For Reference Use Only
Pathfinder
®
Chlamydia Culture
Confirmation System
30701
For the identification of Chlamydia in cell culture by
direct fluorescence.
For in vitro diagnostic use
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/
Léxico/Leksikon/Ordlista ... page 3 English ... page 5 Français ... page 15 Español... page 27 Deutsch ... page 39 Italiano ... page 51 Português ... page 63 Dansk... page 75 Svenska ... page 86 References/Bibliographie/Referencias/Literatur/ Bibliografia/Bibliografia/Referencer/Referenser ... page 97 0197
FOR REFERENCE USE ONLY: DO NOT USE in
place of package inserts provided with each test
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L e xico n/ Lex iqu e/G losar io /G lo ssar /D e fini z io n e d e i sim b o li/ Léxi co /L ek siko n/ Or d list a En g lis h F ran ça is Es p a ñ o l Deut s c h It a li a n o Po rt u g uê s Dans k Sv en s k a E u ro pean C o nfor m it y Co n fo rm it é aux nor m es eur o pé ennes Co n fo rm i-d a d e u rop e a C E -K o nfo r-mi tä tsken-nzei ch nung Co n fo r-mi tà e u ro -pe a Co n fo rm i-d a de c o m as norm as e u ro pe ia s Eur o pæ is k over ens-stem -mel s e Eur o pe is k över en s-stäm m e lse Us e b y Ut iliser avan t le Fech a de cad ucidad Ve rw e n d -bar bi s Ut ilizzar e en tr o i l Ut ilizar at é Ho ld b a r t il A n vä nd för e For In V it ro D iag no st ic Us e Disp o s it if mé di cal d e d iag n o st ic in vitr o Pa ra u s o di ag nós ti c o in vitr o In-v itr o -Dia g n o st i-kum Pe r u s o di a g n o s -ti c o in vit ro P a ra u tiliza-çã o no diag-n ó stico i n vitr o Me d -icin sk ud st yr til in vit ro -di ag nos ti k För i n v itr o -di agn o s ti k Ba tc h c o d e Co d e d u lo t C ó di g o de lo te Ch ar g e n -bez e ic h-nung Co d ice d e l lo tt o C ó di go do lo te Lot num-mer P a rt inum -mer M a nu factu rer Fa bri can t Fab ricant e Her s te ller F a bbr i-ca nte Fa b ri c a n te P rodu cent T illver kar eFor Reference Use Only
C o nsul t Instr u ctio ns for U s e Co n s u lt e r les in st ru ct io n s d ’u tilisat io n Co n s u lt e las in st ru c-cione s de uso Gebr auch -san- wei s ung bea c hten Co n s u l-ta re l e ist ru z io n i pe r l 'u s o C o nsul te a s inst ruçõ es d e u tilizaçã o Se bru g-sanvi s ni ng Se b ru k -sanvi s ni n-gen T e mper a tur e Li mi tat io n Lim it e s d e tem p ér atur e Lí mi te s de tem p er atur a Z u lä ssig e r Te m p e r-atur ber e ich Li m iti di te mpe r-at ura Li mi te de te mpe ratu ra Te m p e r-atur be-g ræ n snin g T e mper -atur begr än-sning X n . Har m fu l X n . No cif X n . No civo X n . Gesun d -heitss- chäd lich Xn . N o c iv o Xn . N o c iv o X n . S u n d -hed sskad elig Xn. H ä ls o s -kad lig t Au th o ri z e d R e pre s e nt a -ti ve i n th e E u ro pean C o mmu ni ty R e pr ésen-tan t ag réé d a n s la Co m -mu nauté Eu ro pé e n n e Re p re s e n -tant e aut o r-izado en la C o mu ni dad Eu ro pe a Bevo ll-m ä ch ti g ter in de r Eu ro pä is -chen Union Ma n d a -ta ri o au tor iz-z a to pe r l'Un io n e Eu ro pe a R e pre s e n -ta n te au to r-izad o n a Co m u -ni da d e Eu rop e ia R e præ s e n tant i det Eur o pæ is ke Fæ l-lesskab Au k to ri s e -rad r e pr e-sentan t i Eur o pe is k a geme ns kap en Mon o c lona l An ti bo d y A n ti co rps mo noclo n al A n ticuer po mo noclon al Mo nok -lo n a le r -An ti k ö rp e r A n ti co rpo mo n o cl o -na le A n ti co rpo M o no clonal Mo nok -lo n a lt an ti -sto f Mon o k -lo n a l a n ti k -ro pp E n g li s h F ra nç a is E s p a ñ o l De ut s c h Ita li a n o P o rtu g u ê s Da ns k S ve ns k aFor Reference Use Only
INTENDED USEThe Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation Assay is a direct
fluores-cent procedure for the identification of chlamydia in cell culture.
SUMMARY AND EXPLANATION
Chlamydia organisms are the suspected causative agents in a wide variety of health problems. Two species of Chlamydia have been identified:
Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci. Chlamydia psittaci mainly
infects birds, however humans can develop diseases such as pneumonia or a generalized systemic infection due to exposure to infected species.
Chlamydia trachomatis generally infects only humans. The clinical
syn-dromes most often associated with Chlamydia trachomatis include inclu-sion conjunctivitis; trachoma; urethritis, cervicitis and other urogenital disorders; and lymphogranuloma venereum (LGV) (1). Transmission of
Chlamydia trachomatis may occur via sexual contact with an infected
per-son, passage of a fetus through an infected birth canal, or as in the case of trachoma in developing countries, primarily through non-sexual person-to-person contact (2).
Chlamydia trachomatis is currently recognized as the leading cause of
sexually transmitted disease. Unfortunately many infected individuals remain asymptomatic allowing the organism to go undetected (3). In women, undiagnosed genital infections may lead to permanent reproduc-tive damage due to complications such as salpingitis or pelvic inflamma-tory disease (4,5). Chlamydia trachomatis is also the causative agent of trachoma, the world’s leading cause of preventable blindness (6). Early diagnosis of these chlamydial infections can lead to timely treatment of the disease, thereby reducing the possibility of complications and the risk of further transmission.
Early methods of chlamydia isolation included growth in mice or chick embryo yolk sacs. As tissue culture methods improved, they replaced these more cumbersome techniques (7,8). The use of immunofluores-cence and monoclonal antibody technology to detect organisms in tissue culture has further increased the sensitivity of chlamydia culture and reduced the need to perform passage on all specimens (9).
The Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System uses a
fluores-cein-conjugated monoclonal antibody to identify chlamydial inclusions in inoculated cell cultures. This assay combines the specificity and reproduc-ibility of monoclonal antibodies with the speed and simplicity of a direct fluorescent test. For the detection of chlamydial organisms in culture, this test offers a simple, sensitive alternative to other culture stains.
PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
This test uses a fluorescein-conjugated monoclonal antibody to identify chlamydia in culture. The antibody reacts with the lipopolysaccharide por-tion of the elementary bodies and reticulate bodies within the inclusion.
For Reference Use Only
This assay will detect all known serovars of Chlamydia trachomatis,
Chlamydia psittaci, and Chlamydia pneumoniae. It will not differentiate
between species or serovars.
The monoclonal antibody reacts with chlamydial antigens, if present, in the cell culture. A washing step removes unbound antibody. When viewed under the fluorescent microscope, cell culture specimens infected with chlamydia show a characteristic apple-green fluorescence of inclusions against a red counterstained background.
KIT REAGENT
• For In Vitro Diagnostic Use. • Store the Antibody at 2-8ºC.
• The Monoclonal Antibody is stable to the expiration date stated on the label, when stored as recommended.
• Once open, the Monoclonal Antibody is stable to the expiration stated on the label, when stored as recommended.
1. Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody
The vial contains 4.2 mL of fluorescein-conjugated murine monoclonal antibody to chlamydia (genus-specific) with a protein stabilizer, Evans' blue counterstain, and 0.1% sodium azide. The liquid antibody is at the
working dilution. Diluting the antibody will reduce the sensitivity of the test.
Signs of possible deterioration are:
• Increased green background on control specimens.
• Change in expected reactivity with positive and negative controls.
WARNINGS AND PRECAUTIONS For Professional Use Only Reagents Containing Sodium Azide
The reagent contains 0.1% sodium azide. Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. On dis-posal of liquids, flush with a large volume of water to prevent azide build-up. For further information, please refer to the Manual Guide issued by the Centers for Disease Control (10).
Xn. Harmful R: 21/22
Harmful in contact with skin and if swallowed.
S: 24/25-28-36/37/39
Avoid contact with skin and eyes. After contact with skin, wash immediately with plenty of water. Wear suitable protec-tive clothing, gloves and eye/face protection.
For Reference Use Only
Patient SpecimensWhen collecting and processing patient specimens, handle them as potentially infectious according to universal precautions and good clinical laboratory practices, regardless of their origin, treatment, or prior certifica-tion. Use an appropriate disinfectant for decontaminacertifica-tion. Store and dis-pose of these materials and their containers in accordance with local regulations and guidelines.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Specimen collection is a critical step in the detection of chlamydia (11). Personnel collecting chlamydia specimens should be well-trained to mini-mize the possibility of inadequate specimens. A recommended procedure for collecting cervical and male urethral specimens follows.
CAUTION: Follow routine biosafety procedures when collecting and pro-cessing specimens for chlamydia testing. Consider specimens and all materials they contact as potentially infectious, and dispose of them in an appropriate manner. Do not pipette by mouth. Avoid generation of aero-sols. See Reference 12 for more information on the prevention of labora-tory infections.
Specimen Collection (cervical and male urethral specimens)
Materials Required
1. Large swab to clean exocervix of female prior to endocervical sam-pling.
2. Sterile Swabs
Use swabs which do not inhibit the growth of chlamydia or cells in culture.
3. Transport Medium
Use transport medium which does not inhibit the growth of chlamydia or cells in culture.
Procedure for Collection of Specimens 1. Urethral Specimens
NOTE: For an accurate diagnosis, the specimen must contain epi-thelial cells from the lining of the urethra. These cells are the most susceptible to infection by chlamydia. (The exudate is not an appropriate specimen for laboratory testing of chlamydia.) (13) Instruct the patient to refrain from urinating for 1 hour prior to sampling.
a. Insert small swab 2-4 cm into the urethra. (Rotate swab slightly to aid in insertion.)
b. Gently rotate swab using enough pressure to obtain epithelial cells. c. Allow swab to remain inserted for 1-2 seconds.
d. Withdraw swab, immediately place into transport medium and send to the laboratory. Store specimen at 2-8ºC for up to 24 hours. For longer storage, freeze at -70ºC until inoculated into culture.
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2. Cervical Specimens
NOTE: The columnar epithelial cells of the cervical mucosa are most susceptible to infection by the chlamydia (13). These colum-nar epithelial cells are located just inside the cervical opening. In some cases, the location of the transitional zone, where the stratified epithelium ends and the columnar epithelium begins, may vary (14). Adhering to the following procedure will ensure that specimens are adequate and appropriate.
a. Use a large swab to remove excess mucus and exudate from the exocervix. Dispose of swab.
b. Insert sterile swab into endocervical canal about 1 to 1-1/2 cm until most of the tip is inside the cervical opening.
c. Rotate swab for 5-10 seconds using enough pressure to obtain cells from all surfaces of the endocervical canal.
d. Withdraw swab avoiding contact with vaginal surfaces. Immedi-ately place into transport medium and send to the laboratory. Store specimen at 2-8ºC for up to 24 hours. For longer storage freeze at -70ºC until inoculated into cell culture.
Processing of Cell Culture Specimens
Materials Required 1. Cell culture line:
Use a cell culture line susceptible to chlamydia - e.g.: McCoy cells.
NOTE: The choice and condition of the cell culture line can influ-ence the sensitivity of chlamydia detection by the culture confir-mation technique.
2. Cell culture controls:
• Negative Control - cell culture inoculated with transport medium. • Positive Control - cell culture inoculated with a sample known to be
positive for chlamydia.
3. Other supplies and equipment for cell culture:
• Culture media, culture vials or microtiter plates, centrifuge, CO2
incubator, etc. Cell Culture Procedure
1. Following an established method, inoculate specimen onto appropriate cell monolayer.
2. Incubate monolayer for 48 hours.
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ASSAY PROCEDUREMaterials Provided
1. Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody Materials Required, But Not Provided
1. Methanol fixative - Histological grade or ACS 2. Deionized water
3. Pathfinder® Mounting Medium - Bio-Rad Cat. No. 30693
4. Microtiter plate cover and coverslips (5 mm round), or clean glass microscope slides, and forceps (depending on culture technique) 5. Sterile pipets
6. Humidified chamber
7. Fluorescent microscope - To view specimens stained with fluorescein isothiocyanate, use a filter system which provides an excitation wave-length of 480-490 nm and an emission wavewave-length of 510 nm or greater. The type and condition of microscope filters and light source can affect the intensity of the fluorescent reaction.
Procedure for Fluorescent Staining of Cell Culture A. Microtiter Plate Technique
1. Fixing the cell monolayer
a. Carefully aspirate culture medium from each well.
b. Add enough methanol to cover the monolayer in each well. Allow to fix for 10 minutes at room temperature (23ºC ± 3ºC). c. Aspirate the liquid from each well with a pipet, or invert and blot
the plate onto an absorbent paper to remove the methanol. Stain immediately.
If staining is not performed immediately, store the plates at -70ºC.
2. Staining the cell monolayer
NOTE: If cells are dry, moisten with deionized water before staining. (Invert the plate and blot to remove excess liquid.)
a. Add 1 drop (approximately 30 µL) of the Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody to each well. The antibody must completely cover the monolayer.
b. Cover the plate and incubate at room temperature (23ºC ± 3ºC) for 30 minutes. Protect the plate from intense light during incu-bation.
c. Uncover the plate and remove Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody from each well by aspirating the liquid with a pipet, or by inverting and blotting the plate onto an absor-bent paper. Rinse with deionized water to remove residual
anti-For Reference Use Only
body. Invert and blot plate onto absorbent paper to remove excess water.
d. Add 1 drop of mounting medium to each well and apply cover-slips.
NOTE: Use only Pathfinder® Mounting Medium - Bio-Rad
Cat. No. 30693
3. Invert the microtiter plate and examine the wells through a fluores-cent microscope with a long focal length objective. Look at entire monolayer using a minimum magnification of 100X. If inclusion appears questionable, confirm at a higher magnification. If necessary, store the microtiter plates in the dark at 4ºC and read them within 24 hours.
B. Shell Vial Technique
1. Fixing the cell monolayer
a. Carefully aspirate culture medium from each vial.
b. Add enough methanol to cover the monolayer in each vial. Allow to fix for 10 minutes at room temperature (23ºC ± 3ºC). c. Remove methanol by aspirating with a pipet.
If staining is not performed immediately, store the vials at -70ºC. 2. Staining the cell monolayer
a. Using forceps, carefully remove the coverslip with the mono-layer from the vial and place on an appropriately labeled, clean glass slide with the cells facing up. Stain immediately.
NOTE: If cells are dry, moisten with deionized water. (Remove excess liquid.)
b. Add 1 drop (approximately 30 µL) of the Pathfinder® Chlamydia
Culture Confirmation Monoclonal Antibody to the monolayer. The antibody must completely cover the monolayer. c. Incubate in a humidified chamber at room temperature
(23ºC ± 3ºC) for 30 minutes. Protect the coverslips from intense light during incubation.
d. Rinse coverslip with deionized water to remove residual anti-body. (Blot excess water.)
e. Place one drop of mounting medium on another appropriately labeled, clean glass slide. Apply the coverslip carefully to avoid trapping air bubbles, with the monolayer of cells facing down.
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3. Examine the slides through a fluorescent microscope. Scan entire monolayer using a minimum total magnification of 100X. If inclu-sions look questionable, confirm at a higher magnification. If necessary, store the slides in the dark at 4ºC and read them within 24 hours.
NOTE: Use only Pathfinder® Mounting Medium - Bio-Rad Cat.
No. 30693
QUALITY CONTROL
To verify the performance of the culture system, the fluorescent procedure, and the microscope, include positive and negative cell culture controls with each batch of patient cultures.
INTERPRETATION OF RESULTS
Read control specimens first. Cell culture controls aid in interpretation of results by showing positive and negative reactions on the cell line used for patient specimens. If controls exhibit proper reactivity, interpret patient specimens. Repeat test if controls do not react properly. Descriptions of positive and negative results follow.
Positive Results
A positive control or patient sample will exhibit characteristic fluorescence of cytoplasmic inclusions which will be visible at 100X magnification. The inclusion appears as a well-defined, apple-green, fluorescent mass, located in the cytoplasm of the infected cell near the nucleus. The pres-ence of one or more inclusions per culture is considered positive. Unin-fected cells and the background of inUnin-fected cells stain red due to counterstain. Non-specific staining can be distinguished by a yellow, white or dull-green color rather than the expected apple-green.
Negative Results
A negative sample will display no specific apple-green fluorescence. All cells stain red due to counterstain. Non-specific staining is minimal.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
1. If antibody dries on the monolayer, visualization of the inclusion may be difficult.
2. The performance of this test on patient specimens collected during antimicrobial therapy is unknown.
3. For the detection of chlamydia, proper specimen collection is critical. Personnel collecting specimens should be well trained to minimize inadequate and inappropriate specimens.
4. Use of the Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody on direct clinical specimens is not recommended. (Bio-Rad has a Chlamy-dia Direct Specimen Kit available - Cat. No. 30704.)
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EXPECTED VALUESExpected values may vary depending on the population tested. Bio-Rad evaluated 402 specimens from patients in high and low risk populations with the Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation Test and the
MicroTrak™ Culture Confirmation Test. Any discrepancies remaining after passage were resolved with Ortho Diagnostics' Chlamydia Cell Culture Assay. The overall agreement between the tests was 99.5% on initial cul-ture and 100.0% after passage. Only 1 specimen testing negative on initial culture was positive after passage. When compared to the competitor tests, both the sensitivity and specificity of this test after primary and pas-sage culture were 100.0%. (See Specific Performance Characteristics Section for details.)
SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Three independent laboratories evaluated the ability of the Pathfinder®
reagents to detect chlamydia in cell culture. The independent study sites included laboratories in the East, South and West. Syva's MicroTrak™ Culture Confirmation Test was used as the reference method and Ortho Diagnostics' kit was used to resolve any discrepancies after passage. The investigators collected one endocervical or urethral swab from each patient, and placed it into transport medium for inoculation into culture. Two of the investigators inoculated 5 McCoy cell monolayers for each patient. After incubating the cultures for 48 hours, they stained 2 of those monolay-ers, one with the Pathfinder® reagent and one with the MicroTrak™ reagent.
For those cultures with negative or discrepant results on the primary culture, the remaining 3 cultures were disrupted and passed onto another 3 mono-layers. After the next 48 hour incubation, the investigators again stained 2 of these monolayers, one with the Pathfinder® reagent and the other with the
MicroTrak™ reagent. When necessary the remaining passage culture was tested with Ortho's reagent to resolve any discrepancies. The third investi-gator inoculated 3 monolayers per patient and proceeded as above with the exception that, when necessary, the remaining initial monolayer was dis-rupted and passed onto another 3 monolayers.
Cultures with 1 or more inclusions present after primary incubation, or after disruption and passage, were considered positive.
Investigators collected specimens from 2 populations - high risk and low risk. The high risk population included males and females attending sexu-ally transmitted disease clinics who presented with urogenital symptoms or who were asymptomatic contacts of persons with a sexually transmit-ted disease. The overall prevalence of chlamydia in this population was 23.5%. The low risk population included females who were visiting clinics for routine obstetric or gynecological exams, or who met the following cri-teria:
1) over the age of 25; 2) no sign of purulent cervical discharge, cervical ectopy or cervical friability; and 3) no contact with a sexually transmitted
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disease syndrome or pathogen. The overall prevalence of chlamydia in this population was 10.0%
The performance characteristics of the Pathfinder® Culture Confirmation
Test compared to the competitor assays after primary and passage culture are detailed in Table 1.
Table 1 - Comparison of Pathfinder® Culture Confirmation Test to Competitor
Assays after Primary and Passage Culture
NOTE: TP = true positive, FP = false positive, FN = false negative, TN = true negative.
Table 2 summarizes the data comparing the Pathfinder® Culture
Confirma-tion Reagent to the MicroTrak™ Reagent after primary culture only.
Table 2 - Comparison of the Pathfinder® Culture Confirmation Reagent to the
MicroTrak™ Assay after Primary Culture Only
* Two specimens positive on primary culture by the Pathfinder® test and negative by the
MicroTrak™ test were positive by either the MicroTrak™ or Ortho method on passage. When considering these specimens true positives, the specificity and positive predictive value for the high risk, low risk, and cumulative populations become 100%.
High Risk Population
Low Risk Population
Cumlative (High and Low Risk Population) n 302 100 402 Sensitivity TP + FNTP 100.0% 7171 100.0% 1010 100.0% 8181 Specificity TN TN + FP 100.0% 231 231 100.0% 90 90 100.0% 321 321 Positive Predictive Value TP TP + FP 100.0% 71 71 100.0% 10 10 100.0% 81 81 Negative Predictive Value TN TN + FN 100.0% 231 231 100.0% 90 90 100.0% 321 321 High Risk Population Low Risk Population Cumlative (High and Low Risk Population) n 302 100 402 Sensitivity TP TP + FN 100.0% 69 69 100.0% 9 9 100.0% 78 78 Specificity TN + FPTN 99.6% 232*233 98.9% 90*91 99.4% 322*324 Positive Predictive Value TP TP + FP 98.6% 69* 70 90.0% 9* 10 97.5% 78* 80 Negative Predictive Value TN TN + FN 100.0% 232 232 100.0% 90 90 100.0% 322 322
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The performance characteristics for the high risk male and female popula-tions were comparable.
Table 3 details the numbers of positive results after primary culture and after primary culture and passage. The Pathfinder® reagent detected 2.5%
more positive results on primary culture than the MicroTrak™ reagent. Use of the Pathfinder® assay on a passage culture resulted in 1.2% more
posi-tive results than a primary culture alone.
Table 3 - Chlamydia Detection on Primary Culture and After Primary Passage Culture
CROSS-REACTIVITY
Bio-Rad tested the organisms in Table 4 for possible cross-reactivity in the Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation Assay. The organisms listed
were tested on fixed substrate slides and showed no cross-reactivity with the Pathfinder® Monoclonal Antibody.
Table 4 - Cross-Reactivity Studies with Potential Cell Culture Contaminants Primary Culture Passage Culture Positives by Pathfinder® 80 81
Positives by MicroTrak™ 78 80
Organism
Reactivity with the Chlamydia Culture Confirmation Antibody Herpes viruses
Cytomegalovirus Negative Herpes simplex Type I Negative Herpes simplex Type II Negative Varicella zoster Virus Negative Acholeplasma laidlawii Negative Mycoplasma arginini Negative Mycoplasma hominis Negative Mycoplasma hyorhinis Negative Mycoplasma orale Negative Mycoplasma salivarium Negative
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Pathfinder
®
Chlamydia Système
de Confirmation sur Culture 30701
Pour l’identification de Chlamydia dans les cultures
cellulaires par fluorescence directe.
DOMAINE D’APPLICATION
Le Pathfinder® Chlamydia système de confirmation sur culture est un test
d’identification de Chlamydia dans les cultures cellulaires par fluorescence directe.
RESUME ET EXPLICATION
Le Chlamydia est un organisme pouvant être soupçonné d’être l’agent causal d’un vaste éventail de problèmes de santé. Deux espèces de Chlamydia ont été identifiées : Chlamydia trachomatis et Chlamydia
psitt-aci. Cette dernière espèce de Chlamydia infecte principalement les
oiseaux, toutefois les humains peuvent développer des maladies telles que la pneumonie ou une infection généralisée suite à une exposition à une espèce aviaire infectée. Chlamydia trachomatis n’infecte générale-ment que l’homme. Les syndromes cliniques les plus fréquemgénérale-ment asso-ciés à une infection à Chlamydia trachomatis comprennent la conjonctivite à inclusions; le trachome; l’urétrite; la cervicite et d’autres troubles des voies uro-génitales; et le lymphogranulome vénérien (LGV) (1). Chlamydia
trachomatis peut se transmettre par contact sexuel avec une personne
infectée, par passage au fœtus lors de l’accouchement, ou dans le cas du trachome dans les pays en développement, principalement par contact non sexuel entre deux personnes (2).
Chlamydia trachomatis est actuellement reconnu comme étant la première
cause de maladie sexuellement transmissible. Malheureusement, de nom-breux individus infectés restent asymptomatiques, ce qui permet à l’organisme de passer inaperçu (3). Chez la femme, les infections génitales non diagnostiquées peuvent compromettre de façon définitive les capac-ités reproductrices en raison de complications telles que la salpingite ou la pelvipéritonite (4,5). Chlamydia trachomatis est également l’agent causal du trachome, la première cause de cécité dans le monde, une cécité qu’il est possible de prévenir (6). Le diagnostic précoce de ces infections à
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Chlamydia peut permettre de traiter la maladie à temps, ce qui réduit le risque de complications et de transmission future.
Les premières méthodes d’isolement du Chlamydia reposaient sur la cul-ture dans des vésicules vitellines d’embryons de souris ou de poule. Avec l’amélioration des méthodes de culture tissulaire, ces dernières ont rem-placé les techniques antérieures, moins commodes (7,8). L’utilisation de la technologie de l’immunofluorescence et des anticorps monoclonaux dans la détection des organismes dans les cultures de tissu a encore amélioré la sensibilité des tests du Chlamydia et réduit le besoin de réaliser un pas-sage sur tous les échantillons (9).
Le Système Pathfinder® fait appel à un anticorps monoclonal conjugué à
la fluorescéine pour identifier les inclusions chlamydiales dans des cellules en culture inoculées avec des échantillons potentiellement infectés. Ce test allie la spécificité et la reproductibilité des anticorps monoclonaux à la rapidité et la simplicité d’un test par fluorescence directe. Pour la détec-tion du Chlamydia dans les cultures de cellules, ce test offre une alterna-tive simple et sensible à d’autres méthodes de coloration.
PRINCIPES DE LA METHODE
Ce test utilise un anticorps monoclonal conjugué à la fluorescéine dans le but d’identifier le Chlamydia dans des cultures cellulaires. L’anticorps réagit avec le fragment lipopolysaccharidique des corps d’inclusion et des corps réticulés qui sont présents dans les inclusions. Ce test détecte tous les sérovars connus de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci et
Chlamy-dia pneumoniae. Il ne fait pas la différence entre les espèces ou les
séro-vars.
Le cas échéant, l’anticorps monoclonal réagit avec les antigènes chlamydi-ens qui sont présents dans la culture cellulaire. Une étape de rinçage per-met d’éliminer l’anticorps non lié. Visualisés au microscope à fluorescence, les échantillons de culture cellulaire infectés par le Chlamydia présentent une fluorescence vert pomme caractéristique des inclusions, sur un fond contre-coloré en rouge.
TROUSSE DE REACTIFS
• Pour usage diagnostique in vitro. • Conserver l’anticorps entre 2°C et 8°C.
• Quand il est stocké conformément aux recommandations, l’Anticorps Monoclonal est stable jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'éti-quette.
• Une fois ouvert, quand il est stocké conformément aux recommanda-tions, l’Anticorps Monoclonal est stable jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette.
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1. Anticorps Monoclonal pour confirmation de la présence de Chlamydia dans les cultures cellulaires
Le flacon contient 4,2 mL d’une solution d’anticorps monoclonal murin anti-Chlamydia (spécifique du genre) conjugué à la fluorescéine. La solution contient en outre un agent stabilisant les protéines, un contre-colorant Bleu Evans, et 0.1% d’azoture de sodium. La solution d’anti-corps est prête à l’emploi. Toute dilution supplémentaire réduirait la sensibilité du test.
Les signes d’une détérioration possible du produit sont les suivants : • Intensification du fond vert des échantillons témoins.
• Altération de la réactivité nominale des témoins positifs et négatifs.
MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS D’EMPLOI Réservé à un usage professionnel uniquement Réactifs contenant de l’azoture de sodium
Le réactif contient 0,1% d’azoture de sodium. L’azoture de sodium est susceptible de réagir avec le plomb et le cuivre des canalisations et former ainsi des azotures métalliques hautement explosifs. Lors de la mise au rebut des liquides, rincer abondamment à l’eau afin d’éviter l’accumula-tion d’azotures. Pour de plus amples informal’accumula-tions, se référer au Manuel édité par les CDC (Centers for Disease Control) (10).
Xn. Nocif R: 21/22
Nocif en cas de contact avec la peau et par ingestion.
S: 24/25-28-36/37/39
Éviter le contact avec la peau et les yeux. Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l'eau. Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage.
Échantillons patients
Lors du recueil et du traitement des échantillons patients, ces produits doivent être considérés comme potentiellement infectieux et donc manipulés en respectant les précautions d'usage et les bonnes pratiques du laboratoire clinique, quels que soient leur origine, leur traitement ou leur certification antérieur. Utiliser un désinfectant approprié pour la décontamination. Ces produits et leurs récipients doivent être stockés et mis au rebut conformément à la législation et aux directives en vigueur.
RECUEIL ET PREPARATION DES SPECIMENS
Le recueil des échantillons est une étape critique pour la détection du Chlamydia (11). Le personnel procédant au recueil des échantillons doit être pleinement qualifié afin de minimiser le risque de prélever des échan-tillons insuffisants ou inadéquats. Une procédure recommandée pour le prélèvement des échantillons du col utérin et de l’urètre chez l’homme est décrite ci-dessous.
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ATTENTION : Suivre les règles de sécurité biologique habituelles lors du recueil et du traitement des échantillons destinés à la détection de Chlamydia. Considérer les échantillons et tous les matériels avec lesquels ils entrent en contact comme potentiellement infectieux, et les mettre au rebut suivant les procédures établies. Ne pas pipeter à la bouche. Eviter la production d’aérosols. Consulter la référence 12 pour de plus amples informations sur la prévention des infections au laboratoire.
Recueil des échantillons (échantillons du col utérin et de l’urètre mas-culin)
Matériels requis
1. Tampon de grande taille destiné à nettoyer l’exocol avant le prélève-ment d’un échantillon endocervical.
2. Tampons stériles
Utiliser des tampons qui n’inhibent pas la prolifération du Chlamydia ou des cellules en culture.
3. Milieu de transport
Utiliser un milieu de culture qui n’inhibe pas la prolifération du Chlamydia ou des cellules en culture.
Recueil des échantillons : mode opératoire 1. Échantillons urétraux
REMARQUE : Pour un diagnostic précis, l’échantillon doit contenir des cellules épithéliales provenant de la muqueuse de l’urètre. Ces cellules sont les plus sensibles à l’infection par le Chlamydia. (L’exsudat ne constitue par un échantillon approprié pour le test du Chlamydia en laboratoire.) (13)
Donner pour instruction au patient de s’abstenir d’uriner pendant l’heure qui précède le prélèvement.
a. Insérer un petit tampon à l’intérieur de l’urètre, à une profondeur de 2 à 4 cm. (L’insertion sera facilitée en imprimant un léger mouve-ment de rotation au tampon.)
b. Imprimer un mouvement de rotation au tampon en exerçant une pression suffisante pour obtenir des cellules épithéliales. c. Laisser le tampon en place pendant 1 à 2 secondes.
d. Retirer le tampon, le placer immédiatement dans le milieu de trans-port et l’envoyer au laboratoire. L’échantillon peut être conservé à 2-8°C pendant 24 heures maximum. Pour une conservation plus longue, congeler à –70°C jusqu’à l’inoculation.
2. Échantillons cervicaux
REMARQUE : Les cellules épithéliales cylindriques de la muqueuse cervicale sont les plus sensibles à l’infection par le Chlamydia (13). Ces cellules cylindriques se situent juste à l’intérieur de l’orifice du col.
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La situation de la zone de transition, où se termine l‘épithélium stratifié et commence l’épithélium cylindrique, peut varier dans certains cas (14). Le respect de la procédure suivante garantira que les échantillons sont suffisants et appropriés.
a. A l’aide d’un tampon de grande taille, débarrasser l’exocol de l’excès de mucus et d’exsudat. Mettre le tampon au rebut. b. Insérer un tampon stérile dans le canal endocervical, sur une
pro-fondeur d’environ 1 à 1,5 cm jusqu’à ce que la majeure partie du tampon ait franchi l’orifice du col.
c. Imprimer une rotation au tampon pendant 5 à 10 secondes en exerçant suffisamment de pression pour obtenir des cellules prove-nant de toutes les faces du canal endocervical.
d. Retirer le tampon en évitant tout contact avec les muqueuses vagi-nales. Placer immédiatement dans le milieu de transport et envoyer au laboratoire. L’échantillon peut être conservé à 2-8°C pendant 24 heures maximum. Pour une conservation plus longue, congeler l’échantillon à –70°C jusqu’à son inoculation dans la culture cellu-laire.
Traitement des échantillons en vue de la culture cellulaire
Matériels requis 1. Lignée de cellules
Utiliser une lignée de cellules sensible au Chlamydia – par exemple, des cellules McCoy.
REMARQUE : Le choix et l’état des cellules de culture peuvent influ-encer la sensibilité de la technique de détection du Chlamydia par culture de confirmation.
2. Cultures cellulaires témoins
• Témoin négatif – cellules inoculées avec le milieu de transport seul • Témoin positif – cellules inoculées avec un échantillon positif pour
le Chlamydia.
3. Autres fournitures et équipements de culture cellulaire
• Milieux de culture, flacons, plaques de microtitration, centrifugeuse, incubateur à atmosphère contrôlée en CO2, etc.
Procédure de mise en culture
1. Suivant une méthode établie, inoculer l’échantillon sur une couche de cellules confluentes.
2. Incuber la couche monocellulaire pendant 48 heures.
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PROCEDURE DE TESTMatériels fournis
1. Anticorps monoclonal anti-Chlamydia Matériels requis mais non fournis
1. Fixateur : méthanol de qualité histologique ou analytique 2. Eau désionisée
3. Milieu de montage Pathfinder® – N° de catalogue Bio-Rad : 30693
4. Plaque de microtitration pour microscopie avec lamelles adaptées (diamètre 5 mm), ou lames de microscope en verre et pinces (selon la technique de culture utilisée)
5. Pipettes stériles 6. Chambre d’humidification
7. Microscope à fluorescence – Pour visualiser les échantillons colorés à l’isothiocyanate de fluorescéine, utiliser un système de filtres qui donne une longueur d’onde d’excitation de 480-490 nm et une longueur d’onde d’émission égale ou supérieure à 510 nm. Le type et l’état des filtres et de la source lumineuse peuvent affecter l’intensité de la réac-tion fluorescente.
Procédure de coloration fluorescente de la culture cellulaire A. Technique de culture sur plaque de microtitration
1. Fixation de la couche de cellules
a. Aspirer avec précaution le milieu de chaque puits.
b. Ajouter suffisamment de méthanol pour couvrir la couche mono-cellulaire dans chaque puits. Fixer pendant 10 minutes à température ambiante (23°C ± 3°C).
c. Aspirer le liquide de chaque puits à l’aide d’une pipette, ou ren-verser la plaque et l’éponger sur un papier absorbant afin d’éliminer le méthanol. Colorer immédiatement.
Si la coloration n’est pas réalisée immédiatement, conserver les plaques à –70°C.
2. Coloration de la couche monocellulaire
REMARQUE : Si les cellules sont sèches, humecter à l’eau désionisée avant la coloration. (Renverser la plaque et éponger afin d’éliminer l’excès de liquide.)
a. Déposer 1 goutte (environ 30 µL) d’anticorps monoclonal anti-Chlamydia dans chaque puits. La solution d’anticorps doit recouvrir la totalité de la couche monocellulaire.
b. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante (23°C ± 3°C) pendant 30 minutes. Protéger la plaque de la lumière intense durant l’incubation.
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c. Découvrir la plaque et éliminer l’anticorps monoclonal des puits en aspirant le liquide à la pipette, ou en renversant la plaque et en l’épongeant sur du papier absorbant. Rincer à l’eau désion-isée afin d’éliminer les anticorps résiduels. Renverser la plaque et éponger sur du papier absorbant afin d’éliminer l’excès d’eau.
d. Déposer 1 goutte de milieu de montage dans chaque puits et recouvrir d’une lamelle.
REMARQUE : Utiliser uniquement le milieu de montage Pathfinder®, N° de catalogue Bio-Rad 30693
3. Inverser la plaque de microtitration et examiner les puits au micro-scope à fluorescence à l’aide d’un objectif à longue focale. Exam-iner la totalité de la couche monocellulaire à un grossissement minimum de 100 X. Si la présence de corps d’inclusion est dou-teuse, confirmer à un grossissement plus fort.
Si nécessaire, les plaques de microtitration peuvent être con-servées à l’obscurité à 4°C. Elles doivent toutefois être examinées dans les 24 heures qui suivent.
B. Technique de culture en flacon
1. Fixation de la couche monocellulaire
a. Aspirer avec précaution le milieu de culture dans chaque flacon. b. Ajouter dans chaque flacon une quantité suffisante de méthanol pour couvrir la couche de cellules. Fixer pendant 10 minutes à température ambiante (23°C ± 3°C).
c. Eliminer le méthanol par aspiration à la pipette.
Si la coloration n’est pas réalisée immédiatement, conserver les flacons à –70°C.
2. Coloration de la couche monocellulaire
a. A l’aide de pinces, retirer avec précaution la lamelle portant la couche de cellules confluentes du flacon et la déposer sur une lame de verre propre, convenablement étiquetée, les cellules étant dirigées vers le haut. Colorer immédiatement.
REMARQUE : Si les cellules sont sèches, humecter avec de l’eau désionisée. (Eliminer ensuite l’excès de liquide.)
b. Déposer 1 goutte (environ 30 µL) de la solution d’anticorps monoclonal Pathfinder® sur la couche de cellules. La solution
d’anticorps doit recouvrir complètement la couche de cellules. c. Incuber dans une chambre d’humidification à température
ambiante (23°C ± 3°C) pendant 30 minutes. Protéger les lamelles des sources de lumière intense durant l’incubation. d. Rincer la lamelle à l’eau désionisée afin d’en éliminer les
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e. Placer une goutte de milieu de montage sur une lame de verre propre, convenablement étiquetée. Y déposer la lamelle avec précaution, en évitant de piéger des bulles d’air, la couche de cellules étant dirigée vers le bas.
3. Examiner la totalité de la couche monocellulaire à un grossissement minimum de 100 X. Si la présence de corps d’inclusion est dou-teuse, confirmer à un grossissement plus fort.
Si nécessaire, les plaques de microtitration peuvent être con-servées à l’obscurité à 4°C. Elles doivent toutefois être examinées dans les 24 heures maximum.
REMARQUE : Utiliser exclusivement le milieu de montage Pathfinder® de Bio-Rad N° de Catalogue 30693
CONTROLE DE QUALITE
Un témoin positif et un témoin négatif seront joints à chaque lot de cul-tures patients afin de vérifier la performance du système de culture, de la technique fluorescente et du microscope.
INTERPRETATION DES RESULTATS
Examiner d’abord les échantillons témoins. Les cultures cellulaires témoins facilitent l’interprétation des résultats en illustrant les réactions positive et négative sur la lignée de cellules utilisée pour les échantillons patients. Si la réactivité des témoins est conforme, passer à l’interpréta-tion des échantillons patients. En cas de réacl’interpréta-tion inappropriée des témoins, répéter le test. Les réactions positive et négative sont décrites de manière détaillée ci-dessous.
Résultats positifs
Un témoin ou un échantillon patient positif présentera des inclusions cyto-plasmiques fluorescentes caractéristiques qui seront visibles à un gross-issement de 100 X. L’inclusion apparaît comme une masse fluorescente bien définie, de couleur vert pomme, dans le cytoplasme de la cellule infectée, à proximité du noyau. La présence d’une ou de plusieurs inclu-sions dans une culture détermine un résultat positif. Les cellules non infectées et le fond des cellules infectées sont colorés en rouge par le contre-colorant. La coloration non spécifique se distingue par une teinte jaune, blanche ou verte terne plutôt que vert pomme.
Résultats négatifs
Un échantillon négatif ne présentera aucune fluorescence vert pomme spécifique. Toutes les cellules seront colorées en rouge par le contre-colo-rant. La coloration non spécifique est minime.
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RESTRICTIONS1. La visualisation des inclusions peut s’avérer difficile si l’anticorps sèche sur la couche monocellulaire.
2. La performance de ce test sur des échantillons prélevés chez des patients sous traitement antimicrobien est inconnue.
3. Pour détecter le Chlamydia, il est impératif que le prélèvement des échantillons soit effectué dans les règles. Le personnel chargé du recueil des échantillons doit être pleinement qualifié afin de minimiser le risque d’obtenir des échantillons insuffisants ou inappropriés. 4. L’utilisation de l’anticorps monoclonal anti-Chlamydia destiné à tester
les cultures de confirmation sur des échantillons cliniques directs est déconseillée. (Bio-Rad propose une trousse spécifiquement conçue pour la détection du Chlamydia dans les échantillons directs – N° de catalogue 30704.)
VALEURS PREVISIBLES
Les valeurs prévisibles peuvent varier selon la population testée. Bio-Rad a soumis 402 échantillons provenant de patients issus de populations à haut et à bas risque aux tests de confirmation par culture Pathfinder® et
MicroTrak™. Les discordances restant après un passage ont été tranchées en utilisant le test du Chlamydia sur culture cellulaire de Ortho Diagnostics. La concordance globale entre les deux tests était de 99,5% pour les cultures primaires et de 100,0% pour les cultures secondaires. Seul 1 échantillon ayant donné un résultat négatif pour la culture primaire s’est avéré positif après un passage. Par comparaison avec les tests con-currents, la sensibilité et la spécificité du test Pathfinder® étaient toutes
deux de 100,0% pour les cultures primaires et secondaires. (Se reporter à la section Caractéristiques de performance spécifiques pour de plus amples informations.)
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE SPECIFIQUES
Trois laboratoires indépendants ont évalué la capacité du réactif Path-finder® de détecter le Chlamydia dans les cultures cellulaires. Les trois
sites d’étude indépendants étaient situés l’un dans l’Est, l’autre dans le Sud et le troisième dans l’Ouest des Etats Unis. Le test de confirmation sur culture MicroTrak™ de Syva a été utilisé comme méthode de référence et la trousse commercialisée par Ortho Diagnostics a servi à résoudre les discordances éventuelles entre les résultats après un passage. Les investigateurs ont recueilli un frottis endocervical ou un frottis urétral chez chaque patient, placé le tampon dans le milieu de transport en vue de son inoculation dans une culture cellulaire. Deux des investigateurs ont inoculé 5 couches de cellules McCoy à confluence pour chaque patient. Après 48 heures d’incubation, deux des cultures ont été colorées, l’une avec le réactif Pathfinder®, l’autre avec le réactif MicroTrak™. Pour les
pri-For Reference Use Only
maires, les 3 cultures restantes ont été fractionnées et transférées sur 3 autres cultures de cellules. Après 48 heures d’incubation supplémentaires, les investigateurs ont à nouveau coloré 2 des cultures monocouches, l’une avec le réactif Pathfinder®, l’autre avec le réactif MicroTrak™. Le cas
échéant, la culture secondaire restante a été testée à l’aide du réactif de Ortho Diagnostics afin de résoudre les discordances éventuelles. Le troisième investigateur a inoculé 3 monocouches par patient et procédé comme ci-dessus, à l’exception du fait que, le cas échéant, la couche monocellulaire restante était fractionnée en trois nouvelles couches mono-cellulaires.
Les cultures comportant au moins 1 inclusion après l’incubation primaire ou après le fractionnement et le premier passage étaient considérées comme positives.
Les échantillons provenaient de deux populations distinctes, une popula-tion à haut risque et une populapopula-tion à bas risque. La populapopula-tion à haut ris-que se composait d’hommes et de femmes consultant dans des cliniris-ques spécialisées dans les maladies sexuellement transmissibles et présentant des symptômes uro-génitaux ou d’hommes et de femmes asymptoma-tiques en contact avec des patients porteurs d’une maladie sexuellement transmissible. La prévalence globale du Chlamydia dans cette population était de 23,5%. La population à bas risque se composait de femmes con-sultant en vue d’examens obstétriques ou gynécologiques de routine, ou qui répondaient aux critères suivants :
1) âge supérieur à 25 ans ; 2) aucun signe de pertes cervicales purulentes, d’ectopie cervicale ou de friabilité cervicale ; et 3) aucun contact avec un patient porteur d’un syndrome ou d’un pathogène associé à une maladie sexuellement transmissible. Dans cette population, la prévalence globale du Chlamydia était de 10,0%.
Les caractéristiques de performance du Test de Confirmation sur Culture Pathfinder® après culture primaire et secondaire sont détaillées dans le
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Tableau 1 - Comparaison du Test de Confirmation sur Culture Pathfinder® et du test
concurrent après culture primaire et secondaire
REMARQUE : VP = vrai positif, FP = faux positif, FN = faux négatif, VN = vrai négatif
Le Tableau 2 résume les données comparant le Réactif Pathfinder® et le
Réactif MicroTrak™sur les cultures primaires uniquement
Tableau 2 - Comparaison du Réactif Pathfinder® et du Réactif MicroTrak™ sur les
cultures primaires uniquement
* Deux échantillons positifs d’après le test Pathfinder® et négatifs d’après le test
MicroTrak™ après la culture primaire ont donné des résultats positifs après le premier passage aussi bien avec le test MicroTrak™ qu’avec la méthode Ortho Diagnostics. En considérant que ces échantillons sont des positifs vrais, la spécificité et la valeur
prédic-tive posiprédic-tive du test Pathfinder® atteignent 100% pour les populations à haut risque, à
bas risque et cumulée.
Les caractéristiques de performance étaient comparables pour les hom-mes et les femhom-mes de la population à haut risque.
Population à haut risque Population à bas risque Cumulée (Population à haut et à bas risque) n 302 100 402 Sensibilité VP VP + FN 100,0% 71 71 100,0% 10 10 100,0% 81 81 Spécificité VN + FPVN 100,0% 231231 100,0% 9090 100,0% 321321 Valeur prédictive positive VP VP + FP 100,0% 71 71 100,0% 10 10 100,0% 81 81 Valeur prédictive négative VN VN + FN 100,0% 231 231 100,0% 90 90 100,0% 321 321 Population à haut risque Population à bas risque Cumulée (Population à haut et à bas risque) n 302 100 402 Sensibilité VP + FNVP 100,0% 6969 100,0% 99 100,0% 7878 Spécificité VN VN + FP 99,6% 232* 233 98,9% 90* 91 99,4% 322* 324 Valeur prédictive positive VP VP + FP 98,6% 69* 70 90,0% 9* 10 97,5% 78* 80 Valeur prédictive négative VN VN + FN 100,0% 232 232 100,0% 90 90 100,0% 322 322
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Le Tableau 3 détaille les nombres de résultats positifs obtenus après les cultures primaires et secondaires. Le réactif Pathfinder® a permis de
détecter 2,5% de résultats positifs de plus que le réactif MicroTrak™ parmi les cultures primaires. L’utilisation du test Pathfinder® sur les
cul-tures secondaires a donné 1,2% de résultats positifs de plus que sur les cultures primaires.
Tableau 3 -Détection du Chlamydia dans des cultures primaires et secondaires
REACTIVITE CROISEE
Bio-Rad a testé la réactivité croisée des organismes repris dans le Tableau 4 avec le réactif Pathfinder®. Les organismes cités ont été testés sur des
lames à substrat fixé et n’ont manifesté aucune réactivité croisée vis-à-vis de l’anticorps monoclonal Pathfinder®.
Tableau 4 - Etudes de la réactivité croisée de contaminants potentiels des cultures cellulaires vis-à-vis de l’anticorps
Culture primaire Culture secondaire Positives avec Pathfinder® 80 81
Positives avec MicroTrak™ 78 80
Organisme
Réactivité croisée avec l’anticorps monoclonal
anti-Chlamydia Herpes viruses
Cytomegalovirus Négatif Herpes simplex Type I Négatif Herpes simplex Type II Négatif Varicella zoster Virus Négatif Acholeplasma laidlawii Négatif Mycoplasma arginini Négatif Mycoplasma hominis Négatif Mycoplasma hyorhinis Négatif Mycoplasma orale Négatif Mycoplasma salivarium Négatif
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Pathfinder
®
Chlamydia Sistema de
Confirmación en Cultivos
30701
Para la identificación de Chlamydia en los cultivos
celulares por fluorescencia directa.
CAMPO DE APLICACIÓN
El Pathfinder® Chlamydia Sistema de Confirmación en Cultivos es una
prueba de identificación de Chlamydia en los cultivos celulares por fluo-rescencia directa.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Chlamydia es un organismo sospechoso de ser el agente causal de una amplia gama de problemas de la salud. Se han identificado dos especies de Chlamydia: Chlamydia trachomatis y Chlamydia psittaci. Esta última especie de Chlamydia infecta principalmente a los pájaros, pero los humanos pueden desarrollar enfermedades como la neumonía o una infección generalizada tras su exposición a una especie aviar infectada. Generalmente Chlamydia trachomatis sólo infecta al hombre. Los sín-dromes clínicos que con mayor frecuencia se asocian a una infección por
Chlamydia trachomatis incluyen las conjuntivitis de inclusiones, el
tra-coma, la uretritis, la cervicitis y otras afecciones de las vías urogenitales, y el linfogranuloma venéreo (LGV) (1). Chlamydia trachomatis puede trans-mitirse por contacto sexual con una persona infectada, por paso al feto durante el parto, o, en el caso del tracoma en países en vías de desarrollo, principalmente por contacto no sexual entre dos personas (2). Actualmente, Chlamydia trachomatis se conoce por ser la primera causa de enfermedades de transmisión sexual. Desgraciadamente, muchos indi-viduos infectados son asintomáticos, lo que permite al organismo pasar desapercibido (3). En la mujer, las infecciones genitales sin diagnosticar pueden comprometer de forma definitiva sus capacidades reproductoras debido a ciertas complicaciones como la salpingitis o la pelviperitonitis (4,5). Chlamydia trachomatis también es el agente causal del tracoma, la primera causa de ceguera en el mundo, una ceguera que se puede preve-nir (6). El diagnóstico precoz de estas infecciones por Chlamydia
tra-For Reference Use Only
chomatis permite tratar la enfermedad a tiempo, lo que reduce el riesgo
de complicaciones y de una futura transmisión.
Los primeros métodos de aislamiento de Chlamydia se basaban en el cul-tivo en vesículas vitelinas de embriones de ratón o de pollo. Cuando mejo-raron los métodos de cultivos tisulares, éstos remplazaron las técnicas anteriores que eran menos cómodas (7,8). La utilización de la tecnología de la inmunofluorescencia y de los anticuerpos monoclonales en la detec-ción de organismos en los cultivos de tejidos mejoró aún más la sensibil-idad de las pruebas de Chlamydia y redujo la necessensibil-idad de efectuar un pasaje por todas las muestras (9).
El Sistema Pathfinder® utiliza un anticuerpo monoclonal conjugado con
fluoresceína para identificar las inclusiones de Chlamydias en las células en cultivo inoculadas con muestras potencialmente infectadas. En esta prueba se unen la especificidad y la reproducibilidad de los anticuerpos monoclonales con la velocidad y la sencillez de una prueba por fluores-cencia directa. En la detección de Chlamydia en los cultivos celulares, este test ofrece una alternativa sencilla y sensible a otros métodos de col-oración.
PRINCIPIOS DEL MÉTODO
Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal conjugado con fluoresceína para identificar la Chlamydia en los cultivos celulares. El anticuerpo reac-ciona con el fragmento lipopolisacárido de los cuerpos de inclusión y de los cuerpos reticulados que se encuentran en las inclusiones. Esta prueba detecta todos los serotipos conocidos de Chlamydia trachomatis,
Chlamydia psittaci, y Chlamydia pneumoniae. No diferencia entre especies
ó serotipos. Llegado el caso, el anticuerpo monoclonal reacciona con los antígenos de Chlamydia que se encuentran presentes en el cultivo celular. En la etapa de aclarado se elimina el anticuerpo no unido. Cuando se visualizan en el microscopio de fluorescencia, las muestras de cultivo celular infectadas por Chlamydia presentan una fluorescencia verde man-zana característica de los cuerpos de inclusión, sobre un fondo con una contratinción roja.
KIT DE REACTIVOS
• Para uso diagnóstico in vitro. • Conservar el anticuerpo entre 2°C y 8°C.
• El anticuerpo monoclonal está estable hasta la fecha de caducidad establecida en la etiqueta cuando el producto está almacenado según las recomendaciones.
• Una vez abierto, el anticuerpo monoclonal está estable hasta la fecha de caducidad establecida en la etiqueta cuando el producto está almacenado según las recomendaciones.
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1. Anticuerpo Monoclonal para confirmar la presencia de Chlamydia en los cultivos celulares.
El frasco contiene 4,2 mL de una solución de anticuerpos mono-clonales múridos anti-Chlamydia (específicos del género) conjugados con fluoresceína. La solución también contiene un agente estabilizante de las proteínas, una contratinción Azul de Evans y 0,1% de azida sódica. La solución de anticuerpos está lista para usar. Cualquier dilución suplementaria reducirá la sensibilidad de la prueba. Los signos de un posible deterioro del producto son los siguientes: • Una intensificación del fondo verde de las muestras control. • Una alteración de la reactividad nominal de los controles positivo y
negativo.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Reservado para uso profesional únicamente Reactivos que contienen azida sódica
El reactivo contiene 0,1% de azida sódica. La azida sódica puede reaccio-nar con las tuberías de plomo o cobre para formar azoturos metálicos altamente explosivos. Para evitar las acumulaciones de estos azoturos en las cañerías, enjuagar las tuberías con abundante agua mientras se elimi-nan estos líquidos por el desagüe. Para más información, por favor con-sulte el Manual editado por los CDC (Centers for Disease Control) (10).
Xn. Nocivo R: 21/22
Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.
S: 24/25-28-36/37/39
Evítese el contacto con los ojos y la piel. En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua. Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
Muestras de pacientes
Durante la obtención y el tratamiento de muestras procedentes de pacientes, suponga que son capaces de transmitir agentes infecciosos, no obstante su origen, tratamiento o autorización previa. Manipular tales muestras con precauciones universales, siguiendo prácticas adecuadas establecidas por trabajo en el laboratorio clínico. Emplear un desinfec-tante adecuado para realizar la descontaminación. El almacenaje y la eliminación de estas sustancias y los recipientes correspondientes deben realizarse según las normas y directrices locales.
OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
La toma de muestras es una etapa crítica en la detección de Chlamydia (11). El personal encargado de recoger las muestras deberá estar total-mente cualificado para minimizar el riego de obtener muestras insufi-cientes o inadecuadas. Posteriormente se describe el procedimiento
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recomendado para la toma de muestras del cuello uterino, y de la uretra en el hombre.
ATENCIÓN: Respetar las reglas de seguridad biológica habituales durante la obtención y el tratamiento de las muestras destinadas a la detección de Chlamydia. Todas las muestras y todo el material con el que entren en contacto deberán considerarse como potencialmente infeccioso, y se eliminarán según los procedimientos adecuados. No pipetear con la boca. Evitar la producción de vapores. Para más información sobre la preven-ción de infecciones en el laboratorio, consultar la referencia 12.
Obtención de las muestras (muestras del cuello uterino y de la uretra masculina)
Material necesario
1. Tampón grande para limpiar la exocervix antes de obtener una muestra endocervical.
2. Tampones estériles
Utilizar tampones que no inhiban la proliferación de Chlamydia o de las células en cultivo.
3. Medio de transporte
Utilizar un medio de cultivo que no inhiban la proliferación de Chlamydia o de las células en cultivo.
Obtención de las muestras: procedimiento 1. Muestras uretrales
ADVERTENCIA: Para un diagnóstico riguroso, la muestra debe contener células epiteliales procedentes de la mucosa de la ure-tra. Estas células son las más sensibles a la infección por Chlamy-dia. (El exudado no constituye una muestra adecuada para la prueba de Chlamydia en el laboratorio) (13).
Se indicará al paciente que debe abstenerse de orinar durante la hora anterior a la recogida de la muestra.
a. Insertar un tampón pequeño en el interior de la uretra, a una pro-fundidad de 2 a 4 cm. (La inserción será más fácil si se ejerce un ligero movimiento de rotación sobre el tampón).
b. Ejercer un movimiento de rotación sobre el tampón al mismo tiempo que se presiona lo suficiente para obtener células epite-liales.
c. Mantener el tampón en la uretra durante 1 a 2 segundos. d. Retirar el tampón, colocarlo inmediatamente en el medio de
trans-porte y enviarlo al laboratorio. La muestra puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 24 horas. Para un almacenamiento más largo, congelar a –70°C hasta la inoculación.
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2. Muestras cervicales
ADVERTENCIA: Las células epiteliales cilíndricas de la mucosa cervical son las más sensibles a la infección por Chlamydia (13). Estas células cilíndricas se localizan justo en el interior del orificio del cuello.
La situación de la zona de transición, donde termina el epitelio estratificado y comienza el epitelio cilíndrico, puede variar en cier-tos casos (14). Se debe respetar el siguiente procedimiento para garantizar que las muestras son suficientes y adecuadas.
a. Con un tampón grande, limpiar la exocervix eliminando el exceso de mucus y de exudado. Tirar el tampón.
b. Insertar un tampón estéril en el canal endocervical, a una profun-didad de aproximadamente 1 a 1,5 cm hasta que la mayor parte del tampón pase el orificio del cuello.
c. Ejercer un movimiento de rotación sobre el tampón durante 5 a 10 segundos al mismo tiempo que se presiona lo suficiente para obtener células procedentes de todas las caras del canal endocer-vical.
d. Retirar el tampón evitando su contacto con las mucosas vaginales. Colocarlo inmediatamente en el medio de transporte y enviarlo al laboratorio. La muestra puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 24 horas. Para un almacenamiento más largo, congelar a –70°C hasta su inoculación en el cultivo celular.
Tratamiento de las muestras para el cultivo celular
Material necesario 1. Línea de células
Utilizar una línea de células sensible a Chlamydia – por ejemplo, células McCoy.
ADVERTENCIA: La elección y el estado de las células de cultivo pueden influir en la sensibilidad de la técnica de detección de Chlamydia por cultivo de confirmación.
2. Cultivos celulares control
• Control negativo – células inoculadas con el medio de transporte sólo.
• Control positivo – células inoculadas con una muestra positiva para Chlamydia.
3. Otros aparatos y equipos para el cultivo celular
• Medios de cultivo, frascos, placas de microtitulación, centrifuga-dora, incubadora con atmósfera controlada en CO2, etc.
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Procedimiento para cultivar
1. Siguiendo un método establecido, inocular la muestra sobre una capa de células en confluencia.
2. Incubar la capa monocelular durante 48 horas.
3. Si se desea, realizar un pasaje e incubar durante otras 48 horas.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Material suministrado
1. Anticuerpo monoclonal anti-Chlamydia Material necesario pero no suministrado
1. Fijador: metanol de calidad histológica o analítica 2. Agua desionizada
3. Medio de montaje Pathfinder® – N° de catálogo Bio-Rad : 30693
4. Placa de microtitulación para microscopio con cubreobjetos adaptados (diámetro 5 mm), o portas de microscopio de vidrio y pinzas (según la técnica de cultivo utilizada)
5. Pipetas estériles 6. Cámara de humidificación
7. Microscopio de fluorescencia – Para visualizar las muestras colo-readas con isotiocianato de fluoresceína, utilizar un sistema de filtros con una longitud de onda de excitación de 480-490 nm y una longitud de onda de emisión igual o superior a 510 nm. El tipo y el estado de los filtros y de la fuente luminosa pueden afectar a la intensidad de la reac-ción fluorescente.
Procedimiento de coloración fluorescente del cultivo celular A. Técnica de cultivo en placa de microtitulación
1. Fijación de la capa de células
a. Aspirar con cuidado el medio de cada pocillo.
b. Añadir suficiente metanol para cubrir la capa monocelular en cada pocillo. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente (23°C ± 3°C).
c. Aspirar el líquido de cada pocillo con una pipeta, o dar la vuelta a la placa sobre una hoja de papel absorbente para eliminar el metanol. Realizar la tinción inmediatamente.
Si la coloración no se efectúa inmediatamente, conservar las placas a –70°C.
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2. Coloración de la capa monocelular
ADVERTENCIA: Si las células se secan, humedecer con agua desionizada antes de la tinción (dar la vuelta a la placa para eliminar el exceso de líquido).
a. Depositar 1 gota (aproximadamente 30 µL) de anticuerpo mon-oclonal anti-Chlamydia en cada pocillo. La solución de anticuer-pos debe cubrir toda la capa monocelular.
b. Tapar la placa e incubar a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) durante 30 minutos. Mantener la placa protegida de la luz intensa durante la incubación.
c. Destapar la placa y eliminar el anticuerpo monoclonal de los pocillos aspirando el líquido con la pipeta, o dar la vuelta a la placa sobre una hoja de papel absorbente. Aclarar con agua desionizada para eliminar los anticuerpos residuales. Dar la vuelta a la placa sobre una hoja de papel absorbente para elim-inar el exceso de agua.
d. Depositar 1 gota de medio de montaje en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.
ADVERTENCIA: Utilizar únicamente el medio de montaje Pathfinder®, N° de catálogo Bio-Rad 30693
3. Invertir la placa de microtitulación y examinar los pocillos en el microscopio de fluorescencia con un objetivo de distancia focal larga. Examinar toda la capa monocelular con un aumento mínimo de 100 X. Si la presencia de cuerpos de inclusión es dudosa, con-firmar a mayor aumento.
En caso necesario, las placas de microtitulación pueden conser-varse en oscuridad a 4°C. No obstante, deben examinarse en las siguientes 24 horas.
B. Técnica de cultivo en frasco
1. Fijación de la capa monocelular
a. Aspirar con cuidado el medio de cultivo de cada frasco. b. Añadir en cada frasco la cantidad suficiente de metanol para
cubrir la capa de células. Fijar durante 10 minutos a temper-atura ambiente (23°C ± 3°C).
c. Eliminar el metanol aspirando con la pipeta.
d. Si la coloración no se efectúa inmediatamente, conservar los frascos a –70°C.
2. Coloración de la capa monocelular
a. Con unas pinzas, retirar del frasco cuidadosamente el cubre que tiene la capa de células en confluencia; colocar el cubre
