CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE

CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós–Graduação em Química, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Química, Sub-Área. Química Orgânica.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Pereira Ramos

CURITIBA

Aos meus irmãos, Leandro Faria Martins e Bruna Faria Martins.

Aos meus pais, José Soares Martins e Olga Maria Faria Martins.

A minha namorada, Juliana Flávia Ferreira.

“... hoje o céu está pesado, vem chegando temporal

cometemos o pecado de não saber perdoar sempre olhando para o mesmo lado feito estátuas de sal

hoje o tempo escorre dos dedos das nossas mãos

ele não devolve o tempo perdido em vão é um mensageiro das almas dos que virão ao mundo

depois de nós...”.

Carlos Maltz – Depois de Nós

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ... vii

LISTA DE FIGURAS... ix

LISTA DE TABELAS... xiv

ABSTRACT... xv

RESUMO... xvii

1 INTRODUÇÃO... 1

2 OBJETIVO ... 4

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 5

3.1 A PAREDE CELULAR... 5

3.2 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA... 21

3.3 CELULASES ... 22

3.4 CELULASES DE Trichoderma reesei ... 30

3.5 CELULASES DE Penicillium sp... 35

3.6 MODELOS TÍPICOS DE SUBSTRATOS PARA ESTUDO DE CELULASES ...36

4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 44

4.1 ENZIMAS... 44

4.2 PRODUÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE P. echinulatum ... 44

4.3 PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS... 45

4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO

MÉTODO DE BRADFORD (1976)... 46

4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE LOWRY (GHOSE, 1986)... 47

4.6 CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL CATALÍTICO DAS ENZIMAS ... 48

4.7 DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES REDUTORES... 49

4.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELULÁSICA TOTAL... 51

4.9 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENDOGLUCANÁSICA... 52

4.10 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE XILANÁSICA. ... 54

4.11 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA ... 55

4.12 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELOBIÁSICA ... 56

4.13 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELOBIOIDROLÁSICA. ... 56

4.14 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS ... 57

4.15 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS ... 59

4.16 ANALISE DAS POLPAS PARCIALMENTE HIDROLISADAS POR GPC. . 60

4.17 ESTUDO COMPARATIVO ... 63

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 64

5.1 ESCOLHA DO SISTEMA TAMPONANTE... 64

5.2 DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS... 65

5.3 ATIVIDADE CONTRA SUBSTRATOS-MODELO ... 67

5.4 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS ... 77

5.5 ADIÇÃO DE

-GLUCOSIDASE ... 87

5.6 ESTABILIDADE DAS ENZIMAS... 95

5.7 ESTUDOS DE ADSORÇÃO ... 98

5.8 AVALIAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS MASSAS MOLARES... 100

6 CONCLUSÃO... 108

7 TRABALHOS FUTUROS... 110

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 111

AGRADECIMENTOS

Ao Prof Luiz Pereira Ramos pela orientação, amizade, conselhos, apoio e dedicação, principalmente, nos momentos de maior necessidade.

Aos colaboradores deste projeto pertencentes a UCS (Universidade de Caxias do Sul), Prof. Aldo J. P. Dillon, Marli Camassola e Anderson Vizentin, que foram responsáveis pela produção do complexo celulásico utilizado neste trabalho e que me receberam de maneira muito gentil, quando passei duas semanas na UCS conhecendo as metodologias utilizadas pelo grupo.

À Novozymes Latin América (Araucária, PR), pelo fornecimento da preparação celulásica denominada Celluclast 1.5 L FG

, utilizada neste trabalho.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro ao laboratório.

À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.

A todos os amigos e colegas do Laboratório de Química de Fitobiomassas que estiveram comigo durante essa etapa de minha vida: Emir B. Saad, Thiago A. Silva, Anderson K. Domingos, Karla T. Kucek, Daniel Kolling, Ricardo Brugnago, Leonardo Sabariego e Claudinei S. Cordeiro.

Aos amigos do Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise, pelo grande

companheirismo e amizade que iniciou na época em que trabalhamos juntos, quando fui

aluno de iniciação científica e comecei a me interessar pelos processos biotecnológicos, e

que dura até os dias de hoje com muitas conversas de caráter científico e, também, com

momentos de muita descontração: Marcelo Muller, Alessandra Baron, Maria Luiza Fernandes, Joel Meira e Valéria Lima, que hoje se encontra na UEL (Universidade Estadual de Londrina).

A todos os amigos e colegas do Departamento de Química da UFPR, principalmente o Pedro Camargo, José Villar, Cristiano Navarini, Fernando Ferraz, Sérgio Umberto, Alexandre Kimura, Carlos Hauptman e o Prof Aluízio de Abreu Marcondes.

Amigos para toda a hora, desde música até o futebol, passando por um pouco de química, também.

À coordenação do Programa de Pós-graduação em Química da UFPR e a todas as

outras pessoas que, de maneira direta ou indireta, fizeram parte integrante deste processo.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA CÉLULA VEGETAL (FENGEL E WEGENER, 1989)... 6 FIGURA 2 LOCALIZAÇÃO, NA PAREDE CELULAR, DA LAMELA MÉDIA (LM), DA

PAREDE PRIMÁRIA (PP) E DA PAREDE SECUNDÁRIA (PS), COM SUAS LAMELAS CONSTITUINTES, S1, S2 E S3 (FENGEL E WEGENER, 1989)... 7 FIGURA 3 UNIDADES DE D-GLUCOSE NAS FORMAS LINEAR E DE ANEL

HEMIACETÁLICO, EM CONFORMAÇÃO DE CADEIRA ⁴C1 (SOLOMONS, 1996).. 8 FIGURA 4 FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA ENTRE DUAS UNIDADES DE β-D-

GLUCOSE, PRODUZINDO A CELOBIOSE (SOLOMONS, 1996)... 9 FIGURA 5 REPRESENTAÇÃO DA CADEIA LINEAR DA CELULOSE, FORMADA POR

VÁRIAS UNIDADES CONSECUTIVAS DE CELOBIOSE (TÍMÁR-BALÁZSY E EASTOP, 1998)... 9 FIGURA 6 FORMAÇÃO DAS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO NA ESTRUTURA

SUPRAMOLECULAR DA CELULOSE... 11 FIGURA 7 FORMAS ALOMÓRFICAS DA CELULOSE... 12 FIGURA 8 ASSOCIAÇÃO DOS COMPONENTES DA PAREDE CELULAR. (1) ESQUELETO

DA CADEIA DE CELULOSE, COM A INDICAÇÃO DO COMPRIMENTO DA SUA UNIDADE ESTRUTURAL BÁSICA, A CELOBIOSE; (2) ARRANJO DAS CADEIAS DE CELULOSE NA FORMAÇÃO DA FIBRILA ELEMENTAR; (3) CRISTALITO DE CELULOSE; (4) SECÇÃO TRANSVERSAL DA MICROFIBRILA DA CELULOSE, MOSTRANDO CRISTALITOS DE CELULOSE EMBEBIDOS NA MATRIZ DE HEMICELULOSE E PROTOLIGNINA (RAMOS, 2003)... 14 FIGURA 9 MONOSSACARÍDEOS CONSTITUINTES DAS HEMICELULOSES. D-GLUCOSE

(1), D-GALACTOSE (2), L-ARABINOSE (3), D-XILOSE (4), D-MANOSE (5), 4-O- METIL-D-GLUCURÔNICO (6) E L-RAMNOSE (7) (SJÖSTRÖM, 1992)... 16 FIGURA 10 ESTRUTURA DA LIGNINA DE Fagus sp (FENGEL E WEGENER, 1989)... 18 FIGURA 11 ESTRUTURA DOS ÁLCOOIS PRECURSORES DA LIGNINA (SJÖSTRÖM, 1992)... 19

FIGURA 12 MODO DE AÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T.

reesei... 23 FIGURA 13 SÍTIO ATIVO EM FORMA DE CHAVE DAS ENDOGLUCANASES, QUE

PERMITE O ACESSO AO LONGO DE UMA CADEIA DE CELULOSE... 25 FIGURA 14 MODO DE AÇÃO PROGRESSIVA DA CELOBIOIDROLASE I (CBH I) DE T. reesei

(DIVNE et al, 1994)... 26 FIGURA 15 MECANISMO DA HIDRÓLISE DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA COM A INVERSÃO

DE CONFIGURAÇÃO DO CARBONO ANOMÉRICO (RÄTTÖ, 1997)... 29 FIGURA 16 MECANISMO DA HIDRÓLISE DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA COM A RETENÇÃO

DE CONFIGURAÇÃO DO CARBONO ANOMÉRICO (RÄTTÖ, 1997)... 30 FIGURA 17 CELOBIOIDROLASES DE T. reesei. CBH I QUE ATUA NA EXTREMIDADE

REDUTORA DA CADEIA DE CELULOSE E A CBH II QUE ATUA NA EXTREMIDADE NÃO REDUTORA (HARRIS, 2005)... 32 FIGURA 18 SINERGISMO ENTRE AS ENDOGLUCANASES E AS CELOBIOIDROLASES DE

T. reesei. AS ENDOGLUCANASES ATUAM AO LONGO DA CADEIA, GERANDO NOVOS SÍTIOS DE ATAQUE PARA AS CELOBIOIDROLASES (CORTESIA DE MATTI SIIKA-AHO, VTT BIOTECHNOLOGY, FINLÂNDIA)... 33 FIGURA 19 ESTRUTURA DO CORANTE COOMASSIE BRILLIANT BLUE BG-250... 46 FIGURA 20 CROMATOGRATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DOS PADRÕES DE

CARBOIDRATOS. ORDEM CRESCENTE DE ELUIÇÃO: CELOBIOSE, GLUCOSE, XILOSE E ARABINOSE... 56 FIGURA 21 REAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES COM O ÁCIDO 3,5-DINITRO-

SALICÍLICO... 58 FIGURA 22 CURVA DE CALIBRAÇÃO UTILIZADA NA DETERMINAÇÃO DAS MASSAS

MOLARES DAS POLPAS CELULÓSICAS PARCIALMENTE HIDROLISADAS... 61 FIGURA 23 COMPARAÇÃO DAS ATIVIDADES CONTRA PAPEL DE FILTRO DE

COMPLEXOS CELULÁSICOS DE T. reesei E P. echinulatum, DETERMINADAS EM (█) TAMPÃO CITRATO 50 mmol/L, pH 4,8 (█) E TAMPÃO ACETATO 50 mmol/L, pH 4,8... 63

FIGURA 24 QUANTIDADE DE CELOBIOSE (█), GLUCOSE (█), CELOBIOSE + GLUCOSE (█) E RAZÃO CELOBIOSE/GLUCOSE (█) NOS HIDROLISADOS PRODUZIDOS PELO (A) P. echinulatum, (B) T. reesei E (C) P. echinulatum CORRIGIDO PARA A MESMA RAZÃO MOLAR CELOBIOSE/GLUCOSE APRESENTADA NOS HIDROLISADOS DE T. reesei... 73 FIGURA 25 PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) NOS HIDROLISADOS

DO PAPEL DE FILTRO... 74 FIGURA 26 HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA POR CELULASES DE P.

echinulatum (□) E DE T. reesei (○) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11 UPF/g DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE... 76 FIGURA 27 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE DE 11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA... 78 FIGURA 28 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM ATIVIDADE DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA... 79 FIGURA 29 HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA POR CELULASES DE P.

echinulatum (■) E DE T. reesei (●) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11 UPF/g DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE... 80 FIGURA 30 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE DE 11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)... 81 FIGURA 31 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM ATIVIDADE DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)... 82 FIGURA 32 PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) PRODUZIDAS

DURANTE A HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA (A) E NÃO 84

BRANQUEADA (B) PELO T. reesei E HIDRÓLISE DE POLPAS KRAFT BRANQUEADA (C) E NÃO BRANQUEADA (D) PELO P. echinulatum...

FIGURA 33 HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA (○) E DA SIGMACELL^® TIPO 50 (□) PELO P. echinulatum A UM CARGA ENZIMÁTICA DE 5,5 UPF/g E DE 6,3 UΒG/g EM RELAÇÃO AO SUBSTRATO SECO... 86 FIGURA 34 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (○), CELOBIOSE (□) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (∆), PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum, DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v)... 87 FIGURA 35 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (○), CELOBIOSE (□) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum, DURANTE A HIDRÓLISE DA SIGMACELL^® TIPO 50 A 2% (m/v)... 88 FIGURA 36 HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA (●) E DA SIGMACELL^® TIPO 50

(■) PELO T. reesei, A UM CARGA ENZIMÁTICA DE 11,5 UPF/g E DE 13,2 UΒG/g EM RELAÇÃO AO SUBSTRATO SECO...

89

FIGURA 37 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (●), CELOBIOSE (■) E GLUCOSE + CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei, DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v)... 90 FIGURA 38 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (●), CELOBIOSE (■) E GLUCOSE +

CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei, DURANTE A HIDRÓLISE DA SIGMACELL^® TIPO 50 A 2% (m/v) ... 91 FIGURA 39 HIDRÓLISE DA SIGMACELL^® TIPO 50 EM CONCENTRAÇÃO DE 2%(m/v) POR

P. echinulatum (■) E T. reesei + NOVOZYM 188^® (●), A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 10 UPF/g E 11,5 UΒG/g DE SUBSTRATO SECO... 92 FIGURA 40 VARIAÇÃO DOS ART PRODUZIDOS NA HIDRÓLISE DO PAPEL DE FILTRO

POR P. echinulatum (■) E T. reesei (●)EM CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS DE HIDRÓLISE... 93 FIGURA 41 VARIAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA CONTRA pNPG DAS

ENZIMAS DE P. echinulatuM (■) E T. reesei (●)... 94 FIGURA 42 VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DURANTE O

EXPERIMENTO DE HIDRÓLISE. (◊) T. reesei SUPLEMENTADO COM β- GLUCOSIDASES EXÓGENAS E (■) P. echinulatum... 95 FIGURA 43 PERCENTAGEM DAS PROTEÍNAS REMANESCENTES NO MEIO REACIONAL

DURANTE A HIDRÓLISE A 2% (m/v) DA POLPA KRAFT BRANQUEADA. T.

reesei (□), P. echinulatum (▲) E T. reesei + β-GLUCOSIDASE (■)... 97 FIGURA 44 SACARIFICAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v) POR

CELULASES DE P. echinulatum (10 UPF/g E 11,4 UβG/g) (▲), T. reesei (10 UPF/g E 3,9 UβG/g) (■) E T. reesei + NOVOZYM 188^® (10 UPF/g E 11,4 UβG/g) (♦)... 99 FIGURA 45 INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE P. echinulatum SOBRE O GRAU

DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E 48H (─)... 103 FIGURA 46 INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei SOBRE O GRAU DE

POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E 48H (─)... 104 FIGURA 47 INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei SUPLEMENTADO

COM Β-GLUCOSIDASES EXÓGENAS SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E 48H (─) ... 105

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DOS COMPLEXOS CELULÁSICOS... 66 TABELA 2 ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS ABSOLUTAS E POR UNIDADE DE PROTEÍNA. 67

TABELA 3 ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS EM RELAÇÃO À ATIVIDADE CONTRA PAPEL DE FILTRO... 70 TABELA 4 RENDIMENTO DE HIDRÓLISE E EFEITO DOS COMPLEXOS CELULÁSICOS

SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA... 101

ABSTRACT

Penicillium echinulatum has been identified as a potential cellulase producer for bioconversion processes. However, its cellulase system has never been investigated in detail. In this work, the volumetric activities of cellulases from P. echinulatum were determined against substrates such as filter paper (0.27 U/mL), carboxymethylcellulose (1.53 U/mL), hydroxyethylcellulose (4.68 U/mL), birchwood xylan (3.16 U/mL), oat spelt xylan (3.29 U/mL), Sigmacell type 50 (0.10 U/mL), cellobiose (0.19 U/mL), and p - nitrophenyl-glucopiranoside (0.31 U/mL). These values were then expressed in relation to the amount of protein and compared with the activity profile of Celluclast 1.5L FG (Novozymes). Our results have shown that both enzyme complexes have similar total cellulase and xylanase activities. Analysis of substrate hydrolysates demonstrated that P.

echinulatum enzymes have higher

-glucosidase activity than Celluclast 1.5L FG, while the latter enzyme system has greater cellobiohydrolase activity. Hydrolysis experiments also demonstrated that the P. echinulatum system is advantageous for the saccharification of cellulose substrates because it has enough β-glucosidase activity to remove the cellobiose produced in the reaction medium. However, the cellulase complex from T.

reesei became more efficient than P. echinulatum enzymes when it was supplemented

with exogenous β-glucosidase activity (Novozym 188, Novozymes). Both cellulase

complexes displayed the same influence over the degree of polymerization of cellulose,

revealing that hydrolyses were carried out under the typical endo-exo synergism of fungal

enzymes, promoting the progressive peeling of cellulose molecules from the surface of the substrate without accumulating any detectable short cellooligomers in the hydrolysis mixture.

Keywords: Penicillium echinulatum , Celluclast 1.5L FG, cellulases, activity

RESUMO

O fungo filamentoso Penicillium echinulatum foi recentemente identificado como um

bom produtor de celulases. No entanto, o seu complexo celulásico jamais foi estudado em

detalhes. Neste trabalho, a s atividades das celulases de P. echinulatum foram

determinadas e comparadas ao complexo celulolítico de Trichoderma reesei (Celluclast

1.5L FG, Novozymes), empregando substratos como papel de filtro, carboximetilcelulose,

hidroxietilcelulose, xilana de madeira de vidoeiro, xilana de endoderma de aveia,

Sigmacell tipo 50, celobiose e p -nitrofenil-glucopiranosídeo. Além disso, foram

realizados experimentos de hidrólise com diferentes tipos de substratos para avaliar

comparativamente a eficiência de sacarificação dos complexos celulásicos, a importância

da presença de β-glucosidases, a estabilidade das enzimas nas condições operacionais, o

perfil de adsorção protéica durante a hidrólise e, também, a influência da hidrólise sobre o

grau de polimerização (GP) do substrato. Em linhas gerais, estes complexos apresentaram

atividades celulásica total e xilanásica semelhantes. Porém, a análise dos hidrolisados

enzimáticos demonstrou que o complexo de T. reesei possui maior atividade

celobioidrolásica, enquanto o complexo de P. echinulatum apresenta atividade

-

glucosidásica superior. Experimentos de hidrólise também demonstraram que o complexo

de P. echinulatum é vantajoso para a sacarificação de substratos celulósicos, pois possui

atividade β-glucosidásica suficiente para remover a celobiose produzida no meio

reacional. Porém, o complexo celulásico de T. reesei tornou-se um sistema mais completo

e eficiente quando foi suplementado com atividade β-glucosidásica exógena (Novozym

188, Novozymes). Finalmente, a determinação do efeito da hidrólise enzimática sobre o

GP da celulose demonstrou que os dois complexos celulásicos exercem suas atividades

hidrolíticas sobre o substrato de forma semelhante, através de um mecanismo progressivo

e sinérgico, removendo camadas de celulose da superfície do substrato sem permitir o

acúmulo de oligômeros de massa molar intermediária.

A celulose é o composto orgânico mais abundante da Terra e a maior parte da celulose utilizada na indústria provém da madeira (40% a 50% de celulose) e das fibras do algodão (98% de celulose) (Medve, 1997). É o principal elemento estrutural da parede celular das plantas superiores e ocorre em forte associação com os outros dois principais componentes da parede celular, a hemicelulose e a lignina. Essa forte associação faz com que sejam limitadas as aplicações de materiais lignocelulósicos como fonte renovável para a produção de biomoléculas e produtos químicos. Por isso, é de vital importância a identificação das razões que justificam a alta resistência destes materiais a processos biológicos como a hidrólise enzimática e a fermentação (Ramos, 2003).

A celulose é sintetizada por todas as plantas superiores, por certas bactérias e por alguns protozoários. Estima-se que somente as plantas superiores produzam anualmente cerca de 4x10

toneladas deste biopolímero, o que representa cerca de 2,5% das 7x10

toneladas de carbono produzidas na biosfera. Portanto, a biodegradação da celulose tem um enorme impacto sobre o equilíbrio natural do ciclo do carbono (Medve, 1997).

Nas últimas décadas, o emprego de recursos renováveis tem aumentado

significativamente em uma grande variedade de processos industriais. Como resultado

destas atividades, a quantidade de resíduos industriais derivados da fitobiomassa tem

aumentado, a ponto de atingir 40% dos detritos sólidos gerados em municípios norte-

americanos. Portanto, encontrar um destino apropriado para estes resíduos tem se tornado

prioritário para economias em desenvolvimento e, dentre uma variedade de alternativas propostas até o momento, muita atenção tem sido dada ao aproveitamento de hidrolisados de fitobiomassa (celulose) para a produção de etanol e solventes orgânicos (Medve, 1997). Nesse caso, estudos têm sido conduzidos para verificar a viabilidade da sacarificação via hidrólise enzimática, utilizando majoritariamente os complexos celulásicos produzidos por fungos filamentosos como o Trichoderma reesei (Palonen et al , 2004; Sharma et al , 2002; Pere et al , 2001; Ortega et al , 2000; Ramos, 1993a, 1999).

Atualmente, as celulases vêm sendo aplicadas como biocatalisadores em uma série de processos industriais, como na clarificação de sucos (indústria de alimentos), na formulação de ração para animais e na produção de detergentes e amaciantes para roupas.

Porém, estas enzimas encontram aplicações ainda mais interessantes nas indústrias têxtil e de papel e celulose, em substituição à estonagem e/ou biopolimento de denim (Cavaco- Paulo, 1997; Andreaus et al , 2000), na modificação das propriedades processuais das fibras celulósicas comerciais (Mansfield et al , 1996) e na reciclagem de papel ofício, onde atuam eficientemente na remoção de tintas e "toners" de impressão da superfície de fibras recicláveis (Jeffries et al , 1994). Nestes casos, não é obviamente desejada a sacarificação extensiva da celulose, mas sim a ação superficial que gere o efeito desejado. Por esta razão, a investigação da composição centesimal de preparações celulásicas comerciais e/ou experimentais é de suma importância.

Outros fungos de ocorrência natural também apresentam complexos enzimáticos

capazes de degradar eficientemente a celulose, quer nativa ou pré-tratada. Dentre eles

podem ser citados o Humicola insolens , H. grisea , T. viride , Aspergillus niger ,

Penicillium brasilianum e P. echinulatum. Os fungos do gênero Penicillium, embora

pouco estudados, têm apresentado propriedades interessantes em comparação a outras

fontes destas enzimas, principalmente no que diz respeito à distribuição quantitativa dos

componentes enzimáticos no complexo celulásico. Neste contexto, o P. echinulatum

(Dillon et al , 1999; Camassola et al , 2004) é uma espécie que tem apresentado título

enzimático elevado em termos de atividade celulásica total. No entanto, este complexo

enzimático, jamais foi estudado em detalhes e a sua utilização na hidrólise enzimática de

substratos pré-tratados constitui um dos parâmetros de originalidade deste projeto.

2 OBJETIVO

O objetivo principal deste projeto foi o de caracterizar o complexo celulásico derivado de Penicillium echinulatum como um modelo alternativo para a condução de processos de bioconversão de fitobiomassa residual via hidrólise enzimática.

Tal objetivo foi atingido através do desenvolvimento de um planejamento experimental fundamentado nas seguintes etapas:

1. Determinação da atividade do complexo enzimático de P. echinulatum contra diferentes substratos específicos;

2. Investigação do modo de ação catalítica do complexo enzimático sobre substratos celulósicos quimicamente definidos;

3. Determinação do efeito da ação das hidrolases de P. echinulatum sobre as propriedades e composição química de fibras celulósicas comerciais;

4. Desenvolvimento de um estudo comparativo entre os sistemas celulásicos de P.

echinulatum e de T. reesei , tomando como referência a preparação comercial

Celluclast 1.5L FG (Novozymes, Araucária, Brasil).

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Para uma melhor compreensão de como os complexos celulásicos agem, é necessário conhecer a origem, composição química e organização estrutural dos materiais que podem ser empregados como substratos para estas enzimas. Esta revisão bibliográfica pretende mostrar a localização da celulose na parede celular vegetal, juntamente com os outros dois componentes majoritários desta estrutura, a lignina e a hemicelulose.

Posteriormente, será descrito em detalhe o modo de ação das enzimas que compõem o sistema celulásico de fungos filamentosos, particularmente os referentes aos fungos Trichoderma reesei e Penicillium sp. . Finalmente, serão apresentados os diversos tipos de substratos celulósicos e descritas as características químicas e supramoleculares que influenciam o modo de ação e o sinergismo observado entre os diferentes tipos de celulases.

3.1 A PAREDE CELULAR

Os tecidos vegetais são primariamente constituídos por células de parede celular

espessa, cujos formatos e dimensões variam entre as diferentes espécies de madeira

(Figura 1). A integridade estrutural do tecido da planta é atribuída à existência de uma

camada intermediária que une as células como um agente cimentante. Essa camada,

chamada de lamela média, é quase que inteiramente composta de lignina e, junto com

duas paredes primárias adjacentes, forma a lamela média composta (Fengel e Wegener, 1989).

FIGURA 1 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA CÉLULA VEGETAL (FENGEL E WEGENER, 1989)

MEMBRANA CELULAR CITOPLASMA

LAMELA MÉDIA PAREDE PRIMÁRIA MEMBRANA CELULAR CITOPLASMA

LAMELA MÉDIA PAREDE PRIMÁRIA

Em geral, a parede celular das plantas é subdividida em parede primária e

secundária. A distribuição de celulose, hemicelulose e lignina nessas camadas varia

consideravelmente. A parede primária é uma camada delgada, permeável e flexível em

tecidos fisiologicamente ativos (alburno), mas pode tornar-se altamente lignificada em

células do cerne. A parede secundária é formada por uma seqüência de três lamelas, S

,

S

, e S

, onde a camada central é normalmente mais espessa do que as outras. Como

resultado, a maioria das propriedades das fibras, particularmente aquelas que interessam à

indústria de papel e celulose, são derivadas das propriedades e integridade física dessa

camada (Fengel e Wegener, 1989) (Figura 2).

FIGURA 2 - LOCALIZAÇÃO, NA PAREDE CELULAR, DA LAMELA MÉDIA (LM), DA PAREDE PRIMÁRIA (PP) E DA PAREDE SECUNDÁRIA (PS), COM SUAS LAMELAS CONSTITUINTES, S1, S2 E S3 (FENGEL E WEGENER, 1989)

3.1.1 Celulose

O principal componente das fibras vegetais é a celulose, que é o constituinte básico da parede celular. Trata-se de um homopolissacarídeo de ocorrência natural, composto por unidades de

-glucose (

-glucopiranose) unidas através de ligações glicosídicas do tipo

-(1

4) (

-

-glucana), que é encontrado tanto em vegetais primitivos quanto em plantas evoluídas.

A liberdade rotacional da cadeia linear da

-glucose permite que o carbono 1 seja

atacado pela hidroxila do carbono 5, em reação intramolecular que resulta na formação de

um hemiacetal. Após a reação de fechamento do anel, as hidroxilas do carbono anomérico

(quiral) podem se encontrar na posição axial (α) ou equatorial (β), gerando o importante princípio da anomericidade. Em solução aquosa, ocorre uma rápida e dinâmica interconvenção entre essas duas formas, denominada de mutarrotação, mediante o qual é atingido um equilíbrio entre as duas formas anoméricas da

-glucopiranose, sendo a β-

- glucopiranose correspondente 62%, a α-

-glucopiranose a 38% e a forma aberta, a menos de 0,5%. A Figura 3 apresenta a estrutura linear da

-glucose e os anômeros α e β da

- glucopiranose.

FIGURA 3 - UNIDADES DE D-GLUCOSE NAS FORMAS LINEAR E DE ANEL HEMIACETÁLICO, EM CONFORMAÇÃO DE CADEIRA ⁴C1 (SOLOMONS, 1996)

O

OHOH O

OH H

OH

O

OH O OH

H O H

OH OH

O H

OH

OH O

O H

anômero α anômero β

cadeia aberta

A celulose é biossintetizada a partir da união de unidades de

-glucose. A hidroxila glicosídica do carbono 1 de uma unidade sofre reação de condensação com a hidroxila do carbono 4 de outra unidade, formando a ligação glicosídica do tipo

-(1

4) (Figura 4). Durante a biossíntese, diversas cadeias de celulose são sintetizadas

H2O H2O

simultaneamente e de forma ordenada, buscando um arranjo supramolecular que confira maior estabilidade ao agregado e, portanto, menor energia potencial. Este arranjo depende de uma rede de ligações de hidrogênio cuja otimização provoca uma rotação de 180º da segunda unidade de glucose em relação à primeira, e assim por diante. Portanto, a celobiose é definida como unidade conformacional mínima da celulose, enquanto a glucose representa tão somente a unidade fundamental das cadeias do homopolímero (Tímár-Balázsy e Eastop, 1998; Medve, 1997) (Figura 5).

FIGURA 4 - FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA ENTRE DUAS UNIDADES DE β-D- GLUCOSE, PRODUZINDO A CELOBIOSE (SOLOMONS, 1996)

O OH OH

OH O

O H

OH O

O H O H

OH O

OH OH O

H O H

OH

+

OH OH

OH O

H

HO O

OH OH

OH O

O H

OH O

O H O H

OH O

OH OH O

H O H

OH

+

OH OH

OH O

H HO

FIGURA 5 - REPRESENTAÇÃO DA CADEIA LINEAR DA CELULOSE, FORMADA POR VÁRIAS UNIDADES CONSECUTIVAS DE CELOBIOSE (TÍMÁR-BALÁZSY E EASTOP, 1998)

O OH O

OH O O H

OH O

O OH

OH

O OH

OH O O H

OH O

O OH H

OH

O OH OH

OH O O H

OH O

O H O

OH

O OH

OH O O H

OH O

O H

OH

celobiose

n

O OH O

OH O O H

OH O

O OH

OH

O OH

OH O O H

OH O

O OH H

OH

O OH OH

OH O O H

OH O

O H O

OH

O OH

OH O O H

OH O

O H

OH

O OH O

OH O O H

OH O

O OH

OH

O OH

OH O O H

OH O

O OH H

OH

O OH OH

OH O O H

OH O

O H O

OH

O OH

OH O O H

OH O

O H

OH

celobiose

n

A cadeia macromolecular da celulose assume uma disposição linear devido a dois fatores: a hidroxila no carbono anomérico possui orientação equatorial porque a conformação em cadeira do anel piranosídico assume a disposição

C

e as ligações de hidrogênio intra e intermoleculares estabilizam a orientação da cadeia (Fengel e Wegener, 1989). O tamanho ou extensão da cadeia de celulose é medido através de seu grau de polimerização (GP), que representa o número de unidades de glucose que formam cada cadeia polimérica. O GP da celulose varia de acordo com a fonte, o grau de maturação da parede celular, o processamento a que as fibras foram submetidas e o seu envelhecimento.

O GP da celulose nativa na madeira é de cerca de 2500 unidades de anidroglucose, enquanto que o GP do algodão é de aproximadamente 11000 unidades. Para o uso têxtil, sugere-se que a celulose deva ter um GP maior do que 2000 unidades (Tímár-Balázsy e Eastop, 1998).

Em sua estrutura supramolecular, a celulose apresenta regiões altamente

ordenadas, estabilizadas por numerosas ligações de hidrogênio intra e intermoleculares

(Figura 6), e áreas menos ordenadas ou amorfas, onde as cadeias apresentam uma

orientação randomizada (Fan et al ., 1987). A proporção da parte cristalina em cadeias de

celulose é normalmente expressa em porcentagem (índice de cristalinidade ou CrI) e

depende da origem e processo de obtenção da celulose. A celulose produzida pela alga

Valonia macrophysa é praticamente 100% cristalina. Por outro lado, o substrato

considerado 100% amorfo (CrI = 0%) pode ser preparado pelo tratamento de celulose

microcristalina com ácido fosfórico xaroposo. Outras celuloses têm CrI intermediários,

como, por exemplo, a celulose bacteriana (76%), o algodão (70%), a Avicel (46%) e polpas alvejadas largamente utilizadas para a confecção do papel (50 a 60%) (Medve, 1997). Vários autores têm sugerido que a celulose amorfa, devido a sua maior área superficial, é mais suscetível à hidrólise enzimática do que a forma ordenada ou cristalina.

Estudos de modelagem desenvolvidos por Coughlan (1985) demonstraram que sítios de menor organização molecular, localizados na superfície da estrutura cristalina, são mais suscetíveis ao ataque enzimático. No entanto, complexos enzimáticos produzidos por vários microrganismos têm se demonstrado capazes de catalisar a hidrólise de celulose, tanto cristalina quanto amorfa, em açúcares solúveis de baixa massa molar como a glucose e a celobiose.

FIGURA 6 - FORMAÇÃO DAS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO NA ESTRUTURA SUPRAMOLECULAR DA CELULOSE

A celulose nativa cristalina é constituída por duas formas alomórficas: a celulose I

(triclínica) e a celulose I

xy (monoclínica) (Figura 7). As ligações de hidrogênio são diferentes para cada forma, refletindo em diferentes propriedades físico-mecânicas (Fengel e Wegener, 1989; Åkerholm et al , 2004).

FIGURA 7 - FORMAS ALOMÓRFICAS DA CELULOSE

Celobiose

Monoclínico

Iβ Triclínico

Iα

0,62 nm / 0,53 nm

67º / 63º

Vários modelos têm sido propostos para explicar a estrutura interna da celulose

na parede celular. Devido à linearidade do esqueleto celulósico, cadeias adjacentes

formam um conjunto de agregados insolúveis em água de vários comprimentos e larguras,

denominadas fibrilas elementares (D’Almeida, 1988). As forças latentes, responsáveis

pela estabilidade das regiões cristalinas, são basicamente o resultado de um grande

número de ligações de hidrogênio inter e intramoleculares. De acordo com Fengel e

Wegner (1989), diversas fibrilas elementares, com uma espessura média de 3,5 nm, se

associam uma com as outras formando cristalitos de celulose cujas dimensões dependem

da origem e do tratamento da amostra. Posteriormente, quatro desses agregados

cristalinos se unem através de uma monocamada de hemiceluloses, gerando estruturas de

25 nm que são envolvidas por uma matriz amorfa de hemicelulose e protolignina. O

composto natural que resulta dessa associação é chamado de microfibrila de celulose

(Figura 8).

FIGURA 8 - ASSOCIAÇÃO DOS COMPONENTES DA PAREDE CELULAR. (1) ESQUELETO DA CADEIA DE CELULOSE, COM A INDICAÇÃO DO COMPRIMENTO DA SUA UNIDADE ESTRUTURAL BÁSICA, A CELOBIOSE; (2) ARRANJO DAS CADEIAS DE CELULOSE NA FORMAÇÃO DA FIBRILA ELEMENTAR; (3) CRISTALITO DE CELULOSE; (4) SECÇÃO TRANSVERSAL DA MICROFIBRILA DA CELULOSE, MOSTRANDO CRISTALITOS DE CELULOSE EMBEBIDOS NA MATRIZ DE HEMICELULOSE E PROTOLIGNINA (RAMOS, 2003)

3.1.2 Hemiceluloses

As hemiceluloses são genericamente caracterizadas como uma família de polissacarídeos presentes na parede celular vegetal. O termo hemicelulose foi primeiramente utilizado para designar polissacarídeos precursores da celulose. Com a evolução do conhecimento, constatou-se que isso não era verdadeiro e que as rotas envolvidas na síntese desses dois polissacarídeos são distintas. Outra alternativa foi a de considerar as hemiceluloses como polissacarídeos isolados da madeira em meio alcalino, mas essa hipótese acabou apresentando pouca sustentação porque a água quente também pode solubilizar polissacarídeos que não correspondem quimicamente às hemiceluloses.

Atualmente, as hemiceluloses são genericamente definidas como polissacarídeos não- amiláceos e não-celulósicos que podem ser extraídos da parede celular dos vegetais superiores (Sjöström, 1992; Fengel e Wegener, 1989).

As hemiceluloses são formadas por uma ampla variedade de blocos construtivos

incluindo pentoses (por exemplo, xilose, ramnose e arabinose), hexoses (por exemplo,

glucose, manose e galactose) e ácidos urônicos (são exemplos os ácidos 4- Ο -metil-

glucurônico e galacturônico) (Figura 9). São estruturalmente mais parecidas com a

celulose do que com a lignina e são depositadas na parede celular em um estágio anterior

à lignificação. Sua estrutura apresenta ramificações e cadeias laterais que interagem

facilmente com a celulose, dando estabilidade e flexibilidade ao agregado (Ramos, 2003).

As hemiceluloses presentes em folhosas e coníferas diferem significativamente entre si. As hemiceluloses de folhosas são compostas majoritariamante por heteroxilanas altamente acetiladas, geralmente classificadas com 4- Ο -metil-glucuronoxilanas.

Hexosanas também estão presentes, mas em quantidades muito pequenas como glucomananas. Devido a sua característica ácida e as suas propriedades químicas, as xilanas de folhosas são mais lábeis à hidrólise ácida e podem sofrer auto-hidrólise sob condições relativamente brandas. Ao contrário, as coníferas têm uma grande proporção de glucomananas acetiladas e galactoglucomananas, e xilanas correspondem apenas a uma pequena fração. Como resultado disso, as hemiceluloses de folhosas (praticamente pentosanas) são mais lábeis à hidrólise ácida do que as hemiceluloses de coníferas (praticamente hexosanas) (Ramos 2003).

FIGURA 9 - MONOSSACARÍDEOS CONSTITUINTES DAS HEMICELULOSES. D-GLUCOSE (1), D-GALACTOSE (2), L-ARABINOSE (3), D-XILOSE (4), D-MANOSE (5), 4-O-METIL- D-GLUCURÔNICO (6) E L-RAMNOSE (7) (SJÖSTRÖM, 1992)

O

OH OH

O H C H₃

OH O

O OH O H OH O

O H

OH OH

O H O H

OH

O OH O H

O OH H

OH

O

OH OH

O H O

H O

OH OH O

H O H

OH

1 2 3

4 5 6

O OH

OH

OH O

H C H₃

7

3.1.3 Lignina

A lignina está presente na madeira em cerca de 20% a 30%, agindo como material adesivo, como agente de enrijecimento e como barreira contra degradação enzimática e/ou microbiana da parede celular (Fengel e Wegener, 1989)

A lignina é uma macromolécula amorfa com estrutura tridimensional muito

complexa (Figura 10) e baseada em três precursores monoméricos: os álcoois coniferílico,

sinapílico e p -cumarílico (Figura 11). A proporção desses monômeros varia entre

diferentes espécies de plantas e estas diferenças podem ser utilizadas com propósitos

taxonômicos. Dependendo do grau de metoxilação, o grupo aromático é o p -hidroxibenzil

(derivado do álcool p-cumarílico), guaiacil (derivado do álcool coníferilico) ou siringil

(derivado do álcool sinapílico). A propriedade física mais importante dessa

macromolécula orgânica é a sua rigidez, que não só confere estrutura ao tecido da planta,

mas, também, previne o colapso de elementos condutores de água.

FIGURA 10 - ESTRUTURA DA LIGNINA DE FAGUS SP (FENGEL E WEGENER, 1989)

HO HOCH₂

HOCH₂

[

O CH CH CHO

H3CO OCH3

[

HOCH2

[

CH CH₂OH CH

OH H3CO

CH CH CH₂OH

H3CO OCH3

[O

C CH O

CH₂ C

O H2

H

[

[ H

H2

1

2 3

4 5 6

7

8

9 10 11

12

13 14

15

16 17

H₃CO

O

OCH₃ CHOH CH2OH CH

O CH C

O H CH2

18

HO

OCH₃ H3CO

OH OH

OCH3

H3CO

CHOH CH O

H3CO O C

HC O

H3CO

CHOH CH₂OH CH H₃CO

O H3CO

OCH₃ OCH₃ OH CH CH

CH CH₂OH

CH CH2OH CHOH

OCH3

CH CH O

OCH3

H3CO O CH₂OH

HC CH2OH CHOH

OCH3

H3CO O HC

CH O

OCH3

O

CH CH2OH CH

H3CO OCH3

O

O H₃CO

CH O

C C

CH O

CH2

OH OCH3

FIGURA 11 - ESTRUTURA DOS ÁLCOOIS PRECURSORES DA LIGNINA (SJÖSTRÖM, 1992)

As ligninas de coníferas são quase que exclusivamente compostas por resíduos derivados do álcool coniferílico (lignina do tipo G), enquanto as ligninas das folhosas contêm resíduos derivados dos álcoois coniferílico e sinapílico (lignina tipo GS). Em contraste, as ligninas derivadas de gramíneas contêm os três precursores básicos citados acima (lignina tipo HGS). Como conseqüência, as ligninas das folhosas possuem alta quantidade de grupos metoxílicos, são menos condensadas e são mais suscetíveis à conversão química do que as ligninas derivadas das coníferas (Ramos, 2003).

3.1.4 Extrativos

Os componentes de menor massa molar, presentes na fitobiomassa, incluem uma variedade de compostos orgânicos cuja presença relativa é governada por uma série de fatores, entre os quais os de natureza genética e climática. Esses componentes não

Álcool

p -cumarílico Álcool

coniferílico Álcool

sinapílico

residem na parede celular da planta e dividem-se, basicamente, em duas classes. A primeira classe engloba materiais conhecidos como extrativos por serem extraíveis em água e solventes orgânicos neutros ou volatilizados por arraste de vapor. A segunda classe engloba materiais que não são comumente extraíveis com os agentes mencionados, como, por exemplo, compostos inorgânicos (cinzas), proteínas e substâncias pécticas (Ramos, 2003).

O teor de extrativos em folhosas corresponde a cerca de 3 a 10%, estando esse valor em torno de 5 a 8% para as coníferas. Esses constituintes são freqüentemente responsáveis por determinadas características da planta, como a cor, o cheiro, a resistência natural ao apodrecimento, o sabor e suas propriedades abrasivas (D'Almeida, 1988). É comum a denominação de resina para uma determinada classe de extrativos.

Porém, este termo aplica-se a um conjunto de substâncias químicas que inibem a

cristalização e, portanto, caracteriza mais a condição física do que a composição química

da fração. Deste modo, os seguintes compostos podem ser encontrados em resinas de

madeiras: terpenos, lignanas, estilbenos, flavonóides e outros aromáticos. Além dessas

substâncias, outros compostos orgânicos podem também estar presentes nos extrativos,

como gorduras, ceras, ácidos graxos, álcoois, esteróides e hidrocarbonetos de elevada

massa molar (Ramos, 2003).

3.2 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

A sacarificação da celulose representa uma alternativa interessante para a destinação de fitobiomassas residuais como o bagaço de cana e resíduos de atividades florestais. No entanto, apesar de muitos estudos, não estão totalmente compreendidos quais as características do substrato que atribuem maior eficiência à taxa de hidrólise da celulose. Algumas das características mais influentes incluem a acessibilidade, o grau de cristalinidade, o grau de polimerização e a distribuição da lignina (Palomen et al , 2004).

Além disso, bioprocessos baseados na hidrólise enzimática requererão substratos

produzidos com a qualidade adequada, a partir de fitobiomassa residual. Diferentes tipos

de pré-tratamento podem ser aplicados para promover a conversão destes materiais em

substratos susceptíveis à hidrólise enzimática e, dentre estes, o pré-tratamento a vapor tem

sido descrito como um dos mais eficientes (Ramos, 1992; Wyman et al , 2005; Mosier et

al , 2005; Negro et al , 2003; Söderström et al , 2003). Paralelamente, estudos têm sido

realizados na busca de enzimas capazes de hidrolisar a celulose de maneira cada vez mais

efetiva, seja pela otimização de processos fermentativos, pela combinação de enzimas

para a obtenção de complexos celulásicos mais eficientes ou pelo melhoramento de

espécies através de métodos de engenharia genética (Jørgensen et al, 2004; Imai et al,

2004; Kang et al , 2004).

3.3 CELULASES

Atualmente, sabe-se que o complexo celulásico secretado por fungos filamentosos é formado por três componentes enzimáticos majoritários, as endoglucanases, as celobiohidrolases (exoglucanases) e as β-glucosidases, que não são consideradas com celulases legítimas. De acordo com o modelo de sinergismo “endo- exo”, essas enzimas cooperam da seguinte maneira: as celobiohidrolases (CBH) agem como exo-enzimas (e. g., no fim das cadeias) e liberam celobiose como produto principal;

as endoglucanases (EG) agem randomicamente ao longo da cadeia produzindo novos sítios de ataque para as celobiohidrolases; e as β-glucosidases completam o processo através da hidrólise da celobiose e de outros oligossacarídeos à glucose (Medve, 1997;

Zandoná Filho, 2001) (Figura 12).