AVALIAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE CMX DE Mycobacterium tuberculosis COMO EXAME DE TRIAGEM SOROLÓGICO DE TUBERCULOSE
ADRIELLE ZAGMIGNAN
ADRIELLE ZAGMIGNAN
AVALIAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE CMX DE Mycobacterium tuberculosis COMO EXAME DE TRIAGEM SOROLÓGICO DE TUBERCULOSE
SÃO LUIS
2016
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biologia
Parasitária da Universidade CEUMA para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária.
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Martins de Sousa
Zagmignan, Adrielle
Avaliação da proteína recombinante CMX de Mycobacterium Tuberculosis como exame de triagem sorológico de tuberculose: Diagnóstico sorológico para triagem de tuberculose. / Adrielle Zagmignan. - São Luís: UNICEUMA, 2016.
137 p.:il.
Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) – Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária. Universidade CEUMA, 2016. 1. 1. Tuberculose. 2. Soroepidemiologia. 3. Proteína recombinante. I. Sousa, Eduardo Martins de (Orientador). II. Monteiro, Andrea de Souza (Coordenadora). III. Título.
CDU: 576.8:615-002.5 Z19a
ADRIELLE ZAGMIGNAN
AVALIAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE CMX DE Mycobacterium tuberculosis COMO EXAME DE TRIAGEM SOROLÓGICO DE TUBERCULOSE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade CEUMA para obtenção do título de mestres. Aprovado em: ______/______/______ Banca Examinadora Prof. Dr.________________________________________________ Instituição:______________________________________________ Assinatura:_____________________________________________ Prof. Dr.________________________________________________ Instituição:______________________________________________ Assinatura:_____________________________________________ Prof. Dr.________________________________________________ Instituição:______________________________________________ Assinatura:______________________________________________
Aos meus pais Délcio João e Marlene por serem minha fortaleza.
Aos meus irmãos Tatiana e Evandro Pela força e incentivo.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus, meu Senhor e salvador, tudo que sou, tudo que tenho é proporcionado por ti.
Ao meu pai, Délcio João (in memoriam), a pessoa mais especial dessa vida que me ensinou valores e princípios, onde quer que o senhor esteja, sei que sempre caminha comigo e nunca deixou de confiar e acreditar em mim, e tudo na minha vida é dedicado a ti. Pai, meu amor eterno.
À minha mãe, Marlene, amor incondicional, meu alicerce, criatura divina que me concedeu a vida e sempre me deu o melhor. Mulher batalhadora e guerreira, sempre lutou por nossa família, aquela que renunciou seus sonhos para realizar os meus. Mãe, minha inspiração.
Aos meus irmãos Tatiana, Evandro e minha cunhada irmã Katiane, a minha tia Cecília e meu tio Sérgio pelo apoio, por acreditarem em mim e ajudarem na minha formação. Sempre os darei orgulho.
A minha tia Delir e tio Rogério, minha segunda família, meus pais de coração, sempre me deram amor, carinho, instrução e proteção. Nada que eu faça por vocês irá recompensar tudo que fazem por mim. Vocês são meu escudo.
A Nariel Vidal, pessoa especial que esteve comigo em muitos momentos difíceis e felizes, me ajudou a tomar decisões, sempre me
encorajou a buscar meus ideais e a nunca desistir. Sempre serei grata a você.
Ao meu mestre orientador, Eduardo Martins, por ter acreditado em mim, sempre me proporcionou ótimas oportunidades para meu amadurecimento e crescimento como pessoa e profissional, nos momentos difíceis me compreendeu e eu jamais posso decepcioná-lo, sempre serei grata. Obrigada por todo apoio e ensinamento.
Ao Prof° Dr° Lídio Gonçalves, pelas orientações, po r contribuir com meu crescimento e por todo suporte laboratorial. Muito obrigada.
A professora Drª Ana Paula Junqueira-Kipnis e ao professor Drº André Kipnis pelas orientações e oportunidade de pesquisa em seu laboratório, com certeza contribuiu muito para meu crescimento e formação. Meus sinceros agradecimentos.
A Drª Adeliane Castro que foi muito importante para construção dessa dissertação, obrigada por toda ajuda e apoio na realização dos experimentos laboratoriais, por me acolher em sua casa e contribuir com o conhecimento científico. Sempre serei grata a você.
Ao meu amigo todo especial, Matheus Alves, primeira pessoa que conheci no laboratório e que hoje é meu amigo, sempre determinado, feliz e disposto a ajudar. Nossos momentos juntos sempre se multiplicarão. Meu muito obrigada.
Ao meu colega Aruanã Joaquim, agradeço por toda ajuda, força e determinação nos experimentos.
A equipe do Hospital Getúlio Vargas, Drº Ariosvaldo Gaioso, as enfermeiras Conceição Santana, Rosilda Melônio e Socorro e aos demais membros da equipe por me ajudarem a recrutar os pacientes e pelos ensinamentos que me atribuíram durante esse percurso.
Aos meus amigos e colegas do mestrado em biologia parasitária Matheus, Aruanã, Mariana, Enzo, Ennio, João, Cristiane, Camila, Erica, Thiago Henrique e Domingos Magno, juntos compartilhamos conhecimentos, colaborações e alegrias. Que possamos sempre
carregar esse espírito de determinação. Somos a turma VII ☺.
Aos pesquisadores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) em Goiânia, Monalisa, Bruno, Danilo, Lázaro, Tatiana, Viviane, André, Rogério e Lucas por me receberem com todo carinho, pela ajuda e ensinamento científico. Muito obrigada.
Ao aluno de iniciação científica, Rodrigo Bennetton, que me acompanhou durante todo esse percurso, aprendemos muito juntos. Obrigada por tudo.
A nossa excepcional Erymônica por todo suporte emocional, técnico, pelas instruções e por seu excelente trabalho. Meu muito obrigada.
A Francenilde que desenvolve um excelente trabalho, obrigada por todo suporte e instrução.
A Margareth por me ajudar na coleta das amostras dos pacientes, por todo apoio e amizade.
Aos professores do mestrado, Elizabeth, Priscila, Maria Rosa, Marco Aurélio, Letícia, Marcos Grisotto, Andrea, Patrícia Figueredo, Ângela, Cristina, Sílvio, Valério por todo conhecimento científico que me foi passado, pelas instruções e direcionamento. Muito obrigada.
Enfim, agora se inicia uma nova jornada e carregarei uma bagagem muito mais completa que me foi passada por todos aqueles aqui mencionados. Mais uma vez obrigada.
“Lute com determinação, abrace a vida com paixão, perca com classe e vença com ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e a vida é muito para ser insignificante”
Zagmignan, A. Avaliação da proteína recombinante CMX de Mycobacterium tuberculosis como exame de triagem sorológico para tuberculose. [Dissertação]. São Luís. Universidade CEUMA;2016.
RESUMO
O desenvolvimento de novas ferramentas para o diagnóstico rápido e preciso de tuberculose (TB) pulmonar ativa têm sido considerada por vários países como uma estratégia para o controle da tuberculose da doença. Previamente foi demonstrado que a proteína Ag85C-MPT51-HspX (CMX) foi antigênica, quando avaliada a presença de anticorpos específicos IgM e IgG, discriminando pacientes com TB pulmonar ativa de controles saudáveis. O objetivo deste estudo foi avaliar pelo ensaio de ELISA os títulos de anticorpos IgM e IgG anti-CMX de indivíduos com TB pulmonar ativa e controle saudáveis em área endêmica para a TB. Pacientes com TB pulmonar ativa apresentaram títulos de anticorpos IgM anti-CMX (0.476 ± 0.263; p= 0.0001) mais elevados que os controles saudáveis (0.202 ± 0.125). Com uma Área Sob a Curva (AUC) de 0.856 obteve-se uma sensibilidade de 80,0% e especificidade de 74,58%. Pacientes com TB pulmonar ativa apresentaram títulos de
IgG anti-CMX (0.554 ± 0.450; p=0.0001) mais elevados que os
controles saudáveis (0.223 ± 0.077). Com uma AUC de 0.857 obteve-se uma sensibilidade de 80,0% e especificidade de 74,58%. Significativamente os títulos de IgM e IgG anti-CMX foram mais
elevado em pacientes com baciloscopia de escarro positiva e negativa que nos controles (p= 0,0001). Esses resultados sugerem que a proteína recombinante CMX poderá ser utilizada como um marcador para triagem sorológica para indivíduos com suspeita de TB pulmonar ativa.
Palavras-chave: Tuberculose. Sorologia. Proteína recombinante. ELISA. Resposta humoral
Zagmignan, A. Avaliação da proteína recombinante CMX de Mycobacterium tuberculosis como exame de triagem sorológico para tuberculose. [Dissertação]. São Luís. Universidade CEUMA;2016.
ABSTRACT
The development of new tools for the rapid and accurate diagnosis of active pulmonary tuberculosis (TB) has been considered by many countries as a strategy to control tuberculosis. Previously, it was demonstrated that antigenic protein Ag85C-MPT51-HspX (CMX) induces specific IgM and IgG antibodies production discriminating patients with active pulmonary TB in healthy controls. The aim of this study was to apply the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique to titles of IgM and IgG anti-CMX in individuals with active pulmonary TB as well as to healthy controls in an endemic area for TB. Patients with active pulmonary TB had higher titers of anti-CMX IgM antibodies (OD = 0.476 ± 0.263; p = 0.0001) than the healthy controls (OD = 0.202 ± 0.125). With an area under the curve (AUC) of 0.856, a sensitivity of 74.58% and a specificity of 80.0% were obtained. Patients with active pulmonary TB had higher titers of anti-CMX IgG (OD = 0.554 ± 0.450; p = 0.0001) than the healthy controls (OD = 0.223 ± 0.077). With an AUC of 0.857, a sensitivity of 80.0% and a specificity of 74.58% were shown. Significantly, titles of anti-CMX IgM and IgG were higher in patients with positive and negative
sputum smears than in controls (p = 0.0001). These results suggest that recombinant protein CMX can be used as a serological marker for screening individuals suspected of having active pulmonary TB. Keywords: tuberculosis. serology. recombinant protein. ELISA. humoral response
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Perfil clínico e diagnóstico dos indivíduos utilizados no estudo. (A) Sinais e sintomas de TB indicados no momento do diagnóstico. (B) Frequência dos testes utilizados para o diagnóstico da tuberculose pulmonar ativa...57
Figura 2 Nível sérico de IgM em resposta à proteína de fusão CMX entre indivíduos com tuberculose ativa e os controles. (A) As linhas horizontais em cada grupo indicam o valor médio da densidade óptica (DO). As linhas em tracejado em cada gráfico indica o valor do ponto de corte, a qual foi determinada por análise da curva ROC (B). **** p = 0,0001, entre a diferença de absorbância entre os grupos foram determinadas pelo teste t. Pacientes: n = 150 e controles: n = 118...57
Figura 3 O nível sérico de IgG em resposta à proteína de fusão CMX entre indivíduos com tuberculose ativa e controle saudável. (A) As linhas horizontais em cada grupo indicam o valor médio da densidade óptica (DO). As linhas em tracejado em cada gráfico indica o valor do ponto de corte, a qual foi determinada por análise da curva ROC (B). **** p= 0,0001, entre a diferença de absorbância entre os grupos foram determinadas pelo teste t. Os ensaios foram realizados em duplicatas e o experimento repetido
duas vezes. Pacientes: n = 150 e controles saudáveis: n = 118...57
Figura 4 Associação dos títulos de IgM e IgG em resposta à proteína de fusão CMX com a baciloscopia entre indivíduos com tuberculose pulmonar ativa e controles saudáveis. Indivíduos com baciloscopia positiva (n=117) e indivíduos com baciloscopia negativa (n= 33) mostraram níveis séricos de IgG e IgM anti-CMX significativamente mais altos que os controles (n=118). **** p= 0,0001 entre a diferença de absorbância entre os grupos foram determinadas pelo ANOVA...57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características sócio epidemiológicas da população em estudo...58
Tabela 2 Acurácia do ensaio sorológico por ELISA para detecção de IgM e IgG anti-CMX...59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AUC Do inglês - Area Under the Curve
BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente
BCG Bacillus Calmette-Guérin
ELISA Do inglês - Enzyme-linked Immunosorbent Assay
HIV Do inglês - Human Immunodeficiency Virus
IFN-Ȗ Interferon gama
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IGRAs Do inglês- Interferon-Gamma Release Assays
Mtb Mycobacterium tuberculosis
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
OMS Organização Mundial da Saúde
PC Ponto de Corte
pH Potencial Hidrogeniônico
PPD Derivado Proteico Purificado
RIF Rifampicina
TB Tuberculose
TC Tomografia computadorizada
Sumário 1 INTRODUÇÃO ... 18 2 OBJETIVOS ... 26 2.1 Objetivo Geral ... 26 2.2 Objetivos Específicos ... 26 CAPÍTULO 1 ... 27 ANEXOS ... 28 REFERÊNCIAS ... 127
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa considerada um grave problema de saúde pública mundial (ALTINK, 2013). É uma doença que atinge principalmente os países em desenvolvimento, devido as condições de saúde e moradia serem precárias (GLAZIOU, SISMANIDIS, FLOYD et al., 2015).
Em 2014 foram estimados 9,6 milhões de casos novos de TB e 1,5 milhões de mortes por TB no mundo, sendo que 0,4 milhão era HIV positivos (WHO, 2015). O Brasil é um dos 22 países priorizados pela OMS que concentram 80% da carga mundial de TB e em 2014 teve uma incidência de 46 casos por cem mil habitantes. Esses indicadores colocam o Brasil na 16ª posição em relação ao número de casos (WHO, 2015). Apesar das estimativas mostrarem que um terço da população mundial entrou em contato com bacilo, cerca de 5 a 10% progridem para a infecção ativa (NORTH e JUNG, 2004; GLAZIOU, SISMANIDIS, FLOYD et al., 2015).
Os doentes com TB pulmonar ativa são as principais fontes de transmissão do bacilo (BRASIL, 2002). A infecção ocorre a partir da inalação de partículas de aerossóis contendo bacilos expelidos pela tosse, fala ou espirro de indivíduos com TB pulmonar ativa (SINGER-LESHINSKY, 2016). Indivíduos com TB latente são assintomáticos e não transmitem o bacilo (KNECHEL, 2009). No entanto, os bacilos podem persistir nos alvéolos pulmonares viáveis e por algum comprometimento do sistema imune a doença pode ser
reativada (RAMAKRISHNAN, 2012). Embora os pulmões sejam o local mais comum para o desenvolvimento da TB, a doença extrapulmonar ocorre em 20% dos casos, principalmente nos pacientes imunocomprometidos (KNECHEL, 2009).
Comumente o diagnóstico da TB ativa é baseado na suspeita clínica, por meio da manifestação de sinais e sintomas como: tosse acompanhada ou não de secreção presente por mais de três semanas, hemoptise (escarro sanguinolento), perda de peso, dispnéia, suores noturnos, febre, letargia e mal estar geral (BESEN, STAUB e SILVA, 2011; GOUGH e KAUFMAN, 2011).
O diagnóstico de TB em alguns países em desenvolvimento, como o Brasil, é realizado principalmente por meio da avaliação clínica, raio X de tórax, baciloscopia de escarro, cultura microbiológica e de outros testes, como Teste de Sensibilidade a Tuberculina (TST) (BRASIL, 2011).
A baciloscopia de escarro baseia-se na identificação do bacilo pelo método da coloração de Ziehl-Nielsen, em amostras de escarro de um indivíduo com suspeita de TB (MAIGA, ABAZA e BISHAI, 2012). Essa técnica é amplamente utilizada para o diagnóstico de TB pulmonar e está disponível em laboratórios no nível de atenção primária a saúde, além de ser um método rápido, simples e de baixo custo (RYU, 2015). É método específico para a detecção do bacilo, porém sua sensibilidade varia de 20-60%, sendo necessário mais de uma amostra para confirmação do diagnóstico, além de ser uma técnica pouco sensível para a detecção do bacilo em crianças e em
indivíduos HIV positivos (STEINGART, HENRY, NG et al., 2006; RYU, 2015), devido à baixa carga bacilar da infecção e a dificuldade de obtenção de amostras de escarro (PARSONS, SOMOSKOVI, GUTIERREZ et al., 2011; CUEVAS, BROWNING, BOSSUYT et al., 2012).
A cultura microbiológica é o teste padrão ouro para o diagnóstico de TB ativa, na qual detecta os bacilos em amostras de escarro (FLORES, STEINGART, DENDUKURI et al., 2011). É um método que possui elevada sensibilidade e especificidade em comparação a baciloscopia de escarro (BRASIL, 2011; MAIGA, ABAZA e BISHAI, 2012). No entanto, possui a desvantagem de precisar de um período de 2 a 6 semanas para obtenção dos resultados, pois os bacilos da TB possuem crescimento lento em meio de cultura (BRASIL, 2011; MAIGA, ABAZA e BISHAI, 2012).
O raio X do tórax é um exame complementar associado à baciloscopia para diagnóstico de TB (RYU, 2015). Pode ser usado no monitoramento do paciente no decorrer do tratamento e também na verificação de complicações pulmonares (DORMAN, 2010; RYU, 2015).
O TST é um método baseado na resposta imune celular para o diagnóstico de TB latente (LIENHARDT, FIELDING, HANE et al., 2010). É gerado uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia que acontece quando pessoas infectadas com Mtb estão expostas a componentes antigênicos presentes em filtrados de cultura da bactéria. Algumas desvantagens dessa técnica são: reação cruzada
com micobactérias ambientais e em pessoas vacinadas com a BCG (LIENHARDT, FIELDING, HANE et al., 2010; AGGERBECK, GIEMZA, JOSHI et al., 2013).
Outro teste diagnóstico utilizado para detecção da TB latente é o Ensaio de Liberação de Interferon-Gamma (IGRAs), que avalia
a produção de interferon-gama (IFN-Ȗ) pelas células T quando
estimuladas pelos antígenos ESAT-6 e CFP-10 de Mtb, ausentes nas cepas da vacina BCG e em outras micobactérias ambientais (CONNELL, TEBRUEGGE, RITZ et al., 2010). Por conseguinte, apresentam maior especificidade que o TST (SHAMS, WEIS, KLUCAR et al., 2005).
O Xpert MTB/RIF, um teste molecular que utiliza Reação em Cadeia da Polimerase para detecção do Mtb em amostras de escarro, e simultaneamente, as principais mutações em genes responsáveis pela resistência à rifampicina, fármaco utilizado no esquema básico para o tratamento de TB (MENZIES, PAI e COMSTOCK, 2007; CHANG, LU, WANG et al., 2012). No entanto, o uso do teste Xpert MTB/RIF para o diagnóstico da TB nos países em desenvolvimento, como a África, é limitado pelo alto custo (TORTOLI, RUSSO, PIERSIMONI et al., 2012; RYU, 2015). Em adição, a sensibilidade para a detecção do bacilo da TB em amostras extra-pulmonares é inferior a 50% (BODMER e STROHLE, 2012)
O desenvolvimento de um método sorológico para o diagnóstico da TB tem gerado interesse considerável, uma vez que
estes ensaios são simples, de baixo custo e fácil execução (ALTINK, 2013). Os testes sorológicos são baseados na detecção de anticorpos (principalmente IgG) presentes na circulação sanguínea contra antígenos específicos do Mtb. (FENG, XIU, CHEN et al., 2013; LAGRANGE, THANGARAJ, DAYAL et al., 2014). A sensibilidade e especificidade de testes sorológicos tem sido melhorada desde a década de 90, através da utilização de antígenos altamente purificados ou proteínas recombinantes do Mtb (BAUMANN, KAEMPFER, CHEGOU et al., 2014; LAGRANGE, THANGARAJ, DAYAL et al., 2014).
Assim, em relação à proteína recombinante utilizada nesta dissertação, foi demonstrado em estudo prévio a capacidade antigênica da proteína de fusão contendo epítopos imunodominantes Ag85C, MPT51 e HspX (CMX) de Mtb em induzir reposta imune humoral em camundongos, caracterizada por altos níveis de anticorpos específicos da classe IgG1 e IgG2a e também a capacidade imunogênica, caracterizada pelo aumento de linfócitos
TCD4+ IFN-Ȗ+ e TNF-Į+ específicos para a proteína de fusão CMX.
Também foi demonstrado que esta proteína foi antigênica quando testada a presença de anticorpos específicos da classe IgG e IgM contra esta proteína no soro de pacientes com TB pulmonar ativa discriminando controles saudáveis e pacientes com TB (DE SOUSA, DA COSTA, TRENTINI et al., 2012).
O complexo Ag85 é formado por três proteínas Ag85A (32kDa), Ag85B (30 kDa) e o Ag85C(32,5kDa) na qual compreende
o maior complexo proteico secretado pelo Mtb e tem um papel importante na fisiologia da bactéria (PHUNPAE, CHANWONG, TAYAPIWATANA et al., 2014). Essas proteínas possuem atividade micolil transferase responsáveis por converter micolalato de trealose em dimicolato de trealose também conhecido como fator corda, que são importantes para a síntese da parede celular e para sobrevivência dos bacilos (RINKE DE WIT, BEKELIE, OSLAND et al., 1993), possuem atividade antigênica e imunomodulatória interagindo com o sistema imune na fase precoce do processo infeccioso induzindo resposta imune mediada por células e humoral (RINKE DE WIT, BEKELIE, OSLAND et al., 1993; FAVROT, LAJINESS e RONNING, 2014). O antígeno Ag85C vem sendo amplamente estudado como um marcador sorológico para a TB por possuir forte atividade imunogênica (KASHYAP, SAHA, NAGDEV et al., 2010; WARRIER, TROPIS, WERNGREN et al., 2012).
O antígeno MPT51 é uma proteína de 27 kDa e possui 40% de homologia ao complexo Ag85, porém apresenta função biológica diferente, podendo ser encontrada no genoma do Mycobacterium avium, Mycobacterium leprae e Mycobacterium bovis BCG (ACHKAR, DONG, HOLZMAN et al., 2006; SILVA, DA SILVA, DO NASCIMENTO et al., 2009). É uma proteína que pertence à classe
das Įȕ hidrolases não catalíticas, possui função de ligação
fibronectina da matriz extracelular determinando sua ligação a célula hospedeira e potencializado sua virulência (WILSON, MAUGHAN, KREMER et al., 2004). Além disso, a proteína MPT51 é um
marcador sorológico para a TB sendo detectada na fase precoce da infecção em pacientes com tuberculose pulmonar, demonstrando ser reconhecida pela resposta imune humoral (AOSHI, NAGATA,
SUZUKI et al., 2008; MELO CARDOSO ALMEIDA,
VASCONCELOS, KIPNIS et al., 2008).
O antígeno HspX, proteína com peso molecular de 16 kDa codificada pelo gene hspX (435pb), é também conhecida como
proteína homóloga Į-critalina (DAVIDOW, KANAUJIA, SHI et al.,
2005). Produzida sob condições de hipóxia, esta proteína está em maior evidência na fase latente na infecção sendo assim reconhecida no soro da maioria de pacientes com infecção assintomática (DAVIDOW, KANAUJIA, SHI et al., 2005; DEMISSIE, LEYTEN, ABEBE et al., 2006). Estudos demonstram o papel dessa proteína na patogênese da TB, a qual é responsável pela manutenção do bacilo durante a TB latente através da estabilização de estruturas celulares (KENNAWAY, BENESCH, GOHLKE et al., 2005; FONTAN, ARIS, GHANNY et al., 2008).
Assim essas três proteínas de Mtb, expressas em fusão de epítopos imunodominantes, podem representar uma potencial ferramenta de auxílio no diagnóstico de TB. O desenvolvimento de um teste sorológico poderia trazer várias vantagens sobre os demais testes utilizados no diagnóstico da TB como: praticidade na utilização como teste de triagem pelos serviços de atendimento primário a saúde (VAN'T HOOG, COBELENS, VASSALL et al., 2013); detecção de TB em pacientes com baciloscopia negativa
(ZHANG, SU, ZHANG et al., 2013); selecionar pacientes com maior probabilidade de ter a TB confirmada pelo Xpert MTB/RIF, minimizando os custos efetivos no diagnóstico da TB para o serviço público de saúde (KIK, DENKINGER, JEFFERSON et al., 2015); facilidade na obtenção da amostra, principalmente em pacientes incapazes de produzir escarro, e ainda poderia ser utilizado na detecção de TB extrapulmonar (ZHANG, SU, ZHANG et al., 2013).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a proteína recombinante CMX de Mycobacterium tuberculosis como exame de triagem sorológico para tuberculose em áreas endêmicas.
2.2 Objetivos Específicos
Caracterizar o perfil sócio-epidemiológico dos pacientes com tuberculose pulmonar ativa;
Avaliar os níveis séricos de anticorpos IgM específicos para o antígeno CMX do Mtb em pacientes com tuberculose ativa e controles saudáveis;
Avaliar os níveis séricos de anticorpos IgG específicos para o antígeno CMX do Mtb em pacientes com tuberculose ativa e controles saudáveis.
Associar os níveis séricos de IgM e IgG específicos para o antígeno CMX do Mtb com a baciloscopia entre indivíduos com
Identificação de anticorpos específicos para proteína CMX como exame de triagem sorológica de tuberculose em áreas endêmicas
Resumo
O desenvolvimento de novas ferramentas para o diagnóstico rápido e preciso de tuberculose (TB) pulmonar ativa têm sido considerada por vários países como uma estratégia para o controle da doença. Previamente foi demonstrado que a proteína CMX foi antigênica, quando avaliada a presença de anticorpos específicos IgM e IgG, discriminando pacientes com TB pulmonar ativa de controles saudáveis. O objetivo deste estudo foi avaliar pelo ensaio de ELISA os títulos de anticorpos IgM e IgG anti-CMX de indivíduos com TB pulmonar ativa e controle saudáveis em área endêmica para a TB. Pacientes com TB pulmonar ativa apresentaram títulos de anticorpos IgM anti-CMX (0.476 ± 0.263; p= 0.0001) mais elevados que os controles saudáveis (0.202 ± 0.125). Com uma Área Sob a Curva (AUC) de 0.856 obteve-se uma sensibilidade de 74,58% e especificidade de 80,0%. Pacientes com TB pulmonar ativa
apresentaram títulos de IgG anti-CMX (0.554 ± 0.450; p=0.0001)
mais elevados que os controles saudáveis (0.223 ± 0.077). Com uma AUC de 0.857 obteve-se uma sensibilidade de 80,0% e especificidade de 74,58%. Significativamente os títulos de IgM e IgG anti-CMX foram mais elevados em pacientes com baciloscopia de escarro positiva e negativa que nos controles (p= 0,0001). Esses
resultados sugerem que a proteína recombinante CMX poderá ser utilizada como um marcador sorológico para triagem de indivíduos com suspeita de TB pulmonar ativa.
Introdução
A tuberculose (TB) é uma das principais causas de morbidade
e mortalidade por doenças infecciosas no mundo (1). Em 2014 foram estimados 9,6 milhões de casos novos de TB no mundo dos quais, houve 1,5 milhão de mortes pela infecção (2). Nesse mesmo ano, no Brasil, a incidência de TB foi de 44 casos por 100 000 habitantes, ocupando o 16º lugar entre os 22 países responsáveis por 80% dos casos de TB no mundo (2).
A epidemia de tuberculose associada à co-infecção com HIV constitui um fator de risco para o aumento da incidência da TB, principalmente nos países em desenvolvimento (3). Assim, os principais obstáculos para o controle global da TB são: o surgimento das cepas de Mtb multidroga-resistentes (MDR), bem como, extremamente resistentes (XDR) aos medicamentos utilizados no tratamento de TB (4), à ausência de métodos de diagnóstico precisos e acessíveis (5, 6), além da variação da proteção efetiva da vacinação com a BCG (7).
O diagnóstico rápido e eficaz para TB é uma estratégia importante para o controle da doença que é um problema de saúde pública (8, 9). Os principais testes utilizados para o diagnóstico de TB são a baciloscopia e o raio-X de tórax, especialmente nos países em desenvolvimento, como é o caso do Brasil (10). A baciloscopia é um método rápido, simples e de baixo custo disponível no nível de
atenção primária a saúde (5). Porém é um método que possui sensibilidade variável principalmente em indivíduos HIV positivos e crianças (5, 11), devido à baixa carga bacilar da infecção e a dificuldade de obtenção de amostras de escarro em crianças (12, 13). A cultura microbiológica é o método padrão ouro para o diagnóstico da TB, possui uma sensibilidade melhor que a baciloscopia, consegue detectar os bacilos em quantidade pequenas de amostras (13, 14). Porém possui a desvantagem de precisar de um período longo para aquisição dos resultados, pois a bactéria tem um tempo de crescimento lento de 4 a 8 semanas (5). O atraso no diagnóstico resulta em um maior período de transmissibilidade para a população (15).
Outros testes de diagnósticos vêm sendo utilizados, como o Interferon-Gamma Release Assays (IGRAs), desenvolvido para detectar a TB na fase latente, na qual avalia-se a produção de
interferon-gama (IFN-Ȗ) pelas células T quando estimuladas pelos
antígenos ESAT-6 e CFP-10 de Mtb (16). Este teste não apresenta reação cruzada com o bacilo Calmette-Guérin (BCG), possui sensibilidade e especificidade superior ao teste de sensibilidade a tuberculina (TST) (17). Contudo, este teste possui baixa especificidade em locais de alta incidência de TB na qual dificulta distinguir efetivamente TB ativa de TB latente e possui custos relativamente mais altos limitando sua utilização (18-20).
Uma abordagem diferente para melhorar o diagnóstico de tuberculose foi recentemente desenvolvida, o teste Xpert MTB/RIF,
um método molecular que detecta o DNA de Mtb em amostras de muco, bem como analisa as principais mutações em genes responsáveis pela resistência à rifampicina (21). Contudo, a sensibilidade para a detecção do bacilo da tuberculose em amostras extra-pulmonares é inferior a 50% (22), além do custo elevado ser uma barreira em locais onde a TB é endêmica, inviabilizando a realização do teste em todos os casos suspeitos de infecção (23, 24).
O desenvolvimento de um método sorológico para o diagnóstico da TB tem gerado grande interesse mundial, uma vez que estes ensaios são simples e de baixo custo (8). O desenvolvimento de um teste sorológico poderia trazer várias vantagens sobre os demais testes utilizados no diagnóstico da TB como: praticidade na utilização como teste de triagem pelos serviços de atendimento primário a saúde (25); detecção de TB em pacientes com baciloscopia negativa (1); seleção de pacientes com maior probabilidade de ter a TB confirmada pelo Xpert MTB/RIF, minimizando os custos efetivos no diagnóstico da TB para o serviço público (26); facilidade na obtenção da amostra, principalmente em pacientes incapazes de produzir escarro, podendo ainda ser utilizado na detecção de TB extrapulmonar (1).
Assim, pesquisas contínuas com novas proteínas do Mtb têm melhorado a eficácia desses testes sorológicos, tornando-se uma opção atrativa para seu uso como uma ferramenta diagnóstica (8, 27). A proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX (CMX) de Mtb, em
estudo prévio demonstrou ser imunogênica em camundongos,
levando a estimulação de células T CD4+ IFN-Ȗ+ e TNF-Į+
específicas e ainda foi antigênica quando testada a presença de anticorpos específicos da classe IgM e IgG, discriminando pacientes com TB pulmonar ativa de controles saudáveis (28). Com isso, o objetivo do nosso estudo foi avaliar a acurácia de um exame para a triagem sorológica utilizando a proteína CMX de Mycobacterium tuberculosis na detecção de tuberculose pulmonar em áreas endêmicas.
Material e métodos
Aspectos éticos
Este estudo foi conduzido de acordo com as normas para a pesquisa em seres humanos contidas na resolução 466/12 no Conselho Nacional de Saúde que segue a Declaração de Helsinki. A Comissão de Ética da UniCEUMA (CONEP - Comissão Nacional de Ética em Pesquisa) aprovou este trabalho Nº 467.169. Todos os participantes receberam informações sobre a finalidade e procedimentos do estudo e assinaram o termo de consentimento. Os menores de 18 anos de idade que participaram do estudo tiveram o
População de estudo
Este estudo incluiu 150 pacientes com TB pulmonar ativa, recrutados no Hospital Getúlio Vargas, referência para o diagnóstico e tratamento da tuberculose em São Luís – MA, no período de março 2014 a junho de 2015 que atenderam os seguintes critérios de inclusão: todos os pacientes foram diagnosticados como tuberculose pulmonar ativa e definida de acordo o Manual do Ministério da Saúde para o diagnóstico e tratamento de TB com radiografia sugestiva de TB, baciloscopia positiva ou negativa (escarro ou lavado broncoalveolar), cultura microbiológica e/ou GENEXpert MTB/RIF positivos (14).
Como controles, 118 voluntários foram selecionados aleatoriamente na comunidade que preencheram os critérios: que relataram não ter tido contato conhecido com indivíduos doentes com TB, sorologia negativa para HIV e sem doenças crônicas ou parasitárias. Ainda, foram excluídos os indivíduos em uso de medicamentos imunossupressores no período de 15 dias para anti-inflamatórios não esteroides e 6 meses para anti-anti-inflamatórios esteroides e antibióticos, trabalhadores da área de saúde, imigrantes, mulheres grávidas e aqueles que apresentassem alguma infecção do trato respiratório.
Coleta das amostras
Foram coletados 5 mL de sangue para obtenção do soro. Os soros foram separados por centrifugação a 3000 xg durante 15 min, e alíquotas de 50 µL de soro foram armazenadas a - 80ºC até a realização dos ensaios. Todas as amostras foram descongeladas apenas uma vez para a realização dos ensaios.
ELISA indireta para detecção de anticorpos IgG e IgM anti-CMX
Neste estudo, foi utilizado o antígeno proteico recombinante CMX de Mtb (28). Foi realizada a técnica de ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-CMX das classes IgM e IgG no soro de pacientes com doença ativa e controles saudáveis. Inicialmente
placas de poliestireno com 96 poços (Corning®) foram adsorvidas
com o antígeno CMX (10 ȝg/mL) diluído em Tampão
Carbonato-Bicarbonato 0.015 M, pH 9.8. Depois de incubadas por 18h na temperatura de 4 a 8°C. As placas foram bloqueadas utilizando o tampão carbonato-bicarbonato, leite desnatado 1%, por 2h a 37ºC. As amostras de soro foram diluídas (1:40) em tampão PBS, leite desnatado 0.06% e incubadas por 2h a 37ºC. Após a incubação, as placas foram lavadas seis vezes com PBS 0.05% de Tween 20 e
foram acrescentados 50 ȝL de anticorpos anti-IgM e anti-IgG
(IgG/IgM-HRP, Sigma-Aldrich®), nas concentrações 1:2.500 e
e incubado por 1h a 37°C. Após semelhante lavagem d as placas, foi adicionado solução de peroxidase substrato OPD 0,4 mg/mL, fosfato
citrato 0,05M com pH 5.0 (Sigma- Aldrich®,Saint Louis, USA) em 20
mL de água destilada. Em cada poço foram adicionados 50 ȝL da
solução de substrato e incubados por 15 minutos a temperatura ambiente ao abrigo da luz. Após esse período, foi adicionada a
solução de parada 50 ȝL /poço, composta por H2SO4 2N. A leitura
das amostras foi feita em leitor de microplacas a 492݅m. As
amostras foram testadas em duplicata e a média da absorbância foi expressa em densidade óptica (DO) ± desvio padrão. Controles negativos foram utilizados em todas as placas.
Análise Estatística
Toda análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPad Prisma 6. As leituras dos indivíduos foram comparadas por meio do test t de Student. Os ensaios foram considerados
significantes quando p0,05. O ponto de corte para IgG e IgM
anti-CMX de pacientes com tuberculose pulmonar ativa e controles foram examinadas por análise da curva ROC (Receiver Operator Characteristic). Calculou-se ainda, o valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN), sensibilidade e especificidade do ensaio. As diferenças de IgG e IgM anti-CMX de paciente BAAR positivo, BAAR negativo e controles saudáveis foram analisados por Kruskal-Wallis por teste de múltiplas comparações (ANOVA).
Resultados
Características sócio epidemiológicas dos indivíduos incluídos no estudo
As características sócios epidemiológicas dos indivíduos desse estudo podem ser observadas na tabela 1. Dos 150 pacientes com tuberculose pulmonar ativa, 62,6% (n=94) eram do gênero masculino. A média de idade dos indivíduos foram de 37,97 anos. Destes, 82% (n=123) foram vacinados com BCG; 78% (n=117) tiveram resultado de baciloscopia positivo e 100% (n=150) tiveram resultado do raio-X de tórax sugestivo de tuberculose pulmonar. Quanto ao exame de cultura, apenas 14,6% (n=22) foram positivos, 5,4% (n=8) tiveram resultado negativo e 80% (n=120) não realizaram.
Dos 118 indivíduos controles recrutados para a pesquisa, 37,8% eram do gênero masculino (n=41). A média de idade foi de 26,3 anos. Desses, 84,7% (n=100) foram vacinados com BCG.
Frequência dos sintomas clínicos e testes de diagnóstico dos indivíduos com TB pulmonar ativa do estudo
A análise dos sinais e sintomas clínicos demonstrou que a maioria dos indivíduos com TB pulmonar ativa apresentaram com maior frequência tosse (86%) e perda de peso (88%) e em menor proporção hemoptise (37%) (Fig 1A). Em adição, avaliou-se quais os testes eram utilizados para o diagnóstico da TB. O raio X de tórax (100%) e a baciloscopia de escarro (95%) foram os exames mais utilizados para o diagnóstico (Fig 1B), em contraste apenas 32% dos pacientes realizaram a tomografia computadorizada e 20% realizaram a cultura microbiológica.
Avaliação dos títulos de IgM e IgG anti-CMX de indivíduos com TB pulmonar ativa
Foram realizados os ensaios imunoenzimáticos com a proteína recombinante CMX em amostras de soro de pacientes com tuberculose pulmonar ativa e o grupo controle, a fim de se avaliar a resposta imune humoral através da detecção de anticorpos da classe IgM e IgG.
Na análise de anticorpos da classe IgM (Figura 2A), observou-se que os pacientes com tuberculoobservou-se pulmonar ativa apreobservou-sentaram títulos de anticorpos anti-CMX (DO= 0,476 ± 0,263) superiores aos controles saudáveis (DO= 0,202 ± 0,125; p= 0,0001). Para este
ensaio a área sob a curva (AUC) foi de 0,856. Baseado na AUC e adotando um ponto de corte de 0,244, obteve-se uma sensibilidade de 74,5% e especificidade 80,0% (Figura 2B).
Na análise de anticorpos da classe IgG (Figura 3A), observou-se que os pacientes com tuberculoobservou-se pulmonar ativa apreobservou-sentaram títulos de anticorpos anti-CMX (OD= 0,554 ± 0,450) superiores aos controles saudáveis (OD= 0,223 ± 0,077; p= 0,0001). Para este ensaio AUC foi de 0,857. Baseado na AUC e adotando um ponto de corte de 0,270 obteve-se uma sensibilidade de 80,0% e especificidade de 74,5% (Figura 3B).
Avaliação da acurácia do teste sorológico para a triagem de TB pulmonar ativa
Para avaliar a acurácia do teste sorológico utilizando a proteína CMX para a triagem de TB pulmonar ativa, foram calculados os valores preditivos (VP) a fim de predizer a extensão da ocorrência da TB na população em estudo. Também foi analisado o Valor Preditivo Positivo (VPP) para caracterizar a proporção de doentes entre os positivos no teste, e o Valor Preditivo Negativo (VPN) para caracterizar a proporção de indivíduos sadios.
Para IgM anti-CMX, o VPP foi de 80,0% e o VPN foi de 74,0%. Para IgG anti-CMX o VPP foi de 80,0% e O VPN foi de 74,0% (Tabela 2).
Associação entre o teste de baciloscopia e a resposta humoral de IgM e IgG anti-CMX
A associação dos títulos de anticorpos anti-CMX com o resultado da baciloscopia, demonstrou que indivíduos com baciloscopia de escarro positiva apresentaram títulos de IgM (DO= 0,457 ± 0,253; p= 0,0001) mais elevados que os controles saudáveis (DO= 0,202 ± 0,125; p=0,0001), assim, como os títulos de IgG (DO= 0,528 ± 0,416; p= 0,0001) mais elevados que os controle saudáveis (DO= 0,223 ± 0,077; p= 0,0001). Similarmente, indivíduos com baciloscopia negativa apresentaram títulos de IgM (DO=0,523 ± 0,292; p= 0,0001) mais elevados que os controles saudáveis (DO= 0,202 ± 0,125; p= 0,0001), e também IgG (DO=0,646 ± 0,546; p= 0,0001) mais elevados que os controles saudáveis (DO= 0,223 ± 0,077; p= 0,0001).
Discussão
M. tuberculosis, o agente causador da TB, é o patógeno responsável por um dos principais problemas de saúde em todo mundo. O diagnóstico e tratamento precoce são importantes para o controle da doença (29). Um teste sorológico utilizando antígenos proteicos de Mtb representa uma nova abordagem para o diagnóstico da infecção ativa ou latente (30-32). No entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para melhorar a acurácia do
diagnóstico sorológico utilizando antígenos purificados do Mtb, principalmente em indivíduos que apresentam baciloscopia de escarro e cultura microbiológica negativas (33, 34). Neste estudo, nós avaliamos a proteína recombinante formada pela fusão de epítopos imunodominantes das proteínas Ag85C, MPT51 com a proteína HspX (CMX) avaliando seu potencial para o sorodiagnóstico em indivíduos com TB pulmonar ativa. Eficientemente, a proteína CMX usada no teste de ELISA indireto demonstrou uma boa sensibilidade para triagem de indivíduos com TB pulmonar ativa.
O diagnóstico da TB continua sendo um grande problema em todo o mundo, especialmente nos países em desenvolvimento, onde o diagnóstico é realizado predominantemente pela baciloscopia de escarro e cultura microbiológica, devido ao baixo custo das técnicas (30, 35, 36). Entretanto, a baixa sensibilidade da baciloscopia (20 – 60 %) resulta em vários casos de TB não detectados, e a cultura microbiológica do escarro possui uma alta sensibilidade de (80 - 85%) e especificidade (98%), porém o resultado do diagnóstico é tardio devido ao tempo lento de crescimento bacteriano (30). A cultura microbiológica é considerada o método padrão ouro. No entanto, na prática clínica, alguns casos de TB são cultura de escarro negativos, o que significa que nem todos os casos podem ser diagnosticados por esse método (37). Dessa maneira, ambos os testes são insuficientes para o diagnóstico na prática clínica. No Brasil 86,7% dos casos de TB pulmonar são diagnosticados pela baciloscopia de escarro (14). Em nosso estudo, os testes mais
utilizados para o diagnóstico de TB foram basicamente: raio X de tórax e baciloscopia de escarro, que estão de acordo com os testes frequentemente realizados em áreas endêmicas (38). O Xpert
MTB/RIF também vem sendo utilizado nos países em
desenvolvimento para o diagnóstico de TB. Um estudo de meta-análise mostrou que o Xpert MTB/RIF apresenta uma sensibilidade (89%) e especificidade (99%) alta (39). Contudo, nos países em desenvolvimento esse teste tem seu uso limitado pelo alto custo, tornando-se assim não adequado para a triagem de casos de TB em áreas endêmicas (27).
Testes sorológicos utilizando antígenos purificados de Mtb são relativamente simples e de baixo custo, apropriados para um teste de diagnóstico e triagem, especialmente nos países em
desenvolvimento.Países endêmicos para a TB como a Índia e a
China já utilizam testes sorológicos como ferramenta no diagnóstico para TB (40-42). O sucesso para o desenvolvimento de um teste sorológico é identificar antígenos sensíveis capazes de servirem como um biomarcador biológico (43, 44). Em nosso estudo, foi avaliado a proteína CMX como um novo antígeno em teste de diagnóstico sorológico com uma sensibilidade (80%) melhor que o teste de baciloscopia de escarro, demonstrando seu potencial para aplicação clínica na triagem de casos suspeitos de TB. Apesar dos testes sorológicos em áreas endêmicas terem sua eficácia questionada em muitos estudos (11, 45, 46), a utilização de antígenos purificados e proteínas recombinantes de Mtb têm
melhorado a acurácia desses testes (47) e poderiam ser úteis na detecção casos de TB com baciloscopia de escarro e cultura negativas (40).
Vários estudos têm detectado anticorpos no soro de pacientes com TB pulmonar ativa contra diferentes antígenos de Mtb (46, 48, 49). Nesse estudo, a proteína CMX foi capaz de discriminar indivíduos com TB pulmonar ativa de controles saudáveis. O antígeno Ag85C, é fundamental para a síntese da parede celular do Mtb (50, 51), e devido seu potencial imunodominante tem sido apontando como um forte marcador sorológico para o diagnóstico de TB (52). Como demonstrado em um estudo realizado na Índia, crianças com TB pulmonar ativa apresentaram maiores níveis de anticorpos IgG anti-Ag85C, apresentando alta sensibilidade (89,7%) e especificidade (92%) do teste (53). Em adição, outro estudo demonstrou maior sensibilidade de testes sorológicos utilizando antígenos do complexo Ag85 (84,1%) quando comparados com os antígenos ESAT-6 (64,9%) e CFP-10 (66%) (54). O antígeno MPT51, é um marcador sorológico de fase precoce da infecção pelo Mtb (55). O estudo de Almeida e colaboradores (2008) mostrou níveis mais elevados de IgM anti-MPT51 entre os indivíduos com TB pulmonar ativa do que os controles saudáveis (55). Foi demonstrado que mais de 90% de indivíduos com co-infecção TB ativa e HIV assintomáticos, apresentaram anticorpos IgG e IgA anti-MPT51 (41). O antígeno HspX é produzido sob condições de hipóxia pelo Mtb, sendo mais produzida na fase latente da infecção (56, 57). Estudo
realizado na Índia, demonstrou que indivíduos com TB pulmonar ativa apresentaram níveis de IgG anti-HspX enquanto que os controles saudáveis não apresentaram anticorpos, evidenciando a especificidade do antígeno (42). Em outro estudo, a resposta imune humoral de IgM anti-HspX foi mais elevada em trabalhadores da saúde com TB recente que em controles saudáveis, e não foi observado diferença nos níveis de IgG anti-HspX, sugerindo um possível papel deste antígeno na identificação de infecção recente (48). A combinação dessas três proteínas imunodominantes realizada em estudo preliminar (28) e no presente estudo, demonstrou que o uso de proteínas de fusão aumenta a sensibilidade, especificidade e acurácia do ensaio sorológico.
Demkow e colaboradores (58) demonstraram que a TB crônica é positivamente associada aos altos níveis de IgG contra antígeno 38+16 kDa de Mtb comparados com casos de TB recentes (58). A combinação de antígenos de Mtb melhoram a acurácia dos testes sorológicos para TB (59), como demonstrado em nosso estudo. Em outro estudo, avaliando os níveis séricos de IgG utilizando combinações de antígenos 38F (38kDa-ESAT6-CPF10) e 64F (Mtb8.4-MPT64-TB16.3-Mtb8) e cada um desses antígenos separadamente, foi verificado maior sensibilidade e especificidade quando usado proteínas de fusão (60). Em adição, estudo avaliando a resposta humoral de IgG anti-Ag85B - Hsp16.3 mostrou resultados promissores com uma sensibilidade de 80% e especificidade de 86% ao discriminar indivíduos com TB pulmonar de controles saudáveis e
apresentou ainda uma sensibilidade de 84,78% e especificidade de 63,33% ao discriminar indivíduos com TB latente (40).
Em nosso estudo, indivíduos com TB pulmonar ativa apresentaram títulos mais elevados de IgM e IgG anti-CMX em relação aos controles saudáveis. Similarmente, na cidade de Goiânia-GO/Brasil, indivíduos com TB pulmonar ativa apresentam títulos de IgM e IgG anti-CMX mais elevados que os controles saudáveis. A análise da curva ROC mostrou a mesma sensibilidade nos ensaios realizados com indivíduos das cidades de Goiânia e São Luís (80%), entretanto, a especificidade do ensaio em São Luís (74,0%) foi maior que Goiânia (61,54%) para anticorpos IgM anti-CMX. A sensibilidade do ensaio foi maior em Goiânia (92,45%) que São Luís (80,0%), e a especificidade foi menor em Goiânia (71,79%) que São Luís (74,0%) para anticorpos IgG anti-CMX (28). Em ambos os estudos foi possível discriminar indivíduos com TB pulmonar ativa dos controles saudáveis com melhor performance de anticorpos da classe IgG. A diferença dos valores de sensibilidade e especificidade para o ensaio entre as cidades de São Luís e Goiânia podem ser explicadas pelas diferenças de densidade demográfica, condições climáticas, condições de saneamento básico e economia (61).
Em muitos estudos, a sensibilidade dos ensaios sorológicos é maior em indivíduos com baciloscopia positiva que em indivíduos com baciloscopia negativa (62-64). Isso provavelmente ocorre devido aos indivíduos com baciloscopia positiva apresentarem maior carga bacilar, maior nível de exposição ao bacilo e maior reposta
imune frente ao Mtb (65). Em contraste, em nosso estudo foi possível detectar significativa resposta IgM e IgG anti-CMX em indivíduos com TB pulmonar ativa que apresentavam baciloscopia negativa (p=0,0001). Similarmente, em outro estudo, indivíduos com TB que apresentavam baciloscopia negativa, mostraram forte resposta humoral contra a proteína Rv1168c de Mtb (66). Esses dados indicam que o antígeno testado pode facilitar o diagnóstico precoce de TB, particularmente em indivíduos com baciloscopia negativa ou naqueles incapazes de produzirem escarro, reforçando a eficiência do teste.
Em conclusão, o ensaio sorológico utilizando a proteína de fusão CMX foi capaz distinguir os indivíduos com tuberculose pulmonar ativa de indivíduos saudáveis, além de discriminar a infecção de TB naqueles pacientes em que a baciloscopia de escarro foi negativa, sugerindo que esse teste pode ser utilizado como ferramenta adicional para a triagem de TB em regiões endêmicas. No entanto, são necessários mais estudos em regiões com diferentes taxas de incidência de TB no Brasil e no mundo para verificar a eficiência do teste. Para assim ser implementada como suporte no diagnóstico precoce da infecção ou teste rápido para populações de alto risco.
Apoio financeiro
AZ recebeu uma bolsa de estudos da Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) – BM 01883/14.
Agradecimentos
Agradecemos a professora Drª Ana Paula Junqueira Kipnis, que gentilmente cedeu a proteína de fusão CMX construída no Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública do estado de Goiás, Brasil.
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