio e Lailton por me ensinarem que não há distância que nos separe de um objetivo e que resistir, em certos momentos, é sinônimo de vencer;
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A presença de rotavírus foi pesquisada em amostras fecais provenientes de crianças até doze anos de idade, com sintomas de diarréia aguda infecciosa hospitalizadas no setor de Emergência do Instituto de Puericultura e Pediatria e Martagão Gesteira (IPPMG-UFRJ), no período de janeiro de 2005 a junho de 2006.O objetivo dessa análise foi o de verificar a epidemiologia das rotaviroses e o padrão das amostras dos rotavírus circulantes.
Cento e duas amostras fecais foram submetidas à análise por
eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e por ensaio imunoenzimático para a detecção de antígenos de rotavírus e adenovírus. Destas, 33 (32,4%) amostras apresentaram positividade para rotavírus. Um padrão eletroforético típico de rotavírus do grupo A foi determinado em 29 destas amostras, sendo 25 (86,2%) com eletroferotipo longo e 4 (13,8%) com perfil curto. Um único eletroferotipo longo foi encontrado durante todo o ano de 2005, em todas as faixas etárias. Os perfis curtos foram observados apenas entre os meses de abril e junho de 2006, na faixa etária de oito meses a três anos. Adenovírus foi detectado em 3 (5,3%) de 56 amostras negativas para rotavírus.
Estes dados confirmam a importância dos rotavírus como um dos principais agentes etiológicos de gastroenterites. Algumas peculiaridades foram observadas, como a homogeneidade dos padrões longos, e a antecipação dos casos de rotavirose para o final do verão no período estudado.
xi
Rotavirus was investigated in fecal specimens collected from children up to 12 years old with acute gastroenteritis who were hospitalized at the
Emergency Service of the Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG-UFRJ) from January 2005 to June 2006. The study aimed at examining the epidemiology of rotavirus infections and analyzing the
electrophoretic patterns of the circulating strains.
One hundred and two fecal specimens were screened for the presence of rotavirus genome by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and for rotavirus and adenovirus antigens by an enzyme immunoassay. A total of 33 (32.4%) specimens were positive for rotavirus. Typical group A rotavirus
electrophoretic patterns were found for 29 of those specimens: 25 (86.2%) had long electrophoretic patter, and 4 (13.8%) had short profiles. A single
electropherotype was present during the entire year of 2005 and in all age groups, whereas rotaviruses of short electrophoretic profiles were observed only between April and June 2006 in specimens from children aged between eighth months to three years old. Adenovírus was detected in 3 (5.3%) out of 56 specimens negative for rotavirus.
These data reinforced the importance of rotavirus as an etiologic agent of childhood diarrhea. Some striking features, such as the homogeneity of the long electrophrotypes and the early onset of the yearly epidemic seasons beginning by late summer were observed.
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Lista de Abreviações
IPPMG Instituto de Puericultura e Pediatria e Martagão Gesteira UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida EIE Ensaioimunoenzimático
EIARA Ensaioimunoenzimático para detecção de antígenos de rotavirus e adenovirus
Da Daltons
bp Pares de base RNAm RNA mensageiro VP Proteína viral
NSP Proteína não estrutural
RRV-TV Rotavirus rhesus tetravalente
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária g Gravidade
SDS Dodecil sulfato de sódio
TTA Tampão de tratamento de amostra PA Persulfato de amônio TEMED Tetrametiletilenodiamina PBS Tampão salina-fosfato Anti-IgG Anti-imunoglobulina-G TMB Tetrametilbenzidina DO Densidade óptica
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1. Introdução ...1
1. 1. Histórico...4
1. 2. Morfologia e Taxonomia ...5
1. 3. Classificação: sorotipo/ genotipo...8
1. 4.Aspectos Gerais da Doença...10
2. Epidemiologia ......12
2.1. Morbidade e mortalidade...12
2.2. Distribuição geográfica...15
2.3. Transmissão...16
2.4. Distribuição temporal...17
2.5. Epidemiologia molecular dos rotavírus...19
3. Análise de eletroferotipos...21 4. Vacina...23 5. Objetivos...25 6. Material e Métodos......26 6.1. Amostras...26 6.2. Colheita e transporte...26
6.3. Triagem das amostras positivas para rotavírus...26
6.4. Clarificação...27
6.5. Extração de RNA viral...27.
6.6. Tratamento das amostras...28
6.7. Eletroforese em gel de poliacrilamida ...28
xiv
6.8. Ensaio imunienzimático (EIARA)...33
6.8.1. Clarificação das amostras...33
6.8.2. Sensibilização das placas...33
6.8.3. Adição de amostras e controles...34
6.8.4. Detecção de antígenos...34 6.8.5. Conjugado...34 6.8.6. Substrato...35 6.8.7. Bloqueador...35 6.8.8. Leitura e interpretação...35 7. Resultados...36
7.1 Distribuição de rotavírus nos meses estudados...36
7.2 Distribuição dos casos de rotavírus de acordo com a faixa etária...38
7.3 Perfil eletroforético do genoma de rotavírus...39
7.4 Distribuição dos padrões longo e curto encontrados...41
7.5 Distribuição dos padrões longo e curto nas faixas etárias estudadas..42
7.6 Resultados do ensaioimunoenzimático (EIARA)...43
8.Discussão...44
9.Conclusão………..46
1. Introdução
A doença diarréica é uma das doenças infantis mais comuns em todo mundo. Embora as evidências demonstrem o declínio da mortalidade nessa última década, em algumas áreas subdesenvolvidas a diarréia permanece uma das principais causas de mortes em crianças menores de dois anos. A etiologia das diarréias pode envolver vários agentes como vírus, bactérias e parasitas. (KAPIKIAN et al., 2001).
Os rotavírus representam a causa mais comum de diarréia infantil grave em todo o mundo. Este agente infeccioso atinge não apenas humanos, mas também filhotes de outros mamíferos e aves (LINHARES, 2000). Nos países em desenvolvimento os rotavírus são responsáveis por até 40% das hospitalizações e 6% da mortalidade global entre crianças com idade abaixo de cinco anos (KAPIKIAN et al., 2001). Nos países em desenvolvimento, estima-se que as gastroenterites associadas a esses agentes virais determinem 600.000 a 870.000 mortes a cada ano, dados que refletem 20 a 25% do total de óbitos por doença diarréica. Em números mais precisos, morrem a cada dia 2.000 crianças com quadro diarréico causado por esses patógenos (Figura 1.1) (LINHARES, 2000).
•= 1.000 mortes (PARASHAR, et al., 2003).
Figura 1.1: Distribuição global de óbitos causados por rotavírus.
Mesmo nos países desenvolvidos, nos quais a taxa de mortalidade por esse vírus é bastante reduzida, estima-se que todas as crianças, até os cinco anos de idade, já tenham apresentado ao menos um episódio de diarréia por rotavírus (PARASHAR et al., 2003). Esses dados indicam que apenas as medidas preventivas, baseadas em hábitos de higiene e saneamento básico, não são suficientes para impedir o contágio (GLASS, 2006).
No Brasil, a importância da rotavirose está relacionada ao impacto dessa doença na população, traduzido nos danos ao desenvolvimento da criança, bem como à sociedade, através dos custos gerados pela demanda aos serviços médicos, atendimento ambulatorial, pronto atendimento e hospitalizações (custos diretos), enquanto que perdas de dia de trabalho, de estudo, gastos com medicamentos, transportes entre outros representam os custos indiretos (INSTITUTO ADOLF LUTZ, 2004).
Asinfecções por rotavírus são comuns e muitas vezes podem ocorrer de forma subclínica. Os episódios de diarréia podem variar de um quadro leve, com diarréia
líquida e duração limitada a quadros graves com febre, vômito e desidratação. As conseqüências da infecção estão relacionadas com a idade. Embora possam infectar indivíduos e animais de todas as idades, as infecções sintomáticas, isto é o quadro de diarréia, geralmente ocorrem em crianças na faixa etária entreseis meses e dois anos e têm sido a principal causa de diarréia nosocomial em creches e pré-escolas (FISCHER et al, 2004).
Estes fatos nos levam a imaginar o impacto sócio-econômico exercido pelas diarréias e justificam a importância e a urgência do estudo epidemiológico da diarréia causada por rotavírus, o qual se mostra extremamente deficiente em nosso país (DOMINGUES, 1998).
A notificação de surtos de diarréia aguda é de extrema relevância para desencadear uma investigação minuciosa quanto a sua origem, se em domicílios, creches, escolas, hospitais, ou devido a problemas ambientais, para se conhecer as possíveis causas de transmissão para que medidas eficazes de controle possam ser adotadas o mais precocemente possível (COSTA et al., 2004).
Devido ao elevado índice de morbidade e mortalidade associada á diarréia por rotavírus, ficou evidente a necessidade de medidas urgentes como o desenvolvimento de vacinas contra esses vírus, cujo objetivo principal é a atenuação da gravidade da doença diarréica (INSTITUTO ADOLF LUTZ, 2004).
1.1 Histórico
Até o início dos anos 70, vários estudos eram realizados visando à associação entre agentes virais e a doença diarréica em humanos, principalmente em crianças. Porém, somente em 1972 Kapikian et al., através do uso da microscopia eletrônica, identificaram o vírus Norwalk e sua associação com gastroenterite viral em crianças mais velhas e adultos.
No ano seguinte, 1973, Bishop et al., visualizaram, em cortes ultrafinos da mucosa intestinal de crianças, partículas virais de 70 nm de diâmetro. No mesmo ano Flewett et al., observaram partículas em fezes clarificadas de crianças dando início ao uso da microscopia eletrônica para o diagnóstico das rotaviroses. Desde então, os rotavírus são considerados os principais agentes etiológicos das diarréias graves infantis, tanto em países desenvolvidos quanto naqueles em desenvolvimento (KAPIKIAN et al., 2001).
Ao longo de duas décadas, múltiplo aspecto da infecção por esses vírus tem sido objeto de estudo em âmbito nacional, integrando dados que abrangem desde os primeiros achados por microscopia eletrônica até a corrente caracterização molecular das amostras virais circulantes e os ensaios de campo com vacinas experimentais. Situadas entre esses marcos temporais, comprovadas pelos inúmeros estudos epidemiológicos realizados no Brasil, está a importância que assumem as diarréias causadas pelos rotavírus na infância (LINHARES, 2000).
1.2 Morfologia e Taxonomia
O nome rotavírus é derivado do latim “ROTA” que significa “roda”, termo sugerido com base na sua morfologia, devido á sua aparência de roda (Figura 1.2) (FLEWETT et al, 1974).
Figura 1.2: Rotavírus - Microscopia eletrônica de uma preparação de rotavirus
purificada mostrando sua típica morfologia de “roda de carroça”.
Os rotavírus são classificados como um gênero pertencente à família Reoviridae e como tal, possuem características comuns a todos os gêneros desta família, como um genoma composto de 10 a 12 segmentos de RNA dupla-fita, partículas medindo entre 60 e 85 nm, e capsídeo protéico icosaédrico (ESTES, 2001). Contudo, os eles possuem algumas particularidades próprias do gênero Rotavirus, como apresentados a seguir.
Estrutura:
• Suas partículas virais, quando íntegras, medem cerca de 70 nm de diâmetro,
possuem um capsídeo protéico icosaédrico, composto por três camadas: uma externa, uma intermediária e uma interna, o cerne, que engloba o genoma (Figura 1.3); VP1/VP3 VP7 VP2 VP4 VP6
Figura 1.3: Corte longitudinal da partícula viral indicando as camadas protéicas:
nucleocapsídeo VP2, capsídeo interno VP6, capsídeo externo VP7, espícula VP4, e as enzimas VP1 e VP3 no interior do nucleocapsídeo (ESTES, 2001).
• Possuem 60 espículas de 12 nm que se projetam da superfície da camada
interna, atravessando o capsídeo externo;
• O peso molecular dos segmentos varia entre 2x105 e 2x106 Daltons e seu
• Não possui envelope;
• A partícula viral contém todas as enzimas necessárias à síntese do RNAm.
Genoma:
• Seu genoma é composto por 11 segmentos de RNA dupla-fita (Figura 1.4)
(ESTES, 2001; ARIAS et al., 2001);
VP6 VP7 VP2 VP4 VP1/VP3 dsRNA
Figura 1.4: Representação esquemática do rotavírus, ilustrando suas principais
características morfológicas e sua composição. Adaptado de CUNLIFFE, et al.,2002.
• O genoma viral codifica seis proteínas estruturais (VP-viral protein) VP1 a
VP4, VP6 e VP7, e cinco proteínas não estruturais (NS-non structural protein) NSP1 a NSP6;
• Cada segmento é monocistrônico, ou seja, representa um gene que codifica
uma proteína com exceção do segmento 11 que é bicistrônico, ou seja, codifica duas proteínas, NSP5 e NSP6 (ESTES, 2001);
• Os vírus são capazes de fazer rearranjos genéticos, podendo resultar no
reagrupamento de segmentos de RNA entre sorotipos diferentes (KAPIKIAN et al., 2001; GOUVEA & BRANTLY, 1995; DESSELBERGER, 1996).
Quando os 11 segmentos são submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) produzem padrões de migração (eletroferotipos) de acordo com sua massa molecular e seu comprimento. Estes perfis eletroforéticos são característicos de cada amostra (ESTES, 2001; GOUVEA & SANTOS, 1997; FAVACHO, et al., 2005).
1.3.Classificação: sorotipo/ genotipo
Os rotavírus são classificados sorologicamente em grupos (sorogrupos), subgrupos e sorotipos. A divisão sorológica se faz em grupos de A a G (A, B, C, D, E, F, G), sendo que apenas os grupos A, B e C infectam humanos e animais, enquanto que os demais infectam somente animais. Dentro de um mesmo grupo os vírus são capazes de fazer rearranjo genético, mais o mesmo não ocorre entre vírus de diferentes grupos (ESTES, 2001; DESSELBERGER, 1996; RAMIG, 2004).
O antígeno de grupo detectado em testes diagnósticos como ELISA (Ensaio Imunoenzimático), é a proteína do capsídeo interno VP6, a qual é altamente imunogênica e a mais abundante na partícula viral constituindo 51% da massa protéica do vírion (BISHOP et al.,1983). Especificamente nos rotavírus do grupo A, a VP6 também media especificidade de subgrupo. Dois subgrupos foram identificados, subgrupo I e II, sendo que a maioria dos rotavírus isolada de animais pertence ao subgrupo I e a maioria dos isolados de humanos pertencem ao subgrupo II (KAPIKIAN et al., 2001).
Os rotavírus do grupo A são classificados em sorotipos G e P de acordo com as especificidades antigênicas das duas proteínas do capsídeo externo: a glicoproteína VP7 (sorotipo G) e a proteína-espícula sensível à protease VP4 (sorotipo P). Até o momento foram identificadas 14 variantes do tipo G – tendo sido detectados 10 em humanos – e 25 do tipo P – sendo detectadas nove em humanos (FISHER et al, 2004; GLASS, 2006; MARTELLA et al., 2006).
O progresso das técnicas de biologia molecular proporcionou a ampliação dos estudos dos sorotipos de rotavírus, viabilizando a determinação dos genótipos G e P. Para tanto foram desenvolvidos ensaios moleculares de reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando iniciadores específicos para cada genótipo (GOUVÊA, et. al., 1990a). Essas técnicas de genotipagem têm produzido importantes informações sobre a epidemiologia do vírus (GOUVÊA, et. al., 1990b).
Estudos epidemiológicos realizados em vários países demonstram a prevalência global de quatro sorotipos G (G1, G2, G3 e G4) e recentemente a emergência do sorotipo G9, e dois sorotipos [genótipo] P (P1A[8] e P1B[4]), apenas modificando suas freqüências em decorrência da localidade e da época do ano
(PARASHAR et al, 2003). No Brasil, o sorotipo G5 mostrou-se também epidemiológicamente importante nas últimas décadas (GOUVEA et al,1994; TIMENETSKY et al,1994; TIMENETSKY et al,1997; GOUVEA & SANTOS, 1997; LUZ, et al., 2005).
1.4. Aspectos gerais da doença
As manifestações clínicas mais comuns da doença são diarréia, vômito, febre, dor abdominal e desidratação. Entretanto, a doença pode se agravar e até mesmo levar à morte, quando associada à desnutrição, ou ainda quando associada à quadros graves de desidratação. O período de incubação é de um a três dias, e o vírus pode ser excretado nas fezes por um período de até 20 dias. A diarréia geralmente é autolimitada e a recuperação do paciente tende a ocorrer num período de sete a dez dias (BISHOP, 1996).
A idade do paciente parece influenciar na severidade da doença. As infecções em neonatos são assintomáticas ou associadas à doença branda, fenômeno em parte associado à proteção de anticorpos maternos adquiridos através do aleitamento materno. As primeiras infecções sintomáticas geralmente são mais severas e ocorrem entre os seis e os vinte e quatro meses de vida. Todavia, em locais onde a exposição ao vírus á mais intensa, elas podem ocorrer mais cedo. É comum a ocorrência de re-infecções e estas costumam ser mais brandas. A alta prevalência de anticorpos anti-rotavírus em adultos sugere que ocorram re-infecções subclínicas, apontando assim, um papel potencialmente importante dos adultos na transmissão e manutenção dos rotavírus na natureza (KAPIKIAN et al., 2001; BISHOP et al, 1983).
O principal sítio de replicação viral é o intestino delgado, em particular o duodeno, situando-se especificamente nas células epiteliais maduras, os enterócitos, que revestem as microvilosidades intestinais. Estas células epiteliais possuem a função de absorção, porém quando há a infecção por rotavírus, elas sofrem um processo de descamação, em conseqüência da replicação viral. A extensa lesão do epitélio desencadeia o fenômeno de má-absorção o que explica o caráter
essencialmente osmótico da diarréia (BISHOP et al., 1996). A diminuição da absorção de sais e água em decorrência do dano celular, reduz a superfície absortiva do intestino, acarretando o acúmulo de fluido no lúmem do intestino e a diarréia (RAMIG, 2004; BURKE &DESSELBERGER, 1996).
Acredita-se que a dose infectante seja de 10 -100 partículas virais. Uma pessoa com diarréia por rotavírus excreta de 108-1010 partículas infecciosas por mililitro de fezes (W.H.O, 1996). Isto quer dizer que apenas uma gotícula contendo este vírus, ao precipitar-se sobre a superfície de um brinquedo onde uma criança encoste a boca já será o suficiente para iniciar uma infecção (GLASS, 2006).
No Brasil, o uso rotineiro da fórmula reidratante oral, preconizada pela Organização Mundial de Saúde, tem se revelado prática altamente eficaz no combate à diarréia aguda, e de ampla aceitação (LINHARES, 2000).
2. Epidemiologia
2.1 Morbidade e mortalidade:
O rotavírus possui grande importância, pois entre os patógenos causadores de gastrenterites, está posicionado como o agente etiológico mais prevalente nas doenças diarréicas agudas em crianças de até cinco anos em todo o mundo. Em países em desenvolvimento, os rotavírus possuem uma alta taxa de morbidade, seguida por uma taxa de mortalidade igualmente alta. Estima-se que aproximadamente 40% das hospitalizações por diarréia infantil, em países em desenvolvimento, estejam associadas á infecções por rotavírus, levando a um número de aproximadamente 870.000 mortes a cada ano (W.H.O, 1996).
Em países desenvolvidos, a diarréia por rotavírus ocorre com alta freqüência, mais com uma taxa de mortalidade baixa, que pode ser atribuída ao desenvolvimento de meios efetivos de reposição dos fluidos e eletrólitos perdidos durante a doença, essas melhorias na terapia resultam em um notável decréscimo na mortalidade, em todas as diarréias infantis (DOMINGUES, 1998).
A ocorrência universal dos rotavírus é amplamente reconhecida, sabendo-se que praticamente todas as crianças, aos cinco anos, já se infectaram. Em geral, a incidência das infecções sintomáticas assume maior expressão na faixa etária de 6 a 24 meses. Em contrapartida, prevalecem as formas inaparentes entre recém nascidos e lactentes até os 3-4 meses, provavelmente como decorrência da proteção conferida pelos anticorpos de origem materna (LINHARES, 1997; BISHOP et al., 1983; ALBERT, et. al., 1982; BISHOP, 1996).
A severidade dos episódios diarréicos caudados por rotavírus é de amplo conhecimento, notando-se maior impacto nos países em desenvolvimento, onde
aparecem como agravantes a desnutrição e os simultâneos processos infecciosos envolvendo outros patógenos entéricos (LINHARES, 2000).
No Brasil, apesar dos importantes avanços alcançados na prevenção e no controle das doenças infecciosas, as doenças diarréicas agudas, ainda continuam como um dos principais problemas de saúde pública e um grande desafio às autoridades sanitárias (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Em 2004, foram notificados pelo sistema de vigilância da MDDA (Monitoramento das Doenças Diarréicas Agudas), ao Ministério da Saúde, 2.395.485 casos de diarréia em geral, considerando todas as etiologias, sendo distribuídos os casos por região de procedência: 321.141 no norte; 995.055 no nordeste; 212.328 no sul; 586.191 no sudeste e 279.770 na região centro-oeste (Figura 2.1) (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Figura 2.1: Casos de doença diarréica aguda por região, segundo a MDDA, em
2.2. Distribuição geográfica:
A epidemiologia dos rotavírus é complexa havendo predominância de determinados tipos, os quais podem variar de região e de ano para ano (GOUVEA et al., 1990b).
Os rotavírus do grupo A são endêmicos em todo mundo. Eles são a principal causa de diarréia em crianças, sendo também responsáveis por infecções desse tipo na maioria dos animais (YANG et al., 2004).
Os rotavírus do grupo B, também chamados de rotavírus da diarréia de adultos, são responsáveis por epidemias de diarréia grave que afetam milhares de pessoas entre todas as faixas etárias na China (HUNG et al, 1983).
Sustenta-se que os rotavírus do grupo C são patógenos primários de suínos, embora também seja evidente o seu papel nas gastroenterites humanas. Não raro, tais agentes são associados a surtos de diarréia em situações favorecidas pela formação de agrupamentos humanos como, por exemplo, escolas ou mesmo o seio familiar (LINHARES, 2000).
Os rotavírus do grupo C têm sido associados com casos esporádicos de diarréia em crianças em vários países, e mais recentemente foram notificados os primeiros surtos no Japão e Inglaterra (GOUVEA et al., 1991; KAPIKIAN et al., 2001; W.H.O ,1996).
No Brasil, os dados pioneiros cabem a Pereira et al (1983), que descreveram a infecção por rotavírus do grupo C em crianças no Rio de Janeiro. Porém, estes agentes também foram detectados, entre crianças com diarréia, em Belém (LINHARES, 1997), no Distrito Federal e em São Paulo (LINHARES, 2000).
2.3. Transmissão:
Os rotavírus são transmitidos pela via fecal-oral, ocorrendo através de mãos e objetos contaminados. Creches, asilos e hospitais são focos de propagação do vírus. A excreção assintomática de rotavírus aponta, um papel potencialmente importante dos adultos na transmissão e perpetuação dos rotavírus de forma endêmica (KAPIKIAN et al., 2001). A água é um importante, talvez o mais expressivo, meio de propagação dos rotavírus em lugares com saneamento básico deficiente ou inexistente. Nessas condições, são comuns escapes de dejetos humanos e de animais para os reservatórios de água, o vazamento de esgoto particularmente após chuvas, enchentes e transbordamento de rios causando a contaminação da água distribuída à população. A utilização de água contaminada na agricultura pode também produzir surtos de diarréia por rotavírus presente em alimentos consumidos crus ou mal lavados (KAPIKIAN et al, 2001, ESTES, 2001)
A transmissão também pode ocorrer entre diferentes espécies animais, e entre estes e o homem. Experimentalmente, a infecção por rotavírus de espécies diferentes pode resultar na doença diarréica. Segundo Gouvêa & Brantly (1995), os rotavirus existem como uma população mista de vírus reagrupados, possivelmente decorrentes da transmissão natural entre diferentes espécies de rotavírus, o que pode contribuir para uma maior diversidade dos rotavírus circulantes, encontrada nos países tropicais em desenvolvimento (GOUVEA & SANTOS, 1997).
2.4. Distribuição temporal:
Em países de clima temperado, os rotavírus exibem um padrão de infecção, com picos endêmicos ocorrendo durante os meses frios do ano. Em países de clima tropical, a ocorrência da infecção é observada durante todo o ano (KAPIKIAN et al., 2001; W.H.O 1996;).
No Brasil, a distribuição sazonal da ocorrência de infecções por rotavírus ao longo do ano, se apresenta de duas formas distintas, dependendo da região avaliada. O período do acontecimento endêmico das gastrenterites incide nos meses mais secos nas regiões Centro-Oeste, Sul e Sudeste. No entanto, este padrão não é registrado no Norte e no Nordeste brasileiro, onde os casos são encontrados de maneira mais regular durante todo o ano (LINHARES, 1997; LINHARES, 2000). Segundo Rosa e Silva et al (2001), os números mais elevados de casos na Região Sudeste, mais especificamente em Juiz de Fora, Minas Gerais, são encontrados nos meses mais frios e secos do ano, atingindo um pico nos meses de junho e julho (Figura 2.2).
FIGURA 2.2: Demonstração gráfica da correlação entre o número de casos rotavírus
positivos e a variação de temperatura e pluviosidade em Juiz de Fora, Minas Gerais (ROSA e SILVA, et al., 2001).
2.5 Epidemiologia molecular dos rotavírus:
Os rotavírus possuem um genoma formado por 11 segmentos de RNA dupla-fita. Quando submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) estes segmentos são separados em bandas bem definidas, formando os perfis eletroforéticos, ou eletroferotipos. A análise eletroforética dos rotavírus é importante no estudo epidemiológico para analisar a coexistência de diferentes eletroferotipos em uma mesma epidemia, o aparecimento de um novo perfil, o desaparecimento de algum perfil que outrora fora encontrado, ou ainda detectar a predominância de um determinado perfil eletroforético na comunidade. (GOUVEA & SANTOS, 1997; ROSA E SILVA et al., 2001; DESSELBERGER, 1996).
Estudos epidemiológicos tem demonstrado que as amostras do grupo A, subgrupo I e, sorotipos G2P[4] e as amostras subgrupo II G1P[8], G3P[8] e G4P[8] são responsáveis pela maioria das infecções em humanos (KAPIKIAN et al, 2001; TIMENETSKY et al, 1994; GOUVEA et al 1990b, 1994; GOUVEA et al 1994; LUZ et al 2005 ).
Estudos realizados nos últimos dez anos no Brasil mostraram a circulação dos tipos mais comuns de rotavírus (G1, G2, G3, G4 e P[4],P[6] e P[8]), observando-se maior incidência de rotavírus tipo G1 P[8] e a emergência do tipo G9, a partir de 1998, como em grande parte do mundo (COSTA et al., 2004).
Todavia, alguns estudos mostraram a existência de amostras de rotavírus com combinações diferentes de tipos P e G, considerados incomuns, detectadas principalmente nas áreas em desenvolvimento. No Brasil, entre outros, foi detectado o tipo G5 P[8] em grande numero de amostras humanas, por pelo menos duas décadas. (GOUVEA & BRANTLY, 1995; GOUVEA et al., 1994; TIMENETSKY et al,
1994), Foram detectadas também, alem de amostras incomuns G5P[8], amostras apresentando ao mesmo tempo, especificidade de dois tipos G distintos, G5 e G11 (TIMENETSKY et al., 1997). O grande número de infecções mistas que se tem encontrado favorece a reagrupamentos dos segmentos genômicos e, conseqüentemente, o aparecimento de novos genótipos (GOUVEA & BRANTLY, 1995).
A extensa diversidade genômica apresentada pelas amostras brasileiras exige um monitoramento epidemiológico para que se possa conhecer as amostras recombinantes e os possíveis tipos emergentes de rotavírus na comunidade. Para tanto, se faz necessário a contínua realização de trabalhos de caracterização desses vírus, para monitorar, não só o surgimento de novos tipos, como também as mudanças na prevalência das amostras, o que permitirá entender melhor a evolução dos rotavírus.
3. Análise de eletroferotipos
O termo eletroferotipagem é aplicado como método de diferenciação das muitas amostras de rotavírus. Isto se dá pelo fato dos rotavírus humanos apresentarem grande variedade de perfis eletroforéticos (KAPIKIAN, et al 2001).
Os 11 segmentos de RNA de fita dupla dos rotavírus do grupo A podem ser agrupados, segundo a ordem de migração em PAGE, em quatro grupos facilmente distinguíveis. O grupo I compreende quatro segmentos (1 a 4); o grupo II, dois segmentos (5 e 6); o grupo III, três segmentos (7 a 9); e o grupo IV, dois segmentos (10 e 11). Assim, para os rotavírus do grupo A, observa-se a distribuição 4, 2, 3, 2 (Figura 3.1)
FIGURA 3.1: Classificação dos segmentos genômicos do rotavírus do
grupo A, segundo ordem de migração em PAGE (Domingues, 1998).
Com esse padrão de distribuição, os rotavírus do grupo A distinguem-se facilmente dos rotavírus dos grupos B e C, que possuem os padrões de distribuição respectivamente (4, 2, 2, 3 e 4, 3, 2, 2).
Dentro de cada grupo de segmento de RNA dupla-fita, podem ocorrer variações nos padrões de corrida eletroforética. A variação mais evidente ocorre no grupo IV, devido à mobilidade do 11° segmento, que é uma característica muito utilizada para diferenciar os padrões. Sua velocidade de migração na eletroforese dá origem aos padrões “curto” e “longo” (Figura 3.2) (PUERTO-SOLIS et al., 2001). Em grande parte dos estudos utilizando o método de PAGE há uma predominância de padrões longos, característicos de sorotipos G1, G3, G4 e G9. O padrão curto é geralmente ligado ao sorotipo G2, sendo menos heterogêneo que o primeiro. Este método é bastante eficiente para a detecção de linhagens recombinantes, avaliar a heterogeneidade de isolados humanos e verificar a ocorrência de infecções mistas (GOUVEA et al., 1990b). Ainda que haja mudanças no perfil eletroforético não significam, necessariamente, modificações nos sorotipos (ESPEJO et al., 1980).
L C
Figura 3.2: Eletroferotipo de padrão longo (L), comparado ao vírus
padrão curto (C) (DOMINGUES, 1998).
4. Vacina
Atualmente, predomina o consenso de que o controle eficaz das gastroenterites por rotavírus está diretamente relacionado à descoberta de uma vacina eficaz para uso rotineiro ao longo do primeiro semestre de vida. Essa conclusão se baseia em pesquisas epidemiológicas das infecções por esses vírus, que demonstra uma certa analogia entre as taxas de incidência da doença nos países desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento (LINHARES, 2000).
A primeira vacina a ser produzida comercialmente foi a Rotashield®, desenvolvida a partir de uma preparação tetravalente recombinante (RRV-TV), que reuniu rotavírus de origem animal (macaco rhesus) e humana, atenuada após múltiplas passagens em cultura de célula (GLASS et al., 2005). A vacina em questão possuía três amostras com especificidade antigênica para G1, G2 e G4, e uma cepa homóloga para o sorotipo G3, e foi licenciada, em 1998, pela FDA (Food and Drug Administration) para uso nos Estados Unidos. Essa vacina foi testada nos Estados Unidos Finlândia e Venezuela demonstrando uma eficácia superior a 90% no combate ao rotavírus (GLASS et al., 2004). Imediatamente após ser liberada a comercialização da vacina, sua administração foi realizada em larga escala em crianças de 2, 4 e 6 anos de idade. Porém, em 1999 o Centro de Controle de Doenças (CDC), nos Estados Unidos constatou casos de intussuscepção, que consiste na invaginação de qualquer parte do intestino em outra porção adjacente, e recomendou a suspensão da vacina (FISCHER et al., 2004).
Em contra partida ao insucesso da Rotashield®, estão sendo desenvolvidas duas novas vacinas para o combate ao rotavírus, a Rotateq (Merck & Co.) e a Rotarix(GlaxoSmithKline) (DADLEY-MOORE, 2006).
A RotaTeq® , produzida pela Merck , é uma vacina oral atenuada pentavalente, com rearranjo humano-bovino que,segundo testes realizados, confere imunidade para os sorotipos G1, G2,G3, G4 e P[8] e oferece elevada proteção para as formas graves de diarréia (FISCHER et al., 2004). Esta vacina parece prevenir 98% dos casos severos de rotavírus e reduz a hospitalização e o atendimento emergencial em 96% e 94% respectivamente. A RotaTeq® recentemente foi licenciada pela FDA para ser comercializada e acaba de ser escolhida pelo CDC nos Estados Unidos para ser administrada em crianças americanas (PARASHAR & GLASS, 2006).
A RotaRix®, produzida pela GlaxoSmithKline Biologicals, é assim como a RotaTeq® , uma vacina oral atenuada, porém, monovalente, conferindo imunidade para o tipo G1P[8] (cepa RIX4414). Estudos preliminares demonstraram a eficácia da vacina em testes realizados na Finlândia e nos Estados Unidos. As pesquisas no Brasil, no México e na Venezuela revelaram a inexistência de efeitos colaterais e apontaram também, a eficácia da vacina na proteção da diarréia causada pelo sorotipo G9. Novas pesquisas estão sendo conduzidas na América Latina, Ásia e no Sul da África (FISCHER et al., 2004). Em julho de 2004, essa vacina recebeu a aprovação da União Européia para ser comercializada na Europa (GLASS et al., 2005). No Brasil, a RotaRix®, foi licenciada em julho de 2005, com o nome de vacina oral de rotavírus humano (VORH), pela ANVISA (Registro do produto nº 10107024300 – publicada em 11/07/2005 no DOU), porém só foi implantada no Calendário Básico de Imunização para Criança em março de 2006 (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006), sendo recomendada sua administração aos dois e aos quatro meses de idade. Com esta medida se espera uma redução de aproximadamente 34% no número de mortes de crianças com menos de cinco anos provocadas por diarréia (GLASS, 2006).
5. Objetivos
9 Estudar os aspectos epidemiológicos da infecção por rotavírus em crianças hospitalizadas;
9 Analisar a distribuição mensal dos casos positivos de rotavírus e verificar um possível padrão de sazonalidade;
9 Correlacionar a incidência da doença com a idade;
9 Caracterizar as amostras de rotavírus positivas quanto ao seu eletroferotipo e a freqüência dos mesmos.
6. Material e métodos
6.1. Amostras:
Neste estudo, foram analisadas amostras fecais de 102 crianças entre 0 e 12 anos de idade, hospitalizadas no setor de emergência do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira ( IPPMG-UFRJ /RJ), com clínica sugestiva de rotavirose, durante o período de janeiro de 2005 a junho de 2006. Foi adotado como critério de inclusão a presença de doença diarréica aguda. No momento de cada coleta, foi preenchida, pelos responsáveis, uma ficha de identificação com informações pessoais e clínicas do paciente e assinado um termo de livre consentimento, aprovado pelo Conselho de Ética do IPPMG/UFRJ, concordando com a participação das crianças na presente pesquisa.
6.2 Coleta
e
transporte:
As amostras fecais foram colhidas e estocadas a temperatura ambiente até o seu transporte, este foi realizado, em acondicionadores térmicos apropriados. No laboratório, as mesmas foram devidamente registradas, rotuladas e estocadas a 4°C, até o seu processamento.
6.3 Triagem das amostras positivas para rotavírus:
A triagem das amostras positivas para rotavírus foi realizada no laboratório, através de eletoroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para a obtenção do perfil
eletroforético das amostras positivas. Para isto, as amostras fecais foram submetidas á uma clarificação, e posterior extração do ácido nucléico viral.
6.4 Clarificação:
Obteve-se uma suspensão de fezes em tampão Tris 0,1 M em pH 7.8. As suspensões foram então clarificadas, através de centrifugação a 12.000 g, durante cinco minutos a temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados e introduzidos em novos tubos devidamente identificados.
6.5 Extração de RNA viral:
As amostras clarificadas foram tratadas para a extração do RNA viral, segundo protocolo de Gouvêa et al (1991) para purificação de ácidos nucléicos, com algumas modificações. Após a clarificação, foi acrescentado às amostras dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10 %, em uma proporção de 1:10, omitindo-se o use de proteinase K. Estas foram então, agitadas e incubadas em banho-maria a 56 °C, por 15 minutos. Logo após, às amostras foi adicionado igual volume de fenol-clorofórmio, rapidamente agitadas em homogeneizador e incubadas à temperatura ambiente por 3 minutos. Este último processo foi repetido por cinco vezes. No protocolo original nesta etapa, as amostras seriam transferidas para um novo tubo contendo hidroxiapatita para adsorção dos ácidos nucléicos e eliminação de inibidores enzimáticos através de lavagens. Essa purificação, requerida antes da reação de RT-PCR, não é necessária para PAGE. Após isso, as amostras foram submetidas à centrifugação de 12.000 g, por mais 15 minutos. O sobrenadante (parte superior) foi
transferido para outro tubo. O RNA foi então precipitado, após a adição de NaCl a 20 % e de 2 volumes de etanol, seguida de incubação, por um período de aproximadamente 18 horas, a – 20°C.
6.6 Tratamento das amostras:
Após o tempo estipulado, passa-se ao tratamento das amostras para posterior aplicação em gel de poliacrilamida.
A precipitação ocorre após centrifugação a 12.000 g, por 15 minutos, os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos de RNA foram secos com o auxílio de um papel de filtro, e ressuspensos com a adição de 20 a 40 µL de tampão de tratamento de amostra (TTA), (água destilada, Tris-HCl pH 6.8, glicerol, SDS 10 %, 2-β-mercaptoetano, azul de bromofenol 1 %), seguida de homogeneização e
posterior incubação em bloco-seco a 56°C por 10 minutos e imediata aplicação em gel de poliacrilamida.
6.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE):
A eletroforese é uma técnica para separação de moléculas numa mistura sob a influência de um campo elétrico gerado pela diferença de potencial aplicado. As moléculas dissolvidas migram a uma velocidade determinada por suas cargas: razão de massa
Os segmentos genômicos de RNA dos rotavírus são muito bem separados pelo método de PAGE proposto por Laemmli (1970) (YANG et al. 2004), que utiliza
um gel descontínuo, ou seja, composto por duas fases: uma fase concentradora (gel superior, a uma concentração de 4 % de acrilamida) e uma fase separadora
(gel inferior, a uma concentração de 7.5 % de acrilamida).
No gel superior, o ácido nucléico se concentra, possibilitando uma melhor resolução das bandas. No gel inferior, as moléculas são então segregadas de acordo com seu peso molecular.
Neste experimento foram utilizadas cubas Mini-V8. 10 Vertical Gel Electrophoresis System – Gibco BRL – Life Technologies, segundo seu manual.
6. 7.1 Preparo do gel de poliacrilamida :
As placas de vidro para géis, uma maior e outra menor, foram limpas com solução de álcool 70 %, e então montadas, separadas por espaçadores de 0,75 mm que dão forma ao gel.
O pente foi inserido entre as placas de vidro e com o auxílio de uma caneta marcou-se a distância de aproximadamente um cm abaixo da linha dos dentes do pente. Este foi o nível ao qual o gel inferior foi vertido.
• Gel inferior (7.5 %):
Para 2 géis de 7.5 % foram utilizados: • 4,8 ml de água destilada;
• 2,5 ml de Tris-HCl 1,5 M em pH 8.8;
• 0,1 ml (100 µL) de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 10 %; • 2,5 ml de acrilamida/bis;
• 0,01 ml (10 µL) de TEMED(tetrametiletilenodiamina).
As soluções foram adicionadas nesta ordem, homogeneizadas e imediatamente vertidas até o nível anteriormente marcado, com o devido cuidado para não formar bolhas de ar.
Deixou-se o gel polimerizar por aproximadamente 45 minutos em temperatura ambiente.
Durante esse período, foi preparada a solução do gel superior:
• Gel superior (4 %):
Para dois géis de 4.0 % foram utilizados: • 3,0 ml de água destilada; a esta, • 1,25 ml de Tris-HCl 0.5 M (pH 6.8);
• 0,05 ml (50 µL) de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) a 10 %; • 0,65 ml (650 µL) de acrilamida/bis;
• 0,05 ml(50 µL) de Persulfato de Amônio (PA);
• 0,005 ml (5 µL) de TEMED (Tetrametiletilenodiamina).
As soluções foram adicionadas nesta ordem, homogeneizadas e imediatamente vertidas até a borda do vidro menor. Um pente de 0,75 mm de espessura, com dez dentes foi embutido entre as placas de vidro.
Deixou-se o gel polimerizar por aproximadamente, 45 minutos, em temperatura ambiente.
6.7.2- Eletroforese das amostras :
As amostras foram corridas em tampão Tris-Glicina (Tris-base 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0,1 %),com uma voltagem inicial de 100 V por 30 minutos. Este é aproximadamente o tempo necessário para que a amostra se torne compacta para iniciar a corrida no gel de maior resolução. Após este tempo houve um aumento da tensão para 150 V, onde o gel correu por aproximadamente 1 hora e 20 minutos até a saída do corante azul do tampão de tratamento da amostra. Após a saída do azul do tampão de amostra, esperou-se mais 40 minutos, quando o gel era único em uma cuba, e mais 50 minutos quando o gel estava em duplicata em uma mesma cuba levando a um tempo total de aproximadamente 2 horas por corrida.
6.7.3- Coloração do gel:
- Após a corrida a fonte foi desligada e as placas foram retiradas da cuba. Os espaçadores foram cuidadosamente removidos, evitando assim danos no gel e as placas foram separadas. O gel assim que retirado, foi marcado para posterior identificação e mergulhado em solução fixadora (10 ml de etanol, 5 ml de ácido acético para 100ml de água destilada), em cuba devidamente identificada e agitado por trinta minutos, quando revelado no mesmo dia,ou armazenado, quando corado posteriormente.
Os géis foram revelados, segundo protocolo de Herring et al., 1982. Após serem agitados em solução fixadora por 30 minutos, os géis foram lavados com um pouco de água destilada e remanejados para uma solução de nitrato de prata a 10mM e agitados por mais 30 minutos. Ao término deste tempo, os géis foram novamente lavados com água destilada e banhados em solução reveladora (75 ml
de hidróxido de sódio 1 N, 760 µL de formaldeído para 100 ml de água destilada) por aproximadamente 10 minutos. A reação foi inibida com a adição de solução de parada, com uma concentração de 5 % de ácido acético (50 ml de ácido acético glacial, 100 ml de etanol, 10 ml de glicerol, 1000 ml de água destilada-q.s.p.).
Após esse procedimento os géis foram desidratados em papel celofane e guardados com suas devidas identificações.
6.8 Ensaio
imunoenzimático
(EIARA):
As amostras negativas pelo método do PAGE foram submetidas á uma nova avaliação, desta vez por EIARA (Ensaio Imunoenzimático para detecção de Antígenos de Rotavirus e Adenovirus), através do kit EIARA, gentilmente cedido pela Fundação Osvaldo Cruz / Biomanguinhos (FIOCRUZ). Este teste se baseia na técnica do “sanduíche duplo” e detecta a presença do antígeno de grupo (VP6) dos rotavírus e da fibra ou hexon dos adenovírus nas fezes.
Neste experimento as amostras também foram clarificadas, porém, com outros tipos de reagentes.
6.8.1- Clarificação das amostras:
Obteve-se uma suspensão de fezes em 400 µL de PBS (tampão salina-fosfato, pH 7.4). As suspensões foram então clarificadas, através de centrifugação a 12.000 g, durante cinco minutos a temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados e introduzidos em novos tubos, previamente identificados.
Amostras clarificadas foram submetidas a um ensaio imunoenzimático para a detecção de antígenos de rotavirus ( do grupo A) e adenovirus .
6.8.2-Sensibilização das placas:
As microplacas de 96 poços foram sensibilizadas com 100 µL/poço de soro hiperimune de cabra, anti-rotavírus (para a captura de rotavírus) diluído 1:100 em tampão fornecido com o kit. A placa foi selada e incubada a 4°C por 16horas.
6.8.3-Adição de amostras e controles:
Após a incubação, o conteúdo das cavidades foi desprezado, e as mesmas foram lavadas três vezes, com tampão de lavagem fornecido com o kit, através da adição de 200 µL de tampão por orifício.
Os controles positivo e negativo, e cada amostra a ser analisada foram testados e diluídos a ¼ em tampão fornecido com o kit, nas cavidades de reação. Foram distribuídos 75 µL do diluente em cada cavidade utilizada, sendo adicionados a seguir 25 µL das amostras e controles. A placa foi selada e incubada na estufa à 37° C por 1 hora.
6.8.4-Detecção de antígenos:
Após a incubação, o conteúdo das cavidades foi desprezado, e as mesmas lavadas três vezes, segundo o procedimento anterior. O antissoro de cobaia anti-rotavirus foi diluído 1:100 em diluente fornecido pelo Kit. Em cada cavidade, foram adicionados 100 µL da diluição. A placa foi selada e incubada em estufa a 37°C por 1 hora.
6.8.5-Conjugado:
Após a incubação, o conteúdo das cavidades foi desprezado, e as mesmas lavadas três vezes, segundo o procedimento anterior. O anti-soro de coelho anti-IgG de cobaia conjugado à peroxidase foi diluído 1:100 em tampão fornecido com o kit, e posteriormente, distribuído em volumes de 100 µL em cada cavidade, exceto nos
correspondentes ao controle do substrato, nos quais foram adicionados 100 µL do diluente do conjugado. A placa foi selada e incubada em estufa a 37°C por 1 hora.
6.8.6-Substrato:
Após a incubação, o conteúdo das cavidades foi desprezado, e as mesmas lavadas três vezes, segundo o procedimento anterior. Foram, então adicionados 100 µL, na diluição 1:100, do substrato (H2O2 + cromógeno: TMB) em todos os poços. As
placas foram incubadas à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, por 15 minutos. As amostras positivas para rotavírus e adenovírus apresentam coloração azul, quando comparadas com o controle negativo. A intensidade do azul dos controles positivos orienta o tempo de incubação do substrato, uma vez que variações de temperatura no ambiente alteram sobremaneira a velocidade da reação.
6.8.7-Bloqueador:
A reação foi bloqueada com a adição de 50 µL de ácido sulfúrico (H2SO4) 2 M,
em todas as cavidades da placa.
6.8.8- Leitura e interpretação:
A leitura dos resultados foi feita em aparelho espectrofotométrico após a adição do ácido sulfúrico que torna a coloração amarela. As amostras foram lidas através do filtro 450 nm e consideradas positivas quando apresentaram DO450, pelo
7. Resultados:
Um total de 102 amostras fecais foram obtidas de crianças com sintomas de diarréia aguda atendidas no IPPMG entre janeiro de 2005 e junho de 2006. Destas, 33 (32,4%) apresentaram resultados positivos para rotavírus do grupo A por um ou pelos dois métodos utilizados.
7.1 Distribuição de rotavírus nos meses estudados:
A figura a seguir, ilustra a distribuição mensal das amostras coletadas durante o período de estudo, assim como das amostras de rotavírus positivas, em cada mês (Figura 7.1). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 J F M A M J J A S O N D J F M A M J
Meses (Jan/05 - Jun/06)
Nú m e ro to ta l de a m o s tr as
Amostras recebidas Amostras positivas
Figura 7.1: Distribuição das amostras rotavírus positivas do total de amostras recebidas no
Pudemos observar infecção por rotavírus nos meses de março a setembro, de 2005, sendo que no ano seguinte casos de gastroenterite tiveram início
excepcionalmente em fevereiro, ainda durante o verão. (Figura 7.2).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 J F M A M J J A S O N D J F M A M J
Meses (Jan/05 - Jun/06)
Número de amostras positivas
7.2-Distribuição dos casos de rotavírus de acordo com a faixa
etária:
A distribuição das rotaviroses de acordo com a faixa etária foi observada em 96 crianças, das 102 cadastradas, que tinham suas idades informadas na ficha de dados clínicos e epidemiológicos.
Na tabela abaixo, podemos observar o número total de amostras coletadas, assim como as faixas etárias estudadas e as amostras positivas e negativas (Tabela 7.1).
Tabela 7.1: Distribuição das rotaviroses nas 96 crianças que tinham suas idades
conhecidas.
ROTAVÍRUS Faixa etária em meses Total
0-5 6-11 12-23 24-48 >48*
Negativos 10 16 20 11 8 65
Positivos 8 11 6 6 0 31
Total 18 27 26 17 8 96
*Faixa etária até 11 anos
7.3- Perfil eletroforético do genoma de rotavírus:
Na figura a seguir, ilustra-se o PAGE de algumas amostras do presente estudo, revelando o perfil eletroforético do genoma de rotavíus do grupo A, com a maioria de padrão longo, e algumas poucas representando o perfil curto (Figura 7.3),. Todas as amostras de 2005 apresentaram não só perfil longo, mas aparentemente um único perfil.
Do total das 33 amostras positivas para rotavírus, 29 (87,8%) foram detectadas apenas através do método de PAGE, todas apresentando o perfil eletroforético característico dos rotavírus do grupo A (4, 2, 3, 2). A analise comparativa destes perfis demonstrou que 25 (86,2%) amostras apresentaram eletroferotipo longo, enquanto quatro (13,8%) possuíam um perfil curto (Figura 7.4).
86%
14%
Padrão longo
Padrão curto
Figura 7.4 : Porcentagem dos eletroferotipos de rotavirus obtidos de fezes de crianças com
7.4- Distribuição dos padrões longo e curto encontrados:
Em nosso estudo o padrão longo foi o mais comum, sendo detectado na maioria dos meses de 2005 e nos primeiros três meses de 2006, em que foi constatada a infecção por rotavírus. O padrão curto, entretanto, apenas foi encontrado nos meses de abril a junho de 2006 (Figura 7.5).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 J F M A M J J A S O N D J F M A M J
Meses (Jan/05 - Jun/06)
Núm e ro de a m os tra s
Padrão longo Padrão curto
7.5- Distribuição dos padrões longo e curto nas faixas etárias
estudadas:
Na gráfico abaixo, os eletroferotipos longos e curtos estão distribuídos entre as faixas etárias estudadas. Podemos notar que o padrão longo incidiu em todas as faixas etárias, enquanto que o padrão curto ocorreu principalmente em crianças de seis a onze meses, embora o número reduzido de amostras com este padrão não permita uma análise conclusiva de sua preferência por uma determinada faixa etária (Figura 7.6), 0 1 2 3 4 5 6 7 8 N ú m er o d e am o st ras 0 - 5 6 - 11 12 - 23 24 - 48 >48 Idade (m eses)
Padrão longo Padrão curto
7.6- Diagnóstico por ensaio imunoenzimático (EIARA):
Das 73 amostras negativas por PAGE, 56 foram submetidas ao EIARA, devido à escassez das demais amostras. Neste teste imunoenzimático foram obtidos quatro resultados positivos adicionais para rotavírus aumentando o numero de amostras positivas de 29 para 33. Encontrou-se três resultados positivos para adenovírus, demonstrando que pelo menos 5, 3% .das gastroenterites estavam provavelmente associados a este agente etiolólgico.
Na figura a seguir, são demonstrados, os percentuais de amostras rotavírus e adenovírus positivas, assim como o das amostras negativas no teste EIARA.
88%
7% 5%
Amostras negativas Amostras rotavírus positivas Amostras adenovírus positivas
Figura 7.7: Resultado obtido por EIARA realizado em 56 amostras negativas
8. Discussão
Em nosso estudo pudemos observar a associação do rotavírus em 32,4% dos casos de diarréia aguda diagnosticada em crianças de zero a doze anos hospitalizadas no setor de Emergência do Instituto de Puericultura e Pediatria e Martagão Gesteira (IPPMG-UFRJ), no período de janeiro de 2005 a junho de 2006. Este resultado ficou um pouco aquém dos 40-50% de positividade geralmente encontrada para rotavírus em crianças hospitalizadas por diarréia aguda em todo o mundo. Em contraponto, a percentagem verificada para adenovírus (5,3%) está no limiar dos resultados de 3-5% descritos na literatura (KAPIKIAN, 2001; PARASHAR et al, 2003; GLASS, 2006).
O padrão de sazonalidade encontrado apresentou características distintas ao que grande parte dos estudos revelam. Em nosso estudo observamos a ocorrência de rotavirose durante os meses de março a setembro de 2005 com picos em março e maio (apesar de uma certa descontinuidade no número de amostras estudadas), resultado estes, distintos dos dados encontrados na literatura, onde a grande parte dos estudos relatam a ocorrência entre os meses de maio e outubro, com pico em junho-julho (LINHARES, 1997; ROSA E SILVA, et. al., 2001; LINHARES, 2000)
A importante contribuição dos rotavírus para o aumento do numero de gastroenterite em determinados meses foi dentro do esperado com base em estudos anteriores. No entanto, números elevados de casos de rotavírus foram observados, extraordinariamente, nos meses de fevereiro e março, durante o verão no Rio de Janeiro, casos estes raramente relatados.
As rotaviroses incidiram na faixa etária de zero a quatro anos, sendo observado que há um aumento crescente do número de casos até um ano de idade,
quando então este número decresce, talvez indicando uma maior vulnerabilidade à infecção por rotavírus, nas faixas etárias abaixo de um ano. Esses resultados confirmam parcialmente dados anteriormente publicados, onde grande parte das infecções sintomáticas por rotavírus no Brasil ocorrem em crianças com idade de seis meses a dois anos (LINHARES, 2000).
Através da análise do perfil eletroforético das amostras, pudemos constatar que houve apenas infecções por rotavírus do grupo A neste estudo. Diferentemente de todos os resultados publicados para o Rio de Janeiro, um único eletroferotipo foi encontrado durante todo o ano de 2005, sendo que o mais comum é ter vários eletroferotipos de rotavírus em um mesmo ano epidemico (COSTA, et al., 2004; ALBERT, et al., 1982), .o que nos leva a concluir tratar-se de uma única amostra viral, provavelmente nova, emergente na comunidade. Isto explicaria o grande numero de lactentes com menos de seis meses, idade geralmente refratária à doença, acometidos por diarréia severa por rotavírus naquele ano.
Através da PAGE foi também observado a introdução de um novo rotavírus de perfil curto em 2006, não detectado no ano anterior, sendo este detectado em crianças na faixa etária entre oito meses e três anos.
9. Conclusão
Neste estudo sobre a epidemiologia e caracterização eletroforética dos rotavírus, algumas características estão bem definidas, e concordam com outros estudos realizados no Brasil, assim como em outras partes do mundo. Tais como, a importância dos rotavírus na etiologia da diarréia aguda infecciosa; a maior prevalência do rotavírus do grupo A nas gastroenterites infantis; a predominância do padrão eletroforético longo sobre o padrão curto; a incidência do padrão curto em períodos isolados de tempo.
Contudo, algumas peculiaridades foram observadas neste estudo, como a homogeneidade dos padrões longos, e o casos de rotavirose iniciando-se precocemente no mês de março, sugerindo tratar-se de um surto causado por um novo tipo de rotavírus de caráter epidêmico.
Dados como a maior susceptibilidade de crianças entre zero e onze meses à infecção por rotavírus revelam alguma similaridade com trabalhos anteriormente publicados.
Este é um estudo que tenta contribuir para o esclarecimento de algumas características da epidemiologia dos casos de rotavírus no município do Rio de Janeiro, no período pré-implementação da vacina de imunização contra o rotavírus, auxiliando assim, futuras análises, através da comparação dos dados, da relação custo-benefício da vacinação nesta população.
10. Referências bibliográficas
ALBERT, M. J., SOENARTO, Y. & BISHOP, R. F. 1982. Epidemiology of rotavirus diarrhea in Yogyakarta, Indonésia, as revealed by electrophoresis of genome RNA. J. Clin. Microbiol., 16(4): 731-733.
ARIAS C. F., ISA, P., GUERRERO C. A., MÉNDEZ, E., ZÁRATE, S., LÓPEZ, T., ESPINOSA, R., ROMERO, P. & LÓPEZ S. 2002. Molecular biology of rotavirus cell entry. Arch. Med. Res., 33: 356-361.
BISHOP, R.F. 1996. Natural history of ruman rotavirus infection. Arch. Virol. 12: 119-128.
BISHOP, R. S., BARNES, G. L., CIPRIANI, E. & LUND, J. S. 1983. Clinical immunity after neonatal rotavirus infection. A prospective longitudinal study in young children. New Engl. J. Med., 309: 72–76.
BISHOP, R. F., DAVIDSON, G. P., HOLMES, I. H. & HUCK, B. J. 1973.Virus particles in epithelial cells of duodenal mucosa from viral gastroenteritis during eight years of study. J. Clin. Microbiol., 18: 71-78.
BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, INFORME TÉCNICO, 2006. Doença diarréica por rotavírus: Vigilância epidemiológica e prevenção pela vacina oral de rotavírus humano-VORH. Documento elaborado pela COVEH/CGDT e CGPNI do
DEVEP/SVS/MS. Acessado em maio, 2006. Disponível em: portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/informe_rotavirus_02_03_2006.pdf
-BURKE, B. & DESSELBERGER, U. 1996. Rotavirus pathogenicity. Virology., 218: 299-305.
COSTA, P. S. S., CARDOSO, D. D. P., GRISI, S. J. F E., SILVA, P. A., FIACCADORI, F., SOUZA, M. B. L. D. & SANTOS, R. A. T. 2004. Infecções e reinfecções por rotavírus A: genotipagem e implicações vacinais. J. Pediatria., 80(2): 119-122.
CUNLIFFE, N. A., BRESEE, J. S. & HART, C. A. 2002. Rotavirus vaccines: development, current issues and future prospects. J. Infec., 45: 1-9.
DADLEY-MOORE, D. 2006. In the news rotavirus vaccines. Nature Reviews Immunology., 6: 88.
DESSELBERGER, U. 1996. Genome rearrangements of rotavirus. Adv. Vir. Res.,
46: 69-95.
DOMINGUES, A. L. S. 1998. Epidemiologia e caracterização de eletroferotipos de rotavírus em crianças hospitalizadas no Rio de Janeiro, no período 1995-1996.Tese (Mestrado). Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes. Universidade Federal do Rio de Janeiro.
ESPEJO, R. T. MUNÕS, O., SERAFIN, F. & ROMERO, P. 1980. Shift in the prevalent human rotavirus detected by ribonucleic acid segment differences. Infect. Immun., 27(2): 351-354.
ESTES, M. K. 2001. Rotaviruses and their replicacation. In: Fields Virology. 4rd ed., Lippincott-Raven, Philadelfia. P 1747-1776.
FAVACHO, A. R. M., KURTENBACH, E., SARDI, S. I. & GOUVEA, V. S. 2005. Cloning, expression, and purification of recombinant bovine rotavírus hemagglutinin, VP8*, in Escherichia coli. Protein. Expr. Purif. 46(2):196-203.
FISCHER, T. K., BRESEE, J. S. & GLASS, R. I. 2004. Rotavirus vaccines and prevention of hospital-acquired diarrhea in children. Vaccine., 22: 49-54.
FLEWETT, T. H., BRYDEN, A. S. & DAVIES, H. 1974. Diagnostic electron microscopy. II- Acute gastroenteritis associated with reovírus-like particles. J. Clin. Pathol., 27: 608-614.
FLEWETT, T.H.,BRYDEN, A.S., DAVIS, H. 1973. Virus particles in gastroenteritis. Lancet 2: 1497.
GLASS, R. I., BRESEE, J. S., TURCIUOS, R., FISCHER, T. K., PARASHAR, U. D. & STEELE, D. 2005.Rotavirus vaccines: Targeting the developing world. J. Infect. Dis.,
192: 160-166.
GLASS, R. I., BRESEE, J. S., PARASHAR, U. D., JIANG B. & GENTSCH, J. 2004. The future of rotavirus vaccines: a major setback leads to new opportunities. Lancet.,
363: 1547-1550.
GOUVEA, V. & SANTOS, N. 1997. Molecular epidemiology of rotavirus in Brazil: a model for the tropics? VIRUS Review & Research – J. Braz. Soc. Virol., 1 e 2: 15-24.
GOUVEA, V. & BRANTLY, M. 1995. Is rotavirus a population of reassortants?. Trends in Microbiol., 3: 159-162.
GOUVEA, V., DE CASTRO, L., TIMENETSKY, M. C., GREENBERG, H. & SANTOS, N. 1994. Rotavirus serotype G5 associated with diarrhea in Brazilian children. J. Clin. Microbiol., 32: 1408-1409.
GOUVEA, V., ALLEN, J. R., GLASS, WOODS, P., FANG, Z-Y, BREMONT, M., COHEN, J., McCRAE, M., SAIF, L. J., SINARACHATANANT, & CAUL, E. O. 1991. Detection of group B an C rotaviruses by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 29: 519-523.
GOUVEA, V., GLASS, R. I. WOODS, P., TANIGUCHI, K., CLARK, H. F., FORRESTER, B. & FANG, Z-Y. 1990a.Polymerase chain reaction amplification and
typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J. Clin. Microbiol., 28(2): 276-282.
GOUVEA, V., HO, M., GLASS, R.I., WOODS, P., FORRESTER, B., ROBINSON, C., ASHLEY, R., RIEPENHOFF-TALTY, M., CLARK, H. F., TANIGUCHI, K., MEDDIX, E., MCKELLAR, B. & PICKERING, L. 1990b. Serotypes and electropherotypes of human rotavirus in the USA: 1987-1989.J. Infect. Dis., 162: 362-367.
HERRING, A. J., INGLIS, N. F., OJEH, C. K., SNODGRASS, D. R. & MENZIES, J. D. 1982. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrilamide gels. J. Cin. Microbiol., 16(3): 473-477.
HUNG, T., WANG, C., FANG, Z., CHOU, Z., CHANG, X., LIONG, X., CHEN, G., YAO, H., CHAO, T., YE, W., DEN, S. & CHANG, W. 1984. Waterborne outbreak of rotavirus diarrhea in adults in China caused by a novel rotavirus. Lancet, i: 1139-1142.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ E CENTRO DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA “PROFESSOR ALEXANDRE VRANJAC” Diarréia e rotavírus. Informes técnicos institucionais. Rev. Saúde Pub.. [on line]. Jan 2004, 38: 844-845. Acessado em maio, 2006. Disponível em: www.fsp.usp.br/rsp.
KAPIKIAN, A. Z., HOSHINO, Y. & CHANOCK, R. M. 2001. Rotaviruses. In: Fields Virology. 4rd ed., Lippincott-Raven, Philadelfia. P 1787-1822.
KAPIKIAN, A. Z., WYATT, R. G., DOLIN, R., THORNHILL, T. S., KALICA, A. R. & CHANOCK, R. M. 1972. Visualization by immune microscopy of a 27 nm particle associated with acute infections non-bacterial gastroenteritis. J. Virol. 10: 1075-1081.
LAEMMILI, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
LINHARES, A. C. 2000. Rotavirus infections in Brazil: epidemiology and challenges for control. Cad. Saúde Pub., 16(3): 629-646.
LINHARES , A. C. 1997. Rotavírus infection in Brazil : Epidemiologyimmunity, and potential vaccination. Braz J. Infect. Dis. 1(6): 284-293.
LUZ, C. R. N. E., MASCARENHAS, J. D., GABBAY, Y. B., MOTTA, A. R. B., RIBEIRO LIMA, T. V., SOARES, L. S. & LINHARES, A. C. 2005. Rotavirus serotypes and electropherotypes identified among hospitalised children in São Luís, Maranhão, Brazil. Rev. Inst. Méd. Trop. São Paulo., 47(5): 287-293.
MARTELLA, V., CIARLET, M., BÁNYAI, K., LORUSSO, E., CAVALLI, A., CORRENTE, M., ELIA G., ARISTA, S., CAMERO, M., DESARIO, C., DECARO, N., LAVAZZA, A. & BOUNAVOGLIA, C. 2006. Identification of a novel VP4 genotype carried by a serotype G5 porcine rotavirus strain. Virology., 346: 301-311.
NIBERT, M. L. & SCHIFF, L. A. 2001. Rotaviruses and their replication. In: Fields Virology. 4rd ed., Lippincott-Raven, Philadelfia.
