B
ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis
Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack
U
3300762JAA(03) 2015-07Português UTILIZAÇÃO PRETENDIDA
O BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack (Embalagem de Reagente de Identificação de Cultura de Complexo Mycobacterium tuberculosis [ctb] BD ProbeTec ET), para utilização com o Sistema BD ProbeTec ET, utiliza a tecnologia de Amplificação por deslocamento de cadeia (SDA - Strand Displacement Amplification) para a identificação do complexo do Mycobacterium tuberculosis isolado de cultura. RESUMO E EXPLICAÇÃO
O uso de sondas de ADN para a identificação de culturas reduz o tempo necessário para a identificação de algumas micobactérias, tais como o complexo do M. tuberculosis, de 1 a 2 semanas com os métodos tradicionais para
menos de 24 h.1
A embalagem de reagente para o complexo Mycobacterium tuberculosis (ctb) é usada com o Sistema BD ProbeTec ET. O sistema de teste utiliza tecnologia de SDA homogénea como o método de amplificação e a transferência de energia (ET) fluorescente como o método para detectar a presença do complexo Mycobacterium tuberculosis a partir
de culturas.2-4 O crescimento pode fazer-se a partir de meios de crescimento de micobactérias à base de ovo, à base de
agar ou líquidos.
O complexo Mycobacterium tuberculosis é constituído por M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e
M. microti.5,6
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O Ensaio BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis complex (ctb) baseia-se na amplificação e detecção simultâneas
do ADN alvo, utilizando primers de amplificação e uma sonda de detecção rotulada por fluorescência.2-4 Os reagentes
de SDA encontram-se secos em dois micropoços separados. A amostra processada é adicionada ao micropoço de inicialização, que contém os “primers” de amplificação, as sondas de detecção com marcação fluorescente e outros reagentes. Após a incubação, a mistura da reacção é transferida para o micropoço de amplificação, que contém duas enzimas (uma ADN polimerase e uma endonuclease de restrição) necessárias à SDA. Os Micropoços de Amplificação são selados para evitar a contaminação e, depois, incubados num leitor fluorescente termocontrolado, que monitoriza a geração de produtos amplificados em cada reacção.
Cada reação co-amplifica e detecta um Controlo de Amplificação Interno (IAC). O objectivo deste controlo consiste em confirmar a validade da reacção de amplificação e identificar a potencial inibição da amostra processada. Os resultados são apresentados como positivos, negativos ou indeterminados, através de um algoritmo.
REAGENTES E MATERIAIS
Cada Embalagem de Reagente para Identificação de Culturas do complexo Mycobacterium tuberculosis (ctb) ET BD ProbeTec contém:
Micropoços de Inicialização de ctb, 24:
4 Oligonucleótidos ≥ 7,6 pmol; dNTP ≥ 37,6 nmol; Sondas detectoras ≥ 30 pmol; Oligonucleótido sintético ≥ 10.500 cópias. Micropoços de Amplificação de ctb, 24:
Enzima de restrição ≥ 25,5 unidades; ADN polimerase ≥ 8 unidades; dNTPS ≥ 10 nmol; Acessórios: 10 Tampas, 8 Sacos para Eliminação, 16 Seladores.
Cada BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Sample Processing Kit (Kit de Processamento de Amostras para Indentificação de Culturas de Micobactérias [ctb] ET BD ProbeTec) contém:
Tampão de lavagem MCI 1 – solução de 225 mL contendo ureia, Tampão CAPS, dimetil sulfóxido, glicerol e hidróxido de sódio.
Tampão de lise MCI 2–50 mL de solução de hidróxido de potássio.
Tampão de Neutralização 3 MCI – 225 mL de solução contendo bicina, hidróxido de potássio, dimetil sulfóxido, glicerol e 0,03% de Proclin (conservante).
Cada BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Control Set (Conjunto de Controlo para Indentificação de Culturas de Micobactérias [ctb, kan] ET BD ProbeTec) contém:
Controlo Positivo MCI – 20 cada (50 µL secos) ADN de testículo de salmão ≥ 5 µg e ≥ 750 cópias de oligonucleótido sintético de M. tuberculosis por reacção ≥ 5.250 cópias no total.
Controlo negativo MCI – 20 cada (50 µL secos) ADN de testículo de salmão ≥ 5 µg.
Instrumentos, equipamento e acessórios: BD ProbeTec ET Instrument (Instrumento BD ProbeTec ET) e Placa do Instrumento, BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (Estufa de Inicialização e Aquecimento BD ProbeTec ET), forno BD ProbeTec ET ou forno de laboratório de utilização geral capaz de aquecer a amostra até 101 ± 1 °C durante um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min, BD ProbeTec ET Sonic Bath (Banho sónico BD ProbeTec ET) e insersor do banho sónico, BD ProbeTec ET Pipettor (Pipeta) e Alimentação Eléctrica BD ProbeTec ET, 2 mL Sample Tube Rack (Suporte para Tubos de 2 mL), Clear Pipetting Rack (Suporte de Pipetagem Transparente), 2 mL Sample Tubes and Caps (Tubos de Ensaio de 2 mL e Rolhas), Rolhas de 2 mL e BD ProbeTec ET Accessories Kit (Kit de Acessórios BD ProbeTec ET), Zaragatoas CultureSwab EZ.
Material necessário mas não fornecido: Microcentrifugadora com confinamento de aerossóis e rotores padrão com capacidade para 12.200 x g (tais como Microcentrifugadora Eppendorf Modelo 5417C), misturador de vórtex, luvas descartáveis, pipetas com pontas resistentes a aerossóis capazes de administrar volumes de 10 µL, 100 µL, 500 µL, 600 µL e 1 mL, hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox*, recipientes estéreis capazes de suportar alíquotas dos três Tampões MCI, cronómetro, desinfectante tuberculocida, esponjas absorventes/compressas, termómetro calibrado. * Adicionar 7,5 g de Alconox por 1 L de hipocloreto de sódio a 1% (v/v) e misturar. Prepare diariamente. Requisitos de Armazenamento e Manuseamento: As embalagens de reagente ctb podem ser armazenados a temperaturas entre os 2 e os 33 °C. Não utilizar as embalagens de reagentes fechadas após o fim do prazo de validade. Depois da abertura de uma bolsa, os micropoços permanecerão estáveis durante 4 semanas, desde que estejam correctamente selados ou até ao prazo de validade, o que ocorrer primeiro. Não congele.
Os reagentes de processamento de amostras para Identificação de Culturas de Micobactérias (MCI) podem ser armazenados a temperaturas entre os 2 e os 33 °C. Não utilizar os reagentes após o fim do prazo de validade. Não congele.
Os controlos para Identificação de Culturas de Micobactérias (MCI) podem ser armazenados a temperaturas entre os 2 e os 33 °C. Não utilize os Controlos findo o prazo de validade. Não congele.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Para Uso em Diagnóstico in vitro
1. A manipulação e o processamento de amostras até ao passo de inactivação por calor devem ser efectuados numa Câmara de Segurança Biológica (BSC) de Classe II. A centrifugação da amostra antes do passo de inactivação por calor só deve ser feita usando o rotor com contenção de aerossóis. O rotor com contenção de aerossóis só deve ser aberto na BSC. Utilize apenas o rotor padrão para a centrifugação de amostras depois da inactivação por calor fora da BSC.
2. Embora não sejam requeridas áreas dedicadas, porque a configuração do BD ProbeTec ET reduz a possibilidade de contaminação por amplicon no ambiente de análises, são necessárias outras precauções para controlar a contaminação, principalmente para evitar a contaminação das culturas durante o processamento ou transferência. 3. Não permutar nem misturar os Micropoços, os Controlos ou os reagentes de processamento retirados de
conjuntos com números de lote diferentes.
4. Cumpra as práticas de laboratório estabelecidas para descartar as pontas de pipeta, os tubos de ensaio, as tampas de Inicialização e os outros materiais descartáveis utilizados.
5. Utilize apenas o Pipetador e as pontas de Pipetas BD ProbeTec ET na transferência das amostras processadas para os Micropoços de Aparelhamento e na transferência das amostras dos Micropoços de Aparelhamento para os Micropoços de Amplificação.
6. As bolsas de reagentes que contenham Micropoços de Inicialização e Micropoços de Amplificação não usados T M de ser cuidadosamente seladas após a sua abertura. Antes de selar novamente a bolsa de reagentes, confirmar a presença de um exsicante.
7. A placa que contém os Micropoços de Amplificação TEM de ser correctamente selada com o Vedante de Amplificação, antes de ser deslocada do Forno de Inicialização e Aquecimento BD ProbeTec ET para o Instrumento BD ProbeTec ET. A selagem é necessária para evitar contaminação do instrumento e da área de trabalho com produtos da reacção de amplificação. Não retire o material vedante dos micropoços em nenhum momento. 8. Na eventualidade de uma placa de teste exceder 6 colunas (> 48 amostras e Controlos), deve ser utilizada uma folha
INTEIRA de vedante de Amplificação, incluída no Kit de Acessórios, para prevenir uma possível contaminação. 9. Para evitar a contaminação do ambiente de trabalho com produtos da amplificação, utilize os sacos para resíduos
fornecidos para eliminar micropoços de amplificação vedados após conclusão dos testes.
10. MUDE DE LUVAS nas fases especificadas durante o processamento de amostras e o procedimento de teste, para evitar a contaminação entre amostras. Se as luvas entrarem em contacto com uma amostra, mudá-las imediatamente para evitar a contaminação das outras amostras.
11. Em caso de contaminação da área ou do equipamento de trabalho com amostras ou controlos, lavar bem a área contaminada com hipocloreto de sódio a 1% (v/v) em Alconox e enxaguar com água destilada/desionizada abundante. Antes de prosseguir, deixe as superfícies secar completamente.
12. Diariamente, limpe toda a área de trabalho - topos de bancadas e superfícies do instrumento - com hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Irrigue abundantemente com água destilada/desionizada. Antes de prosseguir com outros testes, deixe as superfícies secarem completamente.
13. Os Micropoços de Inicialização com líquido residual (após a transferência do líquido dos Micropoços de
Inicialização para os Micropoços de Amplificação) representam uma fonte de contaminação. Sele cuidadosamente os micropoços de inicialização com o selador de placas, antes de os eliminar.
14. Não coloque os dedos nem as mãos no banho sónico quando os ultra-sons estiverem ligados (ON). Se o fizer poderá sentir desconforto e, possivelmente, irritação cutânea. Também poderão ocorrer lesões nos tecidos moles a longo prazo.
15. Não use um termómetro de mercúrio para verificar a temperatura do Banho Sónico. Para esta finalidade, é fornecido um termómetro digital.
16. Contactar os Serviços Técnicos, se ocorrem situações invulgares, tais como derrame no instrumento BD ProbeTec ET ou contaminação com ADN que não possa ser removida através de limpeza.
17. Se utilizar um forno de laboratório de utilização geral, siga as instruções do manual do utilizador do forno para obter as instruções de funcionamento adequadas e as precauções de segurança.
18. Utilize procedimentos laboratoriais estabelecidos para o manuseamento das amostras durante e/ou após a inactivação por calor.
Advertência
H302 Nocivo por ingestão. H315 Provoca irritação cutânea. H319 Provoca irritação ocular grave. H335 Pode provocar irritação das vias respiratórias.
P280 Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/protecção ocular/protecção facial. P264 Lavar cuidadosamente após manuseamento. P312 Caso sinta indisposição, contacte um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. P403+P233 Armazenar em local bem ventilado. Manter o recipiente bem fechado. P501 Eliminar o conteúdo/ recipiente de acordo com os regulamentos locais/regionais/nacionais/internacionais.
Perigo
H302 Nocivo por ingestão. H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves.
P280 Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/protecção ocular/protecção facial. P264 Lavar cuidadosamente após manuseamento. P301+P312 EM CASO DE INGESTÃO: caso sinta indisposição, contacte um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo/ recipiente de acordo com os regulamentos locais/regionais/nacionais/internacionais.
PROCEDIMENTOS PARA PROCESSAMENTO DA CULTURA
NOTA: O procedimento de processamento de culturas que se segue produz uma quantidade de amostra suficiente para a realização de três testes de identificação de cultura.
A. Preparação do Processamento de Amostras - Fora da BSC
1. Os tampões de processamento da amostra devem estar à temperatura ambiente e bem misturados antes da utilização. Para evitar a contaminação dos tampões de stock, construa alíquotas de volumes suficientes dos tampões em recipientes estéreis adequadamente rotulados, da seguinte forma:
a. Tampão de Lavagem MCI 1–2 mL por tipo de colónia de cultura sólida a testar, 1 mL por meio de crescimento líquido a processar mais 1-2 mL extra para uma pipetagem mais fácil.
b. Tampão de Lise MCI 2–0,1 mL por cultura e controlos a processar mais 0,5–1 mL extra para uma pipetagem mais fácil.
c. Tampão de Neutralização MCI 3–0,6 mL por cultura e controlos a processar mais 0,5–1 mL extra para uma pipetagem mais fácil.
d. Para evitar contaminação dos tampões, não despejar o tampão que sobra novamente para os frascos. 2. Utilize os rótulos fornecidos com os Tubos de Amostra e rotule em duplicado os Tubos de Amostra de 2 mL
para cada colónia de cultura sólida a processar num Tubo de Amostra de 2 mL para cada cultura líquida a processar.
3. Retire as tampas dos Tubos de Amostra e dispense 1,0 mL de Tampão de Lavagem 1 MCI em cada tubo. Volte a tapar os tubos.
4. Mova os Tubos de Amostra para a BSC.
B. Processamento das Culturas Positivas para Teste BD ProbeTec ET ctb - Dentro da BSC
NOTA: Na preparação para decantar as amostras, prepare um recipiente para desperdícios líquidos com potencial risco biológico.
1. Para reduzir o inóculo de microrganismos variável das culturas e meio sólido, assegure-se de que a amostragem do crescimento, tubo de processamento no vórtex e preparação da diluição são executados correctamente. Para meios sólidos, execute os seguintes passos:
a. Usando uma ansa de cultura de plástico de 1 µL estéril, transfira o material de uma única colónia da placa de cultura para o primeiro Tubo de Processamento de Amostra rotulado e contendo 1 mL de Tampão de Lavagem 1 MCI.
b. Rode a ansa no tampão durante 5 segundos para remover o microrganismo da ansa. Elimine a ansa. c. Tape o Tubo de Processamento de Amostras e submeta ao vórtice durante 5 segundos.
d. Utilizando uma ponta resistente a aerossóis, transfira 10 µL do primeiro Tubo de Amostra para o segundo Tubo de Amostra. Volte a tapar os dois tubos e descarte o primeiro Tubo de Amostra.
e. Repita os passos a-d para cada cultura sólida. O teste prossegue com o segundo Tubo de Amostra. Prossiga para o passo 3.
2. Para cada cultura líquida, execute os seguintes passos:
a. Misture o recipiente de cultura durante 5 segundos para garantir uma mistura homogénea dos microrganismos no meio cultura líquido. Processe um cultura de cada vez.
b. Utilizando uma ponta resistente a aerossóis, transfira 500 µL do meio líquido para o tubo adequadamente rotulado como Tubo de Amostra contendo 1 mL de Tampão de Lavagem 1 MCI
c. Tape bem o tubo.
d. Repita os passos a-c para cada cultura líquida a testar. 3. MUDE DE LUVAS.
4. Agite cada tubo de amostra no vortex durante 5 segundos.
5. Coloque cada tubo no rotor com contenção de aerossóis e fixe firmemente a tampa de contenção de aerossóis. Limpe o exterior do rotor com folhas de papel ou compressas humedecidas com uma solução anti-microbiana.
6. Transfira o rotor com contenção de aerossóis para a microcentrifugadora. Centrifugue as amostras a 12.200 x g durante 3 min. NOTA: Devem seguir-se as condições de centrifugação especificadas, dado que uma centrifugação insuficiente pode dar origem a resultados falsos negativos.
7. Imediatamente depois da centrifugação, retire cuidadosamente o rotor da microcentrifugadora (sem disromper o vedante de aerossóis) e volte a colocar o rotor na BSC.
8. Retire a tampa de contenção de aerossóis e retire imediatamente as amostras do rotor, usando de precaução para minimizar a re-mistura do sobrenadante e sedimento.
9. Destape o primeiro tubo e decante o sobrenadante para o recipiente de desperdícios líquidos na BSC. Use um movimento de inversão suave e termine com um movimento brusco descendente do tubo invertido. NOTA: O sedimento pode desprender-se no decurso do tempo. Execute os passos 7, 8 e 9 sem demora.
10. Volte a colocar firmemente a tampa e coloque o tubo no Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL. 11. Repita os passos 9 e 10 para todas as amostras.
12. MUDE DE LUVAS.
C.1. Aquecimento da amostra - Forno BD ProbeTec ET
NOTAS: Certifique-se de que os tubos de amostra estão firmemente tapados.
Antes de aquecer as amostras no forno, inspeccione visualmente as tampas dos Tubos de Amostra para confirmar que os anéis em O estão correctamente assentes. Se o anel em O parecer distorcido ou estiver ausente, substitua por uma nova tampa.
Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET para instruções de funcionamento completas, incluindo precauções e advertências relevantes.
1. Coloque o Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL no forno e feche a porta. 2. Seleccione RUN #01. prima “OK”.
3. Prima “START” (INICIAR) para inicializar a execução. 4. Quando a série se iniciar, execute os seguintes passos:
a. Prepare o Banho Sónico BD ProbeTec ET. Este inclui: (1) Coloque o insersor do Banho Sónico no banho.
(2) Encha o Banho Sónico até à linha indicadora de “Máximo” com água corrente quente. (NOTA: Não se deve utilizar água desionizada.)
(3) Defina a temperatura para 65 °C e ligue o aquecedor.
(4) Funcione com os ultrassons durante 60 min (predefinição) com a tampa do banho sónico colocada. b. Fixe o rotor padrão na microcentrifugadora.
5. Decorridos 15 min de ciclo de aquecimento, verifique e registe o termómetro externo do forno para se certificar que a temperatura é ≥ 95 °C.
6. No final da série, será ouvido um apito e o LCD irá indicar que a execução DONE (terminou). Liberte o trinco da porta premindo a tecla DOOR OPEN (ABRIR PORTA) e retire o Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL. NOTA: Qualquer micobactéria presente nos Tubos de Amostra é agora inviável e as manipulações subsequentes
podem ocorrer fora da BSC. As amostras devem continuar a ser tratadas como representando um potencial risco biológico.
C.2. Aquecimento de Amostras - Forno de Laboratorial de Utilização Geral NOTAS: Certifique-se de que os tubos de amostra estão firmemente tapados.
Antes de aquecer as amostras na estufa, inspeccione visualmente as tampas dos Tubos de Amostra para confirmar que os anéis em O estão correctamente assentes. Se o anel em O parecer distorcido ou estiver ausente, substitua por uma nova tampa.
Consulte o manual do utilizador do forno para instruções de funcionamento completas, incluindo precauções e advertências relevantes.
1. Coloque o Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL na estufa e feche a porta.
2. A temperatura da amostra deve atingir 101 ± 1 °C por um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min. Siga as instruções de tempo e temperatura de incubação adequadas.
3. Enquanto as amostras estão a ser aquecidas no forno, efectue os seguintes passos: a. Prepare o Banho Sónico BD ProbeTec ET. Este inclui:
(1) Coloque o insersor do Banho Sónico no banho.
(2) Encha o Banho Sónico até à linha indicadora de “Máximo” com água corrente quente. (NOTA: Não se deve utilizar água desionizada.)
(3) Defina a temperatura para 65 °C e ligue o aquecedor.
(4) Funcione com os ultrassons durante 60 min (predefinição) com a tampa do banho sónico colocada. b. Fixe o rotor padrão na microcentrifugadora.
4. Concluído o ciclo de aquecimento do forno, retire o Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL.
ADVERTÊNCIA: Não manuseie o Suporte de Amostras quentes sem o Equipamento de Protecção Pessoal (EPP). A falha em efectuar esta acção pode causar queimaduras.
NOTA: Qualquer microbactéria presente nos Tubos de Amostra é agora inviável e as manipulações
subsequentes podem ocorrer fora da BSC. As amostras devem continuar a ser tratadas como representando um potencial risco biológico.
D. Lise da Amostra - Banho Sónico BD ProbeTec ET
ADVERTÊNCIA: Não coloque os dedos nem as mãos no banho sónico quando os ultra-sons estiverem ligados (ON). Se o fizer poderá sentir desconforto e, possivelmente, irritação cutânea. Também poderão ocorrer lesões nos tecidos moles a longo prazo.
ADVERTÊNCIA: Não use um termómetro de mercúrio para verificar a temperatura do Banho Sónico. Para esta finalidade, é fornecido um termómetro digital.
NOTA: Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET para instruções de funcionamento completas, incluindo precauções e advertências relevantes.
1. Coloque os Tubos de Amostra na microcentrifugadora com o rotor padrão. 2. Feche a tampa e pulse a centrífuga durante 10 segundos.
3. Retire os tubos da centrífuga e examine os tampas dos tubos relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação.
4. Volte a colocar os tubos no Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL.
5. Retire a tampa do primeiro tubo. Utilizando uma pipeta com ponta resistente a aerossóis, dispense 100 µL de Tampão de Lise 2 MCI no tubo. Volte a colocar e aperte a tampa do tubo de amostra.
6. Repita para todas as amostras utilizando uma nova ponta para cada amostra. 7. MUDE DE LUVAS.
8. Leve todos os tubos ao vortex durante 5 segundos. À medida que os tubos são colocados novamente no Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL, assegure-se de que os tubos estão firmemente tapados e empurre o tubo de forma a que a margem do tubo fique assente na ranhura do suporte. Tal orienta correctamente os tubos para máxima exposição à energia ultra-sónica.
9. Desligue os ultrassons (OFF) e confirme que o nível de água fica entre as linhas indicadoras “Mínimo” e “Máximo” do insersor do Banho Sónico. Retire ou adicione água corrente quente conforme for necessário. Verifique a temperatura do banho sónico com o termómetro digital para garantir que a temperatura é de 65 ± 5 °C. Retire o termómetro do banho.
10. Transfira a Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL para o Insersor do Banho Sónico. Volte a colocar a tampa do banho sónico.
11. Defina o cronómetro do banho sónico para 45 minutos, LIGUE os ultrassons.
12. No final da aplicação de ULTRASSONS, desligue o banho sónico e retire o Suporte para Tubos de Amostra de 2 mL. Coloque o suporte em folhas de papel absorvente para secar.
E. Neutralização da Amostra
1. Coloque os Tubos de Amostra na microcentrifugadora com o rotor padrão. 2. Feche a tampa e pulse a centrífuga durante 10 segundos.
3. Retire os tubos da centrífuga e examine os tampas dos tubos relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação.
4. Coloque os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente.
5. Retire a tampa do primeiro tubo. Utilizando uma pipeta com ponta resistente a aerossóis, dispense 600 µL de Tampão de Neutralização 3 MCI no tubo. Volte a colocar e aperte a tampa do tubo de amostra.
6. Repita para todas as amostras utilizando uma nova ponta para cada tubo. 7. MUDE DE LUVAS.
8. Agite todos os tubos no vortex durante 5 segundos. 9. Centrifugue os tubos seguindo os passos 1–3, em cima.
10. Coloque novamente os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente.
11. As amostras processadas estão agora prontas para serem testadas no Sistema BD ProbeTec ET. NOTA: Se o teste não for efectuado de imediato, as amostras processadas podem ser armazenadas da
seguinte forma:
a. A 18–33 °C durante um período máximo de 12 h.
b. A 2–8 °C durante um período máximo de 5 dias. As amostras devem ser colocadas no vórtex durante 5 segundos e reaquecidas no forno BD ProbeTec ET ou forno de laboratório de utilização geral capaz de aquecer a amostra até 101 ± 1 °C durante um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min, antes de serem testadas.
c. Congeladas a -20 °C ou temperatura inferior (sem ciclismo) durante um período máximo de 3 meses. As amostras congeladas devem ser descongeladas à temperatura ambiente, colocadas no vórtex durante 5 segundos e reaquecidas no forno BD ProbeTec ET ou forno de laboratório de utilização geral capaz de aquecer a amostra até 101 ± 1 °C durante um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min, antes de serem testadas.
d. Depois dos tubos serem reaquecidos (nos passos b e c, acima) coloque os tubos na microcentrifugadora utilizando o rotor padrão. Feche a tampa e centrifugue durante 10 segundos. Retire os tubos da centrífuga e examine as tampas dos tubos relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação. Coloque os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente. As amostras estão agora prontas para serem testadas no Sistema BD ProbeTec ET.
PROCEDIMENTO DE TESTE A. Preparação do instrumento
1. Ligue o instrumento e deixe aquecer antes de iniciar o ensaio.
a. O aquecedor para inicialização e aquecimento requer aproximadamente 90 min para aquecimento e estabilização.
A temperatura definida para o componente de inicialização do aquecedor para inicialização e aquecimento é de 72,5 °C.
A temperatura definida para o componente de aquecimento do aquecedor para inicialização e aquecimento é de 54 °C.
b. O instrumento BD ProbeTec ET é controlado por software e requer, aproximadamente, 30 min para aquecer. 2. As temperaturas dos Fornos de Inicialização e Aquecimento têm de ser verificadas antes de se iniciar o teste.
A temperatura indicada no termómetro do Forno de Inicialização tem de estar situada no intervalo 72–73 °C. A temperatura indicada no termómetro do Forno de Aquecimento tem de estar situada no intervalo 53,5–54,5 °C.
3. Verifique a temperatura exibida no ecrã do instrumento BD ProbeTec ET. A temperatura deve situar-se entre 47,5 e 55 °C.
B. BD ProbeTec ET Pipettor
Consulte o Manual de Operação do Sistema BD ProbeTec ET sobre a explicação pormenorizada das funções do teclado do Pipetador BD ProbeTec ET.
Para efectuar o ensaio do complexo Mycobacterium tuberculosis (ctb) são necessários os seguintes programas: O Programa 1 transfere líquido das amostras processadas para os Micropoços de Inicialização ctb. O programa 5 transfere líquido dos micropoços de inicialização para os micropoços de amplificação.
Programar o pipetador do seguinte modo: Programa 1:
1. Ligue o pipetador (posição de ligado). O pipetador irá emitir um sinal sonoro, mostrar rapidamente “ZERO”, mostrar rapidamente o n.° de versão do software e, por fim, emitirá novo sinal sonoro.
2. Prima a tecla azul “Prog” (Programa). Prima a tecla “Vol” (Volume), até ser exibido “1”, para seleccionar o programa 1. Prima “Enter”.
3. Para entrar no modo de programação, prima e mantenha premida a tecla “Prog”. Mantendo a tecla “Prog” premida, prima em simultâneo a tecla de função especial com uma ponta de pipeta ou a extremidade de um clipe de papel.
4. Prima “Fill” (Encher). Premir a seta de direcção para cima, até aparecer 200. Prima “Enter”. 5. Prima “Disp” (Dispensar). Premir a tecla com a seta para cima, até aparecer 150. Prima “Enter”.
6. Prima novamente “Enter”, para guardar o programa e sair. Será emitido um sinal sonoro para indicar que a programação foi concluída.
7. Verifique o programa, premindo o gatilho para avançar para a acção seguinte. À medida que efectua cada um dos passos, estabeleça a velocidade de aspiração/distribuição utilizando a tecla “Vol”. O indicador de Velocidade aparece em cada acção. Utilize a tecla “Vol” para regular o indicador de velocidade, de forma a mostrar 2 quadrados para os passos “Fill” e “Disp” e 3 quadrados para o passo de “Purge”.
Programa 5:
1. Prima a tecla “Prog”. Prima a tecla “Vol”, até ser exibido “5”, para seleccionar o programa 5. Prima “Enter”. 2. Para entrar no modo de programação, prima e mantenha premida a tecla “Prog”. Mantendo a tecla “Prog” premida, prima em simultâneo a tecla de função especial com uma ponta de pipeta ou a extremidade de um clipe de papel.
3. Prima “Fill”. Prima a seta para cima, até ser exibido 100. Prima “Enter”.
4. Prima “Disp”. Premir a tecla com a seta para cima, até aparecer 100. Prima “Enter”. 5. Prima “Mix” (Misturar). Premir a tecla com a seta para cima, até aparecer 50. Prima “Enter”.
6. Prima novamente “Enter”, para guardar o programa e sair. Será emitido um sinal sonoro para indicar que a programação foi concluída.
7. Verifique o programa, premindo o gatilho para avançar para a acção seguinte. À medida que efectua cada uma dos passos, estabeleça a velocidade de aspiração/distribuição/mistura utilizando a tecla “Vol”. O indicador de Velocidade aparece em cada acção. Utilize a tecla “Vol” para ajustar o indicador de velocidade, de forma a mostrar 2 quadrados para as funções de aspiração e distribuição. Utilize a tecla “Vol” para regular a velocidade de mistura, de forma a serem mostrados 3 quadrados.
Revisão do Programa
Os programas devem ser revistos antes de se iniciar o procedimento. Para rever os programas, LIGUE o pipetador. Prima a tecla azul “Prog” (Programa). Prima a tecla “Vol”, até ser exibido o número de programa apropriado. Prima a tecla “Enter”. Utilizar o gatilho de pipetagem para avançar uma acção de cada vez no programa.
Programa 1: Este programa aspira 200 µL e distribui 150 µL. O visor do pipetador deve apresentar a seguinte leitura: Fill (Enchimento) 200 µL – SII
Reveja o programa 5 da mesma forma:
Programa 5: Este programa aspira 100 µL, dispensa 100 µL e mistura 50 µL três vezes. O visor do pipetador deve apresentar a seguinte leitura:
Fill (Enchimento) 100 µL – SII Dispense (Dispensa) 100 µL – SII Mix (Mistura) 50 µL – SII I Zero (intermitente) C. Disposição da Placa
O Relatório de Configuração da Placa é criado pelo instrumento BD ProbeTec a seguir ao tipo ou tipos de teste, à identificação da amostra e aos números de controlo dos lotes, sendo os números de lote dos conjuntos registados no sistema. O Relatório de Configuração da Placa mostra a configuração física das amostras e controlos de cada placa a testar. Esta orientação aplica-se à placa do Micropoço de Inicialização e à placa do Micropoço de Amplificação. Para o ensaio ctb, os micropoços de inicialização são tiras de micropoços de cor branca uniforme. Os micropoços de amplificação são tiras de micropoços com riscas brancas.
D. Preparação dos Controlos do Ensaio
NOTA: Os Controlos BD ProbeTec ET MCI, Tampão de Lise 2 MCI e Tampão de Neutralização 3 MCI devem estar à temperatura ambiente antes da utilização. Use tampões que tenham sido previamente objecto de alíquotas para o processamento de amostra. Misture bem antes de utilizar.
1. Para cada série de tubos (placa) a ser testada, prepare um tubo de Controlo Negativo MCI e um tubo de Controlo Positivo MCI. Se uma placa contiver mais de um número de lote da embalagem de reagente crb, os controlos devem ser testados com cada lote.
2. Retire a tampa do tubo de controlo negativo:
a. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 100 µL de Tampão de Lise 2 MCI. b. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 600 µL de Tampão de Neutralização 3 MCI. 3. Volte a tapar firmemente o tubo e agite no vortex durante 5 segundos.
4. Retire a tampa do tubo de controlo positivo:
a. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 100 µL de Tampão de Lise 2 MCI. b. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 600 µL de Tampão de Neutralização 3 MCI. 5. Volte a tapar firmemente o tubo e agite no vortex durante 5 segundos.
6. Coloque os tubos de controlo na microcentrifugadora com o rotor padrão. Feche a tampa e centrifugue durante 10 segundos. Retire os tubos da centrífuga e coloque no Suporte de Pipeagem Transparente. E. Procedimento do teste
1. Retire e descarte as tampas dos tubos de amostra e controlos para a primeira série. 2. MUDE DE LUVAS.
3. Utilizando o Relatório de Disposição da Placa como orientação, prepare a placa do Micropoço de Inicialização. 4. Volte a selar a bolsa do Micropoço de Inicialização, conforme indicado a seguir.
a. Coloque a bolsa numa superfície plana. Segure horizontalmente o lado aberto com uma das mãos. b. Exercendo pressão, deslize um dedo pela parte exterior do selo, de uma extremidade da bolsa até à outra. c. Inspeccione para verificar se a bolsa está selada.
5. Seleccione o programa 1 no Pipetador BD ProbeTec ET.
6. Adapte as pontas de pipetas. Expanda o pipetador, puxando totalmente o botão de afastamento.
NOTA: Quando aspirar amostras, evite escombros esféricos que podem entupir as pontas das pipetas e
afectar os resultados do teste.
NOTA: Verifique se as pontas estão firmemente adaptadas no pipetador, para evitar fugas. 7. Aspire 200 µL da primeira coluna de amostras.
8. Colapse suavemente o pipetador, toque com as pontas das pipetas nas paredes laterais do poço e distribua 150 µL na primeira coluna de micropoços de inicialização (1A-H).
NOTA: A distribuição de líquidos contra a parede interior dos micropoços é importante para garantir exactidão e precisão e para evitar contaminação cruzada.
9. Descarte as pontas. Prima o gatilho de pipetagem para rearmar o pipetador.
10. Escolha novas pontas, desenrole o pipetador e aspire 200 µL da segunda coluna de amostras.
11. Apertar ligeiramente o pipetador, encostar as pontas de pipeta às paredes dos poços e dispensar 150 µL para a 2ª coluna de Micropoços de Inicialização (2 A-H).
NOTA: Não aperte o pipetador sobre as amostras ou os micropoços, para evitar a contaminação. Os movimentos bruscos podem dar origem a salpicos ou aerossóis.
12. Descarte as pontas.
NOTA: Elimine as pontas com cuidado para evitar a ocorrência de derrames ou gotículas que possam contaminar a área de trabalho.
13. Continue a transferir as outras amostras da série.
14. Tape a placa de micropoços de inicialização com a cobertura de placa de inicialização e deixe a placa incubar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 min. (Pode incubar até 6 h.)
15. No fim da incubação de Inicialização, prepare a Placa de Micropoços de Amplificação. Configure os micropoços de amplificação na placa para corresponderem ao Relatório de Disposição da Placa (igual à placa de inicialização). Sele novamente a bolsa do Micropoço de Amplificação conforme descrito no passo 4. 16. Retire a tampa da placa de Micropoços de Inicialização e transfira a placa para a Forno de Inicialização.
Coloque IMEDIATAMENTE a placa de micropoços de amplificação no aquecedor para pré-aquecimento.
17. Regule o temporizador para 10 min (NOTA: O tempo neste passo é fundamental.)
18. No fim do período de incubação de 10 min (+/- 1 min), seleccione o programa 5 no pipetador.
19. Adapte imediatamente novas pontas de pipeta e transfira 100 µL da 1 coluna da placa de micropoços de inicialização para a 1 coluna da placa de micropoços de amplificação. Encoste as pontas de pipeta às paredes dos poços e dispensar o líquido. Após a distribuição, deixe o pipetador misturar automaticamente o líquido dos poços.
20. Descarte as pontas. Adapte novas pontas e continue a transferir a mistura da reacção dos micropoços de inicialização para os micropoços de amplificação, coluna a coluna, utilizando pontas novas para cada coluna. 21. Quando a última coluna tiver sido transferida, retire o apoio de um vedante de Amplificação. (Um vedante
de placas de 1/2 irá cobrir um máximo de 6 colunas. Se a placa tiver mais do que seis colunas, TEM de ser utilizada uma folha inteira de vedante). Segurar o vedante pelos bordos e aplicá-lo sobre os micropoços. Use as guias do Forno de Aquecimento como auxiliares na aplicação do vedante. Exercer pressão sobre o vedante para garantir que todos os micropoços ficam totalmente vedados.
22. Na interface do utilizador do BD ProbeTec ET, desloque o transportador para fora e abra a porta e levante a tampa da placa. Transfira IMEDIATAMENTE (no espaço de 30 segundos) a placa de Micropoços de Amplificação selada para o Instrumento BD ProbeTec ET e inicie a série. (Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET, para obter instruções pormenorizadas.)
23. Depois de iniciar a análise, complete a fase do procedimento de limpeza descrita a seguir:
a. Sele a placa de Micropoços de Inicialização com um selador de amplificação e retire a placa do aquecedor para inicialização e aquecimento. (use a luva resistente ao calor para retirar a placa - a temperatura é superior a 70 °C).
b. Deixe arrefecer a placa em cima da bancada durante 5 minutos. Elimine os Micropoços de Inicialização num recipiente próprio para resíduos de contaminantes biológicos perigosos.
c. Limpe a placa de metal:
Lave a placa com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Lave a placa com água destilada ou desionizada.
Envolva a placa numa toalha limpa e deixe secar completamente ao ar, antes de voltar a utilizar. 24. Quando a análise estiver concluída, será elaborada uma cópia impressa dos resultados do teste. 25. Retire da plataforma o transportador da placa, abra a porta e retire a placa. Feche a porta e coloque a
plataforma da placa novamente dentro do instrumento.
26. Retire os micropoços de amplificação selados da placa. CUIDADO: Não retire o material de selagem dos micropoços. Os micropoços selados podem ser facilmente retirados como uma unidade, segurando o selo em cima e em baixo e levantando a direito, para fora da placa. Colocar os micropoços selados no Saco de Eliminação. Selar o saco.
27. Limpe a placa de metal:
Lave a placa com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Lave a placa com água destilada ou desionizada.
Envolva a placa numa toalha limpa e deixe secar completamente ao ar, antes de voltar a utilizar. 28. Após a última série do dia, efectuar o seguinte processo de limpeza:
a. Limpe as bancadas com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Deixe que a solução permaneça nas superfícies de trabalho durante 2 a 3 minutos, depois limpe com água destilada ou desionizada.
b. Limpe a Suporte do Suporte de Tubos de Amostra e Suporte de Pipetagem Transparente mergulhando em hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox durante menos de 60 segundos. Lave minuciosamente com água destilada ou desionizada e deixe secar ao ar.
c. Limpe as superfícies exteriores do Forno de Aquecimento e Inicialização e do Instrumento BD ProbeTec ET com hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Limpe as superfícies com água destilada ou desionizada. d. Limpe a pega do Pipetador (APENAS A PEGA) com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v). Limpe a
pega com água destilada ou desionizada e seqye com um pano limpo. e. Recarregar o Pipetador.
f. Descartar o Saco de Eliminação e o lixo que represente perigo biológico, de acordo com os procedimentos para eliminação de material contaminado.
CONTROLO DE QUALIDADE
O BD ProbeTec ET MCI Control Set é fornecido em separado. Em cada série de ensaios e para cada novo número de lote do kit de reagentes devem ser incluídos um controlo positivo e um controlo negativo. Os controlos podem estar posicionados ao acaso. O controlo positivo MCI monitoriza falhas de reagente substanciais, conclusão dos elementos essenciais do procedimento (pipetagem e incubações), amplificação e detecção. O controlo negativo MCI monitoriza a contaminação de reagentes e/ou ambiental. Os controlos positivo e negativo MCI têm de ser testados, respectivamente, como positivo e negativo, para o relatório de resultados das amostras. Se o desempenho dos controlos não for o esperado, a série do ensaio é considerada inválida e o instrumento não apresenta os resultados
do doente. Caso o CQ não atinja os resultados esperados, repita toda a série utilizando um novo conjunto de controlos, novos micropoços e amostras processadas. Se a repetição do CQ não apresentar os resultados esperados, contacte os Serviços Técnicos (consultar “Interpretação dos resultados”). Consulte a secção D de “PROCEDIMENTO DO TESTE”, para obter instruções sobre a preparação de controlos. Após a preparação dos controlos, prossiga com os testes, conforme descrito na secção E de “PROCEDIMENTO DO TESTE”.
Um Controlo de Amplificação Interno (IAC) está incorporado em cada micropoço. O IAC contém o ácido nucleico pretendido, que é amplificado na presença da matriz da amostra. O IAC destina-se a confirmar a validade da reacção de amplificação e identificar a potencial inibição da amostra processada.
Controlo do Processamento da Amostra:
Para testar a eficácia do processamento da amostra, deve ser testado por rotina um controlo do procedimento, em conformidade com as regulamentações locais. O controlo do procedimento consiste numa suspensão de M. tuberculosis estirpe H37Ra (e.g., ATCC 25177). A suspensão deve ser preparada da seguinte forma:
1. Prepare uma suspensão de McFarland Nº 1 do microrganismo.
2. Dilua a suspensão de McFarland a 1:100 em caldo Middlebrook 7H9 com glicerol (por exemplo, pipete 0,1 mL de
suspensão de McFarland em 9,9 mL de caldo Middlebrook 7H9 com glicerol e homogeneíze totalmente).
3. Alíquotas de 1,0 mL podem ser congeladas a -20 °C ou a temperatura inferior (sem ciclismo).
4. A suspensão de células deve ser preparada como uma amostra para teste no sistema BD ProbeTec ET.
Monitorização da Presença de Contaminação por ADN:
Antes da primeira execução do ensaio BD ProbeTec ET e pelo menos uma vez por mês, deverá efectuar o procedimento de teste descrito em seguida, de forma a monitorizar a área de trabalho e as superfícies do equipamento em relação à contaminação com ADN. A monitorização ambiental é essencial para detectar a contaminação antes que se desenvolva um problema.
1. Use uma zaragatoa CultureSwab EZ para cada área a testar*.
2. Rotule um Tubo de Amostra por cada área a monitorizar com zaragatoa e pipete 100 µL de Tampão de Lise 2 e 600 µL de Tampão de Neutralização 3 MCI para cada tubo.
3. Mergulhe a primeira zaragatoa no tampão de mistura do Tubo de Amostra e limpe a primeira área com um movimento de limpeza amplo.
4. Misture a zaragatoa na mistura tampão, aperte a zaragatoa, tape novamente o tubo e leve ao vortex durante 5 segundos. Descarte as zaragatoas.
5. Repita o processo em todas as áreas.
6. Coloque os tubos no Suporte de Tubo de Amostra e aqueça no forno (secção C do “PROCEDIMENTO DE PROCESSAMENTO DA CULTURA”).
7. Enquanto os tubos estão a incubar, remova a mistura tampão das superfícies tratadas, utilizando toalhetes limpos embebidos em água.
8. Depois de aquecer, coloque os tubos na microcentrifugadora com o rotor padrão, feche a tampa e centrifugue com pulsos durante 10 segundos.
9. Retire os tubos da centrífuga e examine os tampas relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação.
10. Coloque os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente e prossiga para o “PROCEDIMENTO DE TESTE”. *Áreas a testar recomendadas: superfície do forno, banho sónico, Suporte para Tubos de Amostra, Suporte de Pipetagem Transparente, Aquecedor de Inicialização e Aquecimento, placas do micropoço negro, pega do pipetador, teclas de toque do instrumento, teclado do instrumento e bancada de trabalho.
Se uma área produzir um resultado positivo, limpá-la com hipocloreto de sódio a 1% (v/v) em Alconox. Humedeça toda a área com a solução de lixívia e deixe a solução de lixívia permanecer na superfície durante, pelo menos, 2 minutos ou até secar. Se necessário, remova o excesso de solução de lixívia com um toalhete limpo. Limpe a área com um toalhete limpo embebido em água destilada ou desionizada e deixe secar a superfície. Teste novamente a área. Repita até obter resultados negativos. Se a contaminação não for resolvida, contacte os Serviços Técnicos para mais informações.
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Resultado do ensaio ctb Relatório Recomendado
Positivo “O ensaio de sonda de identificação da cultura é positivo para a presença de ADN do
complexo M. tuberculosis”.
Negativo “O ensaio de sonda de identificação da cultura é negativo para a presença de ADN do
complexo M. tuberculosis”.
Indeterminado Repita o ensaio de sonda de identificação de cultura a partir da amostra processada,
se o volume for suficiente. Se o resultado repetido for positivo ou negativo, utilize a afirmação adequada descrita em cima. Se ainda for indeterminado, repita o teste a partir da cultura positiva.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
1. Este método só foi testado com isolados crescidos em meios de crescimento de micobactérias à base de ovo, à
base de agar ou líquidos. Não foi avaliado o desempenho com outros meios de crescimento. A eficácia deste ensaio não foi demonstrada com testes directos de amostras.
2. O ensaio BD ProbeTec ET ctb não foi avaliado para teste do crescimento de AFB em culturas primárias de sangue
3. O ensaio BD ProbeTec ET ctb não pode ser usado para distinguir entre membros do complexo M. tuberculosis - M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti Foi referido que todas as espécies/sub-espécies do complexo M. tuberculosis apresentam região IS6110. Algumas variantes não possuem a sequência de insersão
IS6110 8 e não serão positivas no ensaio BD ProbeTec ET ctb.
4. O não seguimento das instruções do procedimento conforme descrito pode afectar os resultados do teste (por
exemplo, centrifugação incompleta, pipetagem de escombros esféricos).
5. As culturas líquidas testadas com o ensaio BD ProbeTec ET ctb podem ser objecto de subcultura para
isolar crescimento micobacteriano misto e para confirmar a identificação de espécies dentro do complexo M. tuberculosis.
6. A utilização do ensaio para Identificação de Culturas de ctb BD ProbeTec ET está limitada a pessoas com formação
adequada sobre o procedimento de ensaio e sobre o Sistema BD ProbeTec ET.
7. O ensaio para Identificação de Culturas de ctb BD ProbeTec ET não se destina a substituir a cultura para fins de
teste de sensibilidade antimicrobiana.
8. O ensaio para Identificação de Culturas de ctb BD ProbeTec ET fornece resultados qualitativos. Não pode ser
estabelecida nenhuma correlação entre a grandeza do valor MOTA e o número de células numa amostra positiva.
9. A sequência de sonda do complexo M. tuberculosis, IS6110, é específica para M. tuberculosis, M. bovis,
M. bovis BCG, M. africanum e M. microti.
10. Se estiver a utilizar um forno de laboratório de utilização geral, certifique-se de que o líquido existente nos tubos de amostra atinge uma temperatura de 101 ± 1 °C durante, pelo menos, 30 min para tornar inviável qualquer microbactéria presente nos tubos.
RESULTADOS ESPERADOS
Foi colhido um total de 366 amostras em quatro locais geográficos distintos de estudo clínico para avaliar o ensaio BD ProbeTec ET ctb. Foi obtido um total de 722 resultados com o ensaio BD ProbeTec ET ctb. A distribuição da frequência dos valores MOTA iniciais é mostrada na Figura 1 (comparativamente com o método de referência de sonda não amplificada) e Figura 2 (comparativamente com o resultado de ID Final).
A presença ou ausência de complexo Mycobacterium tuberculosis é determinada relacionando os resultados de BD ProbeTec ET ctb MOTA para as amostras com valores limite pré-determinados. O resultado MOTA é utilizado para avaliar a grandeza do sinal produzido em resultado da reacção. A grandeza do resultado MOTA não constitui uma indicação do nível de organismo presente na amostra. Todos os cálculos são efectuados automaticamente pelo software do instrumento.
As amostras testadas nos quatro locais foram identificadas pelo BD ProbeTec ET como positivas, negativas ou indeterminadas. Amostras com resultados inicialmente considerados indeterminados foram repetidas. Foi apenas uma amostra que produziu um resultado indeterminado no teste inicial. Esta amostra resolveu como negativa quando repetida.
Comparativamente com a ID Final, a pontuação MOTA média para os resultados positivos foi de 49.804 com um intervalo de 242 a 76.610 e uma mediana de 49.920. A pontuação MOTA média para resultados negativos foi de 2.057 com um intervalo de 0 a 71.919 e uma mediana de 47. O limite da pontuação MOTA é de 7000.
Figura 1: Distribuição de frequências das pontuações MOTA ctb comparativamente com a Sonda Não Amplificada
0 100 200 300 400 500 600 60.000- 79.999 40.000- 59.999 20.000- 39.999 7.000- 19.999 < 7.000 473 MOTA (-) (+) 1 7 33 10 135 3 54
2 4 Sonda Não Amplificada TB (+)
Sonda Não Amplificada TB (-)
Fr
equência
Distribuição de frequências das pontuações MOTA ctb comparativamente com a Sonda Não Amplificada Resultado de referência
(Sonda Não Amplificada) < 7.000 7.000 – 19.999 20.000 – 39.999 40.000 – 59.999 60.000 – 79.999
Mtbc (+) 1 4 33 135 54
Figura 2: Distribuição de frequências das pontuações MOTA ctb comparativamente com a ID Final 0 100 200 300 400 500 600 60.000- 79.999 40.000- 59.999 20.000- 39.999 7.000- 19.999 < 7.000 473 MOTA (-) (+) 1 7 33 10 135 3 54 2 4 ID Final de TB (+) ID Final de TB (-) Fr equência
Distribuição de frequências das pontuações MOTA ctb comparativamente com a ID Final Resultado de referência (ID final) < 7.000 7.000 – 19.999 20.000 – 39.999 40.000 – 59.999 60.000 – 79.999 Mtbc (+) 1 4 33 135 54 Mtbc (-) 473 2 7 10 3 CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO Avaliação clínica:
O ensaio BD ProbeTec ET ctb foi avaliado em quatro locais clínicos diversos do ponto de vista geográfico. Foi obtido um total de 722 resultados, de 366 amostras, com o ensaio BD ProbeTec ET ctb. Estes resultados foram comparados com um ensaio de sonda não amplificada e são mostrados no Quadro 1, sendo os resultados para a ID final mostrados no Quadro 2. As amostras discordantes foram identificadas com outro método (método de ID de referência); bioquímico, GLC ou HPLC.
Quadro 1: Resultado de ctb Comparativamente com o Resultado da Sonda Não Amplificada resultados de ctb Sonda Não Amplificada (+) Sonda Não Amplificada (-)
(+) 226 22
(-) 1 473
Quando comparadas com o resultado da sonda não amplificada, a sensibilidade e especificidade calculadas foram de 99,6% (226/227) e 95,6% (473/495). A concordância percentual global foi de 96,8% (699/722).
Quadro 2: Resultado de ctb Comparativamente com o Resultado de ID Final resultados de ctb ID Final (+) ID Final (-)
(+) 226 22
(-) 1 473
Quando comparadas com a ID Final, a sensibilidade e especificidade calculadas foram de 99,6% (226/227) e 95,6% (473/495). A concordância percentual global foi de 96,8% (699/722).
Dos 23 isolados discordantes, um foi negativo pelo ensaio BD ProbeTec ET ctb e foi identificado como complexo M. tuberculosis pelo método de ID de referência. Nenhum dos 22 isolados positivos pelo ensaio BD ProbeTec ET ctb foi identificado como complexo M. tuberculosis pelo método de ID de referência.
APRESENTAÇÃO N.° de cat. Descrição
440621 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack, 24 testes.
440636 BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Specimen Processing Kit.
440635 BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Control Set.
440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (20 Coberturas de preparação, Vedantes para a Amplificação e Sacos de
Descarte.).
440458 Pipette Tips, 6 x 120.
440661 BD ProbeTec ET Sample Tubes and Caps, 2 mL 200/emb
440679 BD ProbeTec ET Sample Tube Caps, 2 mL, 200/emb
440681 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tube Rack
440698 Clear Pipetting Rack.
440478 BD ProbeTec ET Instrument.
440480 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, (120V).
440487 BD ProbeTec ET Pipettor.
441752 Oven Large Convection 230 V.
440689 BD ProbeTec ET Sonic Bath.
BIBLIOGRAFIA:
1. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS,
Centers for Disease Control, Atlanta.
2. Walker, G. T., Frasier, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G., Malinowski, D. P. 1992. Strand displacement
amplification – an isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Res. 20(7):1691–1696.
3. Little, M. C., Andrews, J., Moore, R., Bustos, S., Jones, L., Embres, C., Durmowicz, G., Harris, J., Berger, D., Yanson,
K., Rostkowski, C., Yursis, D., Price, J., Fort, T., Walters, A., Collis, M., Llorin, O., Wood, J., Failing, F., O’Keefe, C., Scrivens, B., Pope, B., Hansen, T., Marino, K., Williams, K., Boenisch, M. 1999. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BD ProbeTec ET. Clin. Chem. 45(6): 777–784.
4. Spargo, C. A., Frasier M. S., Van Cleve, M., Wright, D. J., Nycz, C. M., Spears, P. A., Walker, G.T. 1996. Detection of
M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification. Mol. Cell. Probes 10:247–256.
5. Bloodborne Pathogens. Code of Federal Regulations, Title 29, Part 1910.1030, Federal Register 1991,
56:64175-64182.
6. U.S. Dept. of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of
Health. 2007. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 5th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.
7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Approved Guideline M29-A3. Protection of laboratory workers
from occupationally acquired infections, 3rd ed. CLSI, Wayne, Pa.
8. Yuen, L.K., Ross, B.C., Jackson, K.M. and Dwyer, B. 1993. Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains
from Vietnamese patients by southern blot hybridization. J. Clin. Micro. 31:1615-1618.
Assistência Técnica e Suporte da BD Diagnostics: fora dos EUA, contacte o representante local da BD ou visite www.bd.com/ds.
Manufacturer / Производител / Výrobce / Fabrikant / Hersteller / Κατασκευαστής / Fabricante / Tootja / Fabricant / Proizvođać / Gyártó / Fabbricante / Атқарушы / 제조업체 / Gamintojas / Ražotājs / Tilvirker / Producent / Producător / Производитель / Výrobca / Proizvođač / Tillverkare / Üretici / Виробник / 生产厂商
Use by / Използвайте до / Spotřebujte do / Brug før / Verwendbar bis / Χρήση έως / Usar antes de / Kasutada enne / Date de péremption / 사용 기한 / Upotrijebiti do / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Дейін пайдалануға / Naudokite iki / Izlietot līdz / Houdbaar tot / Brukes for / Stosować do / Prazo de validade / A se utiliza până la / Использовать до / Použite do / Upotrebiti do / Använd före / Son kullanma tarihi / Використати до\line / 使用截止日期YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec měsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) ΕΕΕΕ-MM-HH / ΕΕΕΕ-MM (MM = τέλος του μήνα) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fin del mes) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj mjeseca) ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) ЖЖЖЖ-АА-КК / ЖЖЖЖ-АА / (АА = айдың соңы) YYYY-MM-DD/YYYY-MM(MM = 월말) MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mėnesio pabaiga) GGGG-MM-DD/GGGG-MM (MM = mēneša beigas) JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesiąca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârşitul lunii) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = конец месяца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet av månaden) YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) РРРР-MM-ДД / РРРР-MM (MM = кінець місяця) YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = 月末)
