RNAi
Bases biológicas, aplicações
e metodologias
Guido Lenz
Basic Mechanism
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
Antisense
1. mRNA antisense
dsRNA > 30nt - tóxico em mamíferos
Sense
Anti-sense
Antisense x miRNA x RNAi no pubmed
1990 1995 2000 2005 2010 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Antisense RNAi miRNA Years P a pe rs (p e rc e nt of s iz e of c omuni ty )A short history of RNAi.
Discovery
Year
Authors
JournalDouble stranded RNA works better than anti-sense RNA
02/1998 Fire et al., Mello lab. Nature
Feeding C. elegans with bacteria expressing dsRNAs
10/1998 Timmons, Fire Nature
miRNAs 02/2000
10/2001 10/2001
Reinhart et al., in Ruvkun Lab. Lau et al., in Bartel Lab
Lee and Ambros.
Nature Science Nature Biotec RNAi in mammalian cell culture 05/2001 Elbashir et al. in Tuschl Lab Nature
RNAi delivered by plasmids (shRNA) 02/2002 04/2002 04/2002 05/2002 05/2002 05/2002
Paddinson et al., Hannon Lab.a Blummelkamp et al., Agami Lab Paddinson et al., Hannon Lab.b Miyagishi, Taira Lab.
Lee et al, Rossi Lab. Paul et al., Engelke Lab.
Genes Dev. Science PNAS Nature Biotec. Nature Biotec. Nature Biotec. Viral delivered shRNA 09/2002
10/2002
Blummelkamp et al., Agami Lab. Xia et al., Davidson Lab.
Cancer Cell Nature Biotec. shRNA induced animals
knockdowns
03/2003 04/2003
Rubinson et al., Van Parijs Lab. Stewart et al., Novina Lab.
Nature Gen. RNA
C. elegans genome screen using
RNAi
01/2003 01/2003
Kamath et al., Ahringer Lab. Ashrafi et al., Ruvkun Lab.
Nature Nature Human genome screen using RNAi 10/2003
03/2004
Kiger et al., Perrington Lab. Berns et al., Bernards Lab.
J. Biol. Nature Enzyme-mediated RNAi library
synthesis
02/2004 02/2004 04/2004
Sen et al., Blau Lab
Shirane et al., Hirose Lab. Luo et al., Lodish Lab
Nature Gen Nature Gen PNAS
Timmons, L., Fire, A., Specific interference by ingested dsRNA Nature, 395, 854, 1998.
Aplicações
• Silenciamento de um gene específico
• Triagem (screening) de vários genes de
subfamílias ou de todos os genes de um
organismo
Cancer Cell, 2, 243, 20\02.
Metodologias
1. siRNA Dupla fita de RNA (21bp) (fosforilada e
anelada);
2. Vetor que produz uma alça curta de RNA
(shRNA – short hairpin RNA)
2.1. Transfecção direta do plasmídeo
2.2. Transdução viral
Silenciamento de um gene específico
siRNA
AACCGGATCGTCTTAAGCATA GGCCTAGCAGAATTGCTATTT A A C C G G A T C G T C T T A A G C A T A G G C C T A G C A G A A T T G C T A T T T Reagente de transfecçãoVantagens:
• Rápido e fácil • Alta eficiência• Permite curva dose-resposta
• Pode ser usada em animais por injeção direta (mas neste caso a eficiência é menor e dependendo do tecido precisa RNAis modificados)
Desvantagens:
• Silenciamento é transitório
• Cada experimento requer uma nova transfecção • Não é possível analisar os efeitos a longo prazo do silenciamento (mais do que 7 dias)
• Limitado (compra-se siRNA para uma quantidade definida de transfecções)
• Toxicidade da transfecção • Mais offtargets
60pmoles por poço de 24 10nmoles ~ 160 poços...
Science, 296, 550, 2002.
e outros 4 papers no mesmo mes
Cloning
•
T (N19) TTCAAGAGA (N19’) TTTTTTC
5’T
N19
sTTCAAGAGA
N19
rcTTTTTTC
3’A
N19
cAAGTTCTCT
N19
rcAAAAAAGAGCT
5’T
GCGAGAAATACTTCGTAGA
TTCAAGAGA
TCTACGAAGTATTTCTCGC
TTTTTTC
3’A
CGCTCTTTATGAAGCATCT
AAGTTCTCT
AGATGCTTCATAAAGAGCG
AAAAAAGAGCT
XhoI overhang
- Annealed;
- Phosphorylated;
shRNA - transfecção
Reagente de transfecção
Vantagens:
• Rápido e fácil (mas menos que siRNA)
• Permite curva dose-resposta (mas menos que siRNA)
• Custo de fazer o plasmídeo – depois o reagente é virtualmente ilimitado
Desvantagens:
• Eficiência da transfecção (para a maioria das células não é muito alto) – a eficiência do
shRNA é bem menor do que siRNA. • Silenciamento é transitório
• Cada experimento requer uma nova transfecção
• Não é possível analisar os efeitos a longo prazo do silenciamento (mais do que 7 dias)
Genoma do HIV
Genoma do Vetor Lentiviral
Rev VSV-G Rev VSV-G Deleção Separa ção Gene x Genoma do HIV
1 4
3 2
shRNA – transdução viral
Célula Alvo Seleção Puromicina Crescimento HEK293T Reagente de transfecção
Viral transduction efficacy
Hek293
U2OS Phase contrast
Sub-clone into Lentivirus vector
XbaI / EcorI
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/mission/SHCLNG-NM_011640?lang=pt®ion=BR
shRNA – transdução viral
Vantagens:
• Silenciamento é estável
• Permite estudos de efeitos a longo prazo
• Alta eficiência (100% depois da seleção) • Pode ser usada em animais por injeção direta (pseudotipagem)
• Menos offtargets
Desvantagens:
• Demorado e trabalhoso
• Requer sala de cultura específica
• Adaptação celular (o que pode ser uma vantagem, dependendo da pergunta) • Muito difícil fazer curva dose resposta (só se diferentes sequências silenciarem de forma diferente) 1 4 3 2 HEK293T Célula Alvo Seleção Puromicina Crescimento Reagente de transfecção
Seleção e confirmação do silenciamento
Recombinant
Endogenous
Nek1 Blot
Hek293 were cloned by growing in low confluency and picking with trypsin
Osteosarcoma (U2OS) was sorted by FACS
Transfecção
Transdução viral
2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 siRNA miRNA shRNA Years P a pe rs (p e rc e nt of s iz e of c omuni ty )
Aplicações
• Silenciamento de um gene específico
• Triagem (screening) de vários genes de
subfamílias ou de todos os genes de um
organismo
Triagem (screening) de vários genes de subfamílias ou
de todos os genes de um organismo
.
.
.
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
Conheça o seu alvo e a sua sequência
2. siRNA (small ou (short) interfering)
3. shRNA (short hairpin)
1. Onde posicionar?
2. Qual sequencia pode, e qual não pode?
3. Tem como garantir silenciamento?
4. Tem como garantir a ausência de silenciamento de
outros alvos (off-targets)?
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
mRNA
2. siRNA (small ou (short) interfering)
3. shRNA (short hairpin)
1. Como começar?
Usando um serviço de desenho de siRNAs ou uma
biblioteca de shRNAs
• AA
(N19-21)
TT (preferentially);
• Not in the first and last 100bp of RNA;
• Preferentially towards the 3’ of mRNA;
• Plan rescue experiments
– Silent point mutations
– 3’UTR
Traduzido
3’UTR
5’UTR
Nature Genetics, 33, 396, 2003.
O que fazer quando não
funciona?
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
mRNA
2. siRNA (small ou (short) interfering)
3. shRNA (short hairpin)
Onde posicionar?
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
Não nos últimos 100nt
Não nos primeiros 100nt
miRNA
based
Amplification
RdRP é encontrada em
Plantas
Nematodeos
Insetos
Não foi encontrada em
vertebrados
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
siRNA/shRNA não conseguiu
entrar na célula
• Usar marcador de seleção (puromicina)
• Usar marcador fluorescente (GFP para
shRNA ou siRNA-FITC)
• Adicionar moléculas carreadoras ou
modificações dão mais estabilidade ao
Alterações químicas nos RNAis:
- Estabilidade:
- 2-O-Metil ribose;
- “Phosphorothioate backbone”;
- Farmacocinética:
- Colesterol no 3’ da fita senso - ligação à
albumina.
Apolipoproteína B
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Alvo não foi atingido
Mutações/deleções do alvo
Alvo não foi atingido
Mutações/deleções do alvo
•
Pubmed é um consenso de alguns (poucos)
organismos de uma determinada espécie (e o Watson
tem mais de 2 milhões de SNPs em relação ao
consenso)
–
Isto dá 1 pra 2000 – então se o gene que vocês querem
silenciar tem 2000 nt, ele provavelmente vai ter um SNP
•
Muitas anotações no pubmed são sequenciamento
único de um único organismo
•
Linhagens celulares derivadas de cânceres são
geneticamente mais instáveis e normalmente tem
muito mais mutações...
Mutação na posição 1
Não faz nenhuma diferença
Pareamento perfeito silencia
Mutação na posição 5 Silenciamento ausente!
1
Seed Sequence
21
Sense 5 -CAACAAGAT
GAAGAGCACCA
A-3 passanger strand
Anti-sense 3 -GTTGTTCTA
CTTCTCGTGGT
T-5 guide-strand
21 1
Importância do pareamento
(B) Endogenous SOD1 mRNA levels were determined by quantitative RT-PCR for each siRNA transfection. Shown is the mean standard deviation of three replicate determinations for each siRNA. Endogenous wild-type SOD1 mRNA is mismatched to the siRNAs used; taller bars imply greater discrimination against the mismatched target RNA.
• Minha experiência com alvos não conservados
Biblioteca contra genes de humanos e camundongos
CD73 – 3500nt
CD73 – ecto-5’Nucleotidase
Degrada AMP a adenosina
10 - 3
Luis F. Campesato, Patricia L. C. Lopez, Guido Lenz,
Mutações em uma base pode impedir silenciamento
Deleções de exons no alvo poderá impedir
silenciamento
Processamento (splicing) alternativo pode retirar o
mRNA processado a sequência alvo do siRNA
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
1.
Blast
2.
Usar outra sequência
3.
Sequencamento do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Estrutura do RNA alvo
http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi
•
Verificar se a acessibilidade ao sítio alvo determina a clivagem
mediada por RISC in vitro e in vivo
EC
50= concentração necessária para
reduzir pela metade a expressão de
luciferase.
~ 10.000 X > 100 nM
~ 4X = 48 pM ~ 11 pM
Correlação linear: ↑ estabilidade
da estr. secundária , ↓ em
eficiência de clivagem
Quantificação dos ensaios de
clivagem
in vitro
Estruturas secundárias bloqueiam o
acesso ao sítio alvo diretamente e
reduzem a eficiência da clivagem
mediada por RISC de maneira dependente
da estabilidade da estrutura secundária.
RISC não apresenta atividade de
desdobramento de RNA.
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
Mutações/deleções do alvo
2.
Estrutura do alvo
1.
Prever a estrutura do RNA alvo e se a sequência alvo estiver
numa região com uma estrutura com G menor do que
–20kcal/mol, usar outra sequência...
3.
Fita senso foi carregada no RISC
4.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
O silenciamento foi tóxico para a célula ou animal (saturação)
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
O silenciamento foi tóxico para a célula ou animal (saturação)
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Regra geral
RNA alvo: AUCUGGUCCUA
CCGC
UACAUAAUCAA
UAAU
UGGUACGUUGCUUG
siRNA 5
CCGC
UACAUAAUCAA
UAAU
AA
AA
GGCG
AUGUAUUAGUU
AUUA
5
RNA alvo: AUCUGGUCCUACCGC
UACA
UAAUCAAUAAU
UGGU
ACGUUGCUUG
siRNA 5
UACA
UAAUCAAUAAU
UGGU
AA
AA
AUGU
AUUAGUUAUUA
ACCA
5
Qual destes dois tem mais probabilidade de funcionar?
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
1.
Conteúdo de GC maior na 5’ do 3’ (do mRNA alvo)
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
O silenciamento foi tóxico para a célula ou animal (saturação)
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar
errado?
1. Alvo não foi atingido
1. Estrutura do alvo
2. Mutações/deleções do alvo
3. Fita senso foi carregada no RISC
4. Presença de um pseudogene inibidor
2. Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1. Off-targets e como evitá-los
2. Efeitos adversos independentes de sequência
3. Cinética
1. O silenciamento é muito transitório
Alvos Reais
Alvos Preditos (Smith-Waterman) 79, 84, 89% identity cutoff
• My off-target story
SHC002 Sigma MISSION™ Non-Target shRNA Control Vector
The MISSION Non-Target shRNA Control Vector is a lentivirus plasmid vector. The
vector contains an shRNA insert that
does not target human and mouse genes
, making
it useful as a negative control in experiments using the MISSION shRNA library clones.
The short-hairpin sequence contains
4 base pair mismatches to any known human or
mouse gene
. This allows one to examine the effect of transfection of a short-hairpin on
gene expression and interpret the knockdown effect seen with shRNA clones. Ampicillin
and puromycin antibiotic resistance genes provide selection in bacterial or mammalian
cells respectively. In addition, self-inactivating replication incompetent viral particles can
be produced in packaging cells (HEK293T) by co-transfection with compatible packaging
plasmids. The Non-Target shRNA Control Vector is provided as 10 μg of plasmid DNA in
Tris-EDTA (TE) buffer at a concentration of 500 ng/μl.
Não afetou a
atividade em
camundongos
e humanos
O “non-target” foi desenhado para
humano e camundongo – e em ratos?
0 20 40 60 80 100 120 140 160 C6 controle C6/Ci C6/C4 C6/C6 nm ol P i/ m in/ m g a a b a
Controle non-target 6 missmatches seq sem missmatch
Atividade da ecto-5’-NT/CD73 após
silenciamento por shRNA em linhagem de glioma C6 de rato.
Alinhamento da
sequência toda
Alinhamento só
da dos NTs 2-11
(do anti-sense)
1
Seed Sequence
21
Sense 5 -CAACAAGAT
GAAGAGCACCA
A-3
Anti-sense 3 -GTTGTTCTA
CTTCTCGTGGT
T-5
21 1
Importância do pareamento
Quantas bases precisam alinhar em sequência?
1
Seed Sequence
21
Sense 5 -CAACAAGAT
GAAGAGCACCA
A-3 passanger strand
Anti-sense 3 -GTTGTTCTA
CTTCTCGTGGT
T-5 guide-strand
21 1
Importância do pareamento
O que fazer em relação aos
Off-targets?
• Usar a dose mínima necessária
para silenciar o alvo
• Usar pelo menos duas sequências
• Experimentos de recuperação
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
Experimentos de recuperação (rescue)
Expressar o gene silenciado recombinante e ver se recupera o fenótipo
Mas como fazer para o RNAi não silenciar também o recombinante (
depreferência com um tag (Flag, HA) para ter certeza que o recombinante não está sendo silenciado)
1. Se a região alvo for no UTR - Transfectar a célula com um plasmideo contendo o
gene, sem o 3’UTR
2. Se a região alvo for na região traduzida - Transfectar a célula com um plasmideo contendo o gene um uma (ou mais) mutações silenciosas no alvo
Usar modificações em bases únicas que silenciem o
alvo, mas não tenham tantos off-targets
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1. siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula 2. Estrutura do alvo
3. Mutações/deleções do alvo
4. Fita senso foi carregada no RISC 5. Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1. Off-targets e como evitá-los
1. Blast – parcial...
2. Dose mínima necessária (ou shRNA) 3. Usar mais do que uma sequência 4. Experimentos de recuperação 5. Usar siRNA modificados
2. O silenciamento foi tóxico para a célula ou animal (saturação)
3.
Cinética
1. O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1. siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2. Estrutura do alvo
3. Mutações/deleções do alvo
4. Fita senso foi carregada no RISC
5. Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1. Off-targets e como evitá-los
2. Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1. O silenciamento é muito transitório
• 36 out of 49 shRNA sequences delivered by
AAV8 produces liver injury, with 23 ultimately
causing death
• Not restricted to a particular shRNA or target
• But dependent on size – 19mers are not toxic
(and silence), 23mers or bigger are toxic (and
don t silence as well)
• Morbidity was associates with the
downreagulation of liver-derived miRNAs
• Probably due to exportin 5 saturation
• Optimization of dose and sequence
• Does not happen with siRNAs, since they enter
the pathway after exportin 5
Tlr3 – Toll-like receptor 3
Long double-stranded viral RNA sensor dsRNAs maiores do que 21nt são agonistas
de Tlr3 e tem efeito anti-angiogênico TLR7 e 8 can also respond to duplex
Título V
iral
2OMe Mod siRNA Target but do not
stimulate immune system
Outro siRNA não Relacionado teve o mesmo efeito
Porque um experimento pode dar
errado?
1.
Alvo não foi atingido
1. siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2. Estrutura do alvo
3. Mutações/deleções do alvo
4. Fita senso foi carregada no RISC
5. Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1. Off-targets e como evitá-los
2. Efeito adverso independente de sequência
1.
Usar controles
2.
Ficar atento para efeitos que possam ser mediados por
Tlr, PKR etc.
3.
Cinética
1. O silenciamento é muito transitório
Porque um experimento pode dar errado?
1.
Alvo não foi atingido
1.
siRNA/shRNA não conseguiu entrar na célula
2.
Mutações/deleções do alvo
3.
Estrutura do alvo
4.
Fita senso foi carregada no RISC
5.
Presença de um pseudogene inibidor
2.
Efeitos adversos – outros alvos e toxicidade
1.
Off-targets e como evitá-los
2.
Efeito adverso independente de sequência
3.
Cinética
1.
O silenciamento é muito transitório
Transfecção
Transdução viral
