ATIVIDADE CONTRA SUBSTRATOS-MODELO

A atividade volumétrica dos dois complexos celulásicos foi medida contra os seguintes substratos-modelo: papel de filtro (PF), carboximetilcelulose de viscosidade média (CMC), hidroxietilcelulose (HEC), Sigmacell^® tipo 50 (SIG), xilana de madeira de vidoeiro (XMV), xilana de endoderma de aveia (XAE), p-nitrofenil-glucopiranosídio (pNPG) e celobiose. Devido à alta concentração de proteínas existente no complexo celulásico de T. reesei, que é um preparado industrial, a comparação direta das atividades volumétricas não foi capaz de evidenciar quaisquer diferenças entre os sistemas, pois todos os valores foram muito superiores para o T. reesei. A alternativa imediata para a comparação desses dados seria a atribuição desses valores com base na concentração de

proteínas, ou seja, a atividade enzimática volumétrica expressa por unidade de proteína (UI/mg) (Tabelas 2). No entanto, esta medida não está livre da influência dos fatores listados no item anterior.

TABELA 2 - ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS ABSOLUTAS E POR UNIDADE DE PROTEÍNA

Celobiose p-Nitrofenil-copiranosídeo macell ®tipo 50 na de endoderma de aveia na de madeira de vidoeiro roxietilcelulose oximetilcelulose Papel de filtro Substratos Enzima

17,6 ± 0,11 43,3 ± 0,40 40,40 ± 0,39 1367,1 ± 3,51 1232,88 ± 43,92 1390,3 ± 1,42 766,67 ± 6,52 110,2 ± 3,01 UI/mL

0,15 ± 0,01 0,38 ± 0,01 0,35 ± 0,01 11,95 ± 0,14 10,80 ± 0,32 12,16 ± 0,14 6,70 ± 0,06 0,96 ± 0,03 Lowry*

0,29 ± 0,01 0,72 ± 0,03 0,67 ± 0,01 22,76 ± 0,91 20,53 ± 0,53 23,15 ± 0,93 12,76 ± 0,11 1,83 ± 0,09 Bradford** Atividade em UI/mg com base em: T. reesei

0,19 ± 0,01 0,31 ± 0,01 0,10 ± 0,01 3,29 ± 0,18 3,16 ± 0,07 4,68 ± 0,13 1,53 ± 0,01 0,27 ± 0,02 UI/mL

0,52 ± 0,03 0,85 ± 0,05 0,27 ± 0,02 9,02 ± 0,50 17,02 ± 0,11 12,88 ± 0,37 4,25 ± 0,03 0,74 ± 0,05 Lowry*

étodo de Lowry: T. reesei = 114,34 ± 1,28 mg/mL; P. echinulatum = 0,363± 0,003 mg/mLétodo de Bradford: T. reesei = 60,04 ± 2,45 mg/mL; P. echinulatum = 0,149 ± 0,016 mg/mL 1,28 ± 0,06 2,08 ± 0,15 0,67 ± 0,07 22,05 ± 1,10 21,07 ± 0,18 31,45 ± 2,52 10,20 ± 0,05 1,81 ± 0,07 Bradford** Atividade em UI/mg com base em: P. echinulatum

Após a realização dos cálculos das atividades por unidade de proteína, foi observada uma maior proximidade entre os valores obtidos para T. reesei e para P.

echinulatum e algumas comparações puderam então ser realizadas com dados disponíveis na literatura. Com base na determinação de proteínas pelo método de Lowry, Castellanos (1995) demonstrou que a atividade específica de uma cepa de Penicillium sp.

correspondeu a 0,35, 0,92 e 0,11 U/mg para a hidrólise do papel de filtro, pNPG e celobiose, respectivamente, enquanto que, neste trabalho, os valores para o P.

echinulatum foram de 0,74, 0,85 e 0,52 U/mg. Portanto, o complexo de P. echinulatum possui maior atividade contra papel de filtro e celobiose, enquanto que o Penicillium sp.

possui maior afinidade pelo pNPG. Este autor também encontrou valores de 0,32 U/mg e 0,0021 U/mg para as atividades contra papel de filtro e celobiose em uma cepa de T.

reesei produzida pela Privolzhski Fermentation Plant – PFP (Rússia), e de 0,41 U/mg e 0,037 U/mg para uma cepa de T. reesei produzida pela Genencor (CA, USA), demonstrando a baixa atividade β-glucosidásica nos complexos enzimáticos de T. reesei em relação às cepas do gênero Penicillium. Estes valores foram inferiores aos encontrados neste trabalho para a Celluclast 1.5L FG^®, que corresponderam a 0,96 e 0,15 U/mg, respectivamente.

Durand (1984) demonstrou que as enzimas de Penicillium sp. apresentam atividade β-glucosidásica 4,7 vezes superior à observada em celulases de T. reesei. Outros autores também demonstraram resultados similares para diferentes espécies de Penicillium (Jørgensen et al, 2005; Wyk, 1999). Os resultados obtidos neste trabalho

estão de acordo com os citados acima quando se conclui que a atividade β-glucosidásica é superior em complexos celulásicos do gênero Penicillium. Porém, diferenças também foram encontradas na relação numérica entre as atividades, ou seja, a afinidade das enzimas pelos substratos testados não conserva a mesma proporção.

Quando os complexos celulásicos de P. echinulatum e de T. reesei foram comparados, utilizando os dados exibidos nas Tabela 2, conclusões muito diferentes podem ser obtidas dependendo do método de dosagem de proteínas fixado como referência. Por exemplo, considerando-se a hidroxietilcelulose como substrato, o P.

echinulatum apresentou atividade endoglucanásica 6% maior do que T. reesei quando a dosagem de proteínas foi feita pelo método de Lowry, mas quando esta mesma comparação foi realizada com base no método de Bradford, a atividade do P. echinulatum apresentou-se 34% superior. Portanto, para poder comparar as respectivas atividades volumétricas, todos os valores foram indexados em relação à atividade contra papel de filtro, que representa a atividade celulásica total (Tabela 3).

TABELA 3 - ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS EM RELAÇÃO A ATIVIDADE CONTRA PAPEL DE FILTRO

Enzima P. echinulatum T. reesei

Razão P. echinulatum /

T. reesei

PF/PF 1 1 1

CMC/PF 5,68 6,97 0,81

HEC/PF 17,34 12,64 1,37

SIG/PF 0,37 0,37 1

XMV/PF 11,69 11,20 1,04

XEA/PF 12,17 12,43 0,98

pNPG/PF 1,14 0,39 2,92

Celobiase/PF 0,69 0,16 4,31

Os dados apresentados na Tabela 3 têm como destaque a atividade β-glucosidásica contra celobiose e pNPG. A atividade celobiásica do P. echinulatum foi 4,31 vezes maior do que a determinada para ao T. reesei, enquanto que a atividade contra o pNPG apresentou uma diferença menor, de 2,92 vezes. O pNPG é um substrato específico para β-glucosidases e, por esta razão, era esperado que fosse hidrolisado em maior quantidade do que a celobiose, pois o p-nitrofenol é um bom grupo abandonador e a enzima não precisa ser especifica para ligações β-(1→4) para conseguir hidrolisar este

substrato, enquanto que a celobiose é um substrato mais estável e será somente hidrolisada por enzimas que apresentem esta especificidade. Jørgensen et al (2005) encontrou uma razão pNPG/PF de 0,4 para o T. reesei contido na Celluclast FG 1.5L^® (Novozymes) e valores de 4,1, 1,9 e 7,6 para três diferentes espécies de Penicillium (P.

pinophilum, P. persicinum e P. brasilianum, respectivamente). O razão pNPG/PF para o P. echinulatum foi de 1,14. Portanto, o P. echinulatum apresentou uma razão pNPG/PF mais baixa do que todos os outros complexos celulásicos de Penicillium relatados por estes autores, mas ainda assim é superior a razão encontrada para a Celluclast 1.5L FG^® de T. reesei.

As atividades contra xilanas de madeira de vidoeiro e de endoderma de aveia foram equivalentes para os dois complexos celulásicos. No entanto, as enzimas de T.

reesei apresentaram maior atividade contra CMC, enquanto que o complexo de P.

echinulatum apresentou maior atividade contra HEC. Ambos os substratos são indicados como modelo para se avaliar a atividade endoglucanásica, mas suas diferentes propriedades estruturais podem interferir na ação das enzimas, gerando comportamentos distintos. Estas interferências podem ser parcialmente atribuídas ao tipo de substituinte ligado à cadeia de celulose, hidroxietílico ou carboximetílico. No entanto, a interpretação destes resultados experimentais não constitui o objetivo deste trabalho, porque exigiria o isolamento e a purificação de cada uma das principais endoglucanases presentes nos complexos enzimáticos envolvidos neste estudo.

A atividade contra Sigmacell tipo 50 (celulose microcristalina) também foi determinada porque este substrato apresenta alta organização estrutural, baixo grau de polimerização e grande disponibilidade de grupos terminais redutores e não redutores, o que já o caracteriza como substrato ideal para avaliação da atividade celobioidrolásica.

Surpreendentemente, a atividade contra esse substrato, considerando-se a quantidade de ligações glicosídicas hidrolisadas, foi equivalente para os dois complexos celulásicos aqui estudados. Porém, a análise dos carboidratos solúveis produzidos durante a hidrólise (Figura 24) mostra que as β-glucosidases do P. echinulatum podem ter sido as grandes responsáveis por este resultado, pois, ao converterem uma grande quantidade de celobiose em glucose, causaram um aumento considerável do poder redutor do meio reacional. A prova disso é que, para o complexo celulásico de P. echinulatum, a concentração de glucose nos hidrolisados foi superior à concentração deste carboidrato nos hidrolisados de T. reesei. Na tentativa de refinar o estudo comparativo entre as atividades dos complexos celulásicos de P. echinulatum e de T. reesei contra Sigmacell^® tipo 50, foi utilizado como referência o modelo do T. reesei, onde a razão molar entre a celobiose/glucose foi de 0,76. Ao simular o produto de hidrólise de P. echinulatum para uma razão molar celobiose/glucose de 0,76, a atividade volumétrica relativa do complexo celulásico (SIG/PF) foi reduzida para 0,28, demonstrando que o complexo celulásico de T. reesei definitivamente possui uma atividade celobioidrolásica maior.

FIGURA 24 - QUANTIDADE DE CELOBIOSE (█), GLUCOSE (█), CELOBIOSE + GLUCOSE (█) E RAZÃO CELOBIOSE/GLUCOSE (█) NOS HIDROLISADOS PRODUZIDOS PELO (A) P. echinulatum, (B) T. reesei E (C) P. echinulatum CORRIGIDO PARA A MESMA RAZÃO MOLAR CELOBIOSE/GLUCOSE APRESENTADA NOS HIDROLISADOS DE T. reesei

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

T.r. P.e. P.e. corrigido

Carboidrato (mmol)

O maior título de atividade β-glucosidásica em P. echinulatum também foi caracterizado pela análise cromatográfica dos hidrolisados produzidos pela ação enzimática sobre o papel de filtro.

FIGURA 25 - PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) NOS HIDROLISADOS DO PAPEL DE FILTRO

0%

20%

40%

60%

80%

100%

P. echinulatum T. reesei

Carboidrato (%)

A Figura 25 demonstra que o P. echinulatum produziu, após uma hora de hidrólise, 57% de açúcares redutores na forma de glucose e 43% na forma de celobiose, enquanto que o T. reesei produziu apenas 27% de glucose e 73% de celobiose sob as mesmas condições experimentais. Esta observação reitera o fato de que as enzimas de P.

echinulatum possuem maior atividade β-glucosidásica que as de T. reesei (Celluclast 1.5L FG^®).

5.4 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS

Vários experimentos de hidrólise foram realizados para comparar a capacidade dos complexos celulásicos de P. echinulatum e T. reesei em sacarificar substratos celulósicos. No primeiro experimento, foi selecionada uma polpa branqueada obtida pelo processo kraft por ser este um substrato de baixo grau de organização estrutural e, conseqüentemente, mais susceptível à hidrolise enzimática. O experimento foi realizado utilizando-se polpas em uma suspensão a 4% (m/v) e com uma carga enzimática de 15 UPF/g de substrato para o P. echinulatum e de 11 UPF/g substrato para o T. reesei (Figura 26).

FIGURA 26 - HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA POR CELULASES DE P. consideravelmente superior (aproximadamente 12% após 72h de hidrólise), produzindo maior quantidade de açúcares durante o processo. No entanto essa diferença foi provavelmente devida à carga enzimática utilizada para cada um dos experimentos, pois o sistema com P. echinulatum apresentou 4 UPF/g de substrato a mais do que aquele que empregou celulases de T. reesei. Por outro lado, o P. echinulatum possui uma maior

quantidade de β-glucosidases que, ao converterem celobiose em glucose, diminuem a repressão catabólica do meio reacional, particularmente sobre as exoglucanases. As Figuras 27 e 28 apresentam a variação da quantidade de glucose e celobiose durante a hidrólise de polpa kraft deslignificada. Os hidrolisados de P. echinulatum foram compostos majoritariamente por glucose e os de T. reesei apresentaram uma quantidade considerável de celobiose. Portanto, a soma da quantidade dos dois açúcares (em unidades de massa) teve pouca influência sobre o rendimento final de hidrólise com celulases de P.

echinulatum, mas para o T. reesei, o cômputo da celobiose como produto de reação foi muito mais significativo.

FIGURA 27 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE + CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE DE 11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tempo (h)

Carboidrato (g)

FIGURA 28 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE + CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM ATIVIDADE DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA

Uma polpa não branqueada obtida pelo processo kraft, contendo cerca de 5% de lignina residual, também foi hidrolisada sob as mesmas condições empregadas no experimento anterior (Figura 29). Com a utilização deste substrato, foi possível avaliar o efeito da lignina sobre o comportamento das enzimas durante a hidrólise. O P.

echinulatum apresentou, novamente, o maior rendimento, mas a diferença entre os rendimentos caiu para aproximadamente 10%, enquanto que na hidrólise da polpa

branqueada, o P. echinulatum apresentou conversão 15% superior ao T. reesei em 48 h de hidrólise. Este resultado indica uma provável influência da lignina sobre o comportamento das enzimas presentes no complexo de P. echinulatum, uma vez que houve uma redução na diferença entre os rendimentos quando o substrato utilizado continha lignina.

FIGURA 29 - HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA POR CELULASES DE P.

echinulatum (■) E DE T. reesei (●) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11 UPF/g DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tempo (h)

Rendimento (%)

A variação da quantidade de glucose e celobiose também foi acompanhada durante a hidrólise da polpa kraft não branqueada (Figuras 30 e 31), para que se pudesse inferir alguma conclusão sobre o efeito da lignina sobre as β-glucosidases. O comportamento do P. echinulatum foi semelhante à hidrólise da polpa branqueada, mas o T. reesei apresentou uma porcentagem de celobiose maior do que na hidrólise anterior, indicando uma possível inativação das β-glucosidases por influência da lignina.

FIGURA 30 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE + CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE DE 11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)

FIGURA 31 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE + CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM ATIVIDADE DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)

A Figura 32 compara a porcentagem de glucose e celobiose produzidas durante a hidrólise de polpas kraft branqueadas e não branqueadas pelos dois complexos celulásicos. O P. echinulatum apresentou um pequeno decréscimo na produção de glucose durante a hidrólise da polpa kraft não branqueada, quando comparada com a polpa kraft branqueada. Já o T. reesei apresentou uma diferença maior entre as duas hidrólises, principalmente a partir de 11 horas de reação, quando há um aumento na taxa de produção

de glucose durante a hidrólise da polpa kraft branqueada que não é detectado durante a hidrólise da polpa kraft não branqueada. Por interação hidrofóbica, as enzimas podem adsorver na lignina, resultando na redução da atividade celulásica. Foi relatado que as β-glucosidases adsorvem fortemente na lignina e esse fato pode ser observado principalmente no caso da hidrólise realizada com as enzimas de T. reesei. Breuil et al (1992) demonstraram que a influência das β-glucosidases no ensaio de atividade contra papel de filtro é baixa, pois a sua cinética é lenta e o experimento dura apenas 1 h, mas quando se avalia seu efeito em experimentos mais longos como a sacarificação da celulose, estas enzimas exercem grande influência no rendimento final, pois sua ação é efetiva em experimentos de longa duração. Esse fato pode ser observado também na Figura 32, pois a proporção entre glucose e celobiose aumenta em favor de glucose ao longo do experimento.

Como houve uma aproximação entre os rendimentos de hidrólise dos dois complexos celulásicos e apenas o T. reesei apresentou redução na atividade β-glucosidásica, é provável que outras enzimas (celobioidrolases e endoglucanases) do complexo celulásicos de P. echinulatum tenham sido parcialmente adsorvidas na lignina residual.

FIGURA 32 - PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) PRODUZIDAS DURANTE A HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA (A) E NÃO BRANQUEADA (B) PELO T. reesei E HIDRÓLISE DE POLPAS KRAFT BRANQUEADA (C) E NÃO BRANQUEADA (D) PELO P. echinulatum

0%