Mestranda em Patologia das Doenças Tropicais pela Universidade Federal do Pará.

(D

)

Molecular epidemiology of rabies virus in Para state during 2000 to 2005: emergence and transmission by hematophagous bats (Desmodus rotundus) Taciana Fernandes Souza Barbosa1_{, Elizabeth Salbé Travassos da Rosa}2_, Daniele Barbosa de Almeida Medeiros3_{, Livia Medeiros Neves Casseb}4_, Armando de Sousa Pereira5_{, Alberto Lopes Begot}6_{, Reynaldo J. S. Lima}6_, Márcio Roberto Teixeira Nunes7_{, Pedro Fernando da Costa Vasconcelos}8

RESUMO

A ocorrência recente de surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos Desmodus rotundus vem sendo registrada no Estado do Pará desde 2004. Neste artigo, é realizado um estudo retrospectivo de caracterização genética de 37 cepas do vírus rábico de diferentes mamíferos, incluindo o homem, isoladas de 2000 a 2005, de diferentes regiões paraenses. Foi obtido o seqüenciamento nucleotídico parcial do gene N e construída árvore filogenética baseada no método Neighbor-Joining. A análise filogenética determinou a formação de cinco clades principais e agrupou as cepas isoladas no Estado do Pará em três distintas clades: clade I, cepas da variante antigênica 3 (VAg3), comumente encontrada nos morcegos D. rotundus; clade II, cepa relacionada à VAg3, porém com topologia diferenciada isolada de morcego frugívoro Uroderma bilobatum; e clade IV, cepas da variante antigênica 2 (VAg2), comumente isoladas de cães domésticos. No Pará, no período estudado, circularam as variantes VAg2 e VAg3. A VAg3 da clade I se encontra subdividida em três linhagens virais (I-a, I-b, e I-c) associadas à distribuição geográfica: duas delas (I-a e I-b) circulam no continente nas regiões paraenses do Sudeste, Nordeste e Baixo Amazonas, enquanto a linhagem I-c restringe-se à ilha do Marajó. A associação dos dados genéticos com os ecológicos fornece uma melhor compreensão da epidemiologia molecular da raiva no Estado do 1 _{Mestranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da Universiadade Federal do Pará. Seção} de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas, Belém, Brasil. Endereço: Avenida Almirante Barroso 492 - Marco - CEP: 66090-000 - E-mail: tacianabarbosa@iec.pa.gov.br 2 _{Doutoranda em Biologia Parasitária/FIOCRUZ.}

3 _{Doutoranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários pela Universidade Federal do Pará.} 4 _{Mestranda em Patologia das Doenças Tropicais pela Universidade Federal do Pará.}

5 _{Técnico da Seção de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas.}

6 _{Médico Veterinário. Especialista em Saúde Pública pela Escola Nacional de Saúde Pública RJ/UFPA.} Secretaria Executiva de Saúde Pública do Estado do Pará.

7 _{Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Pesquisador da Seção de Arbovirologia e} Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas.

8 _{Doutor em Medicina. Pesquisador e chefe da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do} Instituto Evandro Chagas.

Pará e sugere que duas distintas variantes antigênicas isoladas do vírus da raiva foram associadas com a transmissão da doença por morcegos hematófagos entre 2000 e 2005. Finalmente, foi demonstrado neste estudo a presença de pelo menos três distintas linhagens genéticas da VAg3 no estado, e a emergência de uma possível nova variante, que foi isolada de um morcego frugívoro U. bilobatum capturado na localidade de Ajará, município de Portel, durante o surto ocorrido em 2004.

PALAVRAS-CHAVE

Epidemiologia molecular, vírus da raiva, morcegos hematófagos ABSTRACT

The occurrence of human rabies outbreaks transmitted by bites of the vampire bats Desmodus rotundus have been recently reported in the Para state. In this work a retrospective study was conducted in order to genetic characterize thirty-seven rabies virus strains obtained from different hosts (including humans), time (between 2000 and 2005) and geographic regions of the Para state. The N gene nucleotide sequences were partially obtained from all studied strains and used for phylogenetic reconstruction by the Neighbor-joining method. The phylogenetic analysis depicted five major clades (I to V) and grouped the strains isolated in the Para state in three distinct clades: clade I related to strains associated with the hematophagous bat Desmodus rotundus antigenic variant (AgV3); clade II, which included a single strain isolated from a frugivorous bat (Uroderma bilobatum); and clade IV represented by the dog-related antigenic variant strains (AgV2). Within the clade I, three distinct lineages (I-a, I-b, and I-c) were identified and their dispersion appeared to be geographically related: two of them (I-a and I-b) were found in the continental area of the Para state (Southeast, Northeast and Baixo-Amazonas regions), whereas the lineage I-c was restricted to the Marajo Island. The association of genetic and ecological data provided a better understand of the molecular epidemiology of rabies virus strains isolated in the Para state suggesting that two distinct antigenic variants have been associated with bat-transmitted rabies cases between 2000 and 2005. Finally, it was demonstrated in this study the presence of at least three distinct AgV3 genetic lineages in the region, and the emergence of a possible new antigenic variant distinct from AgV3 strains isolated from the Uroderma bilobatum bat captured in the Portel municipality where rabies outbreak was reported in 2004. KEYWORDS

Molecular epidemiology, rabies virus, hematophagous bats

1. INTRODUÇÃO

A raiva é uma encefalite viral aguda, progressiva e incurável (Rupprecht

et al., 2002). O agente causador é um vírus de RNA neurotrópico, o vírus da

raiva, que pertence à ordem Mononegavirales, família Rabdoviridade e gênero Lyssavírus (Dietzschold et al., 1996; Wagner & Rose 1996; Wu et al., 2002; Fauquet et al., 2005; Finke & Conzelmann, 2005). Morfologicamente, o vírus da raiva é semelhante a um projétil, com aproximadamente 180 nm de comprimento por 75 nm de diâmetro (Tordo & Badrane, 2003; Gonçalves J. L. S. et al., 2002; Woldehiwet, 2002; Guyatt et al., 2003; Fauquet et al., 2005).

A organização genômica do vírus da raiva consiste de um ácido ribonucléico de fita única, sentido negativo, não segmentado. Cinco genes (3’-N-P-M-G-L-5’) monocistrônicos estão relacionados a cinco proteínas virais, são elas: Nucleoproteína (N); Fosfoproteína (P); Proteína Matriz (M); Glicoproteína (G); e RNA-Polimerase (L) (Fauquet et al., 2005).

Com o advento de técnicas moleculares, foram realizados numerosos estudos baseados em comparações na seqüência nucleotídica dos genes N e G, e de

pseudogenes (Ψ) de numerosos isolamentos de Lyssavirus, que permitiram a

identificação e caracterização de sete genótipos (GTs), denominados GT

1 a GT7

(Badrane et al., 2001), quais sejam: vírus da raiva Clássico (RV, GT₁); Lagos bat virus (LBV, GT₂) (Boulger & Porterfield, 1958); Mokola virus (MOKV, GT₃) (Shope et al., 1970); Duvenhage virus (DUVV, GT₄) (Meredith et al., 1971); European bat lyssavirus tipo 1 (EBLV-1, GT₅); (Amengual et al.,1997); European bat lyssavirus, tipo 2 (EBLV-2, GT₆) (Lumio et al, 1986); e Australian bat lyssavirus (ABLV, GT₇) (Gould et al., 2002; Guyatt et al., 2003).

A raiva é uma enfermidade que ocorre de maneira endêmica em diversos países do mundo, e seu ciclo epidemiológico pode ser didaticamente dividido em: ciclo urbano, ciclo rural, silvestre terrestre e silvestre aéreo (Velasco-Villa et al., 2006). O ciclo urbano é principalmente mantido pelos cães e sua transmissão ocorre de cão para cão, e este é considerado o principal transmissor de raiva para o homem, constituindo, esta forma, um grave problema de saúde pública, devido ao estreito relacionamento entre as pessoas e seus animais de companhia (Rezende et al., 1997; Fernandes, 2001).

O ciclo rural é mantido principalmente no campo por morcegos hematófagos, que transmitem o vírus em especial para animais de produção. Das três espécies de morcegos hematófagos existentes no Brasil, Desmodus rotundus é o mais importante transmissor da doença em herbívoros (Uieda et al., 1998; Rezende et al., 1997; Fernandes, 2001; Gonçalves M. A. S. et al., 2002).

No ciclo silvestre terrestre, a transmissão do vírus ocorre entre animais, como raposa, lobo, guaxinim, macaco e quati. É o ciclo de maior prevalência nos países desenvolvidos, em especial nas regiões em que a raiva urbana está sob controle. O ciclo silvestre aéreo ocorre entre as diferentes espécies de morcegos, hematófagos ou não, e apresenta, atualmente, grande importância na manutenção e disseminação do vírus. Por serem os únicos mamíferos que voam, se deslocando em velocidade, os morcegos têm a capacidade de transpor grandes distâncias e barreiras geográficas (Wada et al., 2004).

O ataque de morcegos hematófagos a humanos parece comum em algumas regiões da América Latina. No Brasil, ano de 1986, município de Boca da Mata, Estado de Alagoas, na região nordeste, dois casos de raiva humana transmitidas

por morcegos hematófagos foram registrados. Entre os anos de 1990 e 1992, foram registrados mais seis casos humanos no Estado da Bahia, sendo um ocorrido no município de Pintadas, três no município de Aporá e dois casos no município de Conde (Scheneider & Santos-Burgoa, 1995; Gonçalves M. A. S, et al., 2002).

Mais recentemente, nos anos de 2004 e 2005, foi relatada a ocorrência de mais três surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos, no Estado do Pará. Os primeiros surtos ocorreram nos meses de março e maio de 2004, nos municípios de Portel (mesorregião do Marajó), onde foram relatados 15 óbitos, sendo 10 confirmados laboratorialmente, e Viseu (mesorregião Nordeste), com seis óbitos, dois dos quais confirmados laboratorialmente. O terceiro surto ocorreu em junho de 2005, no município de Augusto Corrêa, onde ocorreram 15 óbitos e 10 foram confirmados por análises laboratoriais (Wada et al., 2004; Travassos da Rosa et al., 2006). Neste mesmo ano, foram relatados outros surtos nos municípios de Godofredo Viana, Cândido Mendes, Carutapera e Turiaçú, Estado do Maranhão, com uma ocorrência de 24 casos humanos (Brasil, 2005) (Figura 1).

No presente estudo, nós descrevemos a caracterização genética de 37 cepas de vírus rábico isoladas no Estado do Pará, de diferentes espécies animais incluindo o homem, ocorridas no período de 2000 a 2005.

Figura 1

Mapa dos estados do Pará e Maranhão onde ocorreram surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos nos anos de 2004 e 2005. Fonte: Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, 2005.

2. MATERIALEMÉTODOS

2.1. AMOSTRAS

O total de 37 cepas do vírus da raiva foram caracterizadas geneticamente neste estudo (Tabela 1), sendo as mesmas obtidas a partir de tecido nervoso humano e animal, recebidas pelo laboratório de Diagnóstico de Raiva, da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas. Os casos foram provenientes das seguintes mesorregiões do Estado do Pará: Baixo Amazonas; Marajó; Metropolitana de Belém; Nordeste Paraense; Sudeste Paraense; e Sudoeste Paraense. Tabela 1

Relação das cepas do vírus da raiva examinadas neste estudo, isoladas no Estado do Pará, 2000 a 2005, e outras previamente publicadas.

2.2. DIAGNÓSTICOLABORATORIAL

As amostras estudadas foram inicialmente diagnosticadas como positivas para a raiva pela Técnica de Imunofluorescência Direta (IFD) para a detecção de antígenos virais, e/ou Prova Biológica (PB) obtendo-se o isolamento do vírus rábico.

2.3. EXTRAÇÃODO RNA VIRALEOBTENÇÃODO DNA COMPLEMENTAR (CDNA)

O RNA viral das 37 amostras foi extraído utilizando o método do reagente TRIZOL LS (Invitrogen, San Diego, EUA) a partir de uma suspensão preparada com 1g do tecido nervoso macerado em 1000 µL da suspensão de albumina bovina a 0,75% em Solução Salina Tamponada, de acordo com as instruções do fabricante.

A obtenção do cDNA foi feita utilizando a técnica de transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (RT-PCR), na qual obteve-se a amplificação parcial do gene N, mediante RT-PCR em dois passos (Barbosa

et al., 2008). O par de iniciadores específicos utilizados, RABV NF (G G A A G A

G A T A A G A A G A A T G T T T G) e RABV NR (T T G G A G C T G A C T G A G A C A T A), foram desenhados com base em regiões altamente conservadas do gene N de diferentes cepas virais e com capacidade de hibridizar na posição compreendida do nucleotídeo 868 ao 1359. O produto obtido foi estimado em 491 pb.

Para a obtenção do DNA complementar (cDNA), inicialmente realizou-se a reação de transcrição reversa (RT) ajustada para o volume final de 10ML, constituída

por: 5µL de RNA (~2-5 ng) e 5µL da mistura de reação que inclui tampão RT 1x

(250mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 15mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA), 0,5

mM dNTP, 10mM, DTT, 10 U/µL de enzima RT (Superscript-II, Reverse

Transcriptase, Invitrogen San Diego, CA); 2,5 µM do iniciador 868 NF

(5’-GGAAGAGATAAGA AGAATGTTTG-3´), e 20 U de inibidor de RNAse (RNaseOUT – Invitrogen). A RT foi processada em um ciclo de 42ºC durante 90 minutos.

A amplificação do produto da RT foi realizada pela técnica de PCR,

cujo volume da reação foi ajustado para 25µL, contendo: 5µL do produto da

RT (cDNA) e 20 µL da mistura de reação constituída por tampão de PCR

10x (250mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 0,1 mM EDTA); 1,5

mM MgCl₂, 0,2 µM dNTPs, 1 µM de cada iniciador (NF) e 1359 NR

(5´-TTGGAGCTGACTGAGACATA-3´) e 0,05U/µL de DNA polymerase

(Platinum Taq DNA Polymerase). A reação de PCR foi executada com 35 ciclos, cada um composto por ciclos de 94°C/40 segundos, 55°C/40 segundos, e 74°C/ 1 minuto, seguidos de um ciclo adicional de extensão de 72°C/10 minutos. Os amplicons foram visualizados em gel de agarose a 1,5%, sendo estes produtos

posteriormente purificados utilizando o kit comercial QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Valência, EUA), de acordo com instruções do fabricante.

2.5. SEQÜENCIAMENTONUCLEOTÍDICO

A obtenção das seqüências nucleotídicas a partir dos cDNA purificados foi realizada utilizando o kit ABI PRISM Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, EUA), cujas reações foram processadas em seqüenciador automático, modelo ABI PRISM 377 (Applied Biosystens).O seqüenciamento foi realizado utilizando o mesmo par de iniciadores empregados nas reações de RT e PCR.

2.6. ANÁLISEFILOGENÉTICA

As seqüências nucleotídicas das 37 amostras de vírus da raiva foram alinhadas entre si e com outras seqüencias homólogas disponíveis no banco de dados do

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando o programa Clustal X (Thompson et al., 1997). As árvores filogenéticas foram construídas usando os métodos de

agrupamento de vizinhos (Neighbor Joining: NJ) (Saitou & Nei, 1987) e máxima parcimônia (MP) (Swofford, 1999), implementados nos programas computacionais Mega 3.0 (Kumar, 2004) e PAUP 4.0 (Swofford, 1999). Valores de confidência foram calculados baseados na divergência nucleotídica de cepas do vírus rábico isoladas de morcegos, cães, raccon e cepas laboratoriais (vírus fixo), sendo tais valores determinados em < 3% e < 1% para o grupamento das cepas em clades e sub-clades, respectivamente.

3. RESULTADOS

3. 1. DETECÇÃODO GENOMA VIRALEANÁLISEDASSEQÜÊNCIAS

O genoma do vírus rábico isolado nas 37 amostras utilizadas neste estudo foram amplificadas pela técnica de RT-PCR, obtendo-se produtos, que após seqüenciamento nucleotídico geraram seqüências parciais do gene N com aproxi-madamente 490 nt e determinadas entre as posições 868 e 1359 do genoma do vírus da raiva. As seqüências obtidas foram analisadas pelo programa BLAST

search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e identificadas como cepas do vírus da raiva

pertencentes às variantes antigênicas 3 (VAg3) e 2 (VAg2) relacionadas a morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus e ao cão doméstico, respectivamente.

3. 2. ANÁLISEFILOGENÉTICARELACIONADAAVARIANTESANTIGÊNICAS

A filogenia comparativa foi realizada entre as 37 cepas seqüenciadas neste estudo e cepas do vírus da raiva provenientes de outros estados brasileiros, cepas de vírus fixos (AV01; GeneBank: X13357 e CVS: GeneBank: D42112); bem

como com cepas da variante de “raccoon” (GeneBank: U27218, U27219, U27220 e U27221). A filogenia mostrou a relação de todas as cepas analisadas com o genótipo I do vírus rábico, sendo separadas em cinco clades principais relacionadas às distintas variantes antigênicas segundo os critérios de inclusão em clades (diver-gência genética < 3%) e sub-clades (diver(diver-gência genética < 0,9%) (Figura 2): Clade I – cepas relacionadas VAg3 (bootstrap > 80%); Clade II – uma única cepa isolada de morcego Uroderma bilobatum (Quiropt 18867), capturado na loca-lidade de Ajará, município de Portel, Estado do Pará (bootstrap > 86%); Clade III cepas relacionadas à variante de “raccoon” (bootstrap > 99%) – Clade IV cepas relacionadas à VAg2 (bootstrap > 95%); Clade V cepas de vírus fixos (bootstrap >99%). Embora a amostra do U. bilobatum esteja geneticamente relacionada às cepas da VAg3 associadas a D. rotundus (Clade I), essa forma uma clade isolada, o que parece constituir uma nova variante, uma vez que o valor de divergência genética de 5% foi superior ao valor limítrofe para a formação de clades (3%).

3. 3. ANÁLISEFILOGENÉTICARELACIONADAÀDISTRIBUIÇÃOGEOGRÁFICA

Quanto à distribuição geográfica, observa-se que dentro da Clade I são identificadas três subclades distintas (I-a, I-b e I-c), sustentadas por um elevado valor de bootstrap (>70%) e valores de inclusão de grupo < 0,9%. Observou-se a formação de dois grupos geográficos distintos: o grupo Continental, o qual compreende duas linhagens circulantes representadas pelas subclades I-a e I-b, cuja divergência genética entre elas é de 1,5%; e o grupo da Ilha do Marajó onde circula a linhagem relacionada na subclade I-c e que apresenta uma divergência genética de 2,5% e 2% com as linhagens I-a e I-b, respectivamente (Figura 2).

Na subclade I-a foram agrupadas as amostras provenientes das mesorregiões do Baixo Amazonas, representada pela amostra de Belterra (Bov 14664); nordeste paraense, dos municípios de Augusto Correa, Bragança e Viseu; e sudeste paraense (municípios de Eldorado dos Carajás, Conceição do Araguaia, Marabá e Xinguará), além das amostras provenientes do sudeste brasileiro. Enquanto que a subclade I-b, na qual estão relacionadas as cepas isoladas de morcegos frugívoros do gênero

Artibeus sp. (BR-AL1, BR-AL-2, BR-AL3 e BR-AP1), encontram-se agrupadas quatro

amostras da mesorregião nordeste do Pará, sendo três cepas de Augusto Correa (Hum 22931, Hum 22899 e Hum 22903) e uma de Viseu (Hum 19222), e duas amostras da mesorregião do sudeste paraense, sendo uma amostra de São João do Araguaia (Sui 17738) e uma de Jacundá (Eq 18727). Na subclade I-c encontram-se agrupadas todas as amostras da mesorregião do Marajó, incluindo os isolamentos do surto de Portel e uma cepa de Breves (Bov 19671).

Figura 2

Análise filogenética construída pelo método de NJ utilizando seqüências parcias do gene N de cepas do VR isoladas no Estado do Pará entre os anos de 2000 a 2006. Valores acimade cada nó correspondem aos percentuais de bootstap. O valor representado na escala correspondente a divergência genética de 20% (0,02).

A clade IV pode ser dividida em duas subclades (bootstrap > 90%, valor de inclusão de 0 a 0,5%), cujo valor de divergência genética entre elas é de 2,5%. Na subclade IV-a, estão agrupadas todas as amostras do Pará e uma amostra da região nordeste do Brasil (Hum 428M), enquanto que na subclade IV-b agrupam-se as cepas isoladas nos estados de Goiás, Minas Gerais e São Paulo. As amostras de VAg-2 provenientes do Estado do Pará foram isoladas das mesorregiões Baixo Amazonas (municípios de Oriximiná e Santarém), Metropolitana de Belém (município de Belém), Nordeste do Pará (municípios de Ipixuna do Pará, Mãe do Rio, Peixe-boi, Salinópolis e Viseu), Sudeste do Pará (municípios de Dom Eliseu, Jacundá, Marabá, Itupiranga e Ulianópolis) e Sudoeste do Pará (município de Rondon do Pará).

3. 4. ANÁLISEFILOGENÉTICAXANÁLISETEMPORALEDEHOSPEDEIRO

Nos anos de 2004 e 2005, a maioria dos isolamentos do vírus da raiva foi proveniente dos municípios de Portel (2004), Viseu (2004) (Travassos da Rosa et al., 2006) e Augusto Correa (2005) (Barbosa et al., 2008), os quais foram identificados como VAg3. Esses resultados caracterizam os três surtos ocorridos nestes municípios como sendo associados a morcegos hematófagos (D. rotundus). Entre os isolamentos obtidos, observou-se uma grande variedade de hospedeiros infectados (bovinos, felinos, eqüinos, humanos, quirópteros e suínos). A identificação da VAg3 na amostra Fel 23167 isolada de um felino procedente de Augusto Correa, que foi caracterizada tanto a nível genético quanto através da tipificação antigênica por painel de anticorpos monoclonais (AcM), demonstra a circulação dessa variante em diversas espécies animais. Um ano após o surto de Viseu, ainda detectou-se a circulação da VAg3 da linhagem I-a nesse município, a partir de isolamentos de uma amostra humana (Hum 23433) e de duas bovinas (Bov 23625 e Bov 23717), muito embora tenha sido também identificada uma cepa de VAg2 de uma amostra canina (Can 22186).

4. DISCUSSÃO

É notória, de longa data, a distribuição cosmopolita do genótipo I do vírus da raiva, bem como o seu impacto na saúde pública e na economia mundial, por promover números significativos de óbitos em humanos e animais de interesse econômico, respectivamente (Belotto, 2001; Rupprecht et al., 2002). Por isso, o genótipo I do vírus rábico continua sendo objeto de vários estudos, muito embora inúmeras pesquisas realizadas tenham melhorado o entendimento sobre esse agente viral. De fato, vários aspectos do ciclo biológico, modo de transmissão, caracteri-zação molecular e epidemiologia, produção de vacinas, dentre outros têm sido amplamente descritos e recentemente revistos (Rupprecht et al., 2002).

Por outro lado, os estudos moleculares do vírus rábico têm claramente demonstrado a importância da obtenção de seqüências nucleotídicas que possibilitem traçar estratégias moleculares para uma detecção rápida, sensível e específica do vírus rábico. Em termos de filogenia, o gene N vem sendo amplamente utilizado mostrando-se eficaz em ressaltar pequenas variações filogenéticas que permitem a identificação dos diferentes genótipos virais (Heaton

et al., 1997) o que tem permitido uma abordagem mais completa da caracterização

viral e o reconhecimento do relacionamento das espécies hospedeiras e também sua distribuição geográfica, contribuindo de forma decisiva na compreensão da epidemiologia molecular da raiva (Kissi et al., 1995; Nadin-Davis, 1998; Badrane et al., 2001).

O complexo ciclo de manutenção do vírus rábico envolve diversos hospedeiros, que apresentam uma estreita relação às variantes antigênicas específicas, determinadas através de um painel de AcM produzidos pelo CDC/Atlanta(EUA). No Brasil, são encontradas quatro variantes: VAg2, VAg3, VAg4 e VAg6. Na espécie canina (Canis familiaris) é comumente identificada a VAg2. A VAg 3 é característica de morcego hematófago da espécie Desmodus rotundus, também sendo comumente encontrada em animais de produção (bovino, eqüino, suíno, caprino, etc.), visto que o D. rotundus apresenta um hábito alimentar eletivo, obtendo preferencial-mente sangue desses animais. As variantes VAg4 e VAg6 têm sido encontradas em morcegos insetívoros das espécies Tadarida brasiliensis e Lasiurus cinereus, respectiva-mente (Favoretto et al., 2002; Diaz et al., 1994). O homem e os felinos domésticos são considerados hospedeiros acidentais, podendo ser infectados pelas variantes VAg2 e VAg3, sendo que cães e morcegos hematófagos D. rotundus são os principais transmissores dessas variantes, respectivamente (Kobayashi et al., 2006). O estudo realizado com amostras isoladas no Estado do Pará corrobora os dados da literatura, onde se verifica a circulação da variante VAg2 entre humanos (Hum 11950 e Hum 13597) e gatos domésticos, além do cão, e da variante VAg3 das espécies humana, felina (Fel 23167), bovina, eqüina e suína.

A análise filogenética dos 37 isolamentos estudados identificou linhagens distintas entre as variantes circulantes no Pará, demonstrando uma importante correlação dessas linhagens com a distribuição geográfica, dentro do estado e em relação ao restante do país. Com efeito, todas as amostras de VAg2 do Estado do Pará estudadas, independente da mesorregião, são estreitamente relacionadas entre si e com a amostra VAg2 proveniente do nordeste brasileiro (Hum 428M; GeneBank: AY563516), o que se deve, provavelmente, à proximidade geográfica do Pará com o estado nordestino do Maranhão e o intenso fluxo de imigrantes e seus animais domésticos entre as duas regiões (Norte-Nordeste). Tais amostras, por sua vez, são claramente distintas da linhagem VAg2 circulante no centro-oeste e

sudeste do país, sugerindo que ambos os grupos filogenéticos (IV-a e IV-b) apresentam origem evolutiva diferente.

Quanto a VAg3, o filograma mostrou um ancestral comum que deu origem a três linhagens no Estado do Pará, sendo duas circulantes na região continental e uma restrita à ilha do Marajó. Os dados demonstraram que na parte continental do Pará circulam duas linhagens da variante de D. rotundus: uma (I-b) que se relacionou às amostras isoladas de morcegos frugívoros do gênero Artibeus, capturados no Estado de São Paulo, em 1998 (Shoji et al., 2004) e uma outra (I-a) isolada de morcegos D. rotundus capturados também no Estado de São Paulo (Ito

et al., 2003). Ambas as linhagens encontram-se circulantes nas mesorregiões

Nordeste e Sudeste do Estado do Pará, muito embora possa se observar uma predominância da linhagem I-a, sobretudo nas amostras isoladas nos municípios de Augusto Correa e Viseu.

A inserção da amostra Bov 19671 proveniente do município de Breves juntamente com as amostras do surto de Portel, em 2004, ambos os municípios localizados na mesorregião paraense do Marajó, reforça a idéia de que a Ilha do Marajó constitui um nicho singular para a manutenção do ciclo silvestre aéreo do vírus da raiva com a circulação de uma linhagem distinta da VAg3, como foi descrito em outros trabalhos (Travassos da Rosa et al., 2006; Barbosa et al., 2008). Interessante, além da VAg3, pode estar circulando no Marajó uma possível nova variante antigênica (Quiropt 18867) isolada a partir de um morcego frugívoro da espécie Uroderma bilobatum capturado na localidade de Ajará, em Portel, durante a ocorrência do surto em 2004. Vale ressaltar que essa informação baseia-se tanto na tipificação antigênica, visto que esta amostra apresentou um padrão de leitura diferenciado das variantes antigênicas circulantes na América Latina, reagindo com os oito AcM disponíveis (C1, C4, C9, C10, C12, C15, C18, e C19), quanto pelo seqüenciamento parcial do gene N, já que a análise filogenética sugeriu que esta amostra está relacionada com a variante de D. rotundus, porém apresentando divergência genética suficiente para ser considerada como uma nova variante.

Os dados da literatura têm mostrado que morcegos frugívoros são hospedeiros de variantes antigênicas específicas, tal como a VAg4 identificada em morcegos da espécie Tadarida brasiliensis e a VAg6 identificada em morcegos Lasiurus cinereus (Uieda, 1998; Velasco-Villa et al., 2006). Vale ressaltar que com base no estudo das caracterizações antigênicas têm sido sugeridas possíveis novas variantes como observado para a amostra de sagüi Callithrix jacchus isolado no Estado do Ceará (Morais et al., 2000; Favoretto et al., 2001). É interessante assinalar, no entanto, que para confirmação da hipótese de uma nova variante do vírus da raiva circulando na ilha do Marajó, estudos adicionais tornam-se necessários, incluindo a caracterização molecular completa do gene N.

De acordo com dados da Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS), Belotto (2003) cita que entre os anos de 1995 e 2000 os morcegos hematófagos ocuparam o segundo lugar na transmissão da raiva humana na América Latina, superados apenas pelos cães, e ainda mostraram que, no período, foram notificados 105 casos de raiva humana transmitida por D. rotundus nas Américas, representando 20% do total. A emergência dos casos de raiva transmitida por morcegos deve-se em parte à melhoria das ações dos programas de controle da raiva de animais domésticos, o que permitiu a redução progressiva do número de casos positivos, principalmente de cães. Em decorrência disso, o morcego tem emergido como o mais importante transmissor da raiva atualmente na América Latina, como tem sido descrito para os países que controlam a raiva transmitida pelos animais domésticos (Rupprecht, et al., 2002; Toporovski et al., 2005).

Esta situação também se reflete no Brasil, e, em particular, no Estado do Pará, que, com base em um levantamento atualizado da raiva realizado no período de 2000 a 2005, foi demonstrada uma importante diminuição do número de casos de raiva humana relacionados ao cão e um aumento considerável de casos associados à transmissão por morcego (Travassos da Rosa, comunicação pessoal/ IEC), conseqüência dos surtos notificados nos municípios paraenses de Viseu e Portel, em 2004 (Travassos da Rosa et al., 2006), e Augusto Correa, em 2005 (Barbosa et al., 2008).

Finalmente, a associação de dados genéticos e ecológicos pode fornecer informações mais precisas e melhorar o entendimento a respeito da evolução do vírus rábico e, talvez, explicar a emergência de novas variantes e linhagens genéticas deste agente viral como resultado de fatores seletivos associados ao hospedeiro, auxiliar na prevenção de futuros surtos de raiva, bem como auxiliar na melhora e desenvolvimento de medidas de controle mais eficazes para a região.

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B

AMENGUAL, B.; WHITBY, J. E.; KING, A.; SERRA COBO, J.; BOURHY, H. Evolution

of European bat lyssaviruses. Journal of General Virology. v. 78, p. 2319 - 2328, 1997. BADRANE, H.; BAHLOUL, C.; PERRIN, O.; TORDO, N. Evidence of two Lyssavirus

phylogroups with distinct pathogenicity and immunogenicity. Journal of Virology.

v. 75, n. 7, p. 3268 - 3276, 2001.

BARBOSA, T. F. S.; MEDEIROS, D. B. A.; TRAVASSOSDA ROSA, E. S.; CASSEB, L. M.

N.; MEDEIROS, R.; PEREIRA, A. S.; VALLINOTO, A. C. R.; BEGOT, A. L.; LIMA, J.

S.; VASCONCELOS, P. F. C.; NUNES, M. R. T. Molecular epidemiology of rabies

occurring in Augusto Correa municipality, Brazilian Amazon. Virology. v. 370,

n. 2, p. 228 - 236, 2008.

BELOTTO, A. J. Raiva transmitida por morcegos nas Américas: impacto na saúde pública e na

produção. In: Seminário Internacional – Morcegos como transmissores da raiva. 2001,

São Paulo. Programa e Resumos... São Paulo: Instituto Pasteur, 2001. Disponível em : <http://www.pateur.saude.sp.gov.br/extras/seminario_2001.pdf>.

______. Raiva transmitida por morcegos nas Américas. Boletim Instituto Pasteur.

v. 7, 2003. 2p.

BOULGER, I. R.; PORTERFIELD, J. S. Isolation of a virus from Nigerian fruit bats.

Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. v. 52, p. 421 - 424, 1958.

BRANDAO, P. E.; CASTILHO, J. G.; SANTOS, H. P.; MACEDO,C. I.; OLIVEIRA, R. N.;

CARNIELI JR, P.; BUENO, C. R.; ZANETTI, C. R.; CARRIERI, M. L.; KOTAIT, I.

Molecular epidemiology of human rabies in Northeastern Brazil. Não publicado. Submetido

ao GeneBank em 02 mar. 2004.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Raiva humana

transmitida por morcegos no estado do Maranhão. Brasília: MS, 2005. p. 1 - 5.

CASTILHO, J. G.; BRANDAO, P. E.; LINO, A. M.; MACEDO, C. I.; OLIVEIRA, R. N.;

CARNIELI, JR. P.; BUENO, C. R.; ZANETTI, C. R.; CARRIERI, M. L.; KOTAIT, I.

Molecular epidemiology of bat-related rabies in cats. Submetido ao GeneBank em 02.

mar. 2004.

DIAZ, A. M.; PAPO, S.; RODRIGUEZ, A.; SMITH, J. S. Antigenic analysis of

rabies-vírus isolates from Latin America and the Caribean. Journal of Veterinary Medical

Biological. v. 41, p. 153 - 160, 1994.

DIETZSCHOLD, B.; RUPPRECHT, C. E.; FU, Z. F.; KOPROWSKI, H. Rhabdoviruses.

IN: FIELDS, B. N.; WOLDEHIWET, B. N.; KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M.; CHANOCK,

R. M.; MELNICK, J. L.; MONATH, T. P.; ROIZMAN, B.; STRAUS, S. E. (Ed.). Fields

Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers,1996. p.1137 - 1159.

FAUQUET, C. M.; MAYO, M. A.; MANILOFF, J.; DESSELBERGER, U.; BALL, L. A.

Virus Taxonomy: classification and nomenclature of viruses. Eighth report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press, 2005. 1259p.

FAVORETTO, S. R.; DE MATTOS, C. C.; MORAIS, N. B.; ARAÚJO, F. A. A.; DE

MATTOS, C. A. Rabies in marmosets (Calithrix jacchus), Ceará, Brazil. Emerging

FAVORETTO, S. R.; CARRIERI, M. L.; CUNHA, E. M. S.; AGUIAR, E. A. C.; SILVA,

L. H. Q.; SODRÉ, M.; SOUZA, M. C. A.; KOTAIT, I. Antigenic typing of Brazilian rabies vírus samples isolated from animals and humans, 1989-2000. Revista do

Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. v. 44, n. 2, p. 91 - 95, 2002.

FERNANDES, C. G. Raiva. In: RIET-CORREA, F.; SCHILD, A. L.; MENDEZ, M. C.;

LEMOS, R. A. A. (Eds.). Doenças de ruminantes e eqüinos. São Paulo: Varela Editora e

Livraria, 2001. p. 149 - 162.

FINKE, E.; CONZELMANN, K. Replication strategies of rabies virus. Virus Research.

v. 111, n. 2, p. 120 - 131, 2005.

GONÇALVES, J. L. S.; VON HUBINGER, M. G.; WERMELINGER, M. C. M. W. Viroses

do sistema nervoso central. In: SANTOS, N. S. O.; ROMANOS, M. T. V.; WIGG, M.

D. (Eds.). Introdução a virologia humana. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.

p. 157 - 164.

GONÇALVES, M. A. S.; SÁ-NETO, R. J.; BRAZIL, T. K. Outbrek of aggressions and

transmission of rabies in human beings by vampire bats in northeastern Brazil.

Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. v. 35, n. 5, p. 461 - 464, 2002.

GOULD, A. R.; KATTENBELT, J. A.; GUMLEY, S. G.; LUNT, R. A. Characterization

of an Australian bat lyssavirus variant isolated from an insectivorous bat. Virus

Research. v. 89, p. 1 - 28, 2002.

GUYATT, J. K.; TWIN, J.; DAVIS, P.; HOLMES, E. C.; SMITH, G. A.; SMITH, I. L.;

MACKENZIE, J. S.; YOUNG, P. L. A molecular epidemiological study of Australian

bat lyssavirus. Journal of General Virology. v. 84, p. 485 - 496, 2003.

HEATON, P. R.; JOHNSTONE, P.; MCELHINNEY, L. M.; COWLEY, R.; O’SULLIVAN, E.;

WHITBY, J. E. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies

and rabies-related viruses. Journal of Clinical Microbiology. v. 35, n. 11, p. 2762 - 2766, 1997.

ITO, M.; ITOU, T.; SHOJI, Y.; SAKAI, T.; ITO, F. H.; ARAI, Y. T.; TAKASAKI, T.;

KURANE, I. Discrimination between dog-related and vampire bat-related rabies

viruses in Brazil by strain-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. Journal of Clinical

Virology. v. 26, n. 3, p. 317 - 330, 2003.

KISSI, B.; TORDO, N.; BOURHY, H. Genetic polymorphism in the rabies virus

KOBAYASHI, Y.; OGAWA, A.; SATO, G.; SATO, T.; ITOU, T.; SAMARA. S. I.; CARVALHO,

A. A.; NOCITI, D. P.; ITO, F. H.; SAKAI, T. Geographical distribution of vampire bat-related cattle rabies in Brazil. The Journal of Veterinary Medical Science. v. 68,

n. 10, p. 1097 - 1100. 2006.

KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA 3: Integrated software for Molecular

Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics. v. 5, n. 3, p. 150 - 163, 2004.

LUMIO, J.; HILLBOM, M.; ROINE, R.; KETONEN, L.; HALTIA, M.; VALLE, M.; NEUVONEN,

E.; LAHDEVIKTRA, J. Human rabies of bat origin in Europe. Lancet. v. 1, 1986. 378 p.

MEREDITH, C. D.; PROSSOUW, A. P.; KOCH, H. P. An unusual case of human

rabies thought to be of Chiropteran origin. South African Medical Journal. v. 45, n. 28, p. 767 - 769, 1971.

MORAIS, N. B.; ROLIM, B. N.; CHAVES, H. H. M.; NETO, J. B.; SILVA, L. M. Rabies

in Tamarins (Callithrix jacchus) in the State of Ceará, Brazil, a Distinct Viral Variant? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. v. 95, n. 5, p. 609 - 610, 2000. NADIN-DAVIS, S. A.; HUANG, W.; WANDELER, A. I. The design of strain-specific

polymerase chain reactions for discrimination of the racoon rabies virus strain from indigenous rabies viruses of Ontario. Journal of Virological Methods. v. 57, n. 1, p. 1 - 14, 1996.

NADIN-DAVIS, S. A. Polymerase chain reaction protocols for rabies virus

discrimination. Journal of Virological Methods. v. 75, n. 1, p. 1 - 8, 1998. POCH, O.; TORDO, N.; KEITH, G. Sequence of the 3386 3' nucleotides of the genome of the AVO1 strain rabies virus: structural similarities in the protein regions involved in transcription. Biochimie. v. 70, n. 8, p. 1019 - 1029, 1988. REZENDE, M. B.; TRAVASSOSDA ROSA, E. S.; VASCONCELOS, P. F. C.; REZENDE

JÚNIOR, A. B. RAIVA. IN: LEÃO, R. N. Q.; BICHARA, C. N. C.; MIRANDA, E. C. B.

M.; CARNEIRO, I. C. R. S.; OLIVEIRA, M. R. F.; ABDON, N. P.; VASCONCELOS, P. F.

C.; SILVA, B. M.; PAES, A. L. V.; MARSOLA, L. R. Doenças infecciosas e parasitárias:

enfoque amazônico. Belém: CEJUP, 1997. p. 377 - 395.

RUPPRECHT, C. E.; HANLON, C. A.; HEMACHUDHA, T. Rabies re-examined. The

Lancet Infectious Disease. v. 2, n. 6, p. 327 - 343, 2002.

SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for

reconstruction of phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. v. 4, p. 406 - 425, 1987.

SCHNEIDER, M. C.; SANTOS-BURGOA, C. Algunas consideraciones sobre la rabia

humana transmitida por murciélago. Revista de Salud Pública de México. v. 37, p. 4, p. 354 - 362, 1995.

SHOJI, Y.; KOBAYASHI, Y.; SATO, G.; ITOU, T.; MIURA, Y.; MIKAMI, T.; CUNHA, E.

M. S.; SAMARA, S. I.; CARVALHO, A. A. B.; NOCITTI, D. P.; ITO, F. H.; KURANE, I.;

SAKAI, T. Genetic characterization of rabies viruses isolated from frugivorous bat (Artibeus spp.) in Brazil. The Journal of Veterinary Medical Science. v. 66, n. 10, p. 1271 - 1273, 2004.

SHOPE, R. E.; MURPHY, F. A.; HARRISON, A. K.; CAUSEY, O. R.; KEMP, G. E.; SIMPSON,

D. I. H.; MOORE, D. Two African viruses serologically and morphologically related to

rabies virus. Journal of Virology. v. 6, n. 5, p. 690 - 692, 1970.

SWOFFORD, D. L. PAUP 4.0. Phylogenetic Analysis Using Parsimony and other methods.

Suderland, MA: Sinauer Associates Incorporated, 1999. CD.

THOMPSON, J. D.; GIBSON, T. J.; PLEWNIAK, F.; JEANMOUGIN, F.; HIGGINS, D. G.

The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research.

v. 25, n. 24, p. 4876 - 4882, 1997.

TOPOROVSKI, R. Z.; FAVORETTO, S. R.; SOARES, S. L.; CAMPOS, A. C. A.; LOPES, M.

C.; MARTORELLI, L. F. A.; SACRAMENTO, D. R. V.; DURIGON, E. L. Antigenic studies of

rabies virus isolates from different animal species and humans. In: National Meeting of

Virology. 2005. 16., Virus Reviews & Research, v. 10, Supl 1, p. 112, 2005. TORDO, N.; POCH, O.; ERMINE, A.; KEITH, G.; ROUGEON, F. Walking along the

rabies genome: is the large G-L intergenic region a remnant gene? Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America. v. 83, n. 11,

p. 3914 - 3918, 1986.

TORDO, N., BADRANE, H. A evolução do gênero Lyssavirus. Boletim Instituto Pasteur.

v. 7, p. 3 - 5, 2003.

TRAVASSOSDA ROSA, E. S.; KOTAIT, I.; BARBOSA, T. F. S.; CARRIERI, M. L.;

BRANDAO, P. E.; PINHEIRO, A. S.; BEGOT, A. L.; WADA, M. Y.; DE OLIVEIRA,

R. C.; GRISARD, E. C.; FERREIRA, M.; DA SILVA LIMA, R. J.; MONTEBELLO, L.;

MEDEIROS, D. B. A.; SOUZA, R. C. M.; BENSABATH, G.; CARMO, E. H.; VASCONCELOS,

P. F. C. Bat-transmitted human rabies outbreaks, brazilian Amazon. Emerging

Infection Disease. v. 12, n. 8, p. 1197 - 1202, 2006.

UIEDA, W. Rabies in the insectivorous bat Tadarida brasiliensis in southeastern

VELASCO-VILLA, A.; ORCIARI, L. A.; JUAREZ-ISLA, V.; GOMEZ-SIERRA, M.; PADILLA

-MEDINA, I.; FLISSER, A.; SOUZA, V.; CASTILLO, A.; FRANKA, R.; ESCALANTE-MANE, M.; SAURI-GONZALEZ, I.; RUPPRECHT, C. E. Molecular diversity of rabies viruses

associated with bats in México and other countries of the Américas. Journal of

Clinical Microbiology. v. 44, n. 5, p. 1697 - 1710, 2006.

WADA, M. Y.; BEGOT, A. L.; NORONHA, S. L. B.; ALMEIDA, I. F.; LIMA, R. J. S.;

SANTOS, L. B. C.; MONTEIRO A.; CRUZ, R. S.; SILVA, I. N. O.; SOARES, D. S.;

PINHEIRO, A. S.; MORAES, J. R. F.; TENÓRIO, A. S.; PEREIRA, A. G. G.; PENHA, T.

C.; TRAVASSOSDA ROSA, E. S.; BARROS, V. L. S.; VASCONCELOS, P. F. C.; BARBOSA,

T. F. S. B.; KOTAIT, I.; SOUZA, J. C. P.; GITTI, C. B.; UIEDA, W.; CARMO, E. H.;

OLIVEIRA, R. C.; HATCH, D. L.; SILVA, E. D.; MUNHOZ, E. Surto de raiva humana

transmitida por morcegos no Município de Portel-Pará, março/abril de 2004.

Boletim Eletrônico Epidemiológico. v. 4, n. 6, p. 1 - 5, 2004.

WAGNER, R.; ROSE, J. K. Rhabdoviridae: the viruses and their replication. In:

FIELDS, B. M.; KINIPE, P. M. (Eds.). Virology. Philadelphia: Linppincott Raven Publishers, 1996. p. 1121 -1159.

WU, X.; GONG, X.; FOLEY, H. D.; SCHELL, M. J.; FU, Z. F. Both viral

transcription and replication are reduced when the rabies virus nucleoprotein is not phosphorylated. Journal of Virology. v. 76, n. 9, p. 4153 - 4161, 2002. WOLDEHIWET, Z. Rabies: recent developments. Research in Veterinary Science. v. 73,