UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
RENATA VIEIRA DO NASCIMENTO
INFLUÊNCIA DO TEMPO DE RESFRIAMENTO E DE SOLUÇÕES DILUENTES SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN DE CURIMATÃ COMUM, Prochilodus
brevis (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
FORTALEZA-CEARÁ
2017
RENATA VIEIRA DO NASCIMENTO
INFLUÊNCIA DO TEMPO DE RESFRIAMENTO E DE SOLUÇÕES DILUENTES SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN DE CURIMATÃ COMUM, Prochilodus
brevis (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração:
Reprodução e Sanidade Animal.
Orientadora: Prof.
aDr.
aCarminda Sandra Brito Salmito Vanderley
Coorientadora: Prof.
aDr.
aLiliane Veras Leite Castro
FORTALEZA-CEARÁ
2017
AGRADECIMENTOS
A Deus!
Aos meus pais, Maria de Fátima Vieira do Nascimento e Sérgio Rodrigues do Nascimento, por todo amor e dedicação. Por sempre me ajudarem nos momentos em que precisei, me encorajarem nos momentos difíceis e sempre me apoiarem independentemente da ocasião.
Toda a minha gratidão nunca será o suficiente.
Ao meu irmão Renan Vieira do Nascimento, por sua bondade e pelo seu zelo, mesmo que disfarçado, por mim.
Ao meu querido e amado esposo, José de Sousa Júnior, por me apoiar, me encorajar e me consolar nos momentos críticos. Obrigada por cuidar de mim e por me fazer uma pessoa mais feliz.
A todos os meus amigos de graduação. Em especial, às minhas queridas companheiras Cristina Dyna, Isabela Ponte e Julissy Tocachelo obrigada pelo carinho e amizade sincera. A distância entre nós tem sido grande e a saudade também!
Aos meus amigos mais que amados, Maria Eduarda Magalhães de Souza e Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro. Durante um bom tempo, formamos uma equipe que comparecia a diversos eventos “Ueceanos” e enlouquecemos nossas mães! Lembro com muito carinho dos nossos momentos.
À minha amiga Júlia Trugilio Lopes. Agradeço por muitas coisas, principalmente por me escutar, me dar conselhos e, principalmente, por toda a paciência comigo, eu sei que muitas vezes já quase te levei a loucura com as minhas crises de ansiedade. Por fim, gostaria de agradecer por ter tornado mais leve essa trajetória do mestrado, que passou por muitos altos e baixos.
À minha orientadora Dra. Sandra Salmito, por aceitar me orientar na monitoria, na iniciação científica e na pós-graduação. Agradeço por todo o apoio nessa trajetória, principalmente nos momentos de angustia. A senhora é um grande exemplo pra mim e para todo o laboratório.
À minha coorientadora Dra. Liliane Veras Leite Castro, por ter sido minha “mãe científica”
durante grande parte da minha iniciação científica e por disponibilizar seu tempo limitado para me ajudar no desenvolvimento da minha dissertação.
Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado o convite e pelas contribuições dadas a este trabalho.
As minhas queridas colegas de pós graduação Júlia Trugilio, Mayara Setúbal, Larissa
Teixeira, Priscila Silva e Vanessa Alves pelo ajuda antes, durante e depois dos meus
experimentos, que não eram nada curtos. Por todos os nossos momentos de alegria e também pelos momentos de desabafo! Júlia por sua arte de escutar e dar conselhos, Mayara pelo seu lado Augusto Cury e por sempre ter uma palavra de apoio, Larissa por toda a sua solidariedade e compreensão, Priscila por toda a sua bondade, solidariedade e correções do português e Vanessa por toda seu companheirismo nessa jornada do mestrado e por sua grande generosidade e vontade de ajudar ao próximo.
Aos alunos de iniciação científica do LBRP, Yasmim Maia, Jéssica Castelo Branco, Pedro Arruda, Sayansk Queiroz, Yan Reis, Jessica Uchoa, Jorgeany Bento, Edna Raquel e Raphael Neres pela disposição em ajudar, ensinar e aprender. Em especial, às minhas filhas científicas Jessica Castelo Branco e Jorgeany Bento por sempre me ajudarem. Além desses, gostaria de agradecer ao meu querido Romulo Roberto que me ajudou imensamente na preparação e na execução do meu experimento.
Aos integrantes do Núcleo Integrado de Biotecnologia por exercerem de forma exemplar as práticas de boa convivência.
Aos meus colegas de turma de mestrado por toda ajuda e troca de conhecimentos.
Ao Dr. Assis Rubens Montenegro e ao professor Claudio Cabral Campello, por terem realizado toda a parte estatística da minha dissertação e por toda a paciência em me explicar tudo o que havia sido feito.
Aos funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), pelo apoio, conhecimento e experiências fornecidas ao longo desses dois anos, que muito me acrescentaram.
À Universidade Estadual do Ceará, onde iniciei a vida acadêmica, explorei um novo mundo, vivi experiências incri ́veis e conheci pessoas maravilhosas.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pela bolsa de pós-graduação.
A todos, minha imensa gratida ̃o!
RESUMO
Prochilodus brevis é um peixe reofílico de importância econômica e ecológica. Entretanto, a ação antropogênica tem tornado sua população vulnerável. Dessa forma, é necessário o desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas, como a conservação seminal, a fim de subsidiar estudos sobre sua piscicultura. Porém, muitas vezes, as coletas seminais ocorrem em locais com poucos recursos laboratoriais e, por isso, são necessários estudos sobre o tempo máximo em que o sêmen pode ser mantido resfriado até ser congelado. Dessa forma, objetivou-se avaliar a influência do tempo de resfriamento e da presença de soluções diluidoras sobre a congelabilidade do sêmen da espécie. Para isso, nove pools foram analisados quanto:
concentração, pH, integridade de membrana, morfologia e cinética espermáticas. Após a análise do pool in natura (controle 1), este foi submetido às seguintes etapas: 1- Congelação imediata (controle 2); 2- Resfriamento: Não Diluído, Diluído em água de coco em pó (ACP- 104) ou Diluído em Glicose 5%, em diferentes tempos de resfriamento (6, 12, 24 ou 48 h); 3- Congelação pós-resfriamento: os tratamento foram rediluídos nos seus respectivos diluentes, acrescidos de 10% de dimetilsufóxido. Após 15 dias, as amostras foram descongeladas e analisadas quanto aos parâmetros citados anteriormente. Para o sêmen resfriado e o pós- descongelado, foi realizado um delineamento inteiramente casualizado com 2 e 3 fatores, respectivamente, e os testes de ANOVA e Dunnett foram aplicados para a comparação das médias. No que se refere ao resfriamento seminal, para a motilidade espermática não houve diferença (P > 0,05) entre o controle 1 e os tratamentos resfriados Não Diluído e Diluído em ACP-104 por até 24 h. Após 48 h, para velocidade curvilinear (VCL) apenas o tratamento resfriado Diluído em ACP-104 foi semelhante (P > 0,05) ao controle 1. Na comparação da forma de armazenagem (Não Diluído, Diluído em ACP-104 ou Diluído em Glicose) com o tempo de resfriamento, a partir de 24 h a motilidade espermática dos tratamentos resfriados Não Diluído e Diluído em ACP-104 foram superiores (P < 0,05) ao Diluído em Glicose. Após 48 h, o sêmen resfriado Diluído em ACP-104 apresentou uma maior estabilidade (P < 0,05) da motilidade do que os demais tratamentos. Para as velocidades espermáticas, o tratamento resfriado Diluído em Glicose por 48 h apresentou resultados inferiores (P < 0,05) quando comparados aos demais. No que se refere ao sêmen pós-descongelado, o sêmen resfriado Diluído por 6 h, independente do diluente empregado, apresentou valores de cinética espermática superiores (P < 0,05) quando comparado ao controle 2 e aos demais tratamentos.
Com relação à forma de armazenagem (Diluído e Não Diluído) e os diluentes empregados, o
tratamento previamente resfriado em ACP-104 apresentou a melhor cinética espermática.
Portanto, para possíveis ensaios de fertilização, recomenda-se a utilização do diluente ACP- 104 no resfriamento seminal de P. brevis por até 48 h ou do sêmen que foi congelado após ter sido resfriado em ACP-104 por no máximo 6 h.
Palavras-chave: Conservação seminal. Análise seminal. Peixe continental. Peixe reofílico.
ABSTRACT
Prochilodus brevis is a rheophilic fish of economic and ecological importance. However, anthropic action has made its population vulnerable. Thus, the development of reproductive biotechnologies, such as seminal conservation, is necessary to subsidize their fish farming.
However, seminal collections are often performed in places with few laboratory resources, demanding studies to determine the maximum time for which sperm can be cooled, as well as its process until frozen. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of cooling time and the presence of dilution solutions on cryopreservation of P. brevis semen. After seminal collection, nine pools were analyzed for seminal pH, concentration, membrane integrity, morphology and spermatic kinetics. After the analysis of the pools in natura (control 1), they were processed as follows: (1) immediate freezing (control 2); (2) cooling: undiluted, diluted in coconut water powder (ACP-104) or diluted in 5% glucose, followed by cooling at different times (6, 12, 24 or 48 h); (3) Post-refrigeration freezing: the pools were diluted in their respective diluents and 10% dimethyl sulfoxide. After 15 days, the samples were thawed and analyzed for the aforementioned parameters. For the cooled and post-thawed semen, a completely randomized design with 2 and 3 factors, respectively, was utilized. ANOVA and Dunnett tests were applied to compare the means. In case of seminal cooling, there was no difference (P > 0.05) in sperm motility between control 1 and the undiluted and diluted treatments in ACP-104 for up to 24 h. After 48 h, only the curvilinear velocity (VCL) of the sample diluted in ACP-104 was similar (P > 0.05) to that of control 1. When comparing forms of storage (undiluted, diluted in ACP-104 or diluted in glucose) and cooling times, the undiluted samples and the samples diluted in ACP-104 were better (P < 0.05) for all the kinetics parameters analyzed, than those diluted in glucose after 24 h. After 48 h, the cooled semen diluted in ACP-104 presented greater (P < 0.05) motility than the other treated semen samples. The samples diluted in glucose for 48 h presented lower spermatic velocity (P <
0.05) than those subjected to other treatments. Regardless of the diluent used, the post-thawed semen and the cooled semen diluted for 6 h, presented higher sperm kinetic values (P < 0.05) than those of control 2 and other treated samples. Therefore, for fertilization trials, it is recommended to use ACP-104 as diluent for seminal cooling of P. brevis for up to 48 h or semen that has been frozen after cooling in ACP-104 for a maximum of 6 h.
Key-words: Seminal Conservation. Seminal Analysis. Continental fish. Rheophilic fish.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...10
2 REVISÃO DE LITERATURA...12
2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Prochilodus brevis E SUA REPRODUÇÃO...12
2.2 TAXONOMIA (FROESE; PAULY, 2017)...13
2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO SÊMEN DE TELEÓSTEOS...13
2.4 CONSERVAÇÃO SEMINAL...13
2.4.1 Congelação Seminal...14
2.4.2 Resfriamento Seminal...16
2.5 ANÁLISE SEMINAL...17
3 JUSTIFICATIVA...19
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA...20
5 OBJETIVOS...21
5.1 GERAL...21
5.2 ESPECÍFICOS...21
6 CAPÍTULO 1...22
7 CONCLUSÕES GERAIS...44
8 PERSPECTIVAS...45
REFERÊNCIAS...46
1 INTRODUÇÃO
A curimatã comum (Prochilodus brevis, Steindachner, 1875) é um peixe teleósteo pertencente a ordem dos Characiformes, nativo do semiárido brasileiro (CHELLAPPA et al., 2009). Essa espécie habita águas doces e realiza a piracema para se reproduzir. Estudos mostram que, devido a construção de barragens e a pesca excessiva, principalmente antecedendo sua desova, a sobrevivência da espécie encontra-se ameaçada (GURGEL et al., 2012). Isso é um fator preocupante, visto que a curimatã comum possui o hábito alimentar detritívoro e é considerada um importante componente ecológico, atuando como condutor de energia e biomassa dos níveis inferiores para os níveis superiores da cadeia trófica (GURGEL et al., 2012). Além da importância ecológica, a espécie também possui importância social pois o seu consumo está diretamente relacionado a pesca de subsistência (NUNES et al., 2016).
Com isso, são necessários estudos visando o desenvolvimento de técnicas de conservação dos gametas de P. brevis, a fim de otimizar a sua piscicultura e a sua conservação em ambiente natural. Dentre as técnicas, têm-se o resfriamento seminal e a congelação seminal. O resfriamento seminal tem como objetivo preservar os espermatozoides refrigerados (cerca de 4 ºC) viáveis por um período de horas ou dias (MURGAS et al., 2004).
Por outro lado, a congelação seminal consiste na conservação dos gametas por meio da imersão em nitrogênio líquido (- 196 ºC), mantendo sua viabilidade estrutural e funcional por tempo indeterminado (FERLIZARDO, 2008). Ambas as técnicas têm como vantagens:
estabelecer programas de melhoramento genético, eliminar o problema de assincronia da atividade reprodutiva e reduzir o número de reprodutores machos mantidos na estação de piscicultura, com consequente redução dos custos (GODINHO, 2007).
Atualmente, já existem alguns estudos que esclarecem aspectos sobre a reprodução de P. brevis, inclusive sobre a aplicação da técnica de congelação seminal, que demonstraram a boa congelabilidade do sêmen, utilizando diluentes como a glicose (LOPES et al., 2014; PINHEIRO et al., 2016; NUNES et al., 2016;) e a água de coco em pó (ACP-104;
CAJADO, 2014). No entanto, na literatura ainda não é elucidado por quanto tempo após a coleta o sêmen de P. brevis permanece viável para a congelação, ou qual a melhor forma de armazenar o sêmen durante o transporte até um local adequado para ser congelado.
Essa problemática é comum, pois normalmente a coleta seminal ocorre em campo
ou em lugares com poucos recursos laboratoriais (VIVEIROS et al., 2016). Atualmente, a
solução encontrada para esse entrave é onerosa, pois conta com a translocação de
equipamentos laboratoriais móveis e a necessidade de um grande número de pessoas em
campo. Uma boa alternativa para solucionar esse problema, seria transportar as amostras seminais resfriadas, diluídas ou não em uma solução diluente que garanta uma maior qualidade seminal. Porém, poucos são os estudos sobre o resfriamento de sêmen de P. brevis e não existem dados sobre a viabilidade da congelação (congelabilidade) do sêmen após o resfriamento.
Portanto, é necessário o desenvolvimento de um protocolo de resfriamento seminal para P. brevis, a fim de otimizar a logística das coletas de sêmen para a congelação.
Este é o primeiro estudo sobre resfriamento seminal de P. brevis, corroborando com o
pioneirismo das pesquisas sobre resfriamento seminal de Characiformes.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Prochilodus brevis E SUA REPRODUÇÃO
Prochilodus brevis (antigo Prochilodus cearensis) é uma espécie de peixe teleósteo, conhecido popularmente como curimatã comum. É nativa do semiárido brasileiro (ROSA et al., 2005; CHELLAPPA et al., 2009) e pode ser encontrada por todo o Nordeste e parte do Sul do Brasil (DOURADO, 1981).
A curimatã comum é um peixe gregário, que habita as zonas mais profundas da coluna d’água. Na fase juvenil, alimenta-se de plâncton e a partir da fase adulta ingere sedimentos do fundo dos rios, sendo classificado como um animal detritívoro. Esse tipo de alimentação, torna o P. brevis um importante componente ecológico, atuando como condutor de energia e biomassa dos níveis inferiores para os níveis superiores da cadeia trófica (GURGEL et al., 2012). Animais detritívoros promovem a rotação rápida de nutrientes necessário para sustentação da produção primária, podendo produzir 47% do nitrogênio reciclado (MCINTYRE et al., 2007). Além disso, estudos desenvolvidos na bacia do Orinoco mostraram que a perda de espécies detritívoras pode alterar o metabolismo do ecossistema e o fluxo do carbono orgânico, pois desempenham um papel importante na conservação dos rios neotropicais (TAYLOR et al., 2006).
Com relação a sua biologia reprodutiva, a curimatã comum realiza migração com finalidade reprodutiva (piracema), se deslocando para as cabeceiras dos rios para liberação dos gametas durante o período chuvoso (ARAÚJO, 1998; GURGEL et al., 2012). Essa é uma estratégia evolutiva fundamental no sucesso reprodutivo da espécie (JIMÉNEZ-SEGURA et al., 2010). Esta busca um ambiente favorável à fertilização dos ovos e desenvolvimento dos juvenis, tais como locais de águas mais movimentadas com maior oxigenação e disponibilidade de alimento, além de maior turbidez. Estes fatores garantem menores taxas de predação natural e maior sobrevivência (AGOSTINHO et al., 2007).
No entanto, quando mantidos em cativeiro, os peixes de piracema não se
reproduzem naturalmente, devido à ausência de estímulos ambientais e hormonais,
desencadeados durante a migração, sendo necessária a indução hormonal da reprodução. O
agente indutor mais utilizado é o extrato bruto de hipófise de carpa (EHC) (ZANIBONI
FILHO; WEINGARTNER, 2007), já havendo estudos que comprovando a eficiência deste
indutor para a indução da reprodução de P. brevis (LOPES et al., 2014; NUNES et al., 2016).
2.2 TAXONOMIA (FROESE; PAULY, 2017)
Reino: Animalia Filo: Chordata
Classe: Actinopterygii Ordem: Characiformes Família: Prochilodontidae Gênero: Prochilodus
Espécie: Prochilodus brevis (Steindachner, 1875)
2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO SÊMEN DE TELEÓSTEOS
A produção espermática de peixes é muito alta, devido ao grande número de divisões espermatogoniais (BILLARD, 1986), e muito variada. Em algumas espécies o macho produz 100 bilhões de espermatozoides/ano/kg do peso corporal ou mais de 1 x 10
9espermatozóides/g de testículo/dia, o que é 10 vezes maior do que a produção relatada para mamíferos (BILLARD; COSSON, 1992). Em curimatã comum, LOPES et al (2014) relataram uma concentração média de 22,26 x 10
9espermatozóides por mL.
No final da espermatogênese, ainda no interior dos testículos, os espermatozoides são quiescentes protegidos pelo plasma seminal (COSSON et al., 1999). A osmolaridade gira em torno de 300 mOsmol/kg e a quiescência é mantida até o momento em que o sêmen entra em contato com uma solução hipotônica (<300 mOsmol/kg), no caso dos peixes de água doce, ou com uma solução hipertônica (>300 mOsmol/kg) para os peixes de água salgada (COSSON, 2004). Para P. brevis, a osmolaridade média do sêmen é de 276,18 mOsmol/kg (LOPES et al., 2014).
Na maioria dos peixes, os espermatozoides não possuem estrutura acrossomal, fato compensado pela presença de um orifício para a entrada do gameta masculino no ovócito, denominado micrópila. A micrópila permanece pouco tempo aberta, se fechando em poucos minutos, ao hidratar-se no momento em que entra em contato com a água (NAKATANI et al., 2001).
2.4 CONSERVAÇÃO SEMINAL
A conservação seminal tem a função de preservar os gametas masculinos de peixes para posterior utilização na fertilização artificial. Por isso, o desenvolvimento de técnicas aplicadas à reprodução, vem assumindo papel relevante na aquicultura e na conservação de recursos genéticos (MURGAS et al., 2004). Essas técnicas procuram resolver problemas tanto de ordem econômica, como atender ao mercado consumidor, quanto problemas de ordem ecológica, tendo a função de evitar a extinção de determinadas espécies devido a ações antrópicas prejudiciais ao meio ambiente (MARIA, 2005).
Dentre as técnicas de conservação seminal destacam-se: resfriamento e congelação seminal. Essas biotécnicas reprodutivas são importantes ferramentas na obtenção de um manejo mais fácil dos reprodutores, pois dispensa a presença do macho no momento da fertilização, promove a troca de material genético entre fazendas produtoras de pescado e auxilia nos programas de preservação de espécies ameaçadas de extinção (ISAÚ, 2006).
2.4.1 Congelação Seminal
A congelação do sêmen consiste na conservação dos gametas por tempo indeterminado, sendo este mantido em nitrogênio líquido. O primeiro estudo a respeito desta técnica foi realizado por Blaxter (1953) com o objetivo de viabilizar o cruzamento de dois
“tipos” de arenque (Clupea harengus), que desovam em épocas diferentes do ano. Além disso, o desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas em gametas peixes justifica-se por razões ligadas a questões ambientais e econômicas, pois a utilização e a implantação de bancos genéticos constituem soluções potenciais para minimizar perdas decorrentes da ação do homem sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética tanto para os programas de repovoamento, como para a produção comercial (SHIMODA, 2004).
O sêmen congelado pode ser mantido em bancos por tempo indeterminado, o que possibilita o estabelecimento de programas de melhoramento genético com a utilização de machos selecionados, eliminação do problema de assincronia da atividade reprodutiva entre machos e fêmeas, redução do número de reprodutores machos mantidos na estação de piscicultura, com consequente redução dos custos (GODINHO, 2007).
Para a congelação é necessário que o sêmen seja diluído em um meio de
congelação, composto por um diluente e por um crioprotetor. Esse meio mantém a viabilidade
espermática e previni as crioinjúrias ocasionadas durante a congelação e descongelação
seminal (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). O diluente é, geralmente, uma solução rica em sais e/ou carboidratos, que promove o aumento do volume seminal, facilitando sua distribuição em doses, e atua como fonte de energia para os espermatozoides pós- descongelados. As condições mínimas requeridas para um diluente adequado são:
isotonicidade, para que não haja ativação da motilidade espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen;
condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozoides; esterilidade, ou seja, não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e, finalmente, servir de carreador de crioprotetores (LEGENDRE; BILLARD, 1980).
Salmito-Vanderley et al. (2014) lista os diluentes mais utilizados para a ordem dos Characiformes, dentre eles destacam-se a glicose e a água de coco em pó (ACP-104). A glicose já é um diluente bastante utilização na congelação seminal de peixes, uma vez que trata-se de uma solução de fácil aquisição e que já foi testada para a congelação seminal de diversas espécies (VIVEIROS et al., 2010; VIVEIROS et al. 2012; VIVEIROS et al., 2015;
CARNEIRO et al., 2012; MARTÍNEZ et al., 2012; GWO et al., 2005; PSENICKA et al., 2008; CIERESZKO et al., 2013). Além disso, especificamente para P. brevis já foram realizados estudos, que demonstraram a boa interação, pré e pós-descongelação, do sêmen com a glicose (LOPES et al., 2014; NUNES et al., 2016; PINHEIRO et al., 2016). O ACP- 104 é um diluente que vem sendo muito utilizado no desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas, que apresenta resultados satisfatórios para algumas espécies de mamíferos (SILVA et al., 2011) e peixes (CARVALHO et al., 2014), inclusive P. brevis (CAJADO, 2014). Acredita-se que o ACP-104 seja um diluente promissor devido à sua rica composição em sais minerais, aminoácidos, proteínas e fatores de crescimento vitaminas, antioxidantes e baixo teor em fosfolipídios (AROUCHA et al., 2002).
O crioprotetor tem como função proteger as células espermáticas dos efeitos deletérios provocados pela congelação. Como características gerais, os crioprotetores devem possuir baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água (BATISTA et al., 2006).
Esses podem ser classificados como intracelulares (permeáveis) ou extracelulares
(impermeáveis). Os crioprotetores intracelulares são indispensáveis para o sucesso da
congelação, pois atuam desidratando e reduzindo o ponto crioscópio do interior da célula
dificultando a formação de cristais de gelo intracelulares que as danificam. Os crioprotetores
extracelulares podem ser ou não adicionados ao meio de congelação, e auxiliam na proteção
celular recobrindo a superfície da célula e estabilizando a membrana (WATSON, 1995). Entre
os crioprotetores mais utilizados na congelação do sêmen de peixes podem ser citados os crioprotetores internos como o dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, metanol e etilenoglicol, normalmente em concentrações de 5% a 15% (VIVEIROS; GODINHO, 2009).
Portanto, a técnica de congelação celular pode ser dividida em três etapas: (1) As células são submetidas a uma solução crioprotetora, que penetra na célula e substitui a maior quantidade de água intracelular. (2) Posteriormente, a célula deve regular a osmolaridade, ficando isotônica com o meio extracelular, o que pode causar efeitos tóxicos e impacto osmótico nas mesmas. (3) Finalmente, diminui-se a temperatura passando pelo ponto de congelação da água e da solução crioprotetora (LEZCANO, 2001).
Existem vários utensílios e equipamentos para congelar as amostras de sêmen, sendo os mais utilizados são rampas de congelação, dry shippers, freezers reguláveis e botijões criogênicos, onde que são introduzidas palhetas francesas plásticas, cujo volume pode ser de 0.25, 0.5 e 5 mL (MAISSE et al., 1998).
2.4.2 Resfriamento Seminal
O resfriamento seminal é técnica que mantem a viabilidade espermática por um período de horas ou dias, em temperaturas de refrigeração (~ 4
oC), sendo indicada por facilitar o manejo, dispensar a presença do macho no ato da fecundação e aumentar a eficiência da reprodução artificial nas estações de piscicultura (MURGAS et al., 2004).
Por serem estáticos dentro da gônada, o resfriamento é bastante apropriado para a conservação do sêmen de peixes, visto que não há gasto de energia das células espermáticas (MARIA, 2005). Para a aplicação dessa técnica, é necessária a determinação do diluente ideal, pois este irá diminuir a concorrência dos espermatozoides por oxigênio e espac ̧ o e reduzira ́ a taxa metabólica das células espermáticas (CAROLSFELD; HARVEY, 1999). Por outro lado, para o resfriamento seminal, normalmente, não há adição de crioprotetor, uma vez que este não é recomendada a exposição prolongada dos espermatozoides nessa solução devido a sua alta toxicidade (OLIVEIRA, 2012).
Stoss e Donald (1982) relatam em seus estudos que os fatores que determinam o
sucesso da técnica de resfriamento é a redução da temperatura, o fornecimento e a troca de
gases com o meio, a prevenção do desenvolvimento bacteriano e da dessecação. Com isso, o
resfriamento seminal é possível, mas avaliações devem ser realizadas nos diluentes e nas
condições de estocagem, pois isso associado ao tempo de armazenamento pode interferir na
qualidade seminal, uma vez que as condições anaeróbicas unidas a contaminação microbiana diminuem a motilidade e a viabilidade espermática (RURANGWA et al., 2004).
Estudos sobre a conservação do sêmen de P. lineatus, demonstraram que o sêmen não diluído, quando refrigerado a 6-8 ºC, permanece viável por até dois dias. Sendo isso considerado fora das expectativas, devido a fatores que podem fazer com que a motilidade chegue 0% em pouco tempo, como o envelhecimento celular, competição por espaço e oxigênio e crescimento bacteriano (VIVEIROS et al., 2014).
Na literatura, podem ser encontrados estudos sobre o resfriamento seminal por meio da utilização de glicose, como diluente. Orfão et al. (2010) relatam que o sêmen de P.
lineatus quando diluído em glicose apresentou 26% de motilidade espermática após quatro dias de resfriamento. Oliveira (2006) encontrou em seus estudos, uma motilidade média de 30% no sêmen de dourado (Salminus maxillosus) quando resfriado por 48 horas no diluente supracitado.
Poucas pesquisas sobre resfriamento seminal envolvem o ACP-104 como diluente, existindo apenas estudos com P. lineatus (VIVEIROS et al, 2014) e Colossoma macropomum (OLIVEIRA, 2012). Para P. lineatus e C. macropomum após dois dias de resfriamento, observou-se 20% e 31% de motilidade respectivamente.
2.5 ANÁLISE SEMINAL
A motilidade espermática é o parâmetro mais avaliado e um dos mais importantes, pois está diretamente relacionada com capacidade de fertilização dos espermatozoides (RURANGWA et al., 2004). Essa avaliação pode ser feita de forma subjetiva, na qual o avaliador estima a taxa de espermatozoides móveis numa escala de 0 a 100% (TAITSON et al., 2008). No entanto, atualmente muitos estudos realizam as análises seminais por meio do Computer Assisted Sperm Analysis (CASA), sendo este um método de análise objetiva da motilidade espermática. Esse sistema é automático (hardware e software Sperm Class Analyser -SCA) e utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, gerando informações precisas e significativas do movimento individual de cada célula e de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004).
Por meio deste programa, é possível avaliar parâmetros considerados relevantes,
como a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), a porcentagem de
espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta e analisar a trajetória e velocidade
dos espermatozoides [velocidade curvilínea (VCL- μm/s
-1), velocidade linear progressiva (VSL- μm/s
-1) e velocidade média da trajetória (VAP- μm/s
-1)].
O CASA já foi utilizado para analisar a cinética espermática pós-descongelação de diversas espécies de peixes da ordem dos Characiformes, como a pirapitinga (P.
brachypomus), piabanha (B. insignis), curimba (P. lineatus), tambaqui (C. macropomum) e curimatã comum (P. brevis) (NASCIMENTO et al., 2010; SHIMODA, 2004; VIVEIROS et al., 2014; VIEIRA et al., 2011; LOPES et al., 2014; NUNES et al., 2016; PINHEIRO, et al.
2016).
A morfologia e a integridade de membrana são outros parâmetros relevantes para a definição da qualidade espermática. Com relação a morfologia, esta é importante pois o aumento do número de espermatozoides com anormalidades poderá acarretar na redução da taxa de espermatozoides móveis e consequentemente na sua capacidade de fertilização (COSSON et al., 1999). Por outro lado, a análise da integridade de membrana é um parâmetro importante na avaliação seminal pós-descongelação, uma vez que durante a congelação seminal a formação de cristais de gelo ou algum outro fator pode danificar a célula e causar o rompimento da membrana plasmática. Esta análise se caracteriza por estimar o percentual de células com membrana íntegra (vivas) ou não (mortas) (PÉREZ-CEREZALES et al., 2010).
As morfopatologias espermáticas são divididas em patologias primárias e patologias
secundárias, de acordo com os fatores que possam ter causado as alterações (KAVAMOTO et
al., 1999). Patologias como macro e microcefalia, cabeça degenerada, cauda quebrada, cauda
curta e cauda fortemente enrolada são oriundas do processo de espermatogênese, em
decorrência de causas que acometem os reprodutores, tais como enfermidades,
consanguinidade, deficiência nutricional e estresse ambiental, sendo conhecidas como
patologias primárias ou maiores. Por sua vez, patologias como cabeça livre normal, gota
proximal, gota distal e cauda dobrada são, geralmente, associadas à coleta e manipulação do
sêmen, e são classificados como patologias secundárias ou menores (MILIORINI et al.,
2011).
3 JUSTIFICATIVA
A curimatã comum (Prochilodus brevis) é uma espécie de peixe teleósteo endêmico de rios dos Estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte. Esta possui grande importância ecológica, pois tem hábito alimentar detritívora e desempenha um importante papel na transferência de energias e nutrientes para todo o ecossistema. Além disso, é evidente sua importância econômica devido a pesca com fins comerciais e também de subsistência.
No entanto, fatores como a construção de barragens e a pesca predatória, antecedendo a sua desova, vem tornando a população natural de curimatã comum vulnerável ao declínio. Com isso, surge o interesse de se desenvolver estudos relacionados com a manipulação de seus gametas, a fim de promover a conservação da espécie em ambiente natural, e subsidie melhorias na produção dessa espécie em cativeiro.
Atualmente, já existem estudos que esclarecem aspectos sobre a reprodução de P.
brevis, inclusive sobre a aplicação de biotécnicas reprodutivas, como a criopreservação de sêmen, que demonstraram a boa congelabilidade do sêmen dessa espécie. Porém, ainda não é elucidado quanto tempo pós-coleta o sêmen de curimatã comum permanece viável para a criopreservação ou qual a melhor forma de armazenar o sêmen.
Diante disso, esse estudo se justifica pela necessidade de otimizar o processo de
reprodução artificial da referida espécie, visto que muitas vezes os gametas são coletados em
campo ou em lugares com poucos recursos laboratoriais. Com isso, é necessário o
conhecimento do tempo máximo em que o sêmen de P. brevis pode ser mantido resfriado
após a coleta, até ser submetido ao processo de conservação seminal a longo prazo. Além
disso, é necessário verificar se a adição de soluções diluidoras durante o resfriamento garante
uma maior congelabilidade do sêmen.
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
•
A água de coco em pó associada ao dimetilsufóxido (DMSO) 10% proporciona uma
boa qualidade espermática para o sêmen resfriado e boa congelabilidade em até 48
horas de estocagem.
5 OBJETIVOS
5.1 GERAL
Avaliar a influência do tempo de resfriamento sobre a congelabilidade do sêmen de curimatã comum (Prochilodus brevis), e verificar se a presença de soluções diluidoras durante o resfriamento garante uma maior qualidade seminal pós-criopreservação.
5.2 ESPECÍFICOS
✓
Avaliar a qualidade do sêmen de curimatã comum após diferentes tempos de resfriamento (6, 12, 24 e 48 horas) com ou sem a adição de soluções diluidoras (água de coco em pó – ACP-104 ou glicose);
✓
Avaliar a qualidade pós-criopreservação (congelabilidade) do sêmen previamente resfriado nos diferentes tempos de resfriamento, com ou sem soluções diluidoras;
✓
Definir o melhor diluidor e o tempo máximo de resfriamento que garantam a melhor motilidade, morfologia e vitalidade espermática do sêmen pós-descongelado de P.
brevis.
6 CAPÍTULO 1
Influência do tempo de resfriamento e da adição de soluções diluidoras sobre a congelabilidade do sêmen de Prochilodus brevis (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
Influence of Cooling Time and Diluents on the Freezing of Semen from Prochilodus brevis (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
Periódico: Acta Scentiae Veterinariae (submetido em 15 de julho de 2017)
Qualis: B1
Influência do tempo de resfriamento e da adição de soluções diluidoras sobre a congelabilidade do sêmen de Prochilodus brevis (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
Influence of Cooling Time and Diluents on the Freezing of Semen from Prochilodus brevis (CHARACIFORMES, PROCHILODONTIDAE)
Renata Vieira do Nascimento
1, Liliane Veras Leite-Castro
2, Assis Rubens Montenegro
3, Mayara Setúbal Oliveira-Araújo
1, Júlia Trugilio Lopes
1, Priscila Silva de Almeida-Monteiro
1, Yasmim Maia Ferreira
1& Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley
1Artigo baseado na dissertação do autor principal para obtenção do grau de mestre.
1
Laboratório de biotecnologia da reprodução de peixes (LBRP), Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil.
2Faculdade de Educação, Ciências e Letras Do Sertão Central (FECLESC), Quixadá, CE, Brazil.
3Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE, Brazil.
CORRESPONDENCE: R.V. Nascimento [[email protected] -Tel.: +55 (85) 3101- 9851]. LBRP, Universidade Estadual do Ceará, Campus do Itaperi, Avenida Dr. Silas Munguba, 1700. CEP: 60714-903 Fortaleza, CE, Brazil.
ABSTRACT
Background: Prochilodus brevis is a rheophilic fish of economic and ecological importance.
However, anthropic action has made its population vulnerable. Thus, the development of
reproductive biotechnologies, such as seminal conservation, is necessary to subsidize their
fish farming. However, seminal collections are often performed in places with few laboratory
resources, demanding studies to determine the maximum time for which sperm can be cooled,
as well as its process until frozen. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of cooling time and the presence of dilution solutions on cryopreservation of P. brevis semen.
Material, Methods & Results: After seminal collection, nine pools were formed and analyzed
for seminal pH, concentration, membrane integrity, morphology and spermatic kinetics—
motility, curvilinear velocity (VCL), average path velocity (VAP) and straight line velocity (VSL). After the analysis of the pools in natura (control 1), they were processed as follows:
(1) immediate freezing (control 2); (2) cooling: undiluted, diluted in coconut water powder (ACP-104) or diluted in 5% glucose, followed by cooling at different times (6, 12, 24 or 48 h); (3) Post-refrigeration freezing: the pools were diluted in their respective diluents and 10%
dimethyl sulfoxide. After 15 days, the samples were thawed and analyzed for the
aforementioned parameters. For the cooled and post-thawed semen, a completely randomized
design with 2 (diluent × cooling time) and 3 (storage form × cooling time and storage form ×
diluent) factors, respectively, was utilized. ANOVA and Dunnett tests were applied to
compare the means. In case of seminal cooling, there was no difference (P > 0.05) in sperm
motility between control 1 and the undiluted and diluted treatments in ACP-104 for up to 24
h. After 48 h, only the VCL of the sample diluted in ACP-104 was similar (P > 0.05) to that
of control 1. When comparing forms of storage (undiluted, diluted in ACP-104 or diluted in
glucose) and cooling times, the undiluted samples and the samples diluted in ACP-104 were
better (P < 0.05) for all the kinetics parameters analyzed, than those diluted in glucose after
24 h. After 48 h, the cooled semen diluted in ACP-104 presented greater (P < 0.05) motility
than the other treated semen samples. The samples diluted in glucose for 48 h presented lower
spermatic velocity (P < 0.05) than those subjected to other treatments. Regardless of the
diluent used, the post-thawed semen and the cooled semen diluted for 6 h, presented higher
sperm kinetic values (P < 0.05) than those of control 2 and other treated samples. Overall, the
samples diluted in ACP-104 showed satisfactory results when cooled for up to 48 h or cooled for up to 6 h and frozen.
Discussion: This is the first study that froze semen from
P. brevis after cooling. Although glucose is a commonly used diluent during seminal freezing and has good post-thawing stability for this species, it is not recommended for cooling before seminal freezing, as prolonged exposure of spermatozoa to glucose may cause osmotic stress to sperm cells.
Conversely, good results with ACP-104 might be because of its rich composition, mainly the presence of indole-3-acetic acid (IAA), an auxin with proven potential for seminal conservation of other species. Therefore, for fertilization trials, it is recommended to use ACP-104 as diluent for seminal cooling of P. brevis for up to 48 h or semen that has been frozen after cooling in ACP-104 for a maximum of 6 h.
Keywords: fish, seminal criopreservation, commom curimata, sperm.
Descritores: peixe, criopreservação seminal, curimatã comum, espermatozoide.
INTRODUÇÃO
A curimatã comum (Prochilodus brevis, Steindachner, 1875) é um peixe reofílico pertencente a ordem dos Characiformes, nativo do semiárido brasileiro [6]. Devido a ação antrópica, a sobrevivência da espécie encontra-se ameaçada [8]. Isso é um fator preocupante, pois a curimatã comum é um importante componente ecológico [8] e possui grande importância social [13]. Logo, pesquisas a fim de otimizar sua piscicultura e a conservação em ambiente natural são necessários.
Existem estudos que esclarecem aspectos sobre a reprodução de P. brevis,
inclusive sobre a aplicação da técnica de congelação seminal, que demonstraram a boa
congelabilidade do sêmen, utilizando diluentes como a glicose [10,13,17] e a água de coco em
pó (ACP-104) [4]. Porém, a coleta seminal geralmente ocorre em locais com poucos recursos
laboratoriais, sendo necessária a translocação de equipamentos e mais recursos humanos em
campo [21]. Uma boa alternativa para solucionar esse problema seria transportar as amostras resfriadas até o laboratório. Entretanto, poucos estudos abordam essa técnica e não existem dados sobre a viabilidade da congelação (congelabilidade) seminal após o resfriamento.
Assim, é necessário o desenvolvimento de um protocolo de resfriamento seminal de P. brevis, que determine o tempo ideal no qual as amostras podem permanecer resfriadas e a melhor forma de armazenagem (diluído ou in natura) até a congelação, para garantir uma boa qualidade seminal pós-descongelação.
Diante disso, objetivou-se avaliar a influência do tempo de resfriamento sobre a congelabilidade do sêmen P. brevis, e verificar se a adição de diluentes durante o resfriamento garante uma maior qualidade seminal pós-descongelação.
MATERIAIS E MÉTODOS Manejo dos animais e coleta dos gametas
No segundo semestre de 2016, foram selecionados 15 machos de P. brevis, do plantel do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP), localizado em Fortaleza-CE, que apresentavam características indicativas de maturidade reprodutiva [10,13].
Esses animais foram induzidos hormonalmente à reprodução por meio da aplicação de duas doses de extrato hipofisário de carpa (EHC; 0,3 mg.kg
-1e 3 mg.kg
-1de peso vivo), com intervalo de 14 horas entre as aplicações.
Oito horas após a aplicação da segunda dose de EHC, os animais foram sedados com eugenol e o sêmen foi coletado [10,13,17].
Análise do sêmen in natura e formação do pool
Após a coleta seminal, o volume do sêmen de cada animal foi aferido em tubos
graduados de polietileno e o pH com fitas de pH. A motilidade foi analisada utilizando o
Sistema de Análise Seminal Computadorizado (CASA), por meio do software Sperm Class
Analyser
1(versão 3.2). Apenas as amostras com motilidade superior a 85% foram
selecionadas para a formação de nove pools, cada um composto por 3 a 4 animais.
Posteriormente, alíquotas de cada pool (controle 1 – semen in natura) foram retiradas para analisar concentração (espermatozoides/mL), morfologia (%), integridade de membrana (%) e cinética espermáticas – motilidade (%), velocidade curvilinear (VCL - μm/s
-1), velocidade em linha reta (VSL - μm/s
-1) e velocidade média do percurso (VAP - μm/s
-1) [10,13,17].
Conservação seminal
O experimento foi dividido em três etapas: (1) congelação imediata; (2) resfriamento;
(3) congelação das amostras resfriadas.
1- Etapa 1: Congelação imediata (Controle 2 - hora zero)
O sêmen foi diluído (1:9 - sêmen:solução diluidora) em dois tipos de soluções:
Glicose
25% adicionada de dimetilsufóxido
3(DMSO) a 10% (Glicose+DMSO) ou em ACP- 104
4adicionada de DMSO a 10% (ACP+DMSO). Em seguida, as amostras foram envasadas em palhetas francesas de 0,25 mL e congeladas [10,13,17].
2- Etapa 2: Resfriamento
Os pools foram armazenados de três formas: Não Diluído; Diluído (1:4 - sêmen:diluente) em Glicose 5% ou Diluído em ACP-104. Cada tratamento foi armazenado em tubos estéreis, mantidos a 4 ºC durante os seguintes tempos de resfriamento: 6, 12, 24 e 48 horas (h). Após cada tempo de resfriamento, as amostras foram analisadas quanto à cinética, morfologia e integridade de membrana espermáticas.
3- Etapa 3: Congelação pós-resfriamento
As amostras resfriadas (etapa 2) foram submetidas à congelação. O tratamento Não
Diluído foi adicionado de Glicose+DMSO ou de ACP+DMSO, na taxa de diluição de 1:9
(sêmen:solução diluidora). O sêmen previamente Diluído em Glicose 5% ou em ACP-104
(etapa 2) foi rediluído em Glicose+DMSO ou em ACP+DMSO, respectivamente, atingindo
uma proporção final de 1:9 (sêmen:solução diluidora). Assim, formaram-se os tratamentos
que foram congelados após o resfriamento: Não Diluído, que foi adicionado de Glicose+DMSO ou ACP+DMSO, e Diluído em Glicose ou ACP-104, que foi adicionado de Glicose+DMSO ou ACP+DMSO, respectivamente.
As amostras foram mantidas em nitrogênio líquido por no mínimo 15 dias, descongeladas em banho-maria a 30 °C por 16 segundos [13] e analisadas quanto à cinética, morfologia e integridade de membrana espermática [10,13,17].
Análise Estatística
Os dados foram inicialmente submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para verificação da distribuição dos resíduos e homocedasticidade de variâncias entre os tratamentos, respectivamente. Posteriormente, realizou-se a análise de variância (ANOVA), por meio do Programa SAS (2002), considerando um delineamento experimental inteiramente casualizado em arranjo fatorial do sêmen resfriado em dois fatores (diluente x tempo) e do sêmen pós-descongelação em três fatores (forma de armazenagem x tempo e forma de armazenagem x diluente). O teste de Dunnett foi utilizado para comparar todos os tratamentos com os controles do experimento de resfriamento (controle 1) e do experimento de congelação (controle 2). Para as variáveis que não atenderam aos pressupostos da ANOVA, foi aplicado o teste não paramétrico de Krukall-Wallis. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão das médias (P < 0,05).
RESULTADOS Características do sêmen in natura
As características do sêmen in natura estão descritas na Tabela 1.
Características do sêmen resfriado
Ao comparar a motilidade do controle 1 com os demais tratamentos resfriados (Não
Diluído, Diluído em ACP-104 ou Diluído em Glicose), observou-se que por até 6 h de
resfriamento não houve diferença entre nenhum dos tratamentos (P > 0,05). Após 12 e 24 h, o
sêmen Não Diluído e Diluído em ACP-104 foram semelhantes ao controle 1 (P > 0,05), enquanto que o Diluído em Glicose apresentou motilidade inferior (P < 0,05). Contudo, após 48 h todos os tratamentos apresentaram motilidade inferior (P < 0,05) ao controle 1 (Tabela 2).
No que se refere às velocidades espermáticas, os tratamentos resfriados por até 6 h não diferiram do controle 1 (P > 0,05). Para VCL, após 12 h de resfriamento o sêmen Diluído em Glicose foi inferior (P < 0,05) ao controle 1, porém os outros tratamentos foram semelhantes (P > 0,05). Após 48 h, ainda para o mesmo parâmetro, apenas o sêmen resfriado Diluído em ACP-104 apresentou valores semelhantes ao controle 1 (P > 0,05). Os parâmetros VAP e VSL seguiram o mesmo padrão: até 48 h de resfriamento não houve diferença (P > 0,05) entre os tratamentos Não Diluído e Diluído em ACP-104 em relação ao controle 1, enquanto que o Diluído em Glicose foi inferior (P < 0,05) ao controle 1 após 24 h.
Houve uma interação significativa entre a forma de armazenagem (Não Diluído, Diluído em ACP-104 ou Diluído em Glicose) e o tempo de resfriamento (Tabela 2). Assim, para a motilidade, foi observado que em 12 h de resfriamento não houve diferença entre nenhum dos tratamentos (P > 0,05). No entanto, a partir de 24 h, o sêmen resfriado Não Diluído e Diluído em ACP-104 apresentaram motilidade superior (P < 0,05) quando comparados com o Diluído em Glicose. O efeito da diluição em função dos tempos de resfriamento demonstrou que, independentemente do tempo, o sêmen Diluído em ACP-104 apresentou uma maior estabilidade da motilidade espermática do que os demais tratamentos.
Os resultados referentes às velocidades espermáticas foram semelhantes entre os tratamentos até às 12 h de resfriamento. Os tratamentos Diluído em ACP-104 e Diluído em Glicose diferiram entre si (P < 0,05) após 24 h de resfriamento, porém foram semelhantes (P
> 0,05) ao Não Diluído. No entanto, após 48 h o sêmen resfriado Diluído em Glicose
apresentou-se inferior (P < 0,05) aos demais (Tabela 2).
Independentemente do tempo de resfriamento, as maiores taxas de espermatozoides com membrana íntegra (P < 0,05) foram encontradas nas amostras Diluídas em ACP-104 e Não Diluídas, e os espermatozoides com morfologia normal não diferiram entre os tratamentos Não Diluído, Diluído em Glicose e Diluído em ACP-104 (P > 0,05; Tabela 3).
Características do sêmen pós-descongelação
O controle 2 apresentou os seguintes resultados: motilidade 50,56 ± 12,18%, VCL 31,60 ± 6,45 µm/s
-1, VSL 13,82 ± 5,62 µm/s
-1, VAP 20,67 ± 6,01 µm/s
-1, 68,53 ± 5,4% e 62,22 ± 10,03% de espermatozoides normais e com membrana íntegra, respectivamente (Tabela 4).
Não houve interação tripla entre a forma de armazenagem, o diluente e o tempo de resfriamento. Ao comparar a cinética espermática do controle 2 com os tratamentos pós- descongelados, observou-se valores de cinética superiores (P < 0,05) quando o sêmen foi mantido Diluído, independente do diluente utilizado, e resfriado por até 6 h (Tabela 4).
Houve interação entre a forma de armazenagem (Diluído ou Não Diluído) e o tempo de resfriamento (Tabela 4). Para todos os parâmetros de cinética avaliados, os tratamentos resfriados Diluídos por 6 h apresentaram as melhores taxas pós-descongelação (P < 0,05) do que os resfriados Não Diluídos. Porém, os tratamentos Diluídos resfriados por 12 h apresentaram diminuição nesses parâmetros, tornando-se semelhantes aos Não Diluídos e mantendo valores similares entre si por até 48 h de resfriamento (P > 0,05).
Houve interação significativa entre a forma de armazenagem e os diluentes sobre os parâmetros de cinética, independente do tempo de resfriamento (Tabela 5). Assim, não houve diferença (P < 0,05) pós-descongelação entre o sêmen Diluído em Glicose e o Não Diluído e que depois recebeu Glicose+DMSO. Porém, o tratamento Diluído em ACP-104 apresentou cinética espermática superior ao Não Diluido e que posteriormente recebeu ACP+DMSO (P <
0,05). Não houve diferença (P > 0,05) entre o sêmen congelado em Glicose+DMSO e em
ACP+DMSO, que foi mantido resfriado e Não Diluído. Contudo, quando o sêmen foi mantido resfriado e Diluído, os melhores valores de cinética espermática pós-descongelação (P < 0,05) foram obtidos quando este manteve-se em ACP-104 (Tabela 5).
Independentemente da forma de armazenagem e do tempo de resfriamento, as maiores (P < 0,05) taxas de espermatozoides com membrana íntegra foram encontradas nas amostras congeladas com ACP-104, e os espermatozoides com morfologia normal foram encontrados em maior quantidade (P < 0,05) no sêmen congelado com Glicose (Tabela 6).
DISCUSSÃO
O presente estudo foi pioneiro em congelar sêmen após a aplicação da técnica de resfriamento seminal para P. brevis. Além disso, determinou o tempo máximo no qual o sêmen desta espécie pode permanecer resfriado mantendo as características espermáticas viáveis, visando garantir uma boa qualidade seminal pós-descongelação.
Neste trabalho, evidenciou-se a importância de pesquisas sobre a melhor forma de armazenagem do sêmen antes da congelação, pois a coleta seminal habitualmente ocorre em locais com poucos recursos laboratoriais, necessitando de um tempo de transporte do sêmen até um local adequado para a congelação [21]. Foi observado que o uso do diluente ACP-104, durante a armazenagem do sêmen, foi capaz de manter as células espermáticas viáveis no decorrer do período de resfriamento.
Os dados encontrados para o sêmen in natura de P. brevis corroboram com os relatados na literatura [10,13]. Possíveis variações podem ter ocorrido devido à estac ̧ ão do ano, o clima, o peri ́odo de repouso sexual, o método de coleta e ativação seminal [12].
Durante o resfriamento, o sêmen Diluído em Glicose nos diferentes tempos apresentou
um decréscimo da cinética espermática e da integridade de membrana, mostrando ser o
diluente menos adequado. Neste estudo, foi utilizado Glicose 5%, que é de comum aplicação
na técnica de congelação seminal de diferentes espécies de peixes teleósteos, inclusive de P.
brevis [10,13,17]. Contudo, devido ao contato prolongado do diluente com os espermatozoides, é possível que a Glicose tenha ocasionado estresse osmótico na célula, levando ao rompimento da membrana plasmática. Além disso, a diluição em Glicose, um composto simples, pode ter ocasionado a diminuição de importantes substâncias do plasma seminal, que protegem os espermatozoides contra possíveis efeitos deletérios, tais como íons e anti-oxidantes [3].
Estudos com resfriamento seminal de peixes mostram que a Glicose não consegue manter uma boa qualidade espermática durante um período de resfriamento prolongado.
Pesquisas com P. lineatus relatam que a glicose é capaz de manter somente 30% de motilidade espermática por até três dias de resfriamento [16]. Por outro lado, trabalhos com piabanha (Brycon insignis) indicaram ausência de motilidade espermática após 2 dias de resfriamento, quando diluídos em glicose [1].
Na morfologia espermática do sêmen resfriado, não houve diferença (P > 0,05) entre os tratamentos. De fato, o resfriamento é uma técnica menos prejudicial aos espermatozoides do que a congelação, em que é esperada uma redução de espermatozoides normais [20].
O sêmen resfriado Diluído em ACP-104 ou Não Diluído apresentaram os melhores
resultados de cinética espermática, diferindo em alguns parâmetros em relação ao controle 1
somente após 24 h de resfriamento. Apesar disso, os dados de motilidade desses tratamentos
permaneceram acima de 70% após 48 h de resfriamento, sendo superior ao exigido pelo
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CBRA [7]. Para as velocidades espermáticas,
somente o sêmen resfriado Diluído em ACP-104 apresentou valores semelhantes ao controle
1 após 48 h. Assim, acredita-se que o sêmen resfriado, previamente Diluído em ACP-104,
apresente melhores taxas de fertilização, pois a capacidade de fertilização dos
espermatozoides de peixes está relacionada com as velocidades, principalmente a VCL [22].
Embora os resultados do sêmen Não Diluído tenham sido semelhantes ao Diluído em ACP-104, no resfriamento, recomenda-se a utilização de um diluente, uma vez que a diluição irá reduzir a competição das células espermáticas por espaço e oxigênio e diminuir a toxicidade dos metabólitos [5]. Além disso, foram relatados diversos benefícios da adição de diluente para o sucesso do resfriamento seminal, entre eles evitar o dessecamento das células [19]. Assim, os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que armazenar o sêmen de P. brevis diluído em ACP-104 é o mais recomendado.
Estudos mostram que o uso do ACP como diluente seminal é uma alternativa promissora e eficaz na conservação de importantes características espermáticas em várias espécies animais [2, 9, 14, 18, 22]. Atualmente, poucos são os estudos sobre resfriamento seminal de peixes que envolvem o uso do ACP-104 como diluente, existindo apenas estudos com P. lineatus [22] e Colossoma macropomum [15], sendo os resultados de cinética semelhantes aos encontrados na presente pesquisa.
Atribui-se o sucesso do ACP como diluente seminal à sua composição, com poucos fosfolipi ́deos e rica em proteínas, sais, açúcares, vitaminas e fatores de crescimento, como o ácido indol-3-acético (AIA) [2]. Estudos demonstraram que o AIA estimula e mantém uma maior motilidade para sêmen de caprinos e ovinos [14], além de proporcionar um maior número de espermatozoides com membrana íntegra [9] e com morfologia normal [2].
No que se refere à etapa 3, os tratamentos resfriados Diluídos por 6 h mantiveram a melhor congelabilidade, apresentando valores de cinética pós-descongelação superiores aos preconizados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal [7].
Nas pesquisas envolvendo a congelação seminal de P. brevis, quando utilizado o
diluidor Glicose+DMSO, os resultados de motilidade encontrados na literatura [10,13,17] são
inferiores, entretanto, as velocidades foram superiores às do presente estudo. O mesmo padrão
foi observado para o sêmen, de P. brevis e de P. lineatus, congelado em ACP-104 [4, 22].
Salienta-se que os resultados gerados por esta pesquisa são uma média de quatro tempos de resfriamento pré-congelação, enquanto que os demais não passaram pelo resfriamento prévio.
No que se refere à morfologia espermática, ainda não foi estabelecido o percentual mínimo de espermatozoides normais para a fertilização em peixes. No presente estudo, foram encontrados mais espermatozoides normais no sêmen congelado com Glicose, independentemente da forma de armazenagem e do tempo de resfriamento. Nesta pesquisa, o defeito mais encontrado foi cauda dobrada, independente do diluente utilizado. Porém, como as morfopatologias que mais afetam a motilidade e a taxa fertilização são cauda curta e cauda enrolada [11], não foi observado, neste estudo, uma diminuição da motilidade nos tratamentos com um maior número de morfopatologias. Além disso, é possível que o percentual crítico de anormalidades espermáticas em peixes de fecundação externa oscile em torno de 50%, pois a fertilização artificial envolve uma elevada quantidade de espermatozoides e oócitos [11].
Portanto, acredita-se que, para uma fertilização, o sêmen Diluído em Glicose não obtenha resultados superiores ao Diluído em ACP-104, pois a Glicose não apresentou dados de cinética e vitalidade satisfatórios.
É provável que o sêmen Diluído em Glicose não tenha apresentado bons resultados de cinética e vitalidade espermáticas pós-descongelação, devido a sua composição simples associada a longos tempos de resfriamento. Por outro lado, no presente estudo, o sêmen resfriado por 6 h Diluído em ACP-104 apresentou os melhores resultados pós-descongelação.
Esses dados diferem dos encontrados na literatura, pois recentemente foi demonstrado que o sêmen de P. lineatus permanece viável, sem diluição, por até 3 h [21]. Assim, uma vez definido o diluente adequado, a utilização deste é fortemente recomendada durante o resfriamento, para posterior congelação seminal [5, 19].
Os resultados obtidos são bastante promissores para o desenvolvimento da piscicultura
de P. brevis e para possíveis programas de repovoamento, uma vez que foi determinado um
diluente adequado para o resfriamento seminal, a forma ideal de armazená-lo e o tempo no qual este pode ser mantido resfriado para posterior congelação. Assim, para ensaios de fertilização, acredita-se que o sêmen de P. brevis, submetido a tais condições, apresentem boas taxas de fertilização.
CONCLUSÃO
Os dados in vitro do presente estudo demonstram que o ACP-104 mantém a qualidade das células espermáticas de P. brevis armazenadas a 4 ºC, por até 48 horas de resfriamento. Além disso, quando houver necessidade de armazenamento do sêmen antes da congelação seminal, o ACP-104 também é o mais recomendado, pois este mantém a congelabilidade do sêmen que foi resfriado por até 6 horas, e garante uma boa qualidade seminal pós-descongelação. Assim, para um ensaio de fertilização (in vivo) com sêmen congelado ou resfriado de P. brevis recomenda-se a utilização do ACP-104 como diluente.
MANUFACTURES
1
SCA, Microptics. Barcelona, Espanha.
2
Synth. Diadema, São Paulo, Brazil.
3
Fresenius Kabi Brasil Ltda. Aquiraz, Ceará, Brazil.
4
ACP Biotecnologia. Fortaleza, Ceará, Brazil.
Ethical approval: O projeto de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética para uso de
animais da Universidade Estadual do Ceará (UECE), com o seguinte número de protocolo:
2397704-2016.
Acknowledgements:
À FUNCAP pelo financiamento da bolsa de estudos e ao ACP Biotecnologia pela fornecimento do ACP-104.
Declaration of interest.
