VACUNA ANTIVARIOLICA PREPARADA EN CULTIVO DE TEJIDOS DE RIÑON DE CONEJO*
DRES. CARLOS CAMPILLO SAINZ Y ANA MARIA NEGRETE Laboratorio de Virus de la Secretaria de Salubridad y Asistencia de México
El virus de vacuna antivariólica se pro- paga fácilmente en cultivo de tejidos de dis- tinta naturaleza, en los que suele alcanzar concentraciones elevadas. Esta propiedad puede aprovecharse para elaborar, en cul- tivo de tejidos, una vacuna contra la viruela humana.
Por su esterilidad bacteriológica, menor costo y facilidad de elaboración, la vacuna preparada en cultivo de tejidos presenta ob- vias ventajas sobre la de linfa de ternera. Trabajos preliminares realizados por Rivers (1, 2), en cultivo de tejidos de embrión de pollo, dieron por resultado la obtención de una vacuna que, debido a su baja potencia, no tuvo aceptación general. Inoculando em- briones de pollo en la membrana corioalan- toidea, Goodpasture (3) preparó una vacuna antivariólica. Un método similar fue apli- cado años después por Irons (4) quien, re- cientemente, logró dominar un brote de la enfermedad con la vacuna preparada en embrión de pollo.
En fecha más reciente, Wesslen (5) uti- liz6 cultivos de células suspendidas de tejidos embrionarios de bovinos como fuente de una vacuna antivariólica. Su potencia, juzgada por el número de prendimientos primarios en el hombre, demostró ser muy satisfac- toria.
El presente trabajo se refiere a la prepara- ción de una vacuna antivariólica obtenida en cultivo de tejidos de riñón de conejo; igual- mente se presentan estudios preliminares de evaluación de este producto en los seres hu- manos.
ELABORACION DE LA VACUNA
Como virus semilla se us la linfa ordi- naria de ternera que produce el Instituto de
* Manuscrito recibido en mayo de 1959.
Higiene de México, la cual se trató previa- mente con penicilina y estreptomicina en do- sis de 2,000 U y 200 microgramos por ml., respectivamente. Una vez comprobada la esterilidad bacteriana, se hicieron titula- ciones tanto en cultivo de tejidos de riñón de conejo tripsinizado, como en embrión de pollo. En los primeros se utilizaron dilu- ciones en serie del virus con factor de medio logaritmo, las que fueron inoculadas a la dosis de 0,l ml. por cada tubo de cultivo. Se usaron 6 tubos por cada dilución y se efec- tuaron lecturas diarias de los mismos para observar los cambios citopatogénicos. La lectura se dió por terminada al décimo dfa. Solamente los lotes que tuvieron un título de 10m8 ID,, o superior, se utilizaron como inóculo en la preparación de la vacuna.
Distintos lotes de linfa de ternera se titu- laron en embriones de pollo de ll a 12 dfas. Cada uno de ellos fue inoculado en la mem- brana corioalantoidea con 0,l ml. de las distintas diluciones que se hicieron con fac- tor de un logaritmo. Por cada dilución se utilizaron 6 embriones. El título se calculó por el número de lesiones que se observaron en las membranas corioalantoideas cosecha- das al tercer día. Se desecharon los lotes que no dieron títulos de 10m8 o superiores.
Para preparar los cultivos se escogieron conejos sanos de 3 a 4 semanas de edad, que se desangraron por completo antes de ex- tirparles asépticamente los riñones. En todos ellos se practicó la necropsia con objeto de eliminar a los que presentaran lesiones ana- tomopatológicas ostensibles.
Se prepararon a la vez de 8 a 10 riñones, siguiendo en líneas generales la técnica de tripsinización descrita por Youngner (6). La suspensión de células renales tripsinizadas, ajustada a 300.000 por ml., se distribuyó en botellas de Roux en volúmenes de 60 ml.
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para cada una de ellas. El medio de cultivo estaba constituido por líquido de Hanks (60 %), hidrolizado de lactalbúmina (20 %), suero de caballo (20 %) y penicilina y estrep- tomicina en las dosis habituales de 100 U de la primera y 100 microgramos de la segunda por ml. Por lo general, los cultivos se man- tuvieron a 37°C. y al cabo de 6 días podía observarse que las células neoformadas tapi- zaban completamente la pared de la botella sobre la cual se habían sedimentado. En ese momento se reemplazaba el medio de cultivo por otro recién preparado, cuya concentra- ción de suero de caballo se redujo al 5 %. En seguida, cada una de las botellas se inoculó con 6 ml. del virus semilla diluido a 10m3 en solución salina fisiológica. Las botellas, una vez inoculadas, se colocaron de nuevo en la estufa a 37°C. y se examinaron diariamente al microscopio para observar la degenera- ción celular, la cual, la mayoría de las veces, había llegado hasta las etapas finales 72 horas después de la inoculación. Se procedió entonces a cosechar en un mismo matraz los líquidos de cultivo procedentes de las bo- tellas donde la degeneración celular era com- pleta y generalizada. La mezcla de estos líquidos se centrifugó a 2.000 r.p.m. durante 10 minutos para eliminar los restos celulares y, con el sobrenadante, se llenaron al vacío tubos capilares iguales a los usados para en- vasar la vacuna clásica de linfa de ternera. Los líquidos cosechados se manipularon constantemente a una temperatura com- prendida entre 0°C. y 4°C. para evitar la disminución de potencia que pudiera oca- sionar la exposición a temperaturas más al- tas. Asimismo, los tubos capilares en los que se envasó el producto final, se congelaron de inmediato y se mantuvieron en ese estado hasta que, de acuerdo con los resultados de las pruebas de esterilidad, de inocuidad y de potencia, se decidiera si habían de usarse o desecharse.
Estas pruebas se efectuaron examinando una muestra de cada lote, que se tomó in- mediatamente después de cosechar el medio de cultivo y cuyo volumen equivalia al 3 % del eorresnondiente al lote por probar. Las
pruebas de esterilidad y potencia se efectua- ron en forma abreviada, usando una segunda muestra, que fue recogida del producto final ya envasado en los capilares.
Prueba de esterilidad
Se usaron medios de cultivo líquidos y sólidos, a saber: tioglicolato, caldo glucosado, glucosa-sangre y medio de Sabouraud. Doce tubos preparados con tioglicolato y 6 con caldo glucosado, se sembraron con 0,5 ml. de la muestra para cada uno de ellos; los primeros, divididos en dos grupos iguales se incubaron a 37°C. y 22°C. respectivamente, mientras que los tubos con caldo glucosado, se incubaron sólo a 37°C. Se sembraron tam- bién 2 cajas de glucosa-sangre y 6 tubos de Sabouraud. Aquéllas y éstos recibieron 0,5 ml. de la muestra por unidad, o sea 4 ml. en total; las cajas se incubaron a 37°C. y los tubos a 22°C. Todos los cultivos se tuvieron
en observación durante 10 días. Se estipuló que si alguno de los cultivos o de las cajas revelaba contaminación microbiana, sería necesario repetir la prueba y desechar el lote en caso de que volviera a aislarse un micro- organismo del mismo tipo. La prueba se consideró satisfactoria cuando no se desarra- llaron agentes microbianos en ninguno de los medios inoculados. Sólo se aceptaron lotes en los que las pruebas definitivas revelaron ausencia total de microorganismos.
Siguiendo una técnica más simplificada, se repitieron las pruebas de esterilidad del pro- ducto final, con el objeto de descubrir posi- bles contaminaciones que hubieran podido ocurrir durante el envase. Para ello se des- congelaron 75 capilares y se inoculó su con- tenido a razón de 0,l ml. por cada tubo, en 2 tubos de tioglicolato y otros tantos de me- dio de Sabouraud y caldo glucosado. La téc- nica seguida y el criterio de interpretación fueron los mismos que en la primera prueba.
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Pruebas de inocuidad
Se inocularon 10 ratones sanos de 4 a 6 semanas de edad, por vía intracerebral con 0,03 ml. de la muestra correspondiente a cada lote. Se exigió que todos los animales permanecieran sanos y sobrevivieran a los 21 días del período de observación, así como que no revelaran lesiones anatomopatológi- cas en la necropsia, la cual se practicó en to- dos los casos al término de dicho período. Se convino también que si un ratón, o a lo sumo 2, morían durante el período de obser- vación, la prueba tendría que repetirse para que ~610 en caso de llenar los requisitos seña- lados, pudiera aceptarse el lote estudiado.
Como complemento de la prueba en ra- tones, se vacunaron por vfa intraperitoneal 3 cobayos sanos de 300 a 500 g. de peso. Cada uno recibió 0,25 ml. de la muestra corres- pondiente al lote por probar. Se estipulb que los animales debían conservarse sanos du- rante 21 días, Si 2 de ellos presentaban du- rante este plazo reacción febril u otro signo de enfermedad, el lote se desecharía. En caso de que esas manifestaciones se presentaran en un solo animal, la prueba se repetiría, imponi6ndole esta vez el requisito de que los 3 cobayos permanecieran sanos; pues de lo contrario el lote sería definitivamente eli minado.
Pruebas de potencia
Estas pruebas se hicieron en cultivo de tejidos de riñón de conejo, en embriones de pollo y en conejo. Las titulaciones efectua- das en cultivo de tejidos y en embriones de pollo, se hicieron siguiendo la técnica ya des- crita anteriormente a propósito del virus se- milla. Tanto en los cultivos de tejidos como en los embriones de pollo, el título exigido fue de lOA8 IDso.
Respecto a las titulaciones hechas por es- carificación cutánea en el conejo, se siguió la técnica de Forte y Laleake (7)) aprobada por los Institutos Nacionales de Higiene de Es- tados Unidos; se adoptó el mismo criterio, a saber: aparición de lesiones confluentes a una dilución de 1: 1.000 y la presencia de no menos de 10 vesículas en la diluci6n de 1: 10.000.
Con el material procedente del producto envasado y usando, como se dijo ya, la misma muestra substraída para hacer las pruebas de esterilidad, se hizo otra titulación control en cultivo de tejidos, siguiendo igual procedi- miento que en la ant,erior; pero en ella se in- cluyeron 3 tubos por cada dilución. No se aceptaron lotes cuyo título hubiera descen- dido por debajo de lOe8 ID,, .
Prueba preliminar de campo
Se efectuó en 102 sujetos no vacunados cuyas edades oscilaron entre 3 meses y 13 años, distribuidos por igual entre ambos sexos y todos ellos residentes en Xochimilco, D. F.
Se aplicó la vacuna en el brazo derecho con la tecnica de la multipuntura. Las lecturas se hicieron al 8” día, encontrándose prendi- miento primario en 95 (93%) de los 102 su- jetos vacunados. Por lo que toca al tiempo de aparición, a la evolución y características de las reacciones, no se observaron diferen- cias con respecto a las producidas por la linfa de ternera.
COMENTARIO
Entre los diferentes tejidos que pueden soportar el crecimiento del virus de la va- cuna antivariólica in vitro, el riñón de conejo parece ser uno de los más adecuados para la producción de una vacuna contra la viruela humana. Con el método aquí descrito se ob- tuvieron regularmente altas concentraciones de virus en el líquido de los cultivos que sir- vieron como fuente del virus. Puesto que no fue necesario utilizar los fragmentos tisula- res para obtener el virus, como lo hace Wess- len, el proceso de elaboración en su conjunto, llegó a su máxima simplificación. Por otra parte, los conejos se consiguen fácilmente a costo muy bajo y, además, el rendimiento de vacuna proporcionado por el cultivo de dos riñones, es equiparable al que se obtiene con una ternera.
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esperar que el riesgo de que aparezcan reac- aspectos relacionados con esta vacuna, se en- ciones de sensibilización mucho menor la cuentran todavía en curso y serán motivo de vacuna de riñón de conejo. El suero de caballo futuras comunicaciones.
que se incluye en el producto final como un
agente estabilizador del virus, representa, RESUMEN
en realidad, una cantidad insignificante Se describe la preparación de una vacuna por cada dosis individual. La posibilidad antivariólica obtenida en tejido de riñón de de que ocasione reacciones de sensibilización conejo. Este producto, bacteriológicamente es, pues, muy remota. Otro tanto puede estéril, parece ser, por su costo tan reducido afirmarse respecto de las lesiones que un y por la sencillez de su elaboración, superior producto elaborado con tejido renal pu- a cualquier otro de los productos similares diera ocasionar sobre los órganos homólogos en uso hasta la fecha para la prevención de de los seres humanos. Esta afirmación se en- la viruela humana. El número de dosis ob- cuentra respaldada por las observaciones en tenidas cuando se procesaron los riñones de gran escala que a este respecto se han hecho un conejo, iguala a los que se obtienen de con la vacuna antipoliomielítica tipo Salk. Es una ternera. Se hizo prueba preliminar de necesario tener en cuenta que los pases en campo con 102 individuos no vacunados. De serie del virus en los tejidos, aun cuando ellos, 95 (93 %) mostraron prendimientos sean en un pequeño número, tienen el efecto primarios los que, por su tiempo de aparición, de disminuir su afinidad por la piel humana. evolución y características, fueron similares De ahí la recomendación de seleccionar como a los producidos con la linfa de ternera. virus semilla linfa de ternera de alta poten- RECONOCIMIENTO
cia, la cual no deberá cultivarse más de una Los autores expresan su agradecimiento al Dr. vez en riñón de conejo. Estudios sobre la Ignacio Sánchez Bravo, Jefe de la Lnidad Sani- resistencia al calor, a la desecación y otros taria de Xochimilco, D. F.
REFERENCIAS
(1) Rivers, T. M., y Ward, S. M.: Jennerian pro- (4) Irons, J. V.; Sullivan, F. D.; Cook, E. B. M.; phylaxis by means of intradermal injections Cox, G. M., y Hale, R. A.: Outbreak of of culture vaccine virus, Jour. Exper. Med., smallpox in the Lower Rio Grande Valley of
62 :549-560, 1935. Texas in 1949, Am. Jour. Pub. Health, 43:
(2) Rivers, T. M.; Ward, S. M., y Baird, R. D.: 25-30 (enero) 1953.
Amount and duration of immunity indueed (5) Wesslen, T.: Citado por Andersen, E. K. en by intradermal inoculation of cultured Pruebas de inocuidad pureza y actividad de vaccine virus, Jour. Exper. Med., 69:857-866, las vacunas antivariólicas, Bol. Of. San.
1939. Pan., 42:147-153, 1957.
(3) Goodpasture, E. W.; Buddingh, G. J.; Rich- (6) Youngner, J. S.: Monolayer tissue cultures. I- ardson, L., y Anderson, K.: The preparation Preparation and standardixation of suspen- of antismallpox vaccine by culture of the sions of Trypsin-Dispersed cells, Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 85:202- monkey kidney virus in the chorio-allantoic membrane of 205, 1954.
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SMALLPOX VACCINE PREPARED IN RABBIT KIDNEY TISSUE CULTURE
Uhmmary)
The article describes the preparation of a the kidneys of a rabbit equals those obtained from smallpox vaccine obtained with tissue of rabbit
