DEP. IMUNOFISIOLOGIA E FARMACOLOGIA LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA E NEUROBIOLOGIA DISCIPLINA DE FARMACOLOGIA

DEP. IMUNOFISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA E NEUROBIOLOGIA

DISCIPLINA DE FARMACOLOGIA

EXCRECÇÃO DA ASPIRINA POR VIA RENAL

I - OBJECTIVO

Identificação e quantificação dos principais produtos de biotransformação da aspirina,

no Homem, após a sua excreção por via renal.

II - INFORMAÇÃO TEÓRICA

A aspirina

(ácido acetilsalicílico, ASA) é o fármaco mais prescrito como analgésico,

antipirético, anti-inflamatório e anti-agregante plaquetário. Administrada por via oral é

rapidamente absorvida, em parte pelo estômago, e principalmente pela porção

proximal do intestino delgado, devido à extensa superfície das vilosidades intestinais.

A absorção de salicilatos ocorre por difusão passiva da forma não dissociada do ácido

acetilsalicílico (PK

≈

3,5) ou do ácido salicílico (Pk

≈

3), através das membranas

gastro-intestinais.

A velocidade de absorção da aspirina depende de vários factores, sendo os mais

importantes a sua velocidade de desintegração e dissolução (quando é administrada

em comprimidos), o pH da mucosa gastro-intestinal e o tempo de esvaziamento

gástrico.

Após absorção os salicilatos são distribuídos pela maioria dos tecidos e fluidos

transcelulares, principalmente por processos passivos dependentes do pH. Os

salicilatos ligam-se extensamente às proteínas plasmáticas (80% a 90%).

A aspirina ingerida é principalmente absorvida como tal, mas uma pequena

percentagem entra na circulação sistémica como ácido salicílico após hidrólise pelas

esterases da mucosa gastrointestinal.

de 30 minutos. O ácido salicílico tem igual acção anti-inflamatória, mas é menos

potente como analgésico.

A biotransformação do ácido salicílico ocorre em muitos tecidos, mas particularmente

no tecido hepático (fracções microssomal e miticôndrial). Os principais metabolitos do

ácido salicílico são: o ácido salicilúrico (ácido salicílico conjugado com a glicina) e os

glucoronatos do ácido salicílico na forma éter e ester (reacções de Fase II).

Adicionalmente uma pequena fracção do ácido salicílico é oxidada a ácido gentísico

(ácido 2,5 di-hidroxibenzoico), a ácido 2,3 di-hidroxibenzoico e a ácido 2,3,5

tri-hidroxibenzoico (reacções de Fase I). (Figura 1).

Os salicilatos, são excretados principalmente pelo rim, sendo praticamente o total da

dose administrada excretada na urina sob a forma dos metabolitos anteriormente

citados. A excreção de salicilatos na forma livre é extremamente variável e depende

tanto da dose como do pH urinário.

VARIAÇÃO DA EXCRECÇÃO DE ÁCIDO SALICÍLICO COM A DOSE

O tempo de semi-vida plasmático da aspirina é aproximadamente de 15 minutos. O

dos salicilatos é da ordem de 2 a 3 horas quando administrados em doses baixas

(600mg/d) e de cerca de 12-16 horas para as doses habituais anti-inflamatórias

(>3,6g/d) . Este tempo de semi-vida pode ser tão longo como de 15 a 30 horas para

altas doses terapêuticas ou quando há intoxicação. Esta eliminação dependente da

dose é resultado da capacidade limitada do sistema hepático em conjugar o ácido

salicílico com a glicina ou com o ácido glucurónico.(Figura2).

VARIAÇÃO DA EXCRECÇÂO DE ÁCIDO SALICÍLICO COM O PH URINÁRIO

Na urina alcalina, mais de 30% do fármaco ingerido pode ser eliminado como ácido

livre, enquanto na urina acídica esse valor pode baixar para os 2%. Estes resultados

são devidos ao facto de que a pH alcalino o ácido salicílico se encontra altamente

ionizado estando a reabsorção tubular renal diminuída. Devido á sua

hidrossolubilidade, os conjugados do ácido salicílico não são facilmente reabsorvidos

nos túbulos renais. Adicionalmente, os glucoronatos são excretados por transporte

activo a nível do túbulo proximal, não estando portanto, a sua eliminação dependente

do pH urinário.

III - FUNDAMENTO DO MÉTODO

Separação e quantificação da aspirina e dos metabolitos excretados na urina

a) Preparação da amostra

b) Separação e quantificação dos componentes da amostra urinária por

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Intrumentação:

O método de separação e quantificação da aspirina e metabolitos excretados na urina

é o de cromatografia de alta eficiência (HPLC).

Será utilizado um sistema cromatográfico Hitachi composto por uma bomba de

gradiente terciário (L-6200, intelligent pump), equipado com uma válvula de injecção

manual (Rheodyne 7125) com uma ansa de 20 ul, ligado a um detector UV (L-4000),

com comprimento de onda variável, sendo o comprimento de onda seleccionado de

303 nm. A este sistema é acoplado um integrador (D-2500) para registo e tratamento

quantitativo dos cromatogramas.

Fase Estacionária:

Coluna de fase inversa (C18) (12,5cm X 4mm d.i.), constituída por partículas de 5

µ

m

de diâmetro (LiChrospher 100 RP-18, Merck).

Fase Móvel:

O sistema de eluição isocrático é constituído por uma solução eluente contendo:

NaH

PO

0,01M,

pH=2 – acetonitrilo – metanol (80:15:5, v/v/v). O fluxo é de 1,25

ml/min.

Identificação e quantificação dos componentes da amostra urinária

A identificação cromatográfica dos componentes da amostra é efectuada por

comparação com o tempo de retenção de padrões de ácido acetilsalicílico (ASA),

ácido salicílico (SA), ácido salicilúrico ASU) e gentísico (AG) com elevada pureza

(>98%) e separados nas mesmas condições cromatográficas.

IV - PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Antes da aula, deverão ser obtidas duas amostras de urina provenientes do mesmo

indivíduo:

Urina controlo:

- Colhida antes da administração PO de 1g de aspirina dissolvida em 300 ml de água.

Urina tratada:

- Colhida duas horas após a ingestão da aspirina.

1 – Extracção com acetato de etilo / hexano

1.1 Coloque a urina controlo e tratada em provetas diferentes (marque nas

respectivas provetas C e T).

1.2 Meça o volume.

1.3 Baixe o pH das soluções C e T com H

PO

até pH

≈

3

(Para isso, vá deitando com uma pipeta Pasteur o ácido até ao pH desejado,

utilizando uma fita indicadora de pH).

1.4 Retire para tubos de centrifuga “eppendorf” (C e T) 500 µl da urina controlo e

tratada, respectivamente.

1.5 Adicione, a cada amostra obtida na alínea anterior, 500

µl

de uma mistura de

acetato de etilo e hexano (V/V).

1.6 Agite no vortex durante 1 minuto.

1.7 Centrifugue durante 45 segundos

NOTA

Fase superior - acetato de etilo / hexano

Fase inferior - urina

1.8 Retire a fase orgânica para novos tubos “eppendorf” (C e T).

1.9 Adicione a cada tubo “eppendorf” 500 µl

de uma

solução 0,01M

de

NaH

PO4

pH=7.

1.10 Agite no vortex durante 1 minuto.

1.11 Centrifugue durante 45 segundos

1.12 Rejeite a fase superior.

V– BIBLIOGRAFIA

Furst

D.

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Ulrich

R.

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Anti-inflammatory

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