UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
MÔNICA HUGUENIN DE ARAUJO FARIA
ENCAPSULAÇÃO DO ANTIBIÓTICO TETRACICLINA EM MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA E ALGINATO
CAMPINAS 2018
MÔNICA HUGUENIN DE ARAUJO FARIA
ENCAPSULAÇÃO DO ANTIBIÓTICO TETRACICLINA EM MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA E ALGINATO
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ciências
Orientador: Prof. Dr. FRANCISCO BENEDITO TEIXEIRA PESSINE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MÔNICA HUGUENIN DE ARAUJO FARIA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FRANCISCO BENEDITO TEIXEIRA PESSINE.
CAMPINAS 2018
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9812-8579
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Encapsulation of the antibiotic tetracycline in microparticles of chitosan and alginate
Palavras-chave em inglês: Sodium alginate Chitosan Tetracycline Microparticles Sustained release
Área de concentração: Físico-Química Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Francisco Benedito Teixeira Pessine [Orientador] Hiram da Costa Araujo Filho
Gilbert Silva
Marcia Miguel Castro Ferreira Pedro Paulo Corbi
Data de defesa: 28-02-2018
Banca Examinadora
Francisco Benedito Teixeira Pessine [Orientador] Hiram da Costa Araujo Filho (IQ-IFRJ)
Gilbert Silva (IEM-UNIFEI)
Márcia Miguel Castro Ferreira (IQ - Unicamp) Pedro Paulo Corbi (IQ - Unicamp)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Mônica Huguenin de Araujo Faria, e orientada pelo prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine, aprovada pela Comissão Julgadora em 28 de fevereiro de 2017.
Dedicatória
A meu esposo André
e à minha filha Beatriz.
“A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de
Deus. Quando considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem
compreende, pesquisa e consegue realizar, então reconheço claramente
que o espírito humano é obra de Deus, e a mais notável.”
Agradecimento
A Deus por ter me dado forças nos momentos de dificuldade e pela proteção durante as viagens até Campinas.
Ao meu esposo e à minha filha, André e Bia, pelo incentivo e por terem cedido momentos preciosos de convivência familiar.
Ao meu pai, Christóvão (in memoriam), pelo exemplo de esforço e dedicação ao trabalho e à família.
À minha irmã, Gilza, pelo incentivo ao longo desses quatro anos de trabalho. Ao Prof. Pessine por ter me recebido em seu grupo e por todo o suporte acadêmico e técnico durante a elaboração desta tese.
Aos colegas do grupo de pesquisa do Prof. Pessine – Daniel, Milene, Daniela, Franciele e Tatiane pela amizade e apoio, cujas colaborações técnicas foram fundamentais para a parte experimental desta tese. Em especial, à querida Letícia, por todo apoio técnico e moral, durante todos os momentos difíceis.
Aos alunos de graduação do IQ Amanda, Gabriela e Eduardo, por toda ajuda na parte experimenta da Tese, a qual foi fundamental para o seu desenvolvimento.
Aos colegas do IQ – Aline Aguiar, Aline Freitas, Sandra Américo e Guilherme pelo apoio nos anos iniciais do doutorado.
Aos técnicos do Instituto de Química da Unicamp – Davi, Vitor, Cláudia, Fabiana, Ricardo, Renata e Hugo pela amizade e por todo apoio e orientação durante a parte experimental desta tese.
Às funcionárias da CPG – Bel, Isabela, Janaina e Carla. Principalmente à Bel, por todas as preciosas orientações nos primeiros anos do curso e, por todo o apoio nos momentos difíceis! E, à Isabela, pela paciência e carinho em responder todas as infindáveis dúvidas “burocráticas”.
À Profa. Márcia pela colaboração com os testes quimiométricos e todo apoio e amizade durante todo o curso de doutorado.
Ao Prof. Bruns pelas orientações iniciais sobre o planejamento experimental. Ao Prof. Bertran pelo apoio nos primeiros anos do doutorado e pelo apoio experimental nas análises de tamanho de partícula.
Ao Prof. Pedro Corbi pelas orientações sobre os ensaios biológicos. Ao Prof. Pedro Volpe pelas orientações sobre as análises térmicas.
À Profa. Dra. Andrea Dessen e à aluna de doutorado Fernanda Rodrigues Costa do Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio)/Instituto de Biologia (Unicamp)/ Institut de Biologie Structurale (IBS). CNRS/ CEA/ Univ. Grenoble pelo suporte aos ensaios microbiológicos.
Aos Profs. Dr. Marcelo Brocchi e Dra. Sandra Martins do Laboratório de Doenças Tropicais/Instituto de Biologia (Unicamp) pelo suporte aos ensaios microbiológicos.
Aos Profs. Dr. Wilton Rogerio Lustri e Dra. Silmara Lazarini pelo suporte aos ensaios microbiológicos.
À UFRJ pela liberação da licença para capacitação, sem a qual, jamais teria sido possível realizar esse projeto.
À Walmir, Gustavo e Eduardo da Waters, pelo esforço na recuperação dos dados analítico e pelo empréstimo de seus equipamentos.
A todos os meus amigos pessoais – dos quais não posso destacar nomes, sem cometer injustiças, pelo apoio, torcida e orações, que me deram força para permanecer firme no propósito de superar todas as dificuldades que surgiram durante esses “longos” 4 anos de curso.
A todos que, de forma direta ou indireta cooperaram acadêmica, técnica ou emocionalmente para a conclusão desta Tese.
RESUMO
Por causa do aumento das mortes por infecção e da resistência microbiana o objetivo dessa Tese foi preparar e caracterizar suspensões aquosas de micropartículas poliméricas com propriedades bioadesivas para liberação sustentada do antimicrobiano cloridrato de tetraciclina utilizando substâncias reconhecidas na literatura como biocompatíveis e de baixa toxicidade, para potencial administração por via oral.
As micropartículas foram preparadas por complexação dos polieletrólitos quitosana e alginato de sódio, reticulado por íons cálcio, e adição de tetraciclina. O método de preparo adotado foi o cisalhamento mecânico.
Através de planejamento experimental fatorial foi possível obter micropartículas com características diferentes em termos de tamanho de partícula, eficiência de encapsulação, percentual de carregamento, potencial zeta, tempo de liberação de 10% de massa de tetraciclina em fluido gástrico simulado (t10%FGS), fluido intestinal (t10%FIS) e atividade antimicrobiana.
Os ensaios preliminares indicam que a liberação de tetraciclina em fluido gástrico e em fluido intestinal simulados ocorreu de forma gradual e sustentada por cerca de três dias. O perfil de liberação reflete o observado por espectrofotometria no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) – que mostra que há diferença na intensidade e/ou tipo de interação entre a tetraciclina, que possui grupos funcionais de natureza catiônica e o grupo carboxilato do alginato, de natureza aniônica; e, dos grupos carboxilatos do alginato e os grupos catiônicos da quitosana. Além disso, o perfil da liberação foi diferente em fluido intestinal e fluido gástrico simulados, o que sugere que são partículas sensíveis à acidez do meio, comportamento esperado para uma matriz de polieletrólitos.
Verificou-se que a reticulação da matriz polimérica e, a formação do complexo coacervado diminuiu a liberação instantânea (efeito burst) sem a necessidade de recobrimento da matriz.
Verificou-se o ajuste da cinética de liberação do fármaco em algumas preparações ao modelo matemático de Higuchi e outras ao modelo de Korsmeyer-Peppas, o que indicou que as diferentes preparações apresentam interações diferentes entre as partículas e o fármaco influenciando a liberação deste nos meios estudados.
Os ensaios de eficácia antimicrobiana indicaram que, em algumas preparações, a tetraciclina presente no sistema de liberação sustentada manteve sua eficácia sobre os microrganismos avaliados aumentada quando comparada aos parâmetros do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2017) no documento Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (M100S).
Os resultados sugerem que uma das preparações possui potencial antimicrobiano para futuras aplicações.
ABSTRACT
Due to infection deaths, and the antimicrobial resistance, the purpose of this project was to prepare and characterize aqueous suspensions of polymeric microparticles with bioadhesive properties to a sustained release of the antimicrobial tetracycline hydrochloride using substances recognized in literature as biocompatible and with low toxicity, to a possible oral use.
Microparticles were prepared by complexation of chitosan and sodium alginate polyelectrolytes, cross-linked by calcium ions and addition of tetracycline. The adopted method of preparation was the mechanical shearing.
Through the factorial trial design it was possible to obtain microparticles with different characteristics in terms of particle size, encapsulation efficiency, loading percentage, release time of 10% of tetracycline in simulated gastric fluid (t10%FGS), intestinal fluid (t10%FIS), and antimicrobial activity.
Primary trials indicate that tetracycline release in simulated gastric fluid and in intestinal fluid ocurred progressively and sustained for about three days. Release profile reflects what was observed by Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) - which shows that there is a difference in intensity and/or interation type between tetracycline, which has functional groups of cation nature, and the alginate carboxylate group and the chitosan cation groups. In addition, the release profile was different in simulated intestinal fluid and gastric fluid, which suggests that the particles are sensible to the enviroment acidity, performance expected by a polyelectrolytes matrix.
It was verified that the polymeric matrix reticulation and the creation of the coacervation complex was reducing the instant release (burst effect) without the need of matrix overlay.
The drug kinetic release ajustment in certain preparations to the Higuchi mathematical model and others in the Korsmeyer-Peppas model was also verified; which indicated that the different preparations present different interactions between the particles and the drug, affecting their release in the studied enviroments.
Antimicrobial efficiency trials indicated that, in some preparations, the tetracycline in the sustained release system kept its efficiency on the evaluated microorganisms, increasing when compared with the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2017) parameters in the Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (M100S) document.
The results suggest that one of the preparations holds the antimicrobial capacity for future formulation.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Representação de 2797 tipos de riscos para a saúde por tipo e país, entre janeiro de 2001 e setembro de 2013. Os surtos causados por doenças infecciosas representam 84% das doenças. Dados
não publicados da OMS (2013) (Tradução livre para essa Tese. Adaptado de DYE, 2014). ... 23
Figura 2: Variação da concentração plasmática após administração de dosagem convencional. Ao longo do tempo, a dosagem convencional pode atingir o nível tóxico ou permanecer abaixo da faixa terapêutica (adaptado de AZEVEDO, 2005)... 25
Figura 3: Variação da concentração plasmática após administração de fármaco contido em um SLF. A concentração do fármaco permanece constante na faixa terapêutica (adaptado de AZEVEDO, 2005) ... 25
Figura 4: a) SLF esfera; b) SLF cilindro; c) SLF filme (adaptado de SIEPMANN,SIEPMANN, 2008) ... 27
Figura 5: a) SLF reservatório; b) SLF matricial (adaptado de SIEPMANN, SIEPMANN, 2012) ... 27
Figura 6: Formação de rede tridimensional de hidrogéis por reticulação física. (adaptado de HOFFMAN, 2012; REIS, 2016) ... 30
Figura 7: Formação de rede tridimensional de hidrogéis por reticulação química (adaptado de HOFFMAN, 2012; REIS, 2016) ... 30
Figura 8: Estrutura da cadeia de quitosana ... 32
Figura 9: Estrutura da cadeia de ácido algínico (BUENO, 2010) ... 33
Figura 10: Alga marrom (Laminaria digitata) ... 33
Figura 11: Monômeros do ALG (LIMA, 2006) ... 34
Figura 12: Grupos MM, MG e GG (ARAVAMUDHAN et al., 2014) ... 34
Figura 13: Estrutura de ALG reticulado com íons cálcio (SACCHETIN, 2010) ... 35
Figura 14: Estrutura química da molécula de cloridrato de tetraciclina (adaptado de PEREIRA-MAIA et al., 2010) ... 36
Figura 15: Mecanismo de ação da tetraciclina (PEREIRA-MAIA et al., 2010) ... 37
Figura 16: Mecanismo de efluxo (ANVISA, 2007). ... 38
Figura 17: Tipo de transporte através da membrana intestinal (adaptado de FLORENCE, ATTWOOD, 2011) ... 40
Figura 18: Possíveis rotas de internalização de partículas pela parede intestinal: 1) através de células M, 2); através de células epiteliais normais (enterócitos); 3) paracelular – entre as células. A) passagem de partículas através da região das placas de Peyer, desde o lúmen até a camada serosa do intestino. B) passagem de partículas nos vasos linfáticos mesentéricos. C) coleta de partículas em um linfonodo mesentérico (FLORENCE, 1997)... 40
Figura 20: Preparo da micropartícula Figura 21: Suspensão de micropartículas ... 71
Figura 22: Dispositivo para ensaio de liberação de tetraciclina em fluido gástrico simulado... 73
Figura 23: Conjunto de dispositivos para ensaio de liberação de tetraciclina, em estufa termostatizada. ... 74
Figura 24: Difratograma da TC ... 77
Figura 25: Comparação do difratograma da TC com o Padrão JCPDS ... 78
Figura 26: Espectro na região do Ultravioleta-visível da TC ... 79
Figura 27: Espectro IV da TC ... 79
Figura 28: Termograma TGA da TC ... 81
Figura 29: Termograma DSC da TC ... 82
Figura 30: Difratograma do ALG ... 82
Figura 31: Espectro IV do ALG ... 83
Figura 32: Termograma TGA do ALG ... 84
Figura 33: Termograma DSC do ALG ... 85
Figura 34: Difratograma da QTS ... 85
Figura 35: Espectro IV da QTS ... 86
Figura 36 Termograma da QTS ... 87
Figura 37: Termograma DSC da QTS ... 88
Figura 38: Tamanho de Partículas ... 90
Figura 39: Perfil monomodal da determinação de Tamanho de Partículas – Partícula PC ... 90
Figura 40: Gráfico de cubo – Tamanho de partículas ... 91
Figura 41: Gráfico de efeitos – Tamanho de partículas: a)QTS/ALG; b) ALG/Ca; c) TC ... 91
Figura 42: Gráfico de interação entre os efeitos – Tamanho de partículas: a) ALG/Ca e TC; b) QTS/ALG e ALG/Ca; QTS/ALG e TC ... 92
Figura 43: Potencial Zeta ... 94
Figura 44: Gráfico de cubo – Potencial Zeta ... 95
Figura 45: Gráfico de efeitos – Potencial Zeta: a)QTS/ALG; b) ALG/Ca; c) TC ... 95
Figura 46: Gráfico de interação entre os efeitos – Potencial Zeta: a) ALG/Ca e TC; b) QTS/ALG e ALG/Ca; QTS/ALG e TC ... 96
Figura 47: Estabilidade à 5 °C das micropartículas PL01 e PL02 ... 97
Figura 48: Estabilidade à 5 °C das micropartículasPL03 e PL04 ... 97
Figura 49: Estabilidade à 5 °C das micropartículasPL058 e PL06 ... 97
Figura 50: Estabilidade à 5 °C das micropartículasPL07, PL08 e PC ... 97
Figura 52: Gráfico de cubo – %EE ... 99
Figura 53: Gráfico de efeitos – %EE: a)QTS/ALG; b) ALG/Ca; c) TC ... 99
Figura 54: Gráfico de interação entre os efeitos – %EE: a) ALG/Ca e TC; b) QTS/ALG e ALG/Ca; QTS/ALG e TC ... 100
Figura 55: Gráfico de cubo – %PC ... 101
Figura 56: Gráfico de efeitos – %PC, a) QTS/ALG; b) ALG/Ca; c) TC ... 101
Figura 57: Gráfico de interação entre os efeitos – %PC: a) ALG/Ca e TC; b) QTS/ALG e ALG/Ca; QTS/ALG e TC ... 102
Figura 58: Sobreposição dos difratogramas das amostras PL01 à PL04 e PC ... 103
Figura 59: Sobreposição dos difratogramas das amostras PL05 à PL06 ... 103
Figura 60: Espectros IV das amostras PL01 à PL04 e PC ... 105
Figura 61: Espectros IV das amostras PL05 à PL08 e PC ... 106
Figura 62: Sobreposição das curvas TGA das amostras PL01 a PL04 ... 108
Figura 63: Sobreposição das curvas TGA das amostras PL05 a PL08 e PC ... 108
Figura 64: Sobreposição das curvas DTG das amostras PL01 a PL04 ... 109
Figura 65 Sobreposição das curvas DTG das amostras PL05 a PL08 e PC ... 109
Figura 66: Curvas DSC das amostras PL01 à PL04 ... 109
Figura 67: Curvas DSC das amostras PL 05 à PL08 e PC ... 110
Figura 68: Curvas Liberação de TC em FGS ... 111
Figura 69: Curvas Liberação de TC em FGS: PL01 à PL04 ... 112
Figura 70: Curvas Liberação de TC em FGS: PL05 à PL08 e PC ... 112
Figura 71: Gráfico de cubo – t10%FG ... 114
Figura 72: Gráfico de efeitos – t10%FG, a) QTS/ALG; b) ALG/Ca; c) TC ... 114
Figura 73: Gráfico de interação entre os efeitos – t10%FG: a) ALG/Ca e TC; b) QTS/ALG e ALG/Ca; QTS/ALG e TC ... 115
Figura 74: Comparação do perfil de liberação em FIS ... 116
Figura 75: Comparação do perfil de liberação em FIS – primeiras 12 horas... 117
Figura 76:Comparação do perfil de liberação em FIS amostras PL01 à PL04... 117
Figura 77: Comparação do perfil de liberação em FIS amostras PL01 à PL04 – Primeiras 12 horas ... 118
Figura 78:Comparação do perfil de liberação em FIS das amostras PL05 à PL08 e PC ... 118
Figura 79:Comparação do perfil de liberação em FIS das amostras PL05 à PL08 e PC – primeiras 12 horas ... 119
Figura 80: Gráfico de cubo – t10%FIS ... 121
Figura 82: Gráfico de interação entre os efeitos – t10%FIS: a) ALG/Ca e TC; b) QTS/ALG e ALG/Ca; QTS/ALG e TC ... 122 Figura 83: Comparação da quantidade de TC liberada em FGS e FIS em 2h de liberação ... 124 Figura 84: Halos de inibição de crescimento pela ação da TC livre liberada pelos discos. ... 126 Figura 85: Halos de inibição de crescimento pela ação da TC liberada pelas micropartículas impregnadas nos discos. ... 126 Figura 86: Halos de inibição de crescimento pela ação da TC liberada pelas micropartículas impregnadas nos discos e TC livre. ... 127 Figura 87: Avaliação da capacidade de retenção e liberação sustentada tetraciclina pelas micropartículas por 24 horas ... 129 Figura 88: Avaliação da capacidade de retenção e liberação sustentada do antibiótico tetraciclina (TC) pelas micropartículas (48 horas) ... 129 Figura 89: Avaliação da capacidade de retenção e liberação sustentada do antibiótico tetraciclina (TC) pelas micropartículas (72 horas) ... 130
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores de n do modelo de Korsmeyer-Peppas, geometria do sistema e tipo de liberação de
fármacos. ... 52
Tabela 2: Planejamento experimental ... 70
Tabela 3: Bandas identificadas no espectro IV da TC ... 80
Tabela 4: Bandas identificadas no espectro do ALG ... 83
Tabela 5: Bandas identificadas no espectro da QTS ... 86
Tabela 6: Respostas do planejamento experimental ... 89
Tabela 7: Tamanho de partículas (µm) ... 90
Tabela 8: Efeito dos fatores sobre o Tamanho de partículas... 91
Tabela 9: Potencial Zeta () ... 94
Tabela 10: Efeito dos fatores sobre o Potencial Zeta ... 95
Tabela 11:Percentual de carregamento e Eficiência de encapsulação das partículas PL01 a PC ... 98
Tabela 12: Efeito dos fatores sobre o %EE ... 99
Tabela 13: Efeito dos fatores sobre o %PC ... 101
Tabela 14: Comparação do ajuste aos modelos matemáticos ... 113
Tabela 15: Efeito dos fatores sobre o t10%FG... 114
Tabela 16: Comparação do ajuste aos modelos matemáticos ... 120
Tabela 17: Efeito dos fatores sobre o t10%FIS ... 122
Tabela 18: Teste de difusão em discos para determinação da porcentagem teórica de liberação de TC (%LIBT) pelas micropartículas ... 128
Tabela 19: Avaliação da capacidade de retenção e liberação sustentada do antibiótico tetraciclina (TC) pelas micropartículas ... 131
LISTA DE ABREVIATURAS Deformação angular Estiramento Potencial Zeta C Grau centígrado 𝑡1 2
⁄ Tempo de meia vida
%EE Eficiência de encapsulação
%LIBT Porcentagem teórica de liberação de TC liberada a partir das micropartículas
µm Micrômetro
µg Micrograma
ACN Acetonitrila
ALG Alginato
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection
ATR refletância total atenuada
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
D Coeficiente de difusão
Diâmetro Mediano
d distância média
DLS Espalhamento Dinâmico de Luz (Dynamic Light Scattering)
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DRX Difratometria de raios-X
DSC Calorimetria Diferencial de Varredura
DTG Termogravimetria Derivada
FGS Fluido gástrico simulado
FIS Fluido intestinal simulado
FTIR Espectroscopia de Absorção no Infravermelho com transformada de Fourier
G Guluronato
GA Grau de Acetilação
GALT Gut-Associated Lymphoid Tissue
GD Grau de Desacetilação
GPC Cromatografia de Permeação em Gel
h Hora
HCl Ácido clorídrico
HPLC Cromatografia Líquida de Alto Desempenho
IA Índice de Atividade
IC Intervalo de confiança
IV Infravermelho
JCPDS Joint Committee on Powder Diffraction Standards
kB constante de Boltzmann
kDa quilodaltons
M Manuronato
m/v Relação massa por volume
M∞ quantidade de fármaco liberada no tempo infinito
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
mg Miligrama
MH Müller Hinton
MIC Concentração Inibitória Mínima
mL Mililitro
MP Micropartículas
mRNA RNA mensageiro
Mt quantidade de fármaco liberada no tempo t
Mt/M∞ Fração de fármaco liberada no tempo t
mV milivolts
NaOH Hidróxido de sódio
nm nanômetro
OMS Organização Mundial da Saúde
PC% Percentual de Carregamento
PC Amostra Ponto Central do Planejamento Experimental Fatorial
PDI Índice de Polidispersividade
PEC Complexos Polieletrólitos
PHBV Poli(hidróxibutirato-co-valerato)
PIB Produto interno bruto
PL01 Amostra 01 do Planejamento Experimental Fatorial
PL02 Amostra 02 do Planejamento Experimental Fatorial
PL03 Amostra 03 do Planejamento Experimental Fatorial
PL04 Amostra 04 do Planejamento Experimental Fatorial
PL05 Amostra 05 do Planejamento Experimental Fatorial
PL06 Amostra 06 do Planejamento Experimental Fatorial
PL07 Amostra 07 do Planejamento Experimental Fatorial
PL08 Amostra 08 do Planejamento Experimental Fatorial
PLA Poli(L,D-lactato)
PLGA Poli(D,L-lactato-coglicolato)
PSD Diâmetros das partículas
PVA Álcool polivinílico
QT Quitina
QTS Quitosana
RNA Ácido ribonucleico
rpm Rotação por minuto
s Erro padrão
SLC Sistema de Liberação Controlada
SLF Sistema de Liberação de Fármaco
SLS Sistema de Liberação Sustentada
SQD Soma dos quadrados dos desvios,
t tempo
t10% tempo para liberar 10% da massa de ativo encapsulada
TC Cloridrato de Tetraciclina
Tg Temperatura de transição vítrea
TGA Análise Termogravimétrica
TPP Trifosfato de Sódio
U.A. Unidade de arbitrária de intensidade
v/v Relação volume por volume
WHO World Health Organization
μg/L Microgramas por litro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 23
1.1. MORTES POR DOENÇAS INFECCIOSAS...23
1.2. RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS ...24
1.3. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS ...24
1.3.1. TIPOS DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS ...27
1.3.2. USO DE BIOMATERIAIS NA FORMULAÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS...28
1.4. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE TETRACICLINA ...36
1.4.1. TETRACICLINAS ...36
1.4.2. ENCAPSULAÇÃO DE TETRACICLINA ...39
1.5. ABSORÇÃO DE SLF ADMINISTRADOS POR VIA ORAL ...39
1.6. MECANISMOS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS EM SISTEMAS CARREADORES ...41
1.6.1. MECANISMO DE LIBERAÇÃO POR DIFUSÃO ...41
1.7. MÉTODOS DE PREPARO DE SLF POLIMÉRICO ...55
1.7.1. MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA ...57
1.7.2. MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO ...58
1.7.3. REFORÇO EXTERNO DE PARTÍCULAS POLIMÉRICAS ...58
1.7.4. PARTÍCULAS DE ALGINATO E QUITOSANA PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL ...59
1.7.5. ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA DOS DADOS OBTIDOS A PARTIR DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ...60
1.7.6. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ...63
1.7.7. ESTUDO DE MODELAGEM MATEMÁTICA DOS EFEITOS DOS FATORES SOBRE AS RESPOSTAS ...63
2. MOTIVAÇÃO DO ESTUDO E OBJETIVOS ... 66
2.1. MOTIVAÇÕES ...66 2.2. OBJETIVOS ...66 2.2.1. OBJETIVO GERAL...66 2.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...66 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 67 3.1. REAGENTES ...67 3.2. PREPARO DE SOLUÇÕES ...67
3.3. CARACTERIZAÇÃO DOS REAGENTES UTILIZADOS ...68
3.3.1. ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO ...68
3.3.2. CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA...69
3.3.3. ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA ...69
3.4. PREPARO DAS MICROPARTÍCULAS ...69
3.4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL ...70
3.4.2. MÉTODO DE PREPARO ...71
3.4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS ...71
3.4.3.1. TAMANHO DE PARTÍCULA ...72
3.4.3.2. CARREGAMENTO DE ATIVO E EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO ...72
3.4.3.3. OBTENÇÃO DO POTENCIAL ZETA (Ζ) ...72
3.4.3.4. METODOLOGIA DE QUANTIFICAÇÃO DE TETRACICLINA ...72
3.4.4. ENSAIOS DE LIBERAÇÃO ...73
3.4.5. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA ANTIMICROBIANA ...74
3.4.5.1. TESTES DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS POR DISCO-DIFUSÃO ...74
3.4.5.2. PREPARO DOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO WHATMAN Nº 3 ...74
3.4.5.3. CEPAS PADRÃO ...75
3.4.5.4. PREPARO DO INÓCULO ...75
3.4.5.5. TESTE DE DIFUSÃO ...75
3.4.5.6. TESTE DE DIFUSÃO COM LIBERAÇÃO DIRETA ...75
3.4.5.7. TESTE DE DIFUSÃO COM LIBERAÇÃO SUSTENTADA ...76
3.4.5.8. LEITURA DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ...76
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 77
4.1. CARACTERIZAÇÃO DOS REAGENTES ...77
4.1.1. TETRACICLINA ...77
4.1.2. ALGINATO ...82
4.1.3. QUITOSANA ...85
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS ...88
4.2.1. TAMANHO DE PARTÍCULA ...90
4.2.1.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE O TAMANHO DE PARTÍCULA ...91
4.2.1.2. MODELO DO TAMANHO DE PARTÍCULAS ...93
4.2.2. POTENCIAL ZETA () ...94
4.2.2.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE O POTENCIAL ZETA ...94
4.2.2.2. MODELO DO POTENCIAL ZETA ...96
4.2.2.3. ESTABILIDADE ...97
4.2.3. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO E PERCENTUAL DE CARREGAMENTO ...98
4.2.3.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE A EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO ...99
4.2.3.2. MODELO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO... 100
4.2.3.3. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE O PERCENTUAL DE CARREGAMENTO ... 101
4.2.4. DIFRATOMETRIA DE RAIOS X(DRX) ... 103
4.2.5. ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO ... 104
4.2.6. ANÁLISES TÉRMICAS ... 108
4.2.7. ENSAIOS DE LIBERAÇÃO ... 111
4.2.7.1. ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM FGS ... 111
4.2.7.1.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE O T10%FGS ... 114
4.2.7.2. ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM FIS ... 116
4.2.7.2.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE O T10%FIS ... 121
4.2.8. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA ANTIMICROBIANA ... 125
5. CONCLUSÕES ... 132 6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 135 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 136 8. ANEXOS ... 150
1. Introdução
1.1. Mortes por doenças infecciosas
Quase 90 anos depois da descoberta da penicilina pelo médico e bacteriologista inglês Alexander Fleming (1881-1955), o desenvolvimento de novos antibióticos continua sendo alvo da indústria farmacêutica. Entretanto, mesmo com o desenvolvimento dos chamados antibióticos de última geração, a OMS afirma que, de 2797 riscos para a saúde internacional, 84% foram surtos causados por doenças infecciosas. O maior índice de óbitos causados por doenças infectocontagiosas (Figura 1) é observado entre a população de baixa renda (DYE, 2014; BUCHALLA, WALDMAN, LAURENTI, 2003).
Estima-se que, em 2050, mais de 10 milhões de pessoas irão morrer por doenças causadas por infecções bacterianas (DE KRAKER, STEWARDSON, HARBARTH, 2016). Esse panorama aumentará o custo do tratamento com infecções hospitalares (O'NEILL, 2014) e, segundo a ONU (SILVA, 2016), diminuirá entre 3 e 5% o PIB mundial (LIND, 2017).
Figura 1: Representação de 2797 tipos de riscos para a saúde por tipo e país, entre janeiro de 2001 e setembro de 2013. Os surtos causados por doenças infecciosas representam 84% das doenças. Dados não publicados da OMS (2013) (Tradução livre para essa Tese. Adaptado de DYE, 2014).
1.2. Resistência a antimicrobianos
Atualmente há no mercado grande variedade de antibióticos, desenvolvidos para o tratamento das mais diferentes doenças causadas por bactérias. Entretanto, algumas dessas substâncias não têm mais causado o efeito desejado no tratamento das infecções. Isso se deve ao fenômeno conhecido como resistência bacteriana (DE OLIVEIRA et al., 2017).
A resistência microbiana, é a capacidade de micro-organismos continuarem a se reproduzir na presença de certo antimicrobiano, nas doses terapêuticas tradicionais e, mais recentemente, na presença de antimicrobianos reconhecidamente de maior potência – os antibióticos de última geração.
Esses micro-organismos são considerados micro-organismos resistentes à múltiplos fármacos, surgem por diversas causas naturais, sendo as mais comuns, as alterações genéticas (DE KRAKER, STEWARDSON, HARBARTH, 2016; LANGONI, 2016). Entre outras razões, essas alterações também podem ser induzidas pelo mau uso de antibióticos, como o uso indiscriminado ou a interrupção precoce do tratamento (WHO, 2017a). Esta última, denominada “não-adesão”, é caracterizada pelo não cumprimento da posologia prevista no protocolo oficial de tratamento de determinada infecção bacteriana. Isso pode ocorrer ou pelo esquecimento ou pelo abandono do tratamento devido à aparente melhora dos sintomas (TOZER, ROWLAND, 2006).
1.3. Sistemas de liberação de fármacos
Em geral, antibióticos são administrados por via endovenosa ou oral e, em períodos sucessivos que podem variar de 4, 6, 8 e 12 horas. Algum tempo após a primeira dose, a concentração plasmática do ativo pode estar abaixo do nível efetivo (concentração mínima na qual o fármaco é efetivo) e, a cada nova dose, a concentração pode ultrapassar o nível tóxico (concentração do fármaco que passa a ser tóxica para o indivíduo). Em ambos os casos, a concentração plasmática do ativo atinge níveis fora da faixa terapêutica (concentração na qual o fármaco é ativo) (Figura 2). Assim, na administração convencional, como o nível sub-terapêutico pode ser alcançado algum tempo após cada dose, é necessário a administração de novas doses a fim de manter a eficácia do tratamento (AZEVEDO, 2005; HOFFMAN, 2012).
Figura 2: Variação da concentração plasmática após administração de dosagem convencional. Ao longo do tempo, a dosagem convencional pode atingir o nível tóxico ou permanecer abaixo da faixa terapêutica (adaptado de AZEVEDO, 2005).
Na tentativa de proporcionar tratamentos de dosagem única e que mantenham a concentração do ativo constante, na janela terapêutica, durante todo o período do tratamento, diversos dispositivos denominados sistemas de liberação de fármacos (SLF) têm sido desenvolvidos. Nesse sentido, SLF têm grande importância para a medicina, pois podem proporcionar liberação modificada de compostos com propriedades terapêuticas, como moléculas de baixa massa molar, peptídeos, proteínas, materiais genéticos etc. SLF, quando em contato com fluidos corpóreos, liberam pequenas doses do ativo ao longo do tempo, mantendo a concentração plasmática do fármaco constante e dentro da faixa terapêutica (Figura 3) (HOFFMAN, 2012).
Figura 3: Variação da concentração plasmática após administração de fármaco contido em um SLF. A concentração do fármaco permanece constante na faixa terapêutica (adaptado de AZEVEDO, 2005)
Como mencionado, a concentração plasmática de fármaco após administração tradicional, quando comparada à concentração plasmática durante a liberação sustentada, pode, em alguns momentos, atingir o nível tóxico ou o nível sub-terapêutico (AZEVEDO, 2005). Assim, a vantagem do SLF é manter a concentração de fármaco no plasma, constante e dentro da faixa de concentração terapêutica (HOFFMAN, 2012).
Uma vez que a dose de fármaco administrada tradicionalmente estima a quantidade de fármaco perdida por meio da distribuição sistêmica, metabolização e excreção e, considerando que o uso de SLF descarta a necessidade de administração de doses sucessivas, podemos dizer que o SLF reduz efeitos adversos, uma vez que a quantidade de fármaco liberada no organismo é menor. Deste modo, por meio de SLF é possível liberar fármacos de forma mais segura, reduzindo efeitos adversos. Além disso, como SLF permitem administração de doses contínuas e prolongadas, maximizam o efeito do ativo e promovem maior adesão dos pacientes ao protocolo de tratamento.
Nesse sentido, quando se tem em mente que a não-adesão de pacientes ao tratamento com antimicrobianos, pode ser uma das razões para que, em 2050, 10 milhões de pessoas venham à óbito por doenças infecciosas. Pode-se perceber que, idealmente, o desenvolvimento de sistemas de liberação de antibióticos poderá colaborar de forma efetiva para evitar a interrupção precoce do tratamento e assim minimizar, em alguma medida, o aumento da resistência aos antimicrobianos (DE KRAKER, STEWARDSON, HARBARTH, 2016; UHRICH et al., 1999) e diminuir os custos do tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias (ANSELMO, MITRAGOTRI, 2014).
1.3.1. Tipos de sistemas de liberação de fármacos
Os sistemas de liberação de fármacos (SLF) podem ter formatos tanto de esferas (Figura 4a), quanto partículas com outras formas geométricas, como cilindros (Figura 4b), filmes (Figura 4c).
Figura 4: a) SLF esfera; b) SLF cilindro; c) SLF filme (adaptado de SIEPMANN,SIEPMANN, 2008)
Esses dispositivos podem ser classificados, entre outras características, quanto à forma como carregam o ativo (sistemas reservatório e matricial) e quanto à forma como o liberam, quando em contato com fluidos corpóreos (sistema de liberação sustentada e de liberação controlada).
1.3.1.1. Sistemas reservatórios e matriciais
Os sistemas de liberação de fármaco (SLF) podem ser preparados para transportar fármacos no seu interior (reservatórios) ou dispersos em sua matriz (matriciais). SLF reservatórios possuem uma membrana interna (Figura 5a) que isola o núcleo contendo o fármaco do restante da matriz e funciona como uma barreira à difusão do fármaco. Diferentemente, SLF matriciais (Figura 5b), transportam o fármaco distribuído em sua matriz (FRENNING, 2011; SIEPMANN, SIEPMANN, 2012).
1.3.1.2. Sistemas de liberação sustentada e de liberação controlada
Sistemas de liberação de fármacos podem liberar o ativo contido em sua estrutura de forma independente das condições do meio, como temperatura, pH etc. ou, de forma dependente dessas condições. O primeiro libera o fármaco no organismo independente das alterações das condições do meio e são denominados de sistema de liberação sustentada (SLS). O segundo é capaz de liberar fármaco a partir de pequenas alterações do meio e é denominado de sistema de liberação controlada (SLC) (LANGER, 1990; SIEPMANN, SIEPMANN, 2008; 2012; SIEPMANN, SIEGEL, 2012; PEPPAS, 2013).
Em geral, SLS liberam todo fármaco em apenas um dia. Enquanto que os SLC podem liberar o ativo por um tempo maior. Há situações em que se deseja que o fármaco seja liberado de forma prolongada e, para esta finalidade, os SLC são mais vantajosos porque, podem liberar o fármaco em circunstâncias específicas, por longo tempo, de forma contínua ou intermitente (LANGER, 1990; SIEPMANN, SIEPMANN, 2008; 2012; PEPPAS, 2013).
Atualmente, além de manter a dose do fármaco em concentrações adequadas ao tratamento, deseja-se que os SLC entreguem o fármaco diretamente no local de sua atuação, por meio do reconhecimento das regiões afetadas. Para essa finalidade, vários SLC têm sido desenvolvidos em escala micrométrica e nanométrica (WEISER, SALTZMAN, 2014; CHARMAN, CHARMAN, 2002).
1.3.2. Uso de biomateriais na formulação de sistemas de liberação de fármacos
A fim de evitar efeitos indesejáveis durante o tratamento, os SLF precisam ser fabricados com materiais especiais, denominados biomateriais. Os biomateriais são definidos como materiais que podem ser utilizados na medicina, de forma permanente ou temporária, completa ou parcialmente, para tratar, aumentar ou substituir partes de um organismo de maneira segura e viável, econômica e fisiologicamente (PARK, LAKER, 2007; PARK, 2014). Assim, para que um material seja considerado biomaterial, precisa atender certos requisitos, como ser biocompatível, ou seja, deve possuir propriedades que proporcionem sua perfeita adequação ao organismo, não provocando respostas biológicas indesejáveis, como alergia, inflamação, mutação, rejeição etc. E, além disso, deve ser biofuncional, deve possuir propriedades mecânicas, físicas, químicas e biológicas que permitem ao dispositivo o desempenho de sua função específica (ORÉFICE, PEREIRA, MANSUR, 2005).
Materiais com tais características podem ser utilizados para diversos fins, como a substituição permanente ou temporária de tecidos (moles e duros), ossos, entrega de fármacos etc. (BARBANTI, ZAVAGLIA, DUEK, 2006).
1.3.2.1. Biopolímeros
Entre os diversos tipos de biomateriais, os polímeros têm sido muito utilizados devido tanto à facilidade de obtenção, quanto síntese e manipulação de suas propriedades, por meio de alterações químicas realizadas na cadeia polimérica. Os polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser utilizados como biomateriais, pois se degradam in vivo por solubilização, degradação química ou ação enzimática, como, por exemplo, os polímeros extraídos de animais e plantas (biopolímeros). Entre estes, destacam-se os derivados de polissacarídeos, uma vez que são, naturalmente, constituintes da matéria viva e, por isso, apresentam excelente biocompatibilidade.
Devido à sua estrutura polimérica, os polissacarídeos podem ser utilizados para fabricação de dispositivos destinados a suturas, bandagens, para entrega de fármacos etc. Entre os polissacarídeos mais utilizados como biomateriais estão a celulose, o ácido hialurônico, o alginato, a quitosana e o amido (DUMITRIU, 2002; HOFFMAN, 2012).
1.3.2.1.1. Uso de hidrogel de polissacarídeos em sistemas de liberação de fármacos A escolha do material para fabricação de dispositivos SLF deve levar em conta as propriedades do material que constitui sua matriz. Deseja-se que seja um material que, independente das dimensões da matriz, apresente grande capacidade de carregamento. Entre os tipos de materiais que apresentam essas características, destacam-se os polissacarídeos, devido à presença de grupos funcionais ao longo da cadeia, os quais favorecem a formação de redes tridimensionais denominadas hidrogel (DUMITRIU, 2002; HOFFMAN, 2012).
Os hidrogéis constituídos por cadeias poliméricas de polissacarídeos podem apresentar, tanto propriedades de líquidos, quanto de sólidos, tais como pressão de vapor, compressibilidade, condutividade elétrica (típica dos líquidos) e rigidez (típica dos sólidos). Isso se deve à presença de grupos que conferem a essas cadeias propriedades hidrofílicas. Os grupos mais comuns em hidrogéis de polissacarídeos são hidroxila, carboxila e aminas (SCHACHAT, RAUMOND, 1956; PEPPAS, 2000; HOFFMAN, 2012).
Hidrogéis de polissacarídeos podem ser formados por diferentes métodos, como por evaporação do solvente, pela alteração da acidez ou pela adição de um agente gerador de ligações cruzadas entre as cadeias poliméricas (agente reticulante), entre outros (SCHACHAT, RAUMOND, 1956; REIS, 2016; HOFFMAN, 2012).
Durante o preparo de um hidrogel de polissacarídeos, os seguimentos poliméricos carregados, positiva (polímero catiônico) e negativamente (polímero aniônico), interagem entre si, formando um complexo coacervado (Figura 6). As ligações cruzadas formadas entre os diferentes segmentos da cadeia polimérica, aumentam a rigidez do hidrogel.
Figura 6: Formação de rede tridimensional de hidrogéis por reticulação física. (adaptado de HOFFMAN, 2012; REIS, 2016)
Um hidrogel também pode ser produzido por gelação iônica, na qual o gel é formado por meio de ligações iônicas ou covalentes entre as cadeias poliméricas e um agente químico, que age reticulando as cadeias em uma estrutura tridimensional. Os agentes químicos mais comumente utilizados para reticulação são ânions e cátions multivalentes. Esses íons formam ligações cruzadas (cross link) e produzem uma rede 3D (Figura 7) (SCHACHAT, RAUMOND, 1956; REIS, 2016; HOFFMAN, 2012).
Figura 7: Formação de rede tridimensional de hidrogéis por reticulação química (adaptado de HOFFMAN, 2012; REIS, 2016)
O grau de entrelaçamento da rede depende do tipo e da quantidade de grupos funcionais carregados presentes na molécula e do tipo de cadeia do polissacarídeo – se linear ou ramificada, pois cadeias ramificadas apresentam maior dificuldade para reticular que as lineares (SOLMS, 1960; HOFFMAN, 2012).
Independente da forma como foram preparados (coacervação ou gelação iônica), hidrogéis de polissacarídeos possuem grande quantidade de grupos funcionais hidrofílicos e, por isso, são capazes de absorver grande quantidade de água, que hidrata os grupos funcionais, sem destruir sua estrutura física, nem o dissolver.
Essa capacidade de absorção de grande quantidade de água é denominada intumescimento, fenômeno por meio do qual os hidrogéis podem embeber grande quantidade de solvente aquoso sem perder suas características. Esse processo leva ao inchaço da matriz pela absorção de água (entre 10 a 20% de sua massa) e, dependendo da quantidade de sítios hidrofílicos, pode chegar a milhares de vezes sua massa seca (HOFFMAN, 2002).
Durante o intumescimento ocorre aumento da organização da rede, que começa a ser gerada por forças eletrostáticas. Há, também, aumento da viscosidade, pois o solvente é absorvido ou imobilizado pelos grupos hidrofílicos do polímero (SCHACHAT, RAUMOND, 1956; HOFFMAN 2012).
Hidrogéis formados por polissacarídeos contêm pequena quantidade de substância polimérica (menos de 1% em massa) dispersa em grande quantidade de água e, ainda assim, formam rede 3D (SOLMS, 1960; HOFFMAN, 2012).
A grande quantidade de grupos funcionais favorece o carreamento de fármacos e a propriedade de intumescer favorece a liberação do fármaco retido nas redes poliméricas, suas moléculas dissolvem no meio e são liberadas para o exterior do SLF por meio de difusão que, em geral, segue cinética de ordem zero (DUMITRIU, 2002; SCHACHAT, RAUMOND, 1956; HOFFMAN, 2012).
1.3.2.1.2. Hidrogéis formados por quitosana e alginato
Entre os polissacarídeos, a quitosana (QTS) e o alginato (ALG) têm se destacado como potenciais sistemas carreadores de fármacos por possuírem a capacidade de formar hidrogéis polieletrólitos, devido à presença de grupos funcionais positivos e negativos, respectivamente, na cadeia polimérica.
1.3.2.1.2.1. Quitosana
Além da celulose, a quitina (QT) é um dos polissacarídeos mais abundantes na natureza, uma vez que está presente no exoesqueleto de crustáceos, na parede celular de alguns fungos, na estrutura de casulos etc. Possui estrutura cristalina, altamente organizada, constituída por unidades monoméricas de β-(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glicose. A quitina é insolúvel em meio aquoso e, a partir dela, pode-se obter quitosana (QTS), mediante desacetilação em meio alcalino.
QTS é constituída pelo monômero N-acetil-D-glicosamina e por sua forma desacetilada – a D-glicosamina. É um composto mais solúvel que a QT, devido ao grau de desacetilação acima de 60% (Figura 8) (COSTA SILVA, SANTOS, FERREIRA, 2006; LARANJEIRA, FAVERE, 2009; DAMIAN et al., 2005).
N-acetil-D-glicosamina D-glicosamina Figura 8: Estrutura da cadeia de quitosana
Devido à presença de grupos amina, que podem ser protonados em meio ácido, ao longo da cadeia polimérica, QTS é um polieletrólito catiônico. Em pH abaixo de seu pKa (pKa 6,3), os grupos amina são protonados e se transformam em íons amônio (R-NH3+). Esta é
a razão pela qual QTS é solúvel em ácido acético 0,1M e insolúvel em meio com pH superior a 6,5, ou seja, em meio neutro e alcalino. Devido a isso, QTS interage eletrostaticamente com grupos ácidos de polímeros aniônicos, como o alginato. Além disso, a presença de grupos hidróxido (OH-) favorece a interação por meio de ligações de hidrogênio entre suas cadeias
poliméricas e o meio ao qual estiver exposta.
O fato de ser polieletrólito catiônico confere à QTS característica mucoadesiva, ou seja, possibilidade de aderrir à superfície de carga negativa de mucosas, como a intestinal, por exemplo (COSTA SILVA, dos SANTOS, FERREIRA, 2006; LARANJEIRA, FAVERE, 2009; DAMIAN et al., 2005; LYRA, 2007).
1.3.2.1.2.2. Alginato
Alginato de sódio (ALG) é um polissacarídeo obtido a partir do ácido algínico (Figura 9), substância que constitui cerca de 40% da estrutura de algas marinhas marrons, pertencentes à classe Phaeophyceae, como a alga Macrocystis pyrifera e a Laminaria digitata (Figura 10). Também pode ser produzido por grupos específicos de bactérias, como
Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, entre outras (GARCIA-CRUZ, FOGGETTI,
SILVA, 2008).
Figura 9: Estrutura da cadeia de ácido algínico (BUENO, 2010)
Fonte: Seaweed.ie
Figura 10: Alga marrom (Laminaria digitata)
Alginato de sódio é um polímero com cadeia linear, formado por dois monômeros, ácido β-D-manurônico (M) e ácido α-L-gulurônico (G), ligados por interação glicosídica α(1-4) (Figura 11).
Figura 11: Monômeros do ALG (LIMA, 2006)
Esses monômeros combinam-se de três maneiras: blocos de ácido β-D-manurônico (MM), blocos de ácido α-L-gulurônico (GG) e mistura destes blocos (MG) formando uma cadeia linear de alta massa molar (Figura 12), com seções rígidas e flexíveis (SCHACHAT, RAUMOND, 1956; DUMITRIU, 2002; ARAVAMUDHAN et al., 2014).
Figura 12: Grupos MM, MG e GG (ARAVAMUDHAN et al., 2014)
Os grupos carboxílicos (-COOH) dos monômeros manurônico (pKa 3,38) e gulurônico (pKa 4,4) caracterizam o hidrogel de alginato como polieletrólito aniônico (SOLMS, 1960; HOFFMAN, 2012). Esses grupos, quando ionizados permitem interações eletrostáticas com polieletrólitos catiônicos, como a quitosana, formando com esta, um coacervado de polieletrólitos (PEC).
Além disso, suas cadeias também podem ser reticuladas por gelação iônica, ou seja, pela interação dos grupos carboxilato e cátions polivalentes, como Ca2+,Cu2+ etc.,
formando uma estrutura tridimensional, um hidrogel reticulado (Figura 13) (MENG et al., 2010). Essa estrutura torna o hidrogel de alginato mais resistente e possibilita "controle" da difusão de compostos nele armazenados (SACCHETIN, 2010).
1.4. Sistemas de liberação de tetraciclina 1.4.1. Tetraciclinas
Tetraciclinas são um grupo de substâncias desenvolvidas entre 1950 e 1970 e que possuem propriedades antibióticas. Durante esse período, essas substâncias chegaram a estar entre os antimicrobianos mais utilizados nos Estados Unidos. A popularidade das tetraciclinas se deve ao baixo custo, baixa toxicidade e ampla faixa de atividade antimicrobiana (PEREIRA-MAIA et al., 2010; COUTO, CONCEIÇÃO, REIS, 2000).
Tetraciclinas são antimicrobianos de amplo espectro, sendo ativos tanto em micro-organismos Gram-positivos, quanto em Gram-negativos, aeróbicos e anaeróbicos. Devido a isso, as tetraciclinas foram utilizadas de forma indiscriminada e esse fato colaborou para o surgimento de bactérias resistentes a esse ativo. Apesar disso, devido ao amplo espectro de atuação, esses fármacos continuam a serem utilizados no tratamento de alguns tipos de infecção em humanos e em animais (ANVISA, 2017).
Entre as tetraciclinas, o cloridrato de tetraciclina é um quimioterápico com propriedades antimicrobianas, comumente denominado de tetraciclina (TC) e ao escrevermos tetraciclina estaremos nos referindo ao cloridrato de tetraciclina e não à classe desse antimicrobiano.
A molécula de cloridrato de tetraciclina (C22H24N2O8.HCl) (cloridrato de [4S-(4,
4a, 5a, 6, 12a)]–4–(dimetilamino)–1, 4, 4a, 5, 5a, 6-11, octaidro-3, 6, 10, 12, 12a-pentaidroxi-6-metil-1, 11-dioxo-2-naftacenocarboxamida) possui três grupos com prótons dissociáveis, um em C3 (grupo enol), outro em C10-C12 (sistema ceto-fenólico) e outro em C4
(grupo dimetilamônio), com valores de pKa 3,5; 7,7 e 9,3, respectivamente (Figura 14), e possui dois sítios doadores de elétrons. Um deles nos oxigênios em C10 e C12, no oxigênio
enólico em C3 e nos nitrogênios no grupo amida em C2 e possui massa molar igual à 480,9
g/mol (PEREIRA-MAIA et al., 2010).
A administração tradicional da TC é por via oral e o tempo de meia vida no organismo (t1/2) é de apenas 9h. Entretanto, como a maior parte da absorção da TC é no
estômago e no intestino delgado, a ingestão de alimentos diminui sua absorção, devido à sua afinidade por íons positivos, como cálcio (Ca2+).
A TC é o fármaco de escolha para o tratamento de doenças como a gonorreia, por exemplo. Entretanto, recentemente, essa doença está sendo considerada difícil de se tratar, devido à resistência desenvolvida pela bactéria Neisseria gonorrhoeae (WHO, 2017b).
Além disso, a TC é utilizada nos seguintes tratamentos:
Acne vulgaris como adjuvante de tratamento; actinomicoses causadas por
Actinomyces israelii; antrax causada por Bacillus anthracis; infecção
geniturinária causada por N. gonorrhoeae e por Chlamydia trachomatis; gengivoestomatite causada por Fusobacterium fusiformisans; granuloma inguinal causada por Calymmatobacterium granulomatis; linfogranuloma venéreo por Chlamydia sp; otite média, faringite, pneumonia e sinusite causadas por H. influenzae e Klebsiella sp; tifo causada por riquetsias; sífilis causada por Treponema pallidum; infecção bacteriana do aparelho urinário causada por Escherichia coli e Klebsiella sp; infecção retal menor causada por Chlamydia trachomatis; amebíase extra intestinal causada por Entamoeba
histolytica, usado junto com metronidazol em enterocolites causadas por Shigella sp. (ANVISA 2017)
Em geral, TC atua sobre esses micro-organismos com ação bacteriostática, ou seja, impedindo a multiplicação dos micro-organismos, agindo diretamente sobre o ribossomo bacteriano. Após entrar na célula por difusão (passiva ou ativa – mecanismo que envolve gasto energético) a molécula de TC se liga a um sítio na subunidade 30S do ribossomo bacteriano, impedindo a ligação do RNA transportador ao mesmo, inviabilizando a adição de aminoácidos e, consequentemente, a síntese proteica (Figura 15) (PEREIRA-MAIA et al., 2010; CHOPRA, ROBERTS, 2001).
Para fins desta Tese, o mecanismo de ação da TC sobre as bactérias não será explorado, razão pela qual não abordaremos este tema e os detalhes dos mecanismos de resistência microbiana a este fármaco.
Entre outros mecanismos possíveis, a resistência bacteriana a um antimicrobiano pode ocorrer por bomba de efluxo (Figura 16). Como, por exemplo, o mecanismo de resistência à TC observado em Escherichia coli (ANVISA, 2007).
Figura 16: Mecanismo de efluxo (ANVISA, 2007).
Este mecanismo promove bombeamento do antimicrobiano do interior da célula para o meio extracelular, diminuindo a concentração intracelular de TC até o nível ineficaz. Apesar disso, TC ainda é utilizada no tratamento de diversas infecções (PEREIRA-MAIA et al., 2010; ANVISA, 2017).
Tetraciclinas também possuem propriedades não antibióticas, como anti-inflamatórias, imunossupressivas, inibição da lipase e colagenase, apoptose, angiogênese, entre outras (PEREIRA-MAIA et al., 2010) e tem sido utilizada como coadjuvante no tratamento de algumas neoplasias. Uma das vantagens do uso de tetraciclinas como agente sinergético no tratamento de doenças como artrite reumatoide, osteomielite (de SOUZA, 2008) e neoplasias é devido à sua baixa toxicidade pois, podem ser utilizadas em maior quantidade e, assim, reduzindo a quantidade do fármaco principal e, consequentemente, os efeitos colaterais causados por estes. TC é usada também em tratamentos dermatológicos da acne e da rosácea (PEREIRA-MAIA et al., 2010) e, recentemente, como radioprotetora em tratamentos radioterápicos (ALOK; CHAUDHURY, 2016).
1.4.2. Encapsulação de tetraciclina
O amplo espectro de atuação e a possibilidade de uso de TC no tratamento de doenças não infecciosas aumentou o interesse por esse fármaco e, consequentemente, pelo desenvolvimento de sistemas de liberação do mesmo.
Um dos primeiros sistemas de liberação de fármacos carregado com TC foram fibras de acetato de vinil-etileno, preparadas por Goodson et al. (1983) para tratamento de periodontite. Desde então, diversos dispositivos foram preparados para aplicação local, para uso oral e para tratamento de infecções e doenças não infecciosas. Muitas delas são para aplicação odontológica, como as desenvolvidas por Maheshwari et al (2006) que carregaram TC em um gel associado à Aerosil (dióxido de silício coloidal). Chang e Sultana (2017) prepararam uma membrana de ácido polilático (PLA) e poli(hidróxibutirato-co-valerato) (PHBV) carregada com TC, para aplicação em engenharia de tecidos. Chen et al. (2017) prepararam um curativo, com atividade antimicrobiana, feito à base de hidrogel de ALG e QTS, contendo micropartículas de gelatina carregadas com TC.
Esses são apenas alguns dos diversos trabalhos disponíveis na literatura que demonstram que TC continua sendo um fármaco de interesse para a medicina e, que possui diversas possibilidades de ser carregada em sistemas de liberação, em diferentes meios, para diferentes aplicações.
1.5. Absorção de SLF administrados por via oral
Quando administrado por via oral, o antimicrobiano passa pelo trato gastrointestinal e, na maioria das vezes, é absorvido no intestino (ALLEN, POPOVICH, ANSEL, 2007).
Neste caso, a absorção de um fármaco ocorre na parede celular do intestino delgado. Fármacos de baixa massa molar são transportados por difusão passiva através da membrana celular. Partículas maiores, podem ser transportadas através da membrana celular por meio de mecanismos ativos, por endocitose ou por transporte paracelular – através dos espaços entre as células (Figura 17) (FLORENCE, ATTWOOD, 2011).
Figura 17: Tipo de transporte através da membrana intestinal (adaptado de FLORENCE, ATTWOOD, 2011)
Entretanto, ainda há muita discussão sobre o transporte de partículas maiores através da membrana celular. Para o objetivo desta Tese, apenas nos deteremos em apontar para as possíveis rotas de internalização das partículas carreadoras de fármacos, sem detalhar cada um desses processos.
Considera-se, também, que vírus, bactérias, alguns tipos de proteínas e partículas micrométricas são absorvidas por células especializadas (células M) do tecido linfoide ligadas ao trato gastrointestinal (GALT – Gut-Associated Lymphoid Tissue) (Figura 18) (FLORENCE, 1997; FLORENCE, ATTWOOD, 2011).
Figura 18: Possíveis rotas de internalização de partículas pela parede intestinal: 1) através de células M, 2); através de células epiteliais normais (enterócitos); 3) paracelular – entre as células. A) passagem de partículas através da região das placas de Peyer, desde o lúmen até a camada serosa do intestino. B) passagem de partículas nos vasos linfáticos mesentéricos. C) coleta de partículas em um linfonodo mesentérico (FLORENCE, 1997).
Uma das preocupações ao se administrar SLF para liberação no trato gastrointestinal é sua rápida eliminação, principalmente em casos de pacientes com inflamação no intestino, o que causa constantes eventos de diarreia. Para evitar a perda de SLF, o tamanho ideal de partícula, para que o tempo de residência no trato gastrointestinal
seja adequado é entre 4 e 15 m. Nessas dimensões as partículas ainda podem se depositar sob o muco intestinal, inclusive sob regiões inflamadas, e serem transportadas por fagocitose pelos macrófagos (COLLNOT, ALI, LEHR, 2012; CRCAREVSKA et al., 2008, 2009; BERTRAND, LEROUX, 2012; COLLET, MORETON, 2005; AULTON, 2005).
1.6. Mecanismos de liberação de fármacos em sistemas carreadores
SLF podem ser desenvolvidos a partir de vários materiais e cada um deles poderá conferir características diferentes como maior ou menor interação com as moléculas do fármaco e/ou com fluidos corpóreos, além de características estruturais como porosidade, heterogeneidade, rugosidade, hidrofilicidade etc. (LUNGAN, 2015).
Essas interações do fármaco com o SLF e com o meio e as características da matriz do SLF farão com que o fármaco seja liberado mediante diferentes mecanismos (COSTA, LOBO, 2001; SIEPMANN, PEPPAS, 1985, 2001; SIEPMANN, SIEPMANN, 2008; DASH et al., 2010).
O mecanismo mais comum é a liberação por difusão (WEISER, SALTZMAN, 2014), mas em SLF poliméricos, por exemplo, o fármaco também pode ser liberado por mecanismos como intumescimento, erosão e degradação da matriz polimérica (LANGER, 1990; SIEPMANN, SIEPMANN, 2008, 2012; FRENNING, 2011; PEPPAS, 2013).
1.6.1. Mecanismo de liberação por difusão
A difusão é o principal mecanismo responsável por remover o fármaco do interior de um SLF polimérico. Esse fenômeno ocorre porque as moléculas apresentam um movimento inerente, denominado random-walk (ATKINS, 2008; SIEPMANN, SIEPMANN, 2012), cuja velocidade é dada pela relação entre a temperatura e a massa (Equação 1):
𝑣 = √3𝑘𝐵𝑇
𝑚 Equação 1
onde kB é a constante de Boltzmann.
devido a isso, moléculas de um fármaco tende a escapar de regiões nas quais estão confinadas em um SLF, difundindo-se através da rede polimérica. A distância deste percurso
é representada pela equação de Einstein, que estima a distância média (d) percorrida por partículas a partir de localização inicial, durante o tempo (t) (Equação 2):
𝑑 = √2𝐷𝑡 Equação 2
onde D é o coeficiente de difusão da partícula.
A partir da Equação 2 obtemos D em função do tempo e da distância do percurso (d) (Equação 3):
𝐷 =
𝑑22𝑡
Equação 3
Esta equação evidencia que o coeficiente de difusão (D) está relacionado à velocidade da partícula no meio. Por esta razão, estudos cinéticos de liberação de um mesmo fármaco carregado em determinado SLF terão coeficientes de difusão diferentes para cada meio ao qual o SLF estiver exposto.
Em meios mais viscosos a mobilidade do fármaco será menor que em meios menos viscosos. Desta forma, o coeficiente de difusão também pode ser representado pela Equação 4 (Equação de Stokes-Einstein):
𝐷 =
𝑘𝐵𝑇6𝑎
Equação 4
onde, kB é a constante de Boltzmann, T a temperatura na escala absoluta, o coeficiente de viscosidade do meio e 𝑎 o raio da molécula.
A Equação 4 evidencia que partículas maiores difundem mais lentamente e que a difusão deve ser menor em líquidos com maior viscosidade (ATKINS, 2008; SIEPMANN, 2012).
Assim, pode-se concluir que uma partícula é capaz de se mover em uma matriz polimérica, com determinada velocidade e que o movimento será diferente para partículas com dimensões e tamanhos diferentes e em matrizes poliméricas com viscosidades diferentes (ATKINS, 2008; SIEPMANN, SIEPMANN, 2012).
1.6.1.1. Fluxo de partículas através de uma membrana
Partículas confinadas em um SLF estão em equilíbrio térmico, têm a mesma energia cinética, e aos poucos, difundem pela matriz (Figura 19) e, através de sua membrana externa, para o exterior.
.
Figura 19: Difusão simples em SLF matricial (Sigma Aldrich Biomaterials tutorial)
A quantidade de moléculas de fármaco que passa a fronteira de um SLF durante certo tempo é dada pelo fluxo de partículas liberadas. A medida desse fluxo permite que, estatisticamente, seja previsto o número de moléculas que, em média, serão liberadas do SLF durante certo tempo (ATKINS, 2008; SIEPMANN, 2012). Este fluxo de moléculas de um fármaco (Equação 5) pode ser representado pela relação entre o gradiente de concentração do fármaco entre os dois lados da membrana (1ª lei de Fick):
𝐽𝑖 = −𝐷𝑖𝑝𝜕𝐶𝑖
𝜕𝑥 Equação 5
onde 𝐽𝑖 é o fluxo das espécies i, 𝐷𝑖𝑝 é o coeficiente de difusão das espécies i em
um polímero P, 𝜕𝐶𝑖
𝜕𝑥 é o gradiente de concentração através da membrana.
O gradiente de concentração de fármaco (𝐶𝑖) entre os lados externo e interno do
SLF causa diferença de potencial químico (𝑖- Equações 6 e 7), responsável pela difusão, que
faz com que moléculas das regiões mais concentradas migrem para as menos concentradas, espontaneamente.
𝑖= 𝑖 0+ 𝑅𝑇ln𝐶𝑖 Equação 6
onde µo
𝑖 = 𝑖,𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟− 𝑖,𝑒𝑥𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 = 𝑅𝑇𝑙𝑛 [𝐶𝑖]𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟
[𝐶𝑖]𝑒𝑥𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 Equação 7
Esta diferença de potencial químico é a variação da energia livre de Gibbs molar (∆Gm) do sistema, por mol de fármaco, entre os dois lados do SLF(Equação 8) (CHAI, JIAO, YU, 2017).
∆𝐺𝑚 = 𝐺𝑚,𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟− 𝐺𝑚,𝑒𝑥𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 = 𝑅𝑇𝑙𝑛
[𝐶𝑖]𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟
[𝐶𝑖]𝑒𝑥𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 Equação 8
1.6.1.2. Modelos para representar a liberação de fármacos
Durante a liberação de fármacos a partir de SLF poliméricos podem ocorrer diversos fenômenos os quais, ao longo do processo, fazem com que o gradiente de concentração de fármaco entre o exterior e interior do SLF não se altere (estado estacionário), ou sofra grandes variações (estado não estacionário) ou, ainda, sofra alterações infinitesimais (estado pseudo-estacionário) (SIEPMANN, SIEPMANN, 2012).
A representação destes fenômenos por modelos matemáticos tem como objetivo principal prever o tempo de liberação do fármaco a partir de determinado SLF. Os modelos que consideram que o SLF está em estado estacionário ou pseudo-estacionário se baseiam na 1ª lei de Fick (Equação 5) e, portanto, a liberação do fármaco ocorre por meio de difusão. Já os modelos que consideram que o SLF está no estado não estacionário, se baseiam na 2ª lei de Fick (Equação 9) (LANGER, 1990; FICK, 1995; SIEPMANN, SIEPMANN, 2012).
𝜕𝐶𝑖 𝜕𝑡 = 𝐷𝑖𝑝 𝜕2𝐶 𝑖 𝜕𝑥2 Equação 9 onde 𝜕𝐶𝑖
𝜕𝑡 é a variação da concentração da espécie i no tempo, 𝑥 representa a
posição, 𝑡 o tempo de liberação e Dip é o coeficiente de difusão do ativo no polímero P.
A grande vantagem do uso de modelos é permitir redução do número de estudos experimentais necessários para o desenvolvimento dos SLF, diminuindo o tempo e o custo do desenvolvimento de uma formulação.
Em alguns dos modelos, a difusão fickiana é considerada como o principal mecanismo de liberação do fármaco, enquanto em outros, a morfologia e os processos de degradação são considerados (PEPPAS, NARASIMHAN, 2014). De acordo com Siepmann, Siepmann (2008) para aplicar um modelo a um conjunto de dados experimentais de liberação de fármacos, deve-se considerar a quantidade de excipientes, a técnica de preparação, as condições ambientais, a geometria, as dimensões e as características físico-químicas do SLF.
Nas últimas décadas, a modelagem matemática tem ganhado espaço, e diversos modelos vêm sendo elaborados para descrever a liberação de fármacos dos mais diferentes tipos de matrizes e SLF (FRENNING, 2011). Entre as técnicas de modelagem matemática utilizadas para descrever a liberação de fármacos, destacam-se as de caráter empírico, semi-empírico e realista mecanicista.
Os modelos de caráter empírico e semi-empírico descrevem o fenômeno e os parâmetros de suas equações não representam, necessariamente, parâmetros físicos, químicos ou biológicos. Devido a isso, possuem baixo poder preditivo. Os modelos realistas mecanicistas têm caráter experimental. São baseados em fenômenos como difusão, intumescimento, erosão, além da geometria do SLF. Desta forma, tais modelos representam parâmetros específicos do sistema e possuem melhor poder preditivo (SIEPMANN, SIEPMANN, 2008; PEPPAS, NARASIMHAN, 2014).
Considerando que os SLF poliméricos podem ser diferentes devido à sua constituição polimérica, à geometria, à dimensão e a maneira como transportam o fármaco (reservatórios ou matriciais), também serão diferentes quanto aos mecanismos de liberação. Assim, modelos diferentes são necessários para representá-los (LANGER, 1990; COSTA, LOBO, 2001; SIEPMANN, SIEPMANN, 2008, 2012). Além disso, um mesmo SLF pode liberar fármacos através de mais de um mecanismo. Isso ocorre porque durante a liberação por meio de determinado mecanismo inicial, podem ocorrer alterações das condições físico-químicas iniciais, tais como o gradiente local de concentração, o potencial químico, a energia livre de Gibbs e as condições fisiológicas no local de liberação. Isso pode levar a uma mudança no perfil de liberação, com aparecimento de um segundo estágio nesse perfil. Neste caso, cada estágio deverá ser representado por um modelo diferente. Assim, devido à complexidade desses fenômenos, a representação da liberação de fármacos em matrizes poliméricas por meio de modelos matemáticos é objeto de diversos estudos científicos, que buscam representar tais fenômenos de forma mais realista possível (COSTA, LOBO, 2001; WEISER, SALTZMAN, 2014).
