QUE CODIFICAM A cx-AMILASE

T

BR OT~ RIA GEN ~ Tl C A , [' sboo, XVlll XCll j 69-74 1996

EXPRESSAO DE GENES QUE CODIFICAM A cx-AMILASE

EM

SACCHAROMYCES CEREVISIA:

A LTINO BRANCO CHOU PIN A

licenciodo em BiologjafGeologia [U",vc rsidode dos A<;orcs)

.'.leSlle e m Cicllc io e Tecnol09'0 de AI mentos [U nlvcrsidncc lec nico de Ll sboo) 9oulorc ndo "m Bioqufmic o e 6;010910 Molecul er IU 'lIVcrs,dode de Salomonc a) Doc ente 110 Escol o SUpefOJ Ag ,ollo do Ins lil ul o P o li r ~c Ol CO de Brogom; o e no Escol o Superio r de E d uc o ~ uo do In'Mute Jeo r> P,age l

I . I NTRODU(.~O

O s

cO mpOnCIHCS co nt id o s

no

'Imido

sao

uti li zados pri nci palmenrc

como

rese rva d e alim c lltos para a proc!u \ ao de etanol , so )w;6es alco61icas be bfve is

(Ii corcs, etc. ) e cervej:l. A Saccba romyces cerevisiae, pOI-qu e re aliza a

fCflllcn-u<;:'i o,

e

0 produto r ma is imp o rtan re para estes p ro dutos alco6 li cos, careccndo cOlll ucio cle JCli v ici acies amilolfli cas. Assi m , para a utili zac;ao cle substratos de

:I mido peb leveclura

e

necessario h id ro l izar 0 amide em glucose, malto se e

ma ltor ri ose, as qu .. lis j:5. sao aeeiles e rnetab o lizados pelo sis tema enzimatico cia leveclura.

A hidr6 lise d o am ido pode SCI' rea lizada cle v<l.rias fOrn1JS, pOl' exemplo, pelo [rm amen ro enzim al ico depo is d e rc rm oa queci do .

A i nd list ria ac tu alm e11le lItili za 0 enzima C( -ami b se clo l:Jacillus amy/oliq ue-fa ciell s que se disso l ve faci lmen cc e

e

basrante ter moestavel , e tambem (gluca)--amila ses cle alguns fu ngos, mas , estes micro rga nism os n ao realiza m a ferm c n-ta<;ao c par isso nao po dem utiliza r-se na obrenc;ao de alcool a partir do subst rato am id o .

rias primas alte rnativas ;'i cana-cl o-aC;llcar, de entre as quais se encontram as

m ~ H e ria s primas amilaceas.

V~'irios genes de am ilase fo ram ja c1onados e expressos e m Saccba romyces

cerevisiae, estando d e entre des os cle a-amilase (1 ,4-IX-D. gluca nohidrolase), que qllcbra as Iigac;6es (0<-1 ,4 -glicosid icas) das mo iecllias de glucose no amid o, no glicogenio e nas clexlrinas desdo brando-os e m glucose, maltose e oligossaca-rid eos ramifi caclos.

Estas endomilases sao acessfveis a partir de va rias Fontes.

Recenteme nte, os genes qu e codificam a IX-amilase em eucariontes (pancreas de camunclongo e em fungos) tem sido don ad os e expressos em leveduras atraves de va rias rnanipulac;6es geneticas.

Nes te trabalho procura-se es tudar a expressao de genes da a-arnilase em Saccbaro myces cereuisiae.

2. EXPRESSAO DO GENE o<-AMILASE DE CAMUNDONGO EM S. CEREVISI;1E

Nos (dtimo s anos urn gru po cle pesquisa no Brasil empreendeu um pro-gram a de melh o ramemo gene tico de Saccbaromyces cerevisiae com 0 objec-tiva de introcluzir nes te o rgani smo. Para qu e isso fose possivel co nstrui"ram num plasmidio do tip O YEp uma fus ao ge netica comp ree nde ndo a regEio promoto ra e a regiao coclificado ra dos sin ais de s ecr e~ao cle um peptideo cia pr6 pria leve-dura (0 foro rn o ni o IX), 0 cDNA cia IX-ami lase pancreitica d e camundongo e os sin;.J.is d e terminac;ao da transc ri <;ao clo ge ne FLP da 1eved ura. A transfo rm ac;a o ge nctica de v~lr i as linhagens de Saccbclromyces cerevisiae co m este plasmfdio hibrido resu ltou na obten<;ao cle celuias capazes de secretar act ivamente C(-amilase pa ra 0 meio de cultura. Num a erapa seguinte 0 plasmfdeo fo i integrad o no

cromosso ma 1Il da celu ia hospede ir" fi ca ndo des ta fo rm a es tabilizada " in fo r-mac;ao genetica clo camund ongo ent re a desce ndencia cia celu la cia levedura

3. EXPRESSAO DO G ENE Q UE COD IF ICA A at-AM ILASE DE

BACILL US AMYL O LIQ UE FA CIEN S EM SA CCHAROMYCES CEREVIS IAE

Desd e 1987 q ue llll1 grupo d e c ientistas da Acade mia d e Wi ssenschaften,

na antiga Re publica Oe mocra ri ca Aie ma , [em vindo a realizar tra balhos no

sen-(i eto ele expressar ge nes que codificam a a -amHase de Bacillus a rnyloliquefa

-cfens em Sa ccbaromyces cerevisi ae .

NUI11 desses trabalh os um fra g mento d o DNA d e Bacillus amy loliq

ue/a-ciens que co difiea a c(-Jmilase foi clo nado e co mbinado com 0 pro motor ADHI

cia le vedura num pJasmfde o hfbrid o de Escherichia coli e Saccba romyces cer

e-l'isiae (PAAH S), veno r usado n3 lran s fo rm a ~ a o de estirpes laboratoriais de

Sac-cba r o lnyces ee l"ev/slae.

A expressao em leved uras do gene d e Ba cilius fo i tida com o depenclendo essencialm en te cia aCliv idade do promoto r ADH , cia levedu ra no p lasmfdio PAA H5 , que c amem a sequenCia terminal d o gene ADHI. Os transformantes

de Saccbaromyces cerevisiae sao caracterizados pela presenGa do p iasmfdeo reco mb inan re, identici::lde do fragmento de cDNA do Bacillus, peIa sua eS

t3-bilidade mit6 tica e p e lo valor de ac tivi dade da at-amilase .

As (!manchasll d e RNA total iso iado da E, coli e das trans fo rm ames de le

ve-duras foram identifi cadas cia hibriclizaGJo co m 0 fragm ento de D NA do Ba cillus

(C LaIlBaml ) q ue contbll 0 ge ne a mi lase .

A intro duc; ao de PAAH5- amilase na Saccbar01nyces cerevisiae transfo rm ou :.IS ce iu ias cia Jevectura , que em meio conlencio amid o mostraram , dep o is de um perloda prolongado de tempo, acti v idacies hidro lfticas b em com o di visao celubr inclicando assim uma urilizaGao do substrato.

4 . EXPRESS AO DO G ENE QU E CODIrl CA A at -AM I LAS E DE

S CI-IA IrIANNIOMYCES CAS T E LLI EM SACCH A Il OMYCr:S CEREVIS IAE

o

genera de l evc du r ~ 1 Scb wanniomyces, descrilo peb p rim eira vez par

Kloecker em 1909, at r ~ lill rece nte m e nte inte resse cicnt ifico po r cau sa cia

ele-va da capacidade secre lOra de lima prote ina amilolfti ca pOl' al g umas das suas

es pccies.

Uma clessas especies a Sw. castelli p ro du z a-amil<lse glu coamilases e o ut ras en zimas amiJ o ifticas. Es tas enzim as possll e m uma ac ri viclade 6 ptima a p H

4. I . Discussao dos resultados

4 .1 . 1. Iso/amento do gene que co d~"[i c a a rJ. -amilase:

Var ias eS lirp es transform antes de S. ce reu isiae formadoras do halo LE U,

foram o btida s clo banco cle genes cl e Sw.

castelli .

0 DNA plasmfclico d e lim

clesses trans for mantes foi usado para trans formar E. cOli; esses transform ames

transportavam 0 plasrnfdio pFH4 que par sua vez integrava 0 plasmfdio YEP l 3

co m l lll1 fragmento de D NA cl e 5.3 k b .

Os plasmfdeos pl'1-I4 faram isolaclos de col6 nias que tinham sido hibridadas

co m 1::. coli . Esfe roplastos de S. cerevisiae foram tran sfo rmados com esses

plas-mfdios e aprese ntaram 0 fen6tipo SWA . Todos os plasplas-mfdios que expressaram

o fen6 tipo Swa co ntinham a mesm o fragm en to d e ADN (2.8 kb). Portanto, essa

sequen c ia clevera conter 0 gene S\X1 A. Q uand o os o utros esferoplastos da

leve-dura S. ce revisiae foram transformados co m pFH 4 lodos os clones LE U

apre-se nraram SWA com actividade rJ.-amiias e.

4 .1.2. t:sludas Bia qllfmicos

A naru r ez~ 1 do enzima exp ressado pa r S\XI Ai foi eX3minada em fi ltrados

cl e c ulluras de Sw. castelli (pFH 4) mosu anclo activiclade a -amilas e . Ana iises

cro m3l ograt1cas das amostras co ntendo amido reve laram a pre s en~a de pequenas

qu antid ades de maltose e altas co nce nlrac;oes de maito trioses e o ligossacarideos

de allO peso molecular. Portanto, po cle co ncluir-se que 0 gene SWAI codificou

urn e nzima co m actividade a -amilase.

A produ\;ao cle qllantidad es limitadas de m ~ll lOse po de ria explicar a baixo

nivel de c resc im enw num meio

a

base cle am id o e qu e careee de qualqllcr Olltra

fo m e cle ca rb o na , par parte cla S. cerevisiae (p FH 4).

as res ultados destas experiencias qu e foram realizadas em 1989, no Centro

cle Biol ogia Mo lecular da Universiclacle AUlc5!1 o m<l de Madrid, Espanha , estao

QueI' em Sw. castelli quer em S. cerevisiae (p FH 4) a actividade da (l ~a milase

e

signifi cJtivJ, no en tanto, esta actividad e em Sw. castelli desceu drasticamente

para baixas taxas de crescimento, mas na~ totalmente, enquanto que J activi ~

dade da (l ~ amilase das culturas de S. cerevisiae foi totalmente estavel. A razao

clesta diferenc,;:a

e

desconhecida mas pensa~se que seja de vida

a

presenc,;:a de acti~

vidades proteoHticas secretadas por Sw. castelli.

E

interessante notar que a transic,;:ao do gene SWA foi mais activa em

S. cerevisiae (pFH4) que em Sw. castelli.

Actividade de a-ami lase

5

< 0 ) 4

3

2

1

Actividade

da 5 a-ami las e

< 0 ) 4

3

2

1

Sw.castelli

1 2"

Tempo Choras)

I

's,cerevisiae

I

_L-i

•

15

1~

26

2~

Tempo <horas)

FI G U RA I

T

r

5 4 3 2 D.O.

1 660nm

0.7 <e)

0.6 0 . 5

0.4

0.3 0.2 O. 1

o

5 4 3 2 1 0.7 0 . 6 0.5

0.4 0.3

0 . 2

0.1

0

D. O.

660nm

mente conclusivos para que a indllsrria possa utilizar seguramente essas estirpes

para obter alcool a partir de substratos de amido, eles sao contudo lima boa

indica<;ao do qu e a engenharia genetica pode vir a fazer nesse campo, at raves

cia te cno [og ia ci a D NA recombinanre .

BIBLIOGRAFIA

;\ 1\.\1( (:,\, D . ; JOBATO, \1. F.: CLAHOS, M . G . e .1J.\lEi\" EZ, A . (\ 989). Isol:1 tion and expression in Saccba -romyces cerel ·'isix of :I gen e ecod in g and cx-am il ase from SChtD{/lIJl/olllyces castelli. Pcbs Leiters , 255 , 2 : 4 "i5 -459 ,

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