S
OLU@iES
DE SORBITOL-GELATINA E DE ÁCIDO
GLUTiiMICO-LACTOSE NA
ESTABILIZACAO DE PREP=@jES
REFERfiNCIA DO VÍRUS DO SARAMPO
Edda de Rizzo, l Ehabed Chrzktina Nunes Tenório, ’
Inácib Franca Mendes, l Framzkco Lzkvw Woe Fang, 1 Mide2 Marie Pra( ’
CéZ&z
Sayoko l¿%ata,l Come Miyaki,I Nema Mar& Frazatti GaZZina,l
Hiroho Nakabata TuchiyaI e Olga K2ue Akimural
IN
TRODU@O
A prodyão de preparasoes referência constitui procedimento usual em laboratórios de virologia, sendo sua aferisào feita frente a padrões interna- cionais de referencia, obtidos de labora- tórios internacionais de padróes biológi- cos da OrganizaSao Mundial da Saúde ou de órgáo por ela credenciado. Para melhor reprodutibilidade de resultados, o lote produzido deve permitir trabalhar durante período razoável de tempo e se; conservado em cond@es adequadas. E durante a estocagem, entretanto, que a qualidade do reagente, que é fun@o de sua estabilidade, viabilidade e potencia, é colocada à prova (l-2).A liofiliza@o é o mais impor- tante método usado para a desidratasáo de reagentes biológicos para diagnóstico, vírus, bactérias, soros e vacinas (2-4). Ao serem liofilizados, os microorganismos têm sua sobrevivência extremamente de-
’ Instituto Butancan, Setvico de Virologia, Se@o de Cuba de Tecidos e Controle. Enderqo: Av. Vital Bra- sil 1500, São Paulo, SP, CEP 05504, Brasil.
pendente da composi@o do meio estabi- lizador empregado, cuja furyáo é pro- tege-los de efeitos danosos que podem advir do congelamento, da super-seca- gem ou do aparecimento de grupamen- tos carbonila (5,). Dentre as substâncias mais empregadas com essa finalidade estáo as albuminas humana e bovina, ge- latina, sacarose, amido, lactose, sorbitol, lactobionato de sódio ou de potássio, Tris-ED’IX, hidrolisado de caseína e glu- tamato de sódio (4-6).
A inclusáo de um vírus padráo dos National Institutes of Health (NIH)
dos Estados Unidos da América ou de urna cepa referência nacional, titulada frente ao primeiro em titula@es de vírus do sarampo, é requisito recomendado
pela OMS (7) para estabelecer urna corre- 8 la@0 de potência com o v’rrus em teste. s
Os vírus do sarampo usados na produfáo de vacinas ou de prepa-
$ is rasoes consideradas como referencia sáo ä $ G Fg
preservados por meio da liofiliza@o e es- tocagem em baixas temperaturas, após estabiliza@0 (5).
Na presente investiga@0 tes- taram-se dois estabilizadores para o vírus do sarampo, cepa Schwarz: sorbitol-ge- latina e ácido glutâmico-lactose. Para tal, duas suspensões virais estabilizadas foram estocadas sob as seguintes con- disóes:
0 suspensáo ‘IA”: congelada a -70 “C
0 suspensáo ‘IB”: liofilizada e estocada a - 20 “C.
Durante 21 meses titularam- se as amostras de “A” e “B” quanto à potência, em paraleio com um virus pa- dráo. 0 objetivo foi comparar a estabili- dade proporcionada pelos dois estabiliza- dores às suspensões do vírus em estudo, nas condicóes de estocagem menciona- das, com vistas à sua utiliza@0 como pre- para@0 referencia - lote trabalho.
ATERIAIS
E MÉTODOS
Submeteram-se vírus vivos, atenuados, pertencentes à cepa Schwarz, provenientes de dois lotes de vacinas comerciais codificados como “A” e “B”, $
m a urna passagem em cultura de células Y primárias de embriáo de galinha (CEG),
i
CL para a obten@0 de volumes razoáveis de
3 suspensáo viral(500-600 ml), com título -
8
mínimo de 103~so DICT,,/ml (doses infec-
8
tantes de cultura de tecidos 50%). a, Obtiveram-se culturas primá-
.:: 8
rias de CEG por tripsinita@o de embriões
s
de galinha de nove dias, em agita@0 contínua (duas horas), utilizando solu@o B de tripsina (Difco Laboratories Inc. Fg
46
1: 250) a 0,25% em tampáo fosfato isento de cálcio e magnésio, pH 7,4, acrescido de 0,l % de dextrose. As célu- las dispersas obtidas foram ressuspensas em meio essencial mínimo de Eagle (Ea- gle MEM) (8) suplementado com 5 % de soro de vitela e 25 pg de neomicina/ml e semeadas em garrafas de cultura retangu- lares com 50 cm2 de área útil. Após a confluencia, as culturas foram inoculadas com os vírus “A” e “B” (3 000 a 10 000
DICT,, por garrafa) e , 7 2 horas após haver ocorrido o efeito citopatogênico (ECP), o
conteúdo foi colhido, homogeneizado, misturado aos meios estabilizadores nas propor@es indicadas e distribuido em frascos tipo penicilina (2 ml/ frasco) que foram recravados.
Para preservar o vírus durante a estocagem e / ou liofiliza@o , optou-se pelo uso de dois meios estabilizadores, cujas composifões sáo as seguintes:
0 Meio sorbitol-gelatina: obtido pela mistura volume por volume (v/v) de solu@o de sorbito1 a 50% e de gelatina a 25 % e juntado aS suspensões virais na propor@o de 1: 10;
0 Meio ácido glutâmico-lactose: KOH: 0,274 g; ácido glutâmico: 0,72 g; K*HPOd: 1,254 g; KH2P04: 0,52 g; lac- tose: 100 g; vermelho de fenol: 0,222 g;
água deioniaada: q.s.p. 1 litro. Ao vírus ele foi adicionado na propor@o de 1: 2. Frascos contendo 2 ml de vírus estabilizado foram estocados a frio e ao abrigo da luz durante 21 meses, sob as seguintes condigoes:
0 - 70 “C: vírus apenas esta- bilizado;
0 - 20 “C: vírus estabilizado e liofilizado (1).
A linhagem de células Vero, mantida em meio Eagle MEM acrescido de 10% de soro de vitela, foi utilizada nas titula@es da potência dos vírus do sarampo estabilizados e / ou liofilizados e mantidos em baixas temperaturas.
Realizaram-se no dia zero e nos meses 2, 3, 5, 7 ao 10, 12 ao 16 e 18
ao 2 1, titulafões das suspensões de virus “A” e “B” quando os frascos mantidos a
- 70 “C foram descongelados, e os fras- cos contendo o vírus do sarampo estabili- zado e liofilizado foram reconstituidos pela adi@o de 2 ml de água apirogênica. A partir desse ponto, o conteúdo dos frascos foi diluído em série, ao décimo, com meio Eagle MEM, sendo as dilui@es mantidas em banho de gelo e ao abrigo da luz (1). Inocularam-se com 0,5 ml de cada diluicáo (oito tubos por diluicáo) os tubos de culturas confluentes de células Vero, multiplicadas em Eagle MEM
(0,17 % de NaHC03) suplementado com
10% de soro de vitela e 25 pg de neomi- cina/ml, após terem seu sobrenadante decantado. Após urna hora a 36,5 “C para a adsor@o do vírus, cada tubo rece- beu 1,5 ml de Eagle MEM (O,22% de NaHCO,) acrescido de 2 % de soro de vi- tela e de 25 pg de neomicina/ml. A du- racáo dos testes foi de sete dias, com leituras de ECP nos dias 4 e 7 (9-10).
Todas as titulaSoes foram feitas em triplicata, sendo o resultado o título mé- dio obtido nas três dosagens de cada arriostra.
Os títulos foram calculados pelo método de Reed e Müench (ll) e expressos em DICTSo.
Em todas as titulacóes incluiu- se um vírus do sarampo-padráo, pre- parado no Instituto Butantan, a partir de amostra liofilizada obtida de laboratório credenciado pela OrganizaSáo Mundial da Saúde.
R
ESIJITADOS
E DISCUSSiiO
Nas tabelas 1 e 2 aparecem, respectivamente, os resultados das titu- la@es das amostras das suspensóes “A” e
“B” de virus do sarampo estabilizadas, com sorbitol-gelatina e com ácido glu- tâmico-lactose e náo estabilizadas (con- trole), realizadas periodicamente du- ranteaestocagemde21mesesa -70 “C. A figura 1 constitui a repre- sentagáo gráfica dos resultados constantes do quadro 1. Ela se refere à suspensáo “A” (congelada a - 70 “C após a estabi- lizayáo) e foi feita pelo sistema de retas de regressão, adotado por permitir anali- sar melhor o comportamento dos meios estabilizadores em questáo, com rela@o ao vírus do sarampo (12).
A figura 2 apresenta as retas traGadas com base nos resultados das titu- lasoes da potência das amostras da sus- pensáo de virus “B”, estabilizada e náo estabilizada (controle), submetidas à liofiliza@o e, posteriormente, estocadas a - 20 “C, pelo período previsto de
21 meses.
Os coeficientes de correlasáo (12) entre o título do vírus do sarampo, presente nas amostras das suspensões vi- rais “A” e “B”, e o tempo de estocagem decorrido apresentaram valores que cons- tam na tabela 3. Estes valores correspon- dem às retas que foram negativas tanto para a suspensáo Gral “A’ como para a
“B”, com a ocorrência de apenas urna reta com valor positivo para esta última.
Analisando a figura 1, veri- fica-se que as três retas sáo negativas, in- dicativo de que o vírus estocado a
- 70 “C, estabilizado ou nao, apresen- tou queda de título (l-18). Das duas so- lugoes estabilizadoras empregadas, a de sorbitol-gelatina (r = - 0,65) foi a que melhor protegeu a suspensáo Gral. Com- parando-se o coeficiente de correla@io da
E: .t? a:
Figura 1, Titulo do virus do sarampo, cepa Schwarz (leg,,, BlCT5a/ml), suspensáo “FV’ , segunde a estabizader e o tempo de estocagem a -70 %. Sáo Paulo, 1987
t I I , I . 13 5 7 a 9 io 12 13 14 15 16 ia is 20 21
Tempo OmW 0 S.em &abilkador (k - 0,73)
h Sat~~ol - gehtina (r= - OS) a Áhdo gluSmic0 - hclwi (r= -0,82)
Figura 2. T”dulo do virus do sarampo, cepa Schwan (log10 DICTSO/ml), suspensão “B”, liofilizada, segundo D estabikadw e o tempo de estecagem a -20 OC. São Paulo, 1987
5 * 2 3 5 7 9 10 12 13 14 15 16 16 19 20 21 Tempo V=4 0 5emeslabiliia&r[r=-0.46) A ,C&ivA-gelruina(r= +0,18) 0 Ácido gluramica - kctose [r= - 0,Ol)
TAEIEIA 3. Coeficientes de correla@o entre a ptincia do vírus do sarampo, cepa Schwarz, suspensóes “A” e “B”, e o tempo de estc$agem (21 meses). Sáo Paulo, 1987
Suspensão vira1 “A’ “6” (liofilizada) Temperatura de estocagem -70 “C -20 “C Estabilizador Ausente ~orbiol-gelatina Acido glutâmico-lactose Ausente Sorbiol-gelatina iicido gltimico-lactose Coeficiente de correla@o de Pearson (0 -0,73 -0,65 -0,82 -0,40 +0,18 -0,Ol
reta correspondente à estabiliza@0 com ácido glutâmico-lactose (r = - 0,82),
com o coeficiente obtido para a suspen- são de vírus controle que náo foi estabili- zada (r = - O,73), ambas estocadas a
- 70 “C, ficou demonstrado que a pre- sensa deste estabilizador foi mais preju- dicial para o vírus do sarampo do que a sua ausencia.
Das retas representando a sus- pensáo vira1 “B”, na figura 2, a corres- pondente 2 estabiliza@0 com sorbitol- gelatina apresentou coeficiente de correlafáo igual a + 0,18, indicativo de que urna preserva@0 mais eficiente do vírus ocorreu com ela do que com a so- lu@o de ácido glutâmico-lactose (r =
- O,Ol), que foi menos efetiva. A sus- pensáo controle demonstrou que a ausencia de estabilizador provocou queda de título mais acentuada (r = - 0,40) do que aquela verificada com o uso de qualquer dos estabilizadores estu- dados.
A atuacáo do ácido glu- tâmico-lactose na preserva@0 do virus do sarampo variou com a temperatura em que as suspensóes foram conservadas e também com o fato de serem ou náo liofílizadas. No primeiro caso, estabili- zando a suspensáo “A”, ele teve efeito danoso para o virus (r = - 0,82), en- quanto que no segundo, da suspensáo
“B”, que fora submetida à liofilizgáo, a reta correspondente apresentou r =
- 0,Ol , indicando que o vírus foi preser- vado pelo estabilizador. Do mesmo modo, a solucáo de sorbitol-gelatina também teve melhor efeito protetor para a suspensáo vira1 quando esta foi liofili- zada, pois quando foi apenas congelada a - 70 “C, seu desempenho caiu sen- sivelmente (r = - 0,65).
A pesquisa demonstrou que das solu@es em teste a de sorbitol-ge- latina foi a mais indicada para preservar suspensões do vírus do sarampo, cepa Schwarz, que váo ser submetidas à liofili- za@0 , pois , estocada por 21 meses a
- 20 “C, a suspensáo “B”, liofilizada, apresentou estabilidade satisfatória (r =
+ 0,18, figura 2), preenchendo melhor os requisitos para ser considerada e usada como prepara@0 referencia - lote tra-
balho, do que a suspensáo ‘ ‘A”, que foi apenas mantida congelada a - 70 “C
R
ESUMO
Os autores realizaram 0 es- tudo descrito neste artigo com o objetivo de avaliar o efeito protetor propor- cionado por duas solu@es estabilizadoras ao vírus do sarampo, cepa Schwarz - sorbitol-gelatina e ácido glutâmico-lac- tose -, submetido à liofiliza@o, com vistas à produ@o de preparasoes referên- cia - lotes trabalho. 0 efeito da estoca- gema -20 “Cou -70 “Csobreapo- tência de suspensões virais estabilizadas, liofilizadas ou náo, foi avaliado durante 2 1 meses tendo as amostras sido tituladas quanto à potencia em paralelo com um vírus padráo obtido de laboratório cre- denciado pela Organiza@0 Mundial da Saúde .Depois de comentar e com- parar as várias fases do exudo, tipos de células empregadas, meios estabiliza- dores, como foram estocadas as suspen- sões, a titula@o dos v’rrus estabilizados, etc., os autores concluem ter ficado de- monstrado que a solu@o de sorbitol-ge- latina proporcionou estabilidade mais satisfatória (r = - 0,Ol) 2s suspensões vi- rais que foram liofilizadas e mantidas a
- 20 ” C sendo, portanto, considerada como estabilizador eficiente na prepa- ra@o de vírus referência do sarampo - lotes trabalho, liofilizados. 0
A
GRADECIMEN’I’OS
Ao Dr. Murillo Adelino Soares, Diretor do Serviso de Virologia do Instituto Butantan, pela orienta@ técnica na realiza@0 das liofiliza@es. A Dra. Masaio Mizuno Ishizuka, Professora Adjunta da Faculdade de Medicina Ve- terinária e Zootecnia da Universidade de Sáo Paulo, pela orienta@0 na análise es- tatística dos resultados.R
EFERiNCIAS
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S
UMMARY
SORBITOLGELATIN AND
GLUTAMIC ACID-LACTOSE
SOLU’I’IONS AS SWTL~RS
OF REFERENCE MEASLZS
VIRUS PREPARATIONS
The study described in this arti- cle was carried out for the purpose of evaluat- ing the protective effects of two stabilizing solutions-sorbitol-gelatin and glutamic acid-lactose-on freeze-dried measles virus (Schwartz strain) with a view to the produc- tion of referente preparations in working lots. The effect of storage at - 20 “C and
- 70 “C on the potency of stabilized virus suspensions, whether or not freeze-dried, was evaluated over a period of 21 months; the samples were concurrently titered for potency
with a standard virus obtained from a labora- tory authorized by the World Health Organi- tation.
After comparing and comment- ing on the different phases of the study, tbe types of cells and stabilizing media used, how the suspensions were stored, the titering of the stabilized viruses, etc., the authors con- clude that they have demonstrated a more satisfactory stabilization (r = - 0.01) of freeze-dried virus suspensions stored at - 20 “C by sorbitol-gelatin, which is there- fore regarded as an effective stabilizer for the preparation of freeze-dried referente measles virus in working lots.
