MODELOS TÍPICOS DE SUBSTRATOS PARA ESTUDO DE CELULASES

Em muitos estudos, substratos modelo são utilizados para facilitar a diferenciação entre atividades enzimáticas, como endo- ou exoglucanásicas e celobiásica ou β-glucosidásica. Em seguida, alguns desses substratos serão descritos.

3.6.1 Avicel^®, Sigmacell^® (celulose microcristalina ou hidrocelulose)

A Avicel^® e a Sigmacell^® são tipos de celulose microcristalina que podem ser preparados a partir de fibras de celulose por hidrólise com HCl 2,5 mol/L, seguida de neutralização e várias etapas de lavagem e secagem com solvente (água, acetona, etanol).

Através desse processo, a região amorfa da celulose é atacada preferencialmente pelo tratamento ácido, produzindo partículas cristalinas com GP de 100 a 250 unidades de anidroglucose. O índice de cristalinidade da Sigmacell ^® e da Avicel^® é de aproximadamente 47% (Medve, 1997).

O baixo GP da celulose microcristalina significa que este substrato possui muitas extremidades de cadeia, o que a define como um substrato apropriado para medir atividade exoglucanásica. No entanto, a Avicel^® tem se tornado um substrato amplamente utilizado em estudos sinergísticos e de cinética de adsorção de enzimas celulásicas (Medve, 1997).

3.6.2 Papel de filtro

O papel de filtro é um substrato tradicionalmente utilizado em pesquisas de celulases. As fibras de celulose que constituem o papel têm uma estrutura complexa e, para a sua hidrólise substancial, é necessário um sistema celulásico completo (celobiohidrolases e endoglucanases). O papel de filtro é recomendado pela Comissão de

Biotecnologia da IUPAC para se avaliar a atividade celulásica total de um sistema celulásico (Medve, 1997; Ghose, 1987).

3.6.3 Algodão

O algodão é a forma mais pura e natural da celulose, ainda que contenha pequenas quantidades de impurezas (pectinas, proteínas, ceras) que podem ser removidas por extração alcalina e/ou orgânica a quente, seguida por várias etapas de lavagem e secagem. Sendo, aproximadamente, 70% a 80% cristalino, o algodão é pouco suscetível à hidrólise enzimática e a presença tanto de celobiohidrolases quanto de endoglucanases é necessária para que sua hidrólise seja eficiente. No entanto, espera-se que endoglucanases não apresentem grande acessibilidade ao substrato porque essas enzimas têm preferência à regiões amorfas da estrutura supramolecular da celulose (Medve, 1997; Tímár-Balázsy e Eastop, 1998).

3.6.4 Solka Floc (α-celulose)

A Solka Floc é preparada a partir de madeira moída em moinho de martelo, através de várias etapas de extração orgânica, ácida ou alcalina. As hemiceluloses e a lignina são parcialmente removidas durante estas etapas, mas a celulose permanece aparentemente intacta. Kothari (2002) demonstrou que o GP da celulose de Solka Floc

corresponde a apenas 700 unidades, o que sugere que a celulose sofre uma considerável perda em sua massa molecular. Este material pode ainda conter uma quantidade significativa de xilanas, mas uma preparação mais rica em celulose poderia ser alcançada através do aumento da severidade da extração que, inevitavelmente, também causaria uma degradação ainda maior da celulose.

Fragmentos maiores de Solka Floc são rapidamente degradados por celulases, mas à medida que a parte mais acessível é hidrolisada, a taxa de hidrólise é gradativamente reduzida. A Solka Floc é freqüentemente utilizada como fonte de carbono para a produção de celulases e, também, para estudos de adsorção e sinergismo (Medve, 1997).

3.6.5 Celulose de Valonia sp.

Valonia sp. é uma alga verde que produz microfibrilas de celulose de alta cristalinidade (perto de 100%). A forma cristalina dominante (60-70%) é a Iα. As microfibrilas são grossas e têm secção transversal retangular, com dimensão lateral de 20 nm. A celulose de Valonia tem sido um substrato popular no estudo de adsorção e sinergismo, tanto pela sua cristalinidade como pela sua grande homogeneidade (Medve, 1997).

3.6.6 Celulose bacteriana

A celulose altamente cristalina produzida pelo Acetobacter xylinum também tem se tornado um substrato freqüentemente utilizado para o estudo das propriedades catalíticas de celulases. Os microcristais da celulose bacteriana são mais espessos (3,0 x 6,8 nm) do que os presentes na parede celular e, por essa razão, exigem modos de ação catalítica fundamentalmente baseados na erosão gradativa da superfície do agregado (Medve, 1997).

3.6.7 Celulose obtida por tratamento com ácido fosfórico

Este substrato é obtido através do tratamento de celulose microcristalina com ácido fosfórico xaroposo (85%) a 1°C durante 1 h. Esta celulose, considerada 100%

amorfa, é muito importante para estudos das propriedades catalíticas de celulases. Mesmo celulases purificadas atacam este substrato rapidamente e o seu GP médio depende do material de partida (normalmente, Avicel) e do controle do processo de produção (Medve, 1997).

3.6.8 Derivados solúveis da celulose (CMC, HEC)

Ao substituir a celulose com suficiente quantidade de grupos carboximetílicos ou hidroxietílicos, é possível torná-la solúvel em água. Esses substratos são produzidos comercialmente com diferentes GP e GS (grau de substituição), e têm sido usados há muito como substratos-modelo para ensaios de atividade endoglucanásica. Tal atividade pode ser medida tanto pelo aumento da concentração de açúcares redutores no meio quanto através da redução da viscosidade da solução. Esses tipos de celuloses modificadas (ou substituídas) são bons substratos para endoglucanases porque apresentam grande solubilidade em água e não podem ser hidrolisados extensivamente por celobioidrolases, devido a sua baixa organização estrutural e/ou caráter amorfo pronunciado, além do impedimento estérico causado pelos grupos substituintes (carboximetil ou hidroxietil), que impedem que a cadeia da celulose penetre no sítio ativo das celobioidrolases. A carboximetilcelulose de viscosidade média (CMC) foi escolhida pela Comissão de Biotecnologia da IUPAC (Ghose, 1987) como o substrato recomendado para medir a atividade endoglucanásica e a hidroxietilcelulose (HEC) é utilizada como substrato alternativo para este mesmo fim (Medve, 1997).

3.6.9 Celodextrinas e seus derivados cromogênicos

Os substratos citados anteriormente são usados para investigar processos globais de hidrólise enzimática, mas não são aplicáveis a estudos bioquímicos clássicos como a determinação do número de domínios de ligação, investigação de modos de associação molecular e de cinética enzimática. Celodextrinas (GP inferior ou igual a 8 – as maiores são praticamente insolúveis em água) e especialmente seus derivados cromogênicos ou fluorogênicos, são substratos que podem ser aproveitados para este objetivo. Os cromóforos mais usados são os para- ou orto-nitrofenóis, enquanto que a 4 -metilumbeliferona é o substrato fluorogênico mais empregado. Glucosídeos como o p -nitrofenil-β-(1,4)-celobiosídio tem sido largamente utilizados para a determinação de atividade de celulases. A hidrólise de ligações glicosídicas nesses substratos pode ser facilmente observada pela diferença das propriedades espectrais entre as agliconas livres e em sua forma conjugada aos carboidratos (Medve, 1997).

3.6.10 Xilanas

Os sistemas celulásicos podem freqüentemente apresentar atividade hemicelulásica e esta atividade pode ser detectada utilizando substratos naturais como a xilana de casca de aveia, que contém cerca de 10% de arabinose e 15% de glucose, sendo também um substrato mais ramificado e acetilado. Outro substrato que pode ser utilizado

é a xilana de madeira de vidoeiro, com cerca de 90% de xilose. A xilana de madeira de vidoeiro é menos ramificada e, por isso, recomendada por Bailey (1992) para a determinação de atividade xilanásica em preparações enzimáticas.