UNI V E R S I D A D E F E D E R A L D O C E A R Á
F A C UL D A D E D E M E D I C I NA
PR O G R A M A D E P ÓS -G R A D UA Ç Ã O E M C I ÊNC I A S
M É D I C A S
E F E I T O A NT I -I NF L A M A T ÓR I O E
I M UNO M O D UL A D OR D E C O M PO NE NT E S D E A scaris
suum E M A R T R I T E E X PE R I M E NT A L
A na C ar olina M atias D inelly Pinto
Or ientador : Pr of. D r . F r ancisco A ir ton C astr o da R ocha
UNI V E R S I D A D E F E D E R A L D O C E A R Á
F A C UL D A D E D E M E D I C I NA
PR O G R A M A D E P ÓS -G R A D UA Ç Ã O E M C I ÊNC I A S
M É D I C A S
E F E IT O A NT I-INF L A MA T ÓR IO E IMUNOMODUL A D OR
D E C OMPONE NT E S D E Ascaris suum
E M A R T R IT E
E X PE R IME NT A L
A NA C A R OL INA MA T IA S D INE L L Y PINT O
T ese
apresentada
ao
Programa
de
Pó
s
-
Graduaçã o
em
C iê ncias
Mé
dicas
da
Universidade F ederal C eará
, como requisito
para
a
obtençã o
do
grau
de
D outor
em
C iê ncias Mé
dicas.
Orientador:
Prof.
D r.
F rancisco
A irton
C astro da R ocha
F OR T A L E Z A
A G R A D E C I M E NT O S
A gradeço primeiramente a D eus, que sempre me deu força nos momentos mais difíceis.
À minha mã e Heloisa D inelly (in memorian) pelo exemplo de mulher e que sempre esteve ao meu lado como um anjo da guarda e ao meu pai R aul D inell y por seu incansável apoio e incentivo sendo ele o responsável pela pessoa que sou hoje.
A o meu marido V inícius Martins Gomes, pelo imenso companheirismo, amor e paciê ncia.
A os meus irmã os D avid D inelly, E rika D inell y e J uan D inelly, pelo apoio e carinho e à minha prima K arina Pinto V asconcelos, pelo exemplo de luta.
A os meus sogros C arlos Gomes e A nita Gomes, que me acolheram como filha.
A o meu orientador D r. F rancisco A irton C astro da R ocha, pelas lições e orientações ensinadas e por ter acreditado em mim.
A os pesquisadores D r. J osé Marcos R ibeiro (NIH) e D r. J osé C esar R osa (US P-R ibeirã o Preto) pela colaboraçã o na identificaçã o proteica e execuçã o do projeto.
À professora V irgínia C l audia Girã o, pela ajuda nas avaliações e pelo grande apoio.
A o professor R odrigo Maranguape, que me acolheu para realizaçã o dos experimentos em S obral.
À minha amiga A na C aroline L eite, que sempre me acalmou e me apoiou em toda essa jornada, obrigada por sua constante orientaçã o.
À minha amiga J osyane, que me apoiou em diversos experimentos.
A os meus amigos do L aboratório de Investigaçã o em Osteoartropatias ( L IO), R odolfo, A nelise, Morgana, F ernanda, A ryana e a todos os estudantes que por lá passaram, pelo apoio e aprendizado.
A os professores e integrantes do programa de C iê ncias médicas, do C E MM e do NE MPI, pelos ensinamentos recebidos e pela colaboraçã o na minha formaçã o científica.
À Ivone e R ita, secretárias do Programa de Pós-Graduaçã o em C iê ncias Médicas, pela prontidã o prestada.
A o B iotério C entral da Universidade F ederal do C eará, pela gentileza na doaçã o dos animais para a execuçã o desse trabalho.
À Universidade F ederal do C eará - UF C e ao Programa de Pós - Graduaçã o em C iê ncias Médicas que propiciaram a realizaçã o do projeto.
A os laboratórios que colaboraram na execuçã o desse trabalho:
- L aboratório de Inflamaçã o do D epartamento de F armacologia da Universidade de S ã o Paulo – US P - R ibeirã o Preto.
- Núcleo de E studos em Microscopia e Processamento de Imagem – NE MPI.
R E S UM O
A artrite reumatoide (A R ) é uma doença inflamatória autoimune crô nica com etiopatogenia multifatorial, envolvendo mecanismos genéticos, imunológicos e ambientais, cujo diagnóstico e tratamento tardio influenciam negativamente na prevalência e gravidade da doença. Portanto, pacientes que residem em países com baixa renda deveriam apresentar um aumento da morbidade e / ou mortalidade por essas doenças. C uriosamente, a evoluçÂo parece ser semelhante, se nÂo menos grave, à encontrada em populações com melhores índices socioeconô micos. A hipótese higiênica sugere relaçÂo inversa entre a distribuiçÂo global de doenças autoimunes e infecções parasitárias, onde helmintos tendem a estimular o desenvolvimento de respostas T h2, além de suprimir respostas T h-1 e T h-17. O objetivo deste estudo foi isolar componentes no extrato de Ascaris suum e caracterizar seu mecanismo anti-inflamatório em modelos de artrite experimental. O extrato bruto de Ascaris suum foi separado em fraçõ es > 30 e <30 kD a. F oram obtidas quatro fraçõ es menores (1-4), na fraçÂo <30 kD a, por eletroforese nativa. Na fraçÂo 1, foi identificada a proteína A B A -1, por espectrometria de massa, e após digestÂo proteica com tripsina, sete peptídeos foram isolados (A ba-A ó G). A sequência genô mica dos peptídeos de A ba-B e A ba-F foi inserida em um plasmídeo comercial (V R 2-001-T OPO ™ ). Os plasmídeos foram clonados e expandidos em E . coli e a extraçÂo do D NA plasmidial foi realizada por kit comercial (Qiagen™ ). C amundongos S wiss machos receberam extrato bruto de A. suum (1mg), >30 kD a , <30kD a (50ng) ou fraçõ es 1, 2, 3 e 4 (1µL ), diluídos em salina estéril (200 µL ), v.o., 30 min antes da injeçÂo de Z y (0,1mg) i.a. HipernocicepçÂo foi avaliada pelo von F rey eletrô nico e o influxo celular foi avaliado no fluido articular 6h ou sete dias após zymosan i.a. C amundongos S wiss e B alb/c machos, submetidos a artrite induzida por zymosan A Z y e induzida por antígeno (A IA ), respectivamente, receberam plasmídeos recombinantes de A ba-B ou A ba-F (50μg/30μL ) na parte posterior de cada coxa traseira. O influxo celular foi avaliado 6h ou sete dias (A Z y) e 7h ou 14 dias (A IA ) após o estímulo i.a. C itocinas foram avaliadas no líquido sinovial. S inovite e dano articular foram avaliados por H& E e safranina O, respectivamente, e número de mastócitos por azul de toluidina. Níveis de citocinas (C X C L -1, IL -1β, IF N-γ, IL -5, IL -6 e IL -10) foram avaliadaos por E L IS A e a expressÂo de iNOS , C D 11b, F 4/80 e C D 206 por imunohistoquímica. A administraçÂo das fraçõ es <30 kD a, 1 e 4 reduziu a hipernocicepçÂo e influxo celular agudo e crô nico no modelo de A Z y. A transfecçÂo com ambos os plasmídeos, A ba-B ou F , reduziu significativamente o influxo de células em ambos os modelos de artrite por zymosan e mB S A agudo e crô nico. F oram observados a reduçÂo da sinovite, número de mastócitos, do dano articular e expressÂo de iNOS . Níveis de C X C L 1, IF N-γ, IL -1β e IL -6 foram reduzidos. No entanto, os níveis de IL -10 nÂo aumentaram. S urpreendentemente, os níveis de IL -5 foram significativamente reduzidos após a injeçÂo de plasmídeos. Plasmídeos aumentaram a expressÂo de macrófagos M2 na sinóvia. Uma análise quantitativa por PC R mostrou a expressÂo de peptídeos A ba-B e A ba-F nos músculos da coxa de camundongos que receberam os plasmídeos. E sta é a primeira demonstraçÂo de que sequências peptídicas derivadas de A. suum promovem a atividade anti-inflamatória em modelos de artrite, e que está associada à reduçÂo da liberaçÂo de citocinas inflamatórias. E sses peptídeos promoveram mudança na diferenciaçÂo de macrófagos na membrana sinovial ao mesmo tempo, diminuindo a liberaçÂo de IL -5. A pesar dos complexos mecanismos de modulaçÂo de helmintos de inflamaçÂo, os dados suportam ainda um efeito protetor dos produtos de helmintos em modelos de artrite crô nica.
A B S T R A C T
R heumatoid arthritis (R A ) is a chronic autoimmune inflammatory disease with multifactorial etiopathogenesis, involving genetic, immunological and environmental mechanisms, whose diagnosis and delayed treatment have a negative influence on the prevalence and severity of the disease. T herefore, patients residing in low-income countries should show increased morbidity and / or mortality from these diseases. Interestingly, the evolution seems to be similar, if not less severe, to that found in populations with better socioeconomic indexes. T he hygienic hypothesis suggests an inverse relationship between the global distribution of autoimmune diseases and parasitic infections, where helminths tend to stimulate the development of T h2 responses and suppress T h-1 and T h-17 responses. T he aim of this study was to isolate components in Ascaris suum extract and characterize its anti-inflammatory mechanism in experimental arthritis models. Ascaris suum crude extract was separated into fractions > 30 and <30 kD a. F our smaller fractions (1-4) were obtained, in the fraction <30 kD a, by native electrophoresis. In fraction 1, the A B A -1 protein was identified by mass spectrometry and after protein digestion with trypsin, seven peptides were isolated (A baA -G). T he genomic sequence of the A ba-B and A ba-F peptides was inserted into a commercial plasmid (V R 2 -001-T OPO ™ ). Plasmids were cloned and expanded in E . coli and extraction of plasmid D NA was performed by commercial kit (Qiagen ™ ). Male S wiss mice received crude extract of A. suum (1mg), > 30kD a, <30kD a (50ng) or fractions 1, 2, 3 and 4 (1μL ) , diluted in sterile saline (200 μL ), p.o., 30min before of the injection of Z y (0.1mg) i.a. Hypernociception was evaluated by the electronic von F rey and the cellular influx was evaluated in the joint fluid 6h or seven days after zymosan i.a. S wiss and B alb/c male mice, submitted to Z yA and A IA , respectively, received recombinant plasmids of A ba-B or A ba-F (50μg/30μL ) at the back of each hind leg. T he cell influx was evaluated 6h or seven days (Z yA ) and 7h or 14 days (A IA ) after the i.a stimulus. C ytokines were evaluated in the synovial fluid. S ynovitis and joint damage were evaluated by H& E and safranin O, respectively, and mast cell by toluidine blue. L evels of cytokines (C X C L -1, IL -1β, IF N-γ, IL -5, IL -6 and IL -10) were assessed by E L IS A and the expression of iNOS , C D 11b, F 4/80 and C D 206 by immunohistochemistry. T he administration of fractions <30 kD a, 1 and 4 reduced hypernociception and acute and chronic cellular influx in the Z yA model. T ransfection with both plasmids, A ba-B or F , significantly reduced the influx of cells in both the zymosan and acute and chronic mB S A arthritis models. R eduction of synovitis, mast cell numbers, joint damage and iNOS expression were observed. L evels of C X C L 1, IF N-γ, IL -1β and IL -6 were reduced. However, IL -10 levels did not increase. S urprisingly, IL -5 levels were significantly reduced after plasmid injection. Plasmids increased the expression of M2 macrophages in the synovium. A qPC R analysis showed the expression of peptides in the thigh muscles of mice that received the plasmids. T his is the first demonstration that peptide sequences derived from A. suum promote anti-inflammatory activity in arthritis models, and that it is associated with reduced release of inflammatory cytokines. Peptides promoted a change in the differentiation of macrophages in the synovial membrane at the same time, decreasing the release of IL -5. D espite the complex modulating mechanisms of helminths of inflammation, the data still support a protective effect of helminth products in chronic arthritis.
S UM Á R I O
L I S T A D E F I G UR A S 9
L I S T A D E T A B E L A S 10
L I S T A D E A B R E V I A T UR A S E S I G L A S 11
1. I NT R O D UÇ Ã O 13
1.1. A r tr ite R eumatoide 13
1.1.1. E tiologia 14
1.1.2. Patogê nese 16
1.1.3. T ratamentos na A R 20
1.2. H ipótese higiê nica 22
1.2.1. H elmintos 25
1.2.2. I munomodulaçã o promovida por A scaris sp. 28
1.2. M odelos exper imentais de A R 30
1.3.1. A rtrite I nduzida por Z ymosan (A Z y) 31
1.3.2. A rtrite I nduzida por A ntígeno (A I A ) 32
2. J US T I F I C A T I V A 34
3. O B J E T I V OS 35
3.1. O bj etivo G er al 35
3.2. O bj etivos específicos 35
4. M A T E R I A L E M É T O D O S 36
4.1. A nimais 36
4.2. Pr epar açã o do extr ato br uto de A scaris suum 36
4.4. I nduçã o da ar tr ite por zymosan (A Z y) 38
4.5. I nduçã o da A r tr ite por antígeno (A I A ) 39
4.6. T r atamentos 39
4.7. A nálise da hiper nocicepçã o 41
4.8. A nálise do influxo celular 42
4.9. A valiaçã o histopatológica 42
4.10. A valiaçã o do número de mastócitos 43
4.11. D eter minaçã o dos níveis de C X C L -1, I L -1β, I F N-γ, I L -5, I L -6 e I L -10 43
4.12. I muno-histoquímica 44
4.13. A nálise pr oteica do extr ato de A . suum 44
4.14. C onstr uçã o de D NA plasmidial r ecombinante 46
4.15. C lonagem de plasmídeos r ecombinantes 48
4.16. Pur ificaçã o dos plasmídeos r ecombinantes 49
4.17. E xtr açã o de R NA total e expr essã o gê nica por PC R em tempo r eal 50
4.18. A nálise estatística 50
5. R E S UL T A DO S 51
5.1. E feito do extr ato total de A . suum sobr e influxo celular na A Z y em camundongos.
51
5.2. E feito das fr ações do extr ato A . suum sobr e a hiper nocicepçã o ar ticular e o influxo celular na A Z y em camundongos
52
5.3. E feito das fr ações 1, 2, 3 e 4 do extrato de A . suum na hipernocicepçã o ar ticular e no influxo celular na A Z y, em camundongos
54
5.4. C ar acter izaçã o do extr ato de A . suum 56
5.5. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F no influxo celular na A Z y, em camundongos
57
5.6. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na sinovite crônica induzida por A Z y em camundongos
60
5.7. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na liber açã o de mediador es inflamatór ios em camundongos na A Z y aguda
5.8. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F no influxo celular na A I A , em camundongos
64
5.9. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na histopatologia sinovial de camundongos com A I A aguda
66
5.10. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F no dano ar ticular de camundongos com A I A crônica.
68
5.11. E feito dos plasmídeos de A ba-B e A ba-F no númer o de mastócitos na sinóvia de camundongos com A I A aguda.
70
5.12. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na liber açã o de mediador es inflamatór ios em camundongos com A I A aguda
72
5.13. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na imunoexpr essã o de iNO S na sinóvia de camundongos com A I A aguda
74
5.14. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na ativaçã o de macr ófagos na sinóvia de camundongos com A I A
76
5.15. E xpr essã o gê nica de A ba-B e A ba-F em camundongos com A Z y aguda 78
6. D I S C US S Ã O 79
7. C O NC L US Õ E S 93
L I S T A DE F I G UR A S
F igur a 1. A lterações fisiopatológicas na articulaçã o com artrite reumatoide. (A daptado de B andjee et al, 2009).
17
F igur a 2. C élulas e moléculas envolvidas no desenvolvimento de respostas imunológicas a infecções helmínticas. (J oseph A . J ackson, 2008, com modificações)
27
F igur a 3. R epresentaçã o esquemática do plasmídeo de clonagem D NA T OPO-V R 2001. (Oliveira,2006, com modificações).
48
F igur a 4. E feito do extrato total de A. suum sobre influxo celular na A Z y em camundongos
51
F igur a 5. E feito das frações do extrato A. suum sobre a hipernocicepçã o articular e o influxo celular na A Z y em camundongos
53
F igur a 6. E feito das frações 1, 2, 3 e 4 do extrato de A. suum na hipernocicepçã o articular e no influxo celular na A Z y, em camundongos.
55
F igur a 7. E feito da administraçã o do plasmídeo de A ba-B e A ba-F no influxo celular na A Z y, em camundongos
59
F igur a 8. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na sinovite crônica induzida por A Z y em camundongos
60
F igur a 9. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na liberaçã o de mediadores inflamatórios em A Z y aguda em camundongos.
63
F igur a 10. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F no influxo celular na A IA em camundongos.
65
F igur a 11. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na histopatologia sinovial de camundongos com A IA aguda.
67
F igur a 12 E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F no dano articular de camundongos com A IA crônica
69
F igur a 13. E feito dos plasmídeos de A ba-B e A ba-F no número de mastócitos na sinóvia de camundongos com A IA aguda.
71
F igur a 14. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na liberaçã o de mediadores inflamatórios em camundongos com A IA aguda.
73
F igur a 15. E feito da administraçã o do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na expressã o de iNOS na sinóvia de camundongos com A IA aguda.
75
F igur a 16. E feito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F na ativaçã o de macrófagos na sinóvia de camundongos com A IA aguda.
L I S T A DE T A B E L A S
T abela 1. S equê ncia de nucleotídeos utilizados para confecçã o dos plasmídeos e seus produtos
47
T abela 2. S equê ncia de primers utilizados nas reações de R T -qPC R e seus respectivos tamanhos de fragmentos amplificados
50
T abela 3. S equê ncia de aminoácidos dos peptídeos identificados na proteína A B A -1
56
T abela 4. A valiaçã o histopatológica, em escores, do efeito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F , no dano articular, em camundongos com A Z y crônica.
61
T abela 5. A valiaçã o histopatológica, em escores, do efeito do plasmídeo de A ba-B e A ba-F , no dano articular, em camundongos submetidos à A IA , fase crônica.
L I S T A DE A B R E V I A T UR A S E SI G L A S
A B A -1 Ascaris body fluid allergen
A IA A rtrite induzida por antígeno
A INE s A nti-inflamatórios nã o esteroidais A NOV A A nálise de variância
anti-C C P A utoanticorpos antipeptídeo citrulinado cíclico A PC s C élulas apresentadoras de antígenos
A R A rtrite reumatoide
A rg1 A rginase 1
A Z y A rtrite induzida por zymosan
B S A A lbumina sérica bovina
C élulas T reg C élulas T reguladoras
C IA A rtrite induzida por colágeno
C MV C itomegalovírus
C t C ycle threshold
D C C élulas dendríticas
D A MP Padrã o molecular associado ao dano
D MA R D s D rogas antirreumáticas modificadoras da doença
E C E pítopo compartilhado
E D T A Á cido etilenodiamino tetra-acético
E PM E rro padrã o da média
E R Ns E spécies reativas de nitrogê nio E R Os E spécies reativas de oxigê nio
E S -62 Glicoproteína derivada de Acanthocheilonema viteae E UL A R L iga européia contra o reumatismo
F I F also imunizado
F R F ator reumatóide
GA G Glicosaminoglicano
H& E Hematoxilina e E osina
HL A A ntígeno leucocitário humano
HPL C C romatografia líquida de alta performance
i.a. Intra-articular
i.p. Intraperitoneal
IF N-γ Interferon-γ
IL Interleucina
MMP Metaloproteinases
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
L B L uria-B ertani
L PS L ipopolissacarídeo
M1 Macrófago classicamente ativado
M2 Macrófago alternativamente ativado
mB S A A lbumina sérica bovina metilada NF -κB F ator nuclear-kappaB
NO Óxido nítrico
NPA polyprotein allergens/antigens of nematodes OA R S I Osteoartrite R esearch S ociety International PA MP Padrões moleculares associados a patógenos PA S -1 Proteína de 200kD a extraída de A . suum
PC R R eaçã o em cadeia polimerase
R T T ranscriptase reversa
s.c. S ubcutânea
S D S D odecil sulfato sódico
S D S -PA GE Gel de poliacrilamida em S D S
rS j16 Proteína recombinante derivada de Schistosoma japonicum S T A T 6 S inal transdutor e ativador da transcriçã o 6
T GF -β F ator de transformaçã o do crescimento-β
T h T auxiliar
T L R R eceptor toll-like
T NF F ator de necrose tumoral
T PA A tivador de plasminogê nio tecidual
v.o. V ia oral
1. I NT R O D UÇ Ã O
1.1. A r tr ite R eumatoide
A artrite reumatoide (A R ) é uma doença autoimune sistê mica crônica, qual nã o existe cura, acometendo cerca de 0,5% a 1% da populaçã o mundial (S UZ UK I & Y A MA MOT O, 2015). S ua prevalê ncia na populaçã o brasileira está estimada em 0,2-1%, com maior incidê ncia em pessoas com faixa etária de 30 a 50 anos e predomínio em mulheres, demonstrando uma susceptibilidade até trê s vezes maior do que os homens em desenvolver essa doença (A Z E V E D O et al, 2008; MOT A et al, 2012).
A A R exibe um predomínio no envolvimento articular, resultando em inflamaçã o grave e alterações morfológicas. A gravidade da artrite varia desde quadros limitados até crônicos, progressivos e irreversíveis. S eu curso clínico pode se estender de algumas semanas a meses de desconforto, até anos, de incapacitaçã o, o que leva a prejuízos pessoais e socioeconômicos, sendo causa importante de invalidez temporária e/ou definitiva, uma vez que de 20% a 30% dos pacientes tornam-se incapacitados para o trabalho (S W E E NE Y & F IR E S T E IN, 2004; R A S HID & E B R IE NGE R , 2007; S OK K A et al, 2010). A lterações como degradaçã o da cartilagem articular, hiperplasia sinovial, infiltraçã o de sinoviócitos e erosã o do osso subcondral sã o características patológicas encontradas na A R , responsáveis pelas deformidades e invalidez dos pacientes (R OC K E L & K A POOR , 2016).
1.1.1. E tiologia
E mbora a etiologia da A R nã o esteja ainda totalmente elucidada, admite-se a participaçã o de fatores, imunológicos e ambientais, com a participaçã o dos mecanismos da imunidade celular e humoral, que atuam em conjunto sobre aqueles geneticamente susceptíveis. E studos demontram que a superposiçã o desses fatores é determinante para o desenvolvimento de A R (SUZ UK I & Y A MA MOT O, 2015; T A N & S MOL E N, 2016; S MOL E N et al, 2016).
A lém do gê nero, segundo D eighton, 1989, o fator genético contribuiria em torno de 37% para o desenvolvimento da A R . E studos recentes apontam que, apenas 11% da variabilidade genética estã o envolvidas no curso da doença, com a descoberta de alelos protetores (V R IE S , 2011). E xperimentos relatam, ainda, a influê ncia da hereditariedade no desenvolvimento da A R , demonstrando aumento da prevalê ncia da doença entre parentes (F R IS E L L et al, 2016) . Numerosos fatores de risco, genéticos, foram identificados e relacionados ao desenvolvimento da A R . A lguns deles sã o compartilhados entre distintos grupos étnicos, enquanto outros sã o exclusivos de grupos étnicos específicos (SUZ UK I & Y A MA MOT O, 2015).
Nos anos de 1970, S tasny descreveu a associaçã o genética entre A R e o antígeno leucocitário humano ( HL A ) de classe II, com reconhecimento de uma sequê ncia conservada de aminoácidos ( glutamina-leucina-arginina-alanina-alanina), demostrando o papel de alelos HL A -DR B 1. Pacientes que exibem esse fenótipo, caracterizado como um “epítopo compartilhado” (E C ) tem maior propensã o à A R , especialmente à modalidade mais agressiva da doença (T E Z E NA S et al., 2005, S T A HL et al, 2010; B A L S A et al, 2010). A lelos que codificam o E C podem estar relacionados com a produçã o de autoanticorpos antipeptídeo citrulinados cíclicos (anti -C C P) (V R IE S , 2011).
alternativa do sistema complemento, contribuindo para o dano tecidual (K UHN et al,. 2006; UY S A L et al., 2009).
A citrulinaçã o é o passo crítico para o reconhecimento das variadas proteínas, processo frequentemente realizado por anti-C C P na membrana sinovial, durante o processo inflamatório. E sses autoanticorpos reconhecem uma variedade de proteínas pós-translacionais modificadas, induzidas por reações enzimáticas específicas. C uriosamente, essas enzimas foram encontradas em monócitos e macrófagos do líquido sinovial, sugerindo que a citrulinaçã o pode acontecer em locais pontuais, como em células articulares. (C ONIG L IA R O et al, 2016). A formaçã o de imunocomplexos com anti-C C P estimula a liberaçã o de citocinas pró-inflamatórias por macrófagos. A existê ncia de anti-C C P na articulaçã o, precede as manifestações clínicas e, por esse motivo, esse autoanticorpo está sendo aplicado atualmente como marcador específico para o diagnóstico e o prognóstico da A R (OHMI et al, 2016).
A influê ncia da genética e os autoanticorpos na A R estã o diretamente relacionados com a imunidade adaptativa na patogê nese da doença. Moléculas HL A de classe II, necessárias para ativaçã o de células T e apresentaçã o de antígeno, e citocinas como Interleucinas ( IL ) -12, IL -15, IL -18 e IL -23, sã o expressas em células da membrana sinovial na A R ( L E B R E et al, 2008; MC INNE S & S C HE T T , 2011). T ais achados conferem a importante participaçã o da resposta imunológica com a participaçã o de células T auxiliares (T h1) no estabelecimento da A R (OL IV E IR A et al, 2016).
D ados da literatura também destacaram a influê ncia de infecções por microrganismos, como Proteus mirabilis, micobactérias, Mycoplasma, E scherichia coli na etiopatogenia da A R , por meio de mecanismos de mimetismo molecular (R A S HID & E B R INGE R , 2007; T OUS S IR OT & R OUD IE R , 2008). D e fato, estudos demostraram haver células T , que codificam proteínas virais específicas, nas articulações de pacientes com A R . A inda relatam que os vírus E pstein-B arr, parvovírus, citomegalovírus e vírus da rubéola estã o envolvidos no desencadeamento de infecções em sinoviócitos, levando à sinovite, seja pela liberaçã o de citocinas pró-inflamatórias ou interferindo na produçã o de autoanticorpos, por meio de antígenos reativos (F R A NS S IL A & HE D MA N, 2006; K UW A NA , 2011; T A N & S MOL E N, 2016).
2016). A bactéria Porphyromonas gingivalis, em quadros de periodontite, está relacionada com o aumento de anti-C C P, o que pode dificultar a resposta aos tratamentos (QUIR K E et al, 2014; C A L D E R A R O et al, 2017).
O desenvolvimento da artrite reumatóide também pode estar relacionado a fatores ambientais, como tabagismo ( L UNDS T R Ö M et al, 2009) e baixo nível socioeconômico e de escolaridade (MIL L A R et al, 2013). J á é bem estabelecida a relaçã o entre o uso de tabaco e a maior suscetibilidade ao desenvolvimento da A R em pacientes HL A positivos, demonstrando que o cigarro acelera a citrulinaçã o de proteínas pulmonares, o que estimula a produçã o de autoanticorpos, além de elevar o aparecimento de nódulos reumatoides e laterar o limiar de dor do paciente (HA R T Y & V E A L E , 2010, GOE L D NE R et al, 2011).
1.1.2. Patogê nese
A A R é etiopatogenicamente heterogê nea com a presença de autoanticorpos, associados com o aumento da gravidade, danos nas articulações e mortalidade (GONZ A L E Z , et al 2008; S MOL E N et al, 2016). A susceptibilidade genética, em combinaçã o com fatores epigenéticos e exposições ambientais, está relacionada com o desencadeamento de uma cascata de eventos que induzem uma artrite destrutiva. O compromentimento funcional e estrutural das articulações é resultado da inflamaçã o crônica da sinóvia, caracterizada por interações do sistema imune inato e adaptativo (A NGE L OT T I et al, 2017).
E m pessoas susceptíveis, acredita-se que ocorra, inicialmente, a ativaçã o de osteoclastos, principalmente nas superfícies das mucosas, podem levar à modificaçã o de proteínas, o que contrtibui para a formaçã o de anticorpos. C rê -se, todavia, que ocorra segundo evento que, em conjunto, desenvolva a inflamaçã o na A R . A natureza do segundo sinal nã o está bem definida, mas poderia incluir combinaçã o vascular, neurorregulaçã o, microtraumas e infecções (F IR E S T E IN & MC INNE S , 2017).
infiltrado intersticial com células carctarísticas de origem inata, como macrófagos, células dendríticas, mastócitos e células natural killer, e adaptativas, como linfócitos T e B . A migraçã o celular ocorre pela ativaçã o de microvasos sinoviais, o que aumenta a expressã o de moléculas de adesã o, como integrinas, selectinas e quimiocinas. A alteraçã o celular desenvolvida na sinóvia, associada à neovascularizaçã o significativa, ocupa o centro fisiopatológico da A R , por desenvolv er uma inflamaçã o crônica denominada de sinovite (figura 1) (MC INNE S & S C HE T T , 2011; D E HA IR et al., 2014; F IR E S T E IN & MC INNE S , 2017).
F igur a 1. A lter ações fisiopatológicas na ar ticulaçã o com ar tr ite r eumatoide.
L inhagens de células B sã o detectadas na sinóvia, a qual fornece um meio rico em citocinas para a sobrevivê ncia das células B ( F IR E ST E IN & MC INNE S , 2017). A nticorpos contra autoantígenos modificados por citrulinaçã o podem estar em até 70% dos pacientes e aparecem precocemente na A R ( B R E NNA N & MC INNE S , 2008). O papel exato desses autoanticorpos na patogenia da A R ainda nã o está claro, mas sabe-se que paciente soro-positivo, com altos títulos para esses antígenos, tendem a exibir a doença mais agressiva, com maior dano articular, erosã o óssea e manifestações extra-articulares (OL IV E IR A , 2016).
Os macrófagos ocupam papel importante no desenvolvimento da inflamaçã o, mediante a liberaçã o de citocinas, como fator de necrose tumoral (T NF )-α e IL -1 e IL -6, quimiocinas, metaloproteinases (MMP), peptídeos vasoativos e intermediários de oxigê nio e nitrogê nio (F IR E S T E IN & MC INNE S , 2017). E sse padrã o de expressã o de citocinas pró -inflamatórias e óxido nítrico sintase induzível (iNOS ) sugere um fenótipo predominante de macrófagos do tipo M1, ativados pelos receptores toll-like (T L R ) e reconhecem uma variedade de padrões moleculares associados a patógenos (PA MP) e a danos (D A MP) (MC INNE S & S C HE T T , 2011; UDA L OV A et al., 2016).
A literatura relata, ainda, a interaçã o de macrófagos com células T de memória, principalmente com fenótipo celular T h1, impulsionado pelo antígeno na iniciaçã o e perpetuaçã o da doença, liberando citocinas e quimiocinas (MC INNE S & S C HE T T , 2007; S NIR et al., 2011). A lém disso, células com características T h17 também foram detectadas na doença estabelecida, responsáveis pela liberaçã o de citocinas IL -17A e IL -17F , que atuam em sinergia para reforçar a ativaçã o de fibroblastos sinoviais, condrócitos e osteoclastos (R A Z A et al., 2005; MC INNE S & S C HE T T , 2011). Modelos de artrite em murinos sugerem um papel fundamental para células T h 17 (MIOSS E C & K OL L S , 2012; L UB B E R T S , 2015). A literatura relata uma açã o inflamatória semelhante da IL -17 com T NF -α e IL -1-β, embora isoladamente menos potentes. A credita-se, no entanto, que a coexistê ncia em locais de inflamaçã o promove a exacerbaçã o da reaçã o inflamatória (S T A MP et al., 2004; E GA N et al., 2008).
E mbora raros na sinóvia reumatoide, os neutrófilos tornam-se abundantes no fluido sinovial em processos agudos, contribuindo para a sinovite, sintetizando prostaglandinas, proteases e espécies reativas de oxigê nio, que atuam de modo intra ou extracelular (C A S C Ã O et al., 2010). O avanço da sinovite acontece, ainda, pela produçã o de quimiocinas, citocinas e fatores de crescimento por sinoviócitos do tipo A (macrófago símile) , que, ao incidirem sobre os sinoviócitos do tipo B (fibroblasto símile), promovem a síntese de seus mediadores, estabelecendo uma açã o autócrina/parácrina e a amplificaçã o da inflamaçã o (B A R T OK & F IR E S T E IN, 2010).
macrófagos, expressã o de moléculas de adesã o, promoçã o da angiogê nese, supressã o de células T reguladoras, induçã o da dor, além de ativar diretamente osteoclastos, que induzem a reabsorçã o óssea (HE S S , 2011; MC INNE S & S C HE T T , 2011; OL IV E IR A et al, 2016). D e maneira similar, produçã o de IL -6 está envolvida com a ativaçã o de leucócitos e osteoclastos, na diferenciaçã o de linfócito B , desregulando o metabolismo de lipídeos e promovendo uma resposta na fase aguda. O papel central dessas duas citocinas foi confirmado pelo bloqueio terapê utico de receptores de IL -6 e T NF -α em pacientes com A R (MC INNE S & S C HE T T , 2011).
C itocinas da família IL -1 (1α , 1β) 18, 33 e antagonista do receptor de IL 1 ( IL -1ra) estã o abundantemente expressas na A R , promovendo a ativaçã o de leucócitos, células endoteliais, condrócitos e osteoclastos. E studos apontam ainda que a IL -1 é responsável pela reabsorçã o óssea, por meio da liberaçã o de prostaglandinas, da inibiçã o da síntese de colágeno e da induçã o da proliferaçã o de osteoclastos e de fibroblastos, no entanto, benefícios clínicos após a inibiçã o de IL -1 tê m sido modestos (MC INNE S & S C HE T T , 2007; B R E NNA N & MC INNE S , 2008).
A neoangiogê nese torna-se ativa pelas condições de hipóxia e citocinas liberadas no local (S Z E K A NE C Z et al, 2009). E stas alterações do microambiente, combinada com a ativaçã o de fibroblastos sinoviais promovem uma remodelaçã o do tecido, o que caracteriza a A R . F ibroblastos sinoviais exibem uma independê ncia de ancoragem e atividade migratória e proliferativa, liberando níveis elevados de MMP, citocinas e quimiocinas (F IR E S T E IN & MC INNE S , 2017), o que permite o acúmulo de tecido inflamatório, constituindo o pannus sinovial, que invade a cartilagem articular e o osso, dando início a destruiçã o articular (B A R T OK & F IR E S T E IN, 2010; OL IV E IR A et al, 2016).
1.1.3. T ratamentos da A R
C om a inflamaçã o ocupando o centro dos eventos clínicos encontrados na A R , estando diretamente envolvida com o dano articular, incapacitaçã o e comorbidades, a reversã o da inflamaçã o torna-se o principal alvo terapê utico, uma vez que a limitaçã o da inflamaçã o reduz o dano articular ou a progressã o da doença. Isto impede o comprometimento físico do paciente. D essa forma, a A R requer uma abordagem estratégica, incluindo avaliações regulares, adaptações terapê uticas ou mudanças de drogas, de acordo com a evoluçã o do paciente. A elucidaçã o de mecanismos imunológicos envolvidos na A R pode representar atualmente, um grande avanço no desenvolvimento de fármacos e no tratamento da doença (S MOL E N & A L E T A HA , 2015; S MOL E N, 2016).
E m geral, a terapia para A R envolve o uso de anti-inflamatórios nã o esteroidais (A INE s) , glicocorticoides, drogas antirreumáticas modificadoras da doença (D MA R D s - disease modifying antirheumatic drugs) sintéticas ou biológicas (MA J IT HIA & GE R A C I, 2007).
A o mesmo tempo em que reduz a dor e a rigidez, melhorando a funçã o física do paciente, os A INE s nã o interferem nos danos articulares, portanto, nã o modificam a doença. Os glicocorticoides sã o utilizados de modo semelhante aos A INE s, objetivando o alívio dos sinais e sintomas da A R . D emonstram potente efeito anti-inflamatório, pela inibiçã o de fosfolipase A 2, e consequente reduçã o na liberaçã o de eicosanoides, inibindo também a ativaçã o de NF -κB, bloqueando a produçã o e liberaçã o de citocinas, como IL 1β, IL 6 e T NF -α (MA J IT H IA & GE R A C I, 2007). E stã o associados, entretanto, a sérios problemas com uso em longo prazo, como distúrbios gastrointestinais e cardíacos, mas podem ser indicados em doses baixas ou intermediárias, em conjunto com D MA R D s (S C OT T , 2010; S MOL E N, 2016).
que sejam detectáveis clinicamente. D e fato, pacientes que fizeram uso precoce de D MA R D s tiveram menor progressã o do dano radiológico, medido pelo número de erosões e reduções do espaço articular (S C OT T , 2010). O metotrexato associado à D MA R D s biológicos é recomendado na ausê ncia da resposta, com o objetivo de atingir resultados expressivos no controle clínico da A R ( F UR S T et al., 2010).
Nos últimos 20 anos, os avanços na B iologia Molecular e B ioquímica permitiram uma compreensã o mais detalhada da estrutura e da funçã o de vários receptores importantes na A R , o que promoveu um salto na eficácia das terapias para doenças autoimunes, com o surgimento de D MA R D s biológicos. A lém da melhoria dos resultados terapê uticos e na qualidade de vida dos pacientes, o emprego de D MA R D s biológicos reduziu também a morbimortalidade (O’S HE A et al., 2013; MOT A et al, 2015).
No contexto dos biológicos modificadores da resposta, o desenvolvimento tecnológico permitiu a geraçã o de anticorpos monoclonais e moléculas recombinantes, marcando a geraçã o de medicamentos biológicos modificadores da resposta imunológica. E m seguida, surgiu uma variedade de outros agentes biológicos eficazes, relacionados a outras citocinas e receptores expressos em células do sistema imunológico, envolvidos na patogê nese da A R (O’S HE A et al., 2013).
A terapia biológica atualmente aprovada para A R contempla quatro diferentes mecanismos de açã o: inibidores de T NF (A dalimumab, C ertolizumab, Infliximab, E tanercept) inibidores de receptor de IL -6 (T ocilizumab), inibidor da co-estimulaçã o de células T (A batacept) e inibidor de células B (R ituximab). E studos relatam a açã o anti-inflamatória de antagonistas de repeptores de IL -1 (A nakinra) na A R , no entanto, apenas uma pequena proporçã o de pacientes respondeu à inibiçã o dessa via (SMOL E N, 2016).
A capacidade das D MA R D s biológicas de interferir na sinalizaçã o dos processos celulares reflete em novas possibilidades terapê uticas para doenças autoimunes. A s possibilidades de efeitos indesejáveis, no entanto, provenientes dos medicamentos imunobiológicos ganham enorme importância, pelo fato das moléculas inibidas pelos fármacos participarem de mútiplos processos fisiológicos (MOT A et al, 2015).
E m particular, a incidê ncia de infecções graves é aumentada, em pacientes em uso de D MA R D s biológicos, principalmente infecções do trato respiratório, pele, partes moles e trato urinário, embora diminua ao longo do tempo (W INT HR OP et al, 2005). Um risco especial está relacionado com a reativaçã o da tuberculose, embora isso nã o tenha sido relatado com rituximabe, o que inclui, na estratégia terapê utica, a profilaxia em indivíduos com teste positivo para tuberculose (S MOL E N, 2016). Pacientes em uso de anti-T NF exibem duas vezes maior risco de hospitalizaçã o por infecçã o bacteriana do que pacientes em uso de metotrexato em monoterapia. A inda, este risco aumenta quatro vezes quando se considera o primeiro semestre de tratamento (MOT A et al, 2015).
1.2. H ipótese higiê nica
Nas últimas décadas, foi possível observar maior incidê ncia de doenças inflamatórias nã o transmissíveis, como patologias autoimunes, alergias e asma. E sses pacientes exibem uma incidê ncia cada vez menor de infecções parasitárias, em regiões desenvolvidas. A lém disso, estudos epidemiológicos anteriores indicaram a reduçã o da incidê ncia de doenças autoimunes em regiões endê micas (V E R S INI et al, 2015; A PA E R , 2016). Portanto, essa relaçã o inversa entre a distribuiçã o global de doenças autoimunes e infecções parasitárias é amplamente mostrada e é conhecida a "Hipótese higiê nica". Inicicialmente, nomeada como hipótese de “velhos amigos” nos anos de 1870, pesquisadores observaram que a incidê ncia de febre do feno aumentou em aristocratas e habitantes da cidade, em comparaçã o com os agricultores (T A Y L OR & W A L K E R , 1973).
estudos epidemiológicos e experimentais confirmaram o papel protetor dos parasitas em diversas doenças autoimunes, incluindo diabetes mellitus do tipo 1, esclerose múltipla e A R (A PA E R , 2016).
A s mudanças no ambiente microbiano em contato com o homem foram alvo de transições epidemiológicas, incorporando aspectos relevantes para a hipótese higiê nica. Historicamente, a passagem do Paleolítico para o Neolítico, embora represente importante grau de desenvolvimento e de estabilidade, nã o resultou em perda significativa da exposiçã o aos microorganismos. A té a E ra Moderna, mais de 97% da populaçã o viviam ainda no meio rural próximo à lama, aos animais e à s fezes humanas. A penas, em de meados do século X IX , quando algumas populações foram submetidas à segunda transiçã o epidemiológica, a industrializaçã o, em conjunto com medidas de saúde pública e o uso de antibióticos, resultou em diminuiçã o da exposiçã o a muitos microrganismos (R OOK , 2010).
A urbanizaçã o acarretou menor exposiçã o dos humanos a helmintos e microrganismos, com o uso indiscriminado de anti-helmínticos, vacinaçã o em massa, desestímulo ao aleitamento materno e condições rigorosas de limpeza domiciliar. E ssas modificações das condições de vida parecem estar associadas a uma maior incidê ncia de doenças alérgicas e autoimunes em populações urbanizadas, quando comparadas a pessoas ainda vivendo em meio rural, com baixas condições sócioeconômicas e menos higiene (Y A Z D A NB A K HSH et al, 2001; Y UL A N Y E , 2015). V ários estudos concordam com a hipótese higiê nica, sugerindo que a remoçã o dos efeitos regulatórios de microrganismos e parasitas impede o “amadurecimento” imunológico e tende a levar um desequilíbrio no sistema imunológico e aumento das doenças imunomediadas (GA R N & R E NZ , 2007; W A MME S et al, 2014).
hiperendê mica aos nemátodos intestinais, como Ascaris lumbricoides e T richuris trichiura (T UR NE R et al, 2008).
A ssim, é possível reforçar a teoria do papel protetor das infecções parasitárias na modulaçã o de respostas imunológicas, interferindo no controle de muitas patologias autoimunes, incluindo a A R . C onsistente com esta suposiçã o é reconhecido o fato de que doenças autoimunes exibem incidê ncia e gravidade reduzida em regiões geográficas com alta carga parasitária ( O’SHE A 2013). A pesar das poucas evidê ncias contra o papel benéfico dos parasitas, o benefício foi elucidado em estudos por via da experimentaçã o humana e animal (S HI et al, 2011; A PA E R 2016).
Para explicar o papel protetor de infecções em desordens imunológicas na hipótese higiê nica, os mecanismos foram propostos baseados na competiçã o de antígenos por células fagocíticas, por sítios de ligaçã o a moléculas do complexo de histocompatibilidade e receptores de citocinas essenciais para diferenciaçã o e homeostasia. D ados clínicos e experimentais, em conjunto, sugerem um papel importante e nã o específico de infecções na proteçã o da doença inflamatória do intestino, colaborando para a hipótese higiê nica, abrindo outras pespectivas terapê uticas, incluindo novos contatos com probióticos e outras modalidades de exposiçã o a bactérias ou componentes de parasitas ( F E IL L E T & B A C H, 2004).
Um estudo relata que, pacientes acometidos pela doença de C rohn e tratados com ovos de T richuris suis por 24 semanas exibiram melhora significativa da sintomatologia (S UMME R S et al., 2005). A inda, a infecçã o por Helicobacter pylori mostrou um papel protetor contra doenças inflamatórias intestinais crônicas, através do aumento da expressã o de F oxP3, uma proteína envolvida na funçã o reguladora de células T , e que a colonizaçã o por parasitas, como helmintos, também revela uma associaçã o com a reduçã o da prevalê ncia de doenças inflamatórias intestinais crônicas ( Y UL A N Y E , 2015).
1.2.1. H elmintos
Quando se compara a infecçã o por microrganismos e infestaçã o por helmintos observa-se uma diferença fundamental. E nquanto microrganismos patogê nicos representam uma iminente ameaça e sã o geralmente combatidos por meio de rápidas respostas inflamatórias, relativamente violentas, helmintos parecem ser manuseados com respostas imunológicas mais suaves, com os componentes reguladores, que podem demorar semanas, ou meses, até anos para atingir sua eficácia máxima. (J A C K S ON et al., 2008).
E mbora, alguns desses parasitas, como Schistosoma mansoni, sã o organismos altamente patogê nicos, causando inflamaçã o visceral e fibrose hepática, entre muitos outros efeitos prejudiciais ao hospedeiro, ou até mesmo a morte (K ING, 2015). No entanto, em muitas outras infecções por helmintos, entretanto, os portadores sã o frequentemente assintomáticos, refletindo uma forma de tolerância imunológica pelo hospedeiro em direçã o ao parasita (MA IZ E L S , 2016). A rtigos relatam que helmintos podem viver no instestino humano por até 18 anos, por meio de uma efetiva camuflagem mediante a imunomodulaçã o do hospedeiro (S MA L L W OOD , 2017).
A infecçã o por helmintos resulta em uma série de eventos do sistema imunológico orquestrados por células T h2 (MA IZ E L S , 2009) . E sse fenótipo é marcado pela produçã o significativa de IL -4, 5, 9, 10, 13, 21 e 33, bloqueando citocinas T h1 ( IL -12 e IF N-γ). Pode ser observada também, a hiperplasia de células da mucosa, eosinofilia, produçã o de IgE e aumento da expressã o de células caliciformes (MA T IS Z , 2011). A lém disso, muitas vezes há uma supressã o sistê mica acentuada da imunidade inata e adaptativa no hospedeiro. Isso pode estar ligado ao crescimento de células T C D 4
+
e C D 25
+
, produzindo fatores de transformaçã o do crescimento (T GF -β) e/ou IL -10. ( B L A UV E L T et al., 2006; INC E et al., 2006; ME T W A L I et al., 2007; S HOR et al, 2013; S MA L L W OOD , 2017).
A lguns autores acreditam que a modulaçã o de células T reguladoras e as funções de células dendríticas pelos helmintos seja o mecanismo-chave para esclarecer a teoria da hipótese higiê nica, por meio do desequilíbrio entre respostas T h1 e T h2 promovido pela ausê ncia do contato da poulaçã o com helmintos. C omo respostas T h2 e T h1 sã o contrarregulatórios, o desenvolvimento de respostas T h2 frente a antígenos de helmintos, poderia promover a reduçã o da resposta T h1, a qual se mostra elevada em doenças autoimunes (A L T MA NN et al, 2009; S HOR et al, 2013).
Outro fator importante na infecçã o por helmintos é a diferenciaçã o de macrófagos ativados, sob a influê ncia de citocinas como IL -4, IL -13 e IL -21. E nquanto macrófagos ativados sã o recrutados para o local da infecçã o e sã o implicados como efetores funcionais, eles também exibem intensa atividade anti-inflamatória, secretando IL -10 e T G F -β e aumentando a expressã o de genes como A rginase-1, Y m1 ( chitinase-3-like protein 3) e F IZ Z 1 (resistin-like molecule alpha), os quais estã o envolvidos na reparaçã o de matrizes extracelulares, cicatrizaçã o e fibrose (NA IR et al., 2005; T A Y L OR et al, 2006; A NT HONY et al., 2006; L IU, 2015).
F onte : J oseph A . J ackson, 2008 (com modificações)
F igur a 2. C élulas e moléculas envolvidas no desenvolvimento de r espostas imunológicas a infecções helmínticas. S etas cheias indicam as influê ncias de sinalizaçã o em células (com moléculas de sinalizaçã o importantes indicadas ao lado), e setas tracejadas apontam a trajetória do desenvolvimento de um tipo de célula individual.
E feitos protetores proporcionados por helmintos foram demonstrados em diversos modelos animais, que simulam doenças inflamatórias, incluindo esclerose múltipla, A R e doença inflamatória do intestino. Helmintos tendem a inibir a produçã o de IF N-γ e IL -17, e promover a liberaçã o de IL -4, IL -10 e T G F -β, inibir a expressã o de F oxP3 em células T C D 4
+
F oi demonstrado que a artrite induzida em animais transgê nicos foi atenuada pela infecçã o por Nippostrongylus brasiliensis, por meio do aumento da resposta T h2 e acúmulo de eosinófilos, por via de um mecanismo dependente do S T A T 6 (sinal transdutor e ativador da transcriçã o 6), promovendo a mudança da polarizaçã o dos macrófagos para o fenótipo anti-inflamatório (C HE N et al, 2016), E que em camundongos com artrite induzida por colágeno, infectados por S. mansoni foi observada uma diminuiçã o da atividade inflamatória, desenvolvendo uma poliartrite menos grave, por meio da reduçã o dos níveis de IF N-γ, T NF -α e IL -17 e do aumento de IL -4 e IL -10 (OSA D A et al, 2009; S MA L L W OOD , 2017).
Praticamente, todos os helmintos estudados até agora demonstraram uma ou mais moléculas que podem modificar a atividade imunológica do hospedeiro. Poucas moléculas, no entanto, sã o bem caracterizadas na literatura (HA R NE T T & HA R NE T T , 2010). Uma das poucas exceções é uma glicoproteína (E S -62) isolada em origem no nematoide Acanthocheilonema viteae, regulando negativamente a sinalizaçã o de proteína C -quinase, reduzindo degranulaçã o de mastócitos. E m modelos murinos, E S -62 induziu a produçã o de IL -10, reduzindo IL 12, IL -6, IF N-γ e T NF -α e produçã o de IgG1. Promoveu, ainda, a reduçã o de células IL -17
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nos gânglios linfáticos de camundongos com artrite induzida por colágeno (R OD GE R S , 2015; E A S ON et al, 2016; L UMB et al, 2017).
1.2.2. I munomodulaçã o promovida por A scaris suum
Nos anos de 1960, um grupo de pesquisadores observou que produtos encontrados no extrato de Ascaris spp. induziam alterações, como, degranulaçã o de mastócitos e liberaçã o de histamina (UV NÄ S et al., 1960; B E R A L D O et al., 1961). Houve interesse considerável na identificaçã o de alérgenos em extratos de Ascaris, com objetivo de desenvolvimento de uma vacina. F oi entã o identificado e caracterizado um alérgeno no corpo celômico do Ascaris (A BA -1), com capacidade de sensibilizaçã o de mastócitos e liberaçã o de histamina (McGIB B ON et al., 1990).
proteínas de alto peso molecular desse extrato indicaram atividade imunossupressora dependente de IL -4 e IL -10 (S OUZ A et al, 2002; S OUZ A et al., 2004).
Uma proteína de 200 kD a, purificada a partir do extrato bruto de A. suum (PA S -1), promoveu uma atividade anti-inflamatória, reduzindo a migraçã o leucocitária e a liberaçã o de T NF -α , IL -1β e IL -6 em modelo experimental de bolsa de ar subcutânea estimulada por lipopolissacarídeo (OS H IR O et al., 2005). A inda, PA S -1 demonstrou atividade imunossupressora em animais imunizados com ovalbumina, inibindo a reaçã o de hipersensibilidade do tipo tardia e a produçã o de anticorpos mediada pela liberaçã o de IL -4 e IL -10. C om efeito, pesquisadores relatam que a PA S -1 suprime a resposta imunológica celular e humoral (OS H IR O et al., 2006; A NT UNE S et al, 2015).
F oi demonstrado recentemente que a sequê ncia N-terminal da PA S -1 é semelhante à sequê ncia da proteína A B A -1, sugerindo que a PA S -1 pode ser uma poliproeína repetitiva de A. suum, no entanto, as funções biológicas diferem, sugerindo que a carcaterizaçã o detalhada dessas proteínas pode ser útil como interveçã o terapê utica para doenças inflamatórias (A NT UNE S et al, 2015).
E studos relatam que proteínas derivadas do extrato de A. suum minimizam a resposta celular e humoral, em camundongos no modelo de ovoalbumina, e que esse mecanismo era independente de receptores T oll-like 2 e 4. A lém disso, em estudos in vitro, esse extrato reduziu a expressã o de moléculas MHC de classe II e a secreçã o de IL -12 e IL 6, além de aumentar a liberaçã o de IL -10, em células dendríticas estimuladas com L PS (F A V OR E T T O, et al 2014).
1.3. M odelos exper imentais de A R
A evoluçã o da ciê ncia experimental foi a principal fonte de descobertas nos campos da F isiologia, F isiopatologia e D esenvolvimento T erapê utico. Muitas espécies animais foram usadas, dependendo da disponibilidade, capacidade de reproduçã o, custos e semelhanças fisiolóficas com os seres humanos. A seleçã o do uso de camundongos para o estudo da imunologia teve como base o tamanho reduzido e a necessidade de materiais em menor quantidade. A lém disso, com o rápido crescimento da genotipagem, desde os anos de 1980, a manipulaçã o genética dos camundongos conferiu grande avanço da ciê ncia (W E B B , 2014; B E S S IS et al, 2017).
E mbora a compreensã o da etiopatogenia da A R tenha avançado e elucidado muito dos mecanismos fisiopatológicos, até o momento, nã o existe um modelo animal que apresente as mesmas características da A R em seres humanos. Os modelos em camundongos, no entanto, que recapitulam os aspectos da patogê nese da A R em seres humanos, sã o uma ferramenta importante para investigar tais mecanismos in vivo (C A PL A Z I et al, 2015).
V ários modelos foram descritos, no intuito de induzir artrite em animais, tentando reproduzir achados da A R em humanos. Um modelo ideal de artrite deve preencher requisitos, como achados clínicos, radiológicos e histopatológicos semelhantes aos observados na A R . Nenhum modelo descrito na literatura abrange todas essas condições, embora todos se aproximem razoavelmente do objetivo pretendido. A lguns sã o adequados para avaliar mecanismos celular e molecular da doença, enquanto outros sã o empregados para investigar mecanismos de drogas. ( S IL V A J R . & R OC HA 2006, B OL ON et al., 2011).
E ntre os vários modelos experimentais de artrite, pode ser citado, como modelo de artrite química, a artrite induzida por zymosan (A Z y), demonstrando uma rápida inflamaçã o, caracterizado como um modelo de baixo custo. Nã o demonstra, entretanto, o envolvimento imunológico esperado para um modelo ideal de A R . A tualmente, os modelos experimentais mais utilizados sã o aqueles como artrite induzida por colágeno tipo II (C IA ) e por antígeno (A IA ), por apontarem lesões articulares muito semelhantes à A R em humanos, porém os modelos exigem linhagens especígicas, em decorrê ncia da susceptibilidade para reaçã o imunológica ( B OL ON et al., 2011; C A PL A Z I et al, 2015, B E SS IS et al, 2017).
(como mycoplasma e parede de estreptococos). E m resumo, os modelos experimentais, em camundongos, exprimem uma similaridade histológica com a sinovite da A R humana, mecanismos imunológicos na sua fisiopatologia, além de resposta terapê utica similar à observada na A R (D UMOND E & G L Y NN, 1962; B E S S IS et al, 2017).
Por último, vale destacar o fato de que, manipulações genéticas, fornecendo à pesquisa, animais transgê nicos ou knock-out, vieram agregar outro meio aos modelos animais, podendo demonstrar o aumento da expressã o ou a ausê ncia de um gene, como, por exemplo, de T NF -α , resultando em um desenvolvimento de artrite erosiva crônica em 100% dos animais, permitindo avaliar o papel de genes individuais na fisiopatologia da A R , homeostasia e desenvolvimento de autoimunidade, bem como o papel de citocinas envolvidas na fisiopatologia dessa doença (MA T IS Z et al, 2011; B IT ON et al, 2011).
1.3.1. A rtrite I nduzida por zymosan (A Z y)
O zymosan ( Z y) é um polissacarídeo derivado do fungo Saccharomyces cerevisiae, sendo muito utilizado como agente inflamatório (GA D Ó, 1991). O modelo de A Z y foi descrito pela primeira vez, em 1977, por K eystone et al, que observaram uma artrite inflamatória crônica com infiltraçã o de células mononucleares, hiperplasia sinovial e transformaçã o da membrana sinovial em um tecido inflamatório com propriedades invasivas, definido como pannus reumatoide.
A administraçã o de partículas de zymosan é capaz de induzir a liberaçã o de enzimas lisossomais de macrófagos e ativar o sistema complemento, por meio da via alternativa, promovendo reaçã o inflamatória aguda, caracterizada principalmente pelo aumento da permeabilidade vascular e infiltraçã o de leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos) . Na A Z y, a migraçã o de neutrófilos demonstra um pico de seis horas e persiste por até trê s dias. E stas células, além de propriedades fagocíticas, liberam mediadores inflamatórios como eicosanoides, citocinas, MMP e espécies reativas de oxigê nio (E R O’s) e nitrogê nio (E R N’s) (S C HOR L E MME R , 1977; HA MPT ON, 1998).
da cartilagem e invasã o do osso subcondral, assemelhando-se ao pannus reumatoide (R OC HA et al., 1999).
Na cavidade articular inflamada, uma variedade de células, além dos neutrófilos, é fonte potencial desses mediadores, incluindo sinoviócitos, condrócitos, mastócitos e monócitos. A resposta inflamatória desencadeada por Z y está ligada a um conjunto de receptores, entre eles, o dectin-1, receptor de membrana expresso em macrófagos, células dendríticas e neutrófilos (BR OW N et al., 2003). Uma das principais vias de sinalizaçã o pró -inflamatória para A Z y sã o os T L R s, necessária para o desenvolvimento de uma resposta imune. A ativaçã o desses receptores, por sua vez, induz a liberaçã o de citocinas pró -inflamatórias, como IL -1β, IL -6 e T NF -α , C X C L -1, prostaglandinas e leucotrienos (F R A S NE L L I et al., 2005; C OR R E A et al, 2016)
Na A Z y, a liberaçã o de NO no líquido sinovial e a geraçã o de E R O’s e E R N’s sã o máximas na 6ª hora após a injeçã o do estímulo itra-articular, estando diretamente relacionadas à migraçã o de neutrófilos (R OC HA et al., 1999). Os níveis de nitrito total permanecem elevados no exsudato sinovial durante trê s semanas, embora os níveis mais elevados sejam observados durante a fase aguda do modelo ( B E Z E R R A et al., 2004).
C ondrócitos, osteoclatos e fibroblastos liberam MMP, promovendo a degradaçã o de componentes da matriz cartilaginosa, o que torna possível o aparecimento da lesã o da cartilagem encontrada na A Z y (S T OOP et al., 1999). Utilizando o modelo de A Z y, B ezerra et al. (2004) demonstraram uma cinética da perda de glicosaminoglicanos (G A G) induzida nesse modelo, com uma significativa perda de matriz cartilaginosa.
1.3.2. A rtrite induzida por antígeno (A I A )
A artrite induzida por mB S A constitui um modelo de artrite monoarticular severa, induzida pela injeçã o intra-articular do antígeno após uma imunizaçã o sistê mica, em animais susceptíveis. R esumidamente, os animais sã o sensibilizados por duas injeções, por via subcutânea, de uma emulsã o contendo mB S A e adjuvante completo de F reund, o qual contém Mycobacterium tuberculosis mortos por aquecimento. V inte e um dias após a injecçã o inicial para imunizaçã o, a artrite é induzida pela administraçã o intra-articular (i.a.) de mB S A (GR E S PA N, 2008)
O curso clínico pode ser dividido em duas fases, aguda e crônica. A fase aguda é caracterizada pela infiltraçã o de células polimorfonucleares, predominantemente, edema e rubor na regiã o articular afetada, como consequê ncia da produçã o in situ de imunocomplexo e ativaçã o do sistema complemento na cavidade articular. A s células T C D 4
+
específicas de mB S A fornecem o estímulo inflamatório inicial, levando ao recrutamento de neutrófilos e macrófagos. A pós uma semana, a doença progride para a fase crônica, a qual é mediada por céulas T , mostrando hiperplasia sinovial, formaçã o do pannus reumatoide, destruiçã o da cartilagem e tecido ósseo (von B A NC HE T , 2000; B E S S IS et al 2017).
Outro sintoma importante no qual o modelo se assemelha à A R em humanos é a dor persistente e durante a locomoçã o. A hipernocicepçã o pode ser observada desde a terceira hora após a induçã o, e persiste por pelo menos 24 horas, reduzindo com 72 horas após o desafio. A migraçã o neutrofílica pode ser observada com seis horas persistindo até 24 horas, diminuindo 48 horas depois do desafio, e retornando aos níveis basais 96 horas após (PINT O et al., 2010).
A s citocinas pró-inflamatórias como T NF -α IL -1β e IL -17 e quimiocinas, como, K C e C X C L , desempenham papel importante na gê nese da inflamaçã o e na hipernocicepçã o nesse modelo (V E R R I J R et al., 2006; C UNHA et al., 2007). Pode-se observar, ainda, a participaçã o de MMP, liberadas por leucócitos migrados para o espaço articular, responsáveis pela degradaçã o da matriz cartilaginosa e produçã o de mediadores inflamatórios, tais como endotelinas (PINT O et al., 2010).
2. J US T I F I C A T I V A
Um estudo realizado em Natal-R N, regiã o do Nordeste brasileiro com baixa condiçã o sócioeconômi ca, demonstrou que pacientes portadores de lupus eritematoso sistê mico exibiram índice de dano crônico semelhante ao de pacientes de países desenvolvidos, exceto pelo componente cutâneo, fato esse atribuído à alta exposiçã o solar provocada pela baixa latitude e a situaçã o social de dificuldade do uso de protetor solar (V IL A R et al., 2005).
O que contradiz com a teoria de que pacientes que residem em países com baixa renda deveriam exibir um aumento da morbidade e / ou mortalidade por essas doenças. C uriosamente, a evoluçã o da doença nesses pacientes, em longo prazo, parece ser semelhante, se nã o menos grave, à encontrada em populações com melhores índices socioeconômicos (OL IV E IR A et al, 2016). D iante do fato da recorrente demonstraçã o que o atraso no diagnóstico, a dificuldade ao acesso a um especialista, a falta de adesã o ao tratamento e a falha ou atraso na indicaçã o de drogas modificadoras da doença tem um grande impacto na prevalê ncia e gravidade de doenças autoimunes ( QUINN & E ME R Y , 2005).
D e acordo com a hipótese higiê nica, helmintos podem fornecer fatores protetores, os quais protegem contra a gravidade de doenças imunomediadas, por meio da estimulaçã o do sistema imunológico para respostas T h2 (J A C K S ON, 2008; A PA E R , 2016). S eguindo essa mesma linha de pesquisa, nosso grupo de pesquisa demonstrou papel anti-inflamatório de extrato de A. suum, reduzindo a gravidade da A R em modelos de artrite experimental (R OC HA et al, 2008).
3. O B J E T I V OS
3.1. O bj etivo G er al
Isolar componentes imunomoduladores do extrato de Ascaris suum e caracterizar seu mecanismo anti-inflamatório em modelos de artrite experimental.
3.2. O bj etivos específicos
C onferir o efeito do novo lote do extrato de A. suum na migraçã o celular no modelo de A Z y, fase aguda.
E studar o efeito de frações >30kD a e <30kD a do extrato de A. suum sobre a e hipernocicepçã o e a migraçã o celular no modelo de A Z y, nas fases aguda e crônica. E xaminar o efeito de frações 1, 2, 3 e 4, com suporte no extrato <30kD a de A. suum
sobre a e hipernocicepçã o e migraçã o celular no modelo de A Z y aguda.
Identificar e caracterizar o(s) componente(s) ativo(s) do extrato por eletroforese e espectrometria de massa e construir um vetor recombinante contendo os os genes relacionados com os componentes identificados.
E studar o efeito da transfecçã o com plasmídeo recombinante, sobre a migraçã o celular no modelo de A Z y, fases aguda e crônica.
E studar o efeito da transfecçã o com plasmídeo recombinante, sobre a sinovite crônica desenvolvida pelo modelo de A Z y.
A valiar o efeito da transfecçã o sobre a liberaçã o de mediadores inflamatórios (C X C L -1, IF N-γ, IL -1β e IL -6) na cavidade articular em camundongos com A Z y aguda.
D emonstrar o efeito da transfecçã o com plasmídeo recombinante, sobre a migraçã o celular no modelo de A IA , fase aguda e crônica.
Observaro efeito da transfecçã o com plasmídeo recombinante na sinovite aguda e dano articular crônico em camundongos com A IA .
Investigar o efeito da transfecçã o com plasmídeo recombinante, sobre número de mastócitos e sobre a imunoexpressã o de iNOS, C D 11b, F 4/80 e C D 206, na membrana sinovial, no modelo de A IA aguda;
4. M A T E R I A L E M É T OD O S
4.1. A nimais
F oram utilizados camundongos machos S wiss ( 25-30g), para as avaliações no modelo de artrite induzida por zymosan, e camundongos B alb/C (20-25g), para as avaliações no modelo de artrite induzida por antígeno (n=6, por grupo), fornecidos pelo B iotério C entral da Universidade F ederal do C eará - UF C . Os animais foram submetidos a uma temperatura de 22-25º C , com 12h de ciclo claro/escuro e livre acesso à água e à raçã o. T odos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes preconizadas pelo Manual sobre C uidados e Usos de A nimais de L aboratório (C olégio B rasileiro de E xperimentaçã o A nimal, 2003), com todos os esforços feitos para minimizar o sofrimento. O trabalho foi previamente aprovado pela C omissã o de É tica em Pesquisa A nimal – C E PA da UF C , sob o número 33/2014.
4.2. Pr epar açã o do extr ato br uto de A scaris suum
Ascaris suum adultos, mortos, obtidos do intestino delgado de porcos, de um abatedouro local, foram lavados com soro fisiológico, triturados, homogeneizados em salina (0,15 M) tamponada com borato (0,1 M, pH 7,2), em vórtex e, em seguida, centrifugados por 90 minutos, 12.000 x g à 10
o
C . O sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi ressuspenso (1mL ) em salina tamponada com borato (0,1 M, pH 7,2), homogeneizado em vórtex e colocado em agitaçã o constante por 18 horas a 4°C . A pós esse período, o material foi novamente centrifugado por 90 minutos, 12.000 x g e 10
o
