Contributo para a avaliação da ingestão de carotenoides pela população portuguesa com base na sua determinação analítica em amostras representativas: efeito da sazonalidade

ISEL

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ONTRIBUTO PARA A AVALIAÇÃO DA INGESTÃO DE

CAROTENOIDES PELA POPULAÇÃO

P

ORTUGUESA COM

BASE NA SUA DETERMINAÇÃO ANALÍTICA EM AMOSTRAS

REPRESENTATIVAS

-

EFEITO DA SAZONALIDADE

LUCÉLIA NETO DA SILVA

(Licenciada em Engenharia Química e Biológica)

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre

em Engenharia Química e Biológica

Orientadores:

Doutora Maria Celeste Serra

Doutora Maria da Graça S. Bento M. Leitão Dias

Júri:

Presidente: Profª Doutora Rita Pacheco

Vogais:

Doutora Elsa Vasco

Doutora M. Graça Dias

ISEL

I

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C

ONTRIBUTO PARA A AVALIAÇÃO DA INGESTÃO DE

CAROTENOIDES PELA POPULAÇÃO

P

ORTUGUESA COM

BASE NA SUA DETERMINAÇÃO ANALÍTICA EM AMOSTRAS

REPRESENTATIVAS

-

EFEITO DA SAZONALIDADE

LUCÉLIA NETO DA SILVA

(Licenciada em Engenharia Química e Biológica)

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre

em Engenharia Química e Biológica

Orientadores:

Doutora Maria Celeste Serra

Doutora Maria da Graça S. Bento M. Leitão Dias

Júri:

Presidente: Profª Doutora Rita Pacheco

Vogais:

Doutora Elsa Vasco

Doutora M. Graça Dias

O trabalho apresentado nesta dissertação foi realizado no âmbito do 2º Ciclo em Engenharia Química e Biológica- ramo de Processos Químicos do Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, no Departamento de Alimentação e Nutrição do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP sob orientação da Doutora Maria da Graça Dias e da Professora Doutora Maria Celeste Serra.

Agradecimentos

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer ao Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge pelo financiamento e pela oportunidade de estágio.

A todas as pessoas que fazem parte do DAN, por toda a atenção recebida e pela simpatia demonstrada, especialmente pela Doutora Maria Antónia Calhau.

As minhas orientadoras, Doutora Maria da Graça Dias e Doutora Maria Celeste Serra, por todo o apoio demonstrado, atenção, simpatia, amizade, disponibilidade durante todo o período da tese.

As minhas colegas de laboratório, Mafalda Silva, Denise Costa, por todos os conselhos, carinho, atenção demonstrados principalmente nos momentos mais difíceis.

Aos meus amigos, Jerson e Daniela que me acompanharam nesse percurso académico, por todo o apoio, carinho, amizade e paciência demonstrada.

E por último, mas não menos importante, aos meus familiares, principalmente aos meus pais, pelo apoio e amor incondicional, por acreditarem em mim e por me incentivarem a continuar com essa jornada sem nunca desistir.

ii Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

Resumo

Com este trabalho determinou-se o teor de carotenoides (α-caroteno, caroteno, β-criptoxantina, licopeno, luteína e zeaxantina) em amostras compostas recolhidas no âmbito do projeto TDSExposure (Estudo de Dieta Total), principalmente em frutos e produtos hortícolas.

Avaliou-se e comparou-se o teor de carotenoides em amostras de alimentos recolhidos em diferentes estações do ano, utilizando o método analítico que se encontra acreditado no laboratório de Química do INSA pela norma ISO EN 17025 para a determinação de carotenoides em frutos e produtos hortícolas. O processo de tratamento das amostras incluiu passos de extração e saponificação. A análise dos carotenoides foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência em fase invertida, com deteção no UV/Visível a um comprimento de onda de 473 nm para o licopeno e 450 nm para os restantes carotenoides.

As análises ao material de referência interno permitiram confirmar que o método analítico nas condições utilizadas teve um desempenho adequado.

Para a comparação dos teores de carotenoides ao longo do ano utilizou-se a Diferença Mínima Significativa (DMS), calculada a partir da incerteza expandida do resultado da medição para um nível de significância de 5%.

Os resultados analíticos evidenciaram para algumas matrizes/carotenoides um efeito sazonal (salada de frutas, laranja, figo seco, melão, meloa, maçã, pera, uva, tomate, alface, pimento e feijão-verde, cenoura, nabiças e batata), mas para outras isso não aconteceu (brócolos, grelos e couve-flor).

Os resultados sobre o efeito da sazonalidade no teor de carotenoides nos frutos mostraram para o β-caroteno uma maior gama de variação ao longo do ano (0,0041-0,38 mg/100 g). Nos produtos hortícolas, ao comparar os resultados obtidos na primavera e verão, o teor de β-caroteno foi também o mais influenciado pelo efeito da sazonalidade (0,0035-8,2 mg/100 g).

Abstract

Carotenoids (α-carotene, β-carotene, β-cryptoxanthin, lycopene, lutein and zeaxanthin) were determined in composite samples collected under the TDSExposure (Total Diet Study Exposure) project, mainly on fruits and products vegetables.

The carotenoid content was evaluated and compared in food samples collected in different seasons of the year, using the analytical method that is accredited in the Chemistry Laboratory of INSA by ISO EN 17025 for the determination of carotenoids in fruits and products vegetables. The sample treatment process included extraction and saponification steps. Carotenoid analysis was performed by reversed phase high performance liquid chromatography with UV / Visible detection at a wavelength of 473 nm for lycopene and 450 nm for the remaining carotenoids.

The analyzes of the internal reference material allowed to confirm that the analytical method under the conditions used had an adequate performance.

For the comparison of carotenoid contents throughout the year, the Significant Minimum Difference (DMS) was calculated from the expanded uncertainty of the measurement result at a significance level of 5%.

The analytical results showed for some matrices / carotenoids a seasonal effect (fruit salad, orange, dried fig, melon, cantaloupe, apple, pear, grape, tomato, lettuce, peppers and green beans, carrots, turnips and potatoes), but for others this did not happen (broccoli, greens and cauliflower).

The results on the effect of seasonality on the carotenoid content in the fruits showed a higher variation range for β-carotene throughout the year (0,0041-0,38 mg / 100 g). In vegetables, when comparing spring and summer results, β-carotene content was also most influenced by the effect of seasonality (0,0035-8,2 mg / 100 g).

Índice

Índice de Tabelas ... xiii

Lista de Abreviaturas ... xv

1. Objetivos do Trabalho ... 1

2. Enquadramento do Tema ... 3

3. Introdução ... 5

Estrutura e características dos carotenoides ... 6

Fontes naturais dos principais carotenoides ... 9

Biodisponibilidade e bioacessibilidade dos carotenoides ... 10

Importância dos carotenoides para a saúde ... 12

Funções biológicas ... 12

Prevenção de doenças ... 14

Fatores que influenciam a composição em carotenoides dos alimentos ... 16

Estação do Ano ... 16

Outros fatores ... 17

Métodos analíticos para a determinação de carotenoides ... 20

Métodos de extração e saponificação ... 21

3.6.1.1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ... 22

3.6.1.2. Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência ... 25

3.6.1.3. Outras técnicas de análise ... 26

Material de Referência Interno ... 27

Parâmetros Estatísticos ... 28 4. Materiais e Métodos... 31 Reagentes ... 31 Padrões ... 32 Equipamento ... 32 Soluções ... 33 Soluções de trabalho ... 33

Fase móvel para HPLC ... 34

Soluções de padrões internos ... 35

x Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

Procedimento experimental ... 37

Identificação das amostras ... 37

Extração ... 38

Saponificação ... 39

Condições cromatográficas ... 39

Identificação dos analitos ... 40

Quantificação dos analitos ... 41

Utilização do material de referência interno ... 42

Diferença Mínima Significativa (DMS) ... 42

5. Resultados e Discussão ... 45

Análise do Material de referência interno ... 46

Carta de Controlo de médias ... 46

Carotenoides em amostras de frutos avaliados sob o ponto de vista da sazonalidade ... 50

Influência da sazonalidade ... 50

Comparação com os resultados da literatura ... 60

Carotenoides em produtos hortícolas - influência da sazonalidade ... 63

Influência da sazonalidade ... 63

Comparação com os resultados da literatura ... 73

Carotenoides em amostras não avaliadas sob o ponto de vista da sazonalidade 77 Frutos ... 77

Cogumelos e leguminosas ... 80

Produtos processados contendo frutos ... 82

6. Conclusões ... 83

7. Proposta de trabalho futuro ... 87

8. Referências Bibliográficas ... 89 ANEXOS ... 103 Anexo 1 ... 104 Anexo 2 ... 109 Anexo 3 ... 110 Anexo 4 ... 115 Anexo 5 ... 116 Anexo 6 ... 124 Anexo 7 ... 125 Anexo 8 ... 126 Anexo 9 ... 127 Anexo 10 ... 128

Índice de Figuras

Figura 3.1- Estrutura química dos principais carotenoides presente nos alimentos e no

plasma humano (adaptado de http://en.citizendium.org/wiki/Lycopene). ... 7

Figura 3.2 – Sistema de análise por HPLC (Adaptado de Bhardwaj et al., 2015). ... 23

Figura 5.1- Cromatograma da amostra de salada de frutas contendo 1 - luteína (tr=5,019 min), 2 - zeaxantina (tr=5,340 min), 3 – β-criptoxantina (tr=8,426 min), 4 – equinenona (tr= 8,836 min), 5 - licopeno (tr=12,110 min), 6 – α-caroteno (tr=15,310 min) e 7- β-caroteno (tr=16,783 min). ... 45

Figura 5.2- Carta de controlo de médias para o α-caroteno. ... 47

Figura 5.3 - Carta de controlo de médias para o β-caroteno. ... 47

Figura 5.4 - Carta de controlo de médias para o licopeno. ... 48

Figura 5.5 - Carta de controlo de médias para a luteína. ... 48

Figura 5.6 – Carta de controlo de médias para a zeaxantina. ... 49

Figura 5.7- Carta de controlo de médias para a β-criptoxantina. ... 49

Figura 5.8- Teor de carotenoides nas amostras de salada de frutas nas quatro estações do ano. ... 53

Figura 5.9- Teor de carotenoides em uvas nas quatro estações do ano. ... 53

Figura 5.10- Teor de carotenoides em laranjas nas quatro estações do ano. ... 54

Figura 5.11- Teor de carotenoides em maçãs nas quatro estações do ano. ... 55

Figura 5.12- Teor de carotenoides em pêras nas quatro estações do ano. ... 56

Figura 5.13- Teor de carotenoides em figos secos nas quatro estações do ano. ... 57

Figura 5.14- Teor de carotenoides em meloa em duas estações do ano. ... 58

Figura 5.15- Teor de carotenoides em amostras de melão em duas estações do ano. ... 58

Figura 5.16- Teor de carotenoides em amostras de batatas nas quatro estações do ano. 65 Figura 5.17- Teor de carotenoides em amostras de brócolos em duas estações do ano. . 66

Figura 5.18- Teor de carotenoides em amostras de tomate em duas estações do ano. .... 67

Figura 5.19- Teor de carotenoides em amostras de alface em duas estações do ano. ... 67

Figura 5.20- Teor de carotenoides em amostras de grelos em duas estações do ano. ... 68

Figura 5.21- Teor de carotenoides em nabiças em duas estações do ano. ... 69

Figura 5.22- Teor de carotenoides em cenouras em duas estações do ano. ... 69

Figura 5.23- Teor de carotenoides em couve-flor nas duas estações do ano. ... 70

Figura 5.24- Teor de carotenoides em pimentos nas duas estações do ano. ... 71

Figura 5.25- Teor de carotenoides em feijão-verde nas duas estações do ano. ... 71

Figura 5.26- Teor de carotenoides nos frutos analisadas. ... 79

Figura 5.27- Teor de carotenoides nas amostras de cogumelos, feijão e feijão frade. ... 80

Índice de Tabelas

Tabela 4.1-Coeficientes de extinção (ε) e comprimentos de onda de absorção máxima (λ)

dos carotenoides (DAN, 2012). ... 36

Tabela 4.2-Soluções padrão de trabalho. ... 37

Tabela 4.3-Condições cromatográficas utilizadas na análise por HPLC. ... 40

Tabela 4.4-Condições aplicadas no modo de eluição em gradiente. ... 40

Tabela 5.1- Teores dos carotenoides nas amostras do MR interno (mg/100 g). ... 46

Tabela 5.2- Teores de carotenoides nas amostras de frutos analisadas para o estudo do efeito da sazonalidade ... 51

Tabela 5.3-Época ideal, em termos de ingestão de carotenoides e época recomendada para o consumo de frutos em Portugal. ... 59

Tabela 5.4-Comparação do teor em carotenoides (mg/100 g) obtido neste trabalho com os resultados da literatura. ... 61

Tabela 5.5- Teores dos carotenoides nas amostras de produtos hortícolas-sazonalidade. 64 Tabela 5.6-Época ideal, em termos de ingestão de carotenoides e época para o consumo de produtos hortícolas em Portugal. ... 73

Tabela 5.7-Comparação do teor em carotenoides (mg/100 g) obtido neste trabalho com os resultados da literatura. ... 74

Tabela 5.8- Teores dos carotenoides presentes nas amostras de frutos analisadas (mg/100 g). ... 78

Tabela 5.9- Teores dos carotenoides nas amostras de cogumelos, feijão e feijão-verde (mg/100 g). ... 80

Tabela 5.10- Teores dos carotenoides nas amostras de cogumelos, feijão frade e feijão. 81 Tabela 5.11- Teores dos carotenoides nas amostras de passas de uvas e tarte de frutas (mg/100 g). ... 82

Lista de Abreviaturas

ACN- Acetonitrilo

ADN - Ácido desoxirribonucleico ASE - Extração Acelerada de Solvente BHT – Hidroxitolueno Butilado

CO2 - Dióxido de Carbono CQ - Controlo da Qualidade DAD – Detetor de Rede de Díodos (Diode Array Detector) DAN – Departamento de Alimentação e Nutrição DCM – Diclorometano DDR – Dose Diária Recomendada

DMRI – Degeneração Macular relacionada com a Idade DMS – Diferença Mínima Significativa

EAU -Extração Assistida por Ultra-sons ECD - Detetores Eletroquímicos EtOH – Etanol

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HPLC-DAD - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detetor de rede de díodos

INSA – Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP IPAC – Instituto Português da Acreditação

KOH – Hidróxido de Potássio

LDL – Lipoproteínas de Baixa Densidade MAE - Extração Assistida por Micro-ondas

MeOH- Metanol MR – Material de Referência MRC – Material de Referência Certificado

MRI - Material de Referência Interno MS – Espetrometria de Massa

ms – Matéria Seca NIST - National Institute of Standards Technology NP-HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de fase normal PLE - Extração Líquida Pressurizada R- Recuperação do padrão interno RMN - Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear ROS – Espécies Reativas de Oxigénio (Reactive Oxigen Species)

xvi Instituto Superior de Engenharia de Lisboa RP-HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de fase inversa

SFC- Cromatografia do Fluído Supercrítico SFE- Extração com Fluído Supercrítico

TDSExposure – Estudo de Dieta Total (Total Diet Study Exposure) TEA- Trietilamina

THF- Tetrahidrofurano tr – Tempo de Retenção

UHPLC – Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência UV/Vis – Ultravioleta/ Vísivel

1. Objetivos do Trabalho

O presente trabalho teve os seguintes objetivos:

 Análise de alimentos para determinação do teor de carotenoides: frutos (laranja, pêssego, banana, ananas, uvas, kiwi, salada de frutas, maça, pera, figos, meloa, melão), produtos hortícolas (batata, brócolos, tomate, alface, grelos, nabiças, cenouras, couve-flor, pimentos, feijão verde, cogumelos), passas de uvas, tartes de frutas com frutos secos, feijão-frade e outras variedades de feijão. Contribuição para avaliar a ingestão de carotenoides pela população portuguesa.

 Avaliação e comparação do teor de carotenoides em amostras de frutos e produtos hortícolas – recolhidas em diferentes estações do ano com vista à avaliação do efeito da sazonalidade.

2. Enquadramento do Tema

Os carotenoides são compostos bioativos que foram descobertos no século XIX e que atualmente são de grande importância para a saúde humana. Há bem pouco tempo, o interesse nesses compostos estava relacionado com a atividade de provitamina A que alguns carotenoides apresentam. O combate às carências nutricionais, principalmente à deficiência em vitamina A, continua a ser um dos problemas que mais afeta principalmente crianças de países em desenvolvimento, provocando altos índices de doença e consequentemente de mortalidade. Atualmente, está bem definido que dietas ricas em carotenoides apresentam inúmeros benefícios para a saúde humana independentemente da sua atividade de pró-vitamina A. A ingestão de alimentos que contêm carotenoides na alimentação humana previne e minimiza o desenvolvimento de algumas doenças, tais como, cataratas, doenças cardiovasculares e cancro.

Apesar de desempenharem um papel fundamental na saúde humana, os carotenoides não são considerados como “nutrientes” essenciais. Dados os benefícios para a saúde humana, bem como o facto da composição em carotenoides variar de alimento para alimento, e para uma mesma espécie de produto, com o clima, a variedade, o meio de cultivo, a sazonalidade, localização geográfica, processamento e armazenamento, fazem com que a sua determinação seja de grande importância nomeadamente para a introdução em tabelas da composição de alimentos.

As considerações relativamente à composição em carotenoide bem como aos fatores que influenciam a composição em carotenoides dos alimentos são de grande interesse não apenas para produtores e consumidores, mas também em termos de investigação, nomeadamente do projeto TDSExposure, no âmbito do qual se realizou este trabalho. Este é um projeto financiado pela União Europeia cujo objetivo é harmonizar metodologias para avaliar a exposição a nutrientes e a contaminantes.

3. Introdução

Os carotenoides são moléculas lipofílicas naturais com diversas estruturas e funções, sintetizados por plantas e também por alguns fungos e bactérias. Representam um grupo de mais de 700 pigmentos naturais cujas cores variam entre o vermelho e o amarelo (Dias et al., 2009). São dos pigmentos naturais mais estudados em termos de estrutura, composição, propriedades, estabilidade/instabilidade, cinética, metabolismo, biossíntese, benefícios para a saúde, aditivos alimentares (Amaya, 1997; Rodriguez-Amaya et al., 2006).Como aditivos alimentares, são usados na indústria alimentar o β-caroteno-E160a, licopeno-E160d e a luteína-E161b, segundo a legislação em vigor (Decreto-Lei 193/2000 de 18 de agosto).

Nas plantas, os carotenoides localizam-se normalmente nos cromoplastos e estão presentes nas sementes, raízes, folhas, frutos, flores (Howitt e Pogson, 2006; Mellado-Ortega e Hornero-Méndez, 2015). Apesar de existirem principalmente nas plantas, também podem ser encontrados em animais e microrganismos (Oliver e Palou, 2000, 2000). Para os animais, a fonte de carotenoides encontra-se nos frutos e vegetais usados na sua alimentação (Amorim-Carrilho et al., 2014; Quirós e Costa, 2006; Rodriguez-Amaya et al., 2006). Os principais carotenoides existentes nos alimentos e no plasma humano são seis: α-caroteno, β-caroteno, β-criptoxantina, licopeno, luteína e zeaxantina (Amorim-Carrilho et al., 2014; Barba et al., 2006).

Nos países em desenvolvimento, 80 a 90% da ingestão de vitamina A é obtida a partir do consumo dos carotenoides dos frutos e legumes (Maiani et al., 2009). Dos mais de 700 pigmentos naturais identificados até ao momento, apenas 50 apresentam atividade de pró-vitamina A como é o caso do α-caroteno, β-caroteno e β-criptoxantina (Amorim-Carrilho et al., 2014). Atualmente, um grande número de estudos epidemiológicos revela que, independentemente da atividade de provitamina A, a ingestão de alimentos contendo carotenoides apresenta inúmeros benefícios para a saúde (Rodriguez-Amaya, 2010; Oliver e Palou, 2000).

O consumo de alimentos contendo carotenoides reduz o risco de desenvolvimento de muitas doenças tais como: cancro, doenças cardiovasculares, cataratas, degeneração macular e doenças degenerativas (Amorim-Carrilho et al., 2014; Barba et al., 2006). Apesar de terem um papel muito importante na saúde, os carotenoides não têm atribuído um valor de dose diária recomendada (DDR) (Rao e Rao, 2007).

A composição em carotenoides dos alimentos pode variar quantitativa e/ou qualitativamente. Para uma mesma espécie, estas variações ocorrem por diversos fatores

6 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa sendo a sazonalidade um dos fatores que mais influencia a composição de carotenoides nos alimentos (Maiani et al., 2009; Rodriguez-Amaya et al., 2006).

Estrutura e características dos carotenoides

Os carotenoides presentes na natureza apresentam uma estrutura formada a partir de unidades isoprenóides, uma longa cadeia de ligações duplas conjugadas localizada no centro da molécula e simetria bilateral. Estas características justificam as propriedades físicas e químicas destes compostos que estão diretamente relacionadas com a sua estrutura. A geometria da molécula (tamanho, configuração, presença de grupos funcionais), o sistema de ligações duplas conjugadas e as interações específicas com outras moléculas vizinhas são fatores cruciais que influenciam as propriedades e as características dos carotenoides (Britton, 1995; Rao e Rao, 2007; Stahl e Sies, 2003; Young e Frank, 1996).

Estrutura química

Os carotenoides são tetraterpenóides C40 e são formados a partir de oito unidades isoprenóides C5 que se encontram ligadas de forma que a sua sequência fica invertida no centro dando origem a uma molécula simétrica. A Figura 3.1 apresenta a estrutura química dos principais carotenoides presentes nos alimentos (Britton, 1995; Rodriguez-Amaya, 1997; Rodriguez-Rodriguez-Amaya, 2001).

Figura 3.1-Estrutura química dos principais carotenoides presente nos alimentos e no plasma humano (adaptado de http://en.citizendium.org/wiki/Lycopene).

Devido às ligações duplas os carotenoides podem existir em duas formas (configurações) que são designadas por cis ou trans. Na natureza os carotenoides existem na forma

all-trans (all-E) que é a forma mais estável. A presença de uma ligação cis resulta num maior

impedimento estereoquímico junto dos átomos de hidrogénio e/ou grupos metilo. Por esta razão os isómeros cis são termodinamicamente menos estáveis. Só em algumas situações por ação de agentes específicos ocorre a isomerização ou oxidação geométrica dos carotenoides que se encontram na forma mais estável para a configuração cis (Britton, 1995; Rodriguez-Amaya, 1997; Rodriguez-Amaya, 2001; Meléndez-Martínez et al., 2010; Meléndez-Martínez et al., 2007).

Estruturalmente, os carotenoides podem ser classificados em dois grupos:

 Carotenos: (ex. α-caroteno, β-caroteno e licopeno) – são altamente apolares, formados apenas por carbono e hidrogénio.

8 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa  Xantofilas: (ex. β-criptoxantina, luteína e zeaxantina) – são compostos

polares, formados por carbono, hidrogénio e oxigénio (Augustynska et al., 2015; Courraud et al., 2013; Hempel et al., 2016; Sajilata et al., 2008).

Este último grupo é o mais complexo e pode ser encontrado na forma livre (tal como os carotenos) ou na forma de ácidos gordos esterificados (Murillo et al., 2013).

Os carotenoides apresentam nas suas extremidades grupos lineares ou cíclicos como por exemplo o ciclo-hexano e o ciclo-pentano o que permite assumir várias estruturas pela adição de átomos de oxigénio. A hidrogenação, a ciclização e outras modificações como a isomerização, introdução de grupos funcionais contendo oxigénio ou mesmo a combinação desses processos pode resultar numa grande variedade de estruturas para os carotenoides (Rodriguez-Amaya, 2001).

Principais características

Uma das principais características dos carotenoides é a capacidade de apresentarem uma grande variedade de cores que vão desde o amarelo até ao vermelho como consequência da existência do sistema de ligações duplas conjugadas. Este sistema constitui o cromóforo que permite a obtenção de um espetro de absorção na região do UV/Visível característico dos carotenoides e muito importante para a sua identificação e quantificação. Os carotenoides só apresentam cor quando a molécula tem várias ligações duplas conjugadas. Nessas situações o seu comprimento de onda de máxima absorção desloca-se para a região do visível do espectro (400-600 nm). São precisas no mínimo 7 ligações duplas conjugadas para que a molécula apresente cor. Quando tal não acontece os comprimentos de onda de máxima absorção estarão na região do ultravioleta pelo que não serão compostos corados, como é o caso do fitoeno e do fitoflueno que apresentam 3 e 5 ligações duplas conjugadas, respectivamente (Britton, 1995; Meléndez-Martínez et al., 2007; Meléndez-Martínez et al., 2010; Rodriguez-Amaya, 2001).

A existência do sistema de ligações duplas conjugadas também é responsável pela instabilidade dos carotenoides provocando a predisposição para a ocorrência de reações de isomerização geométrica e oxidação. Os agentes que promovem a oxidação são a luz, o calor, metais, enzimas e oxigénio. No caso da isomerização os agentes responsáveis são o calor, a radiação e os ácidos. Como consequência, estes dois mecanismos provocam a perda de cor presente nos alimentos. Para minimizar as condições necessárias de ocorrência destes dois mecanismos devem ser tomadas algumas medidas de precaução aquando da preparação, armazenamento e processamento

industrial dos alimentos (Meléndez-Martínez et al., 2007; Rao e Rao, 2007; Rodriguez-Amaya, 2001).

Fontes naturais dos principais carotenoides

Os principais carotenoides estão presentes em alimentos como cenouras, abóboras, batata-doce, tomate e óleos vegetais (óleo de palma e seus derivados). A maior parte das xantofilas são encontradas em vegetais verdes e folhosos e quase todos os carotenoides são encontrados em vegetais amarelos (Zeb e Mehmood, 2004).

Na alimentação humana, os carotenoides encontram-se em diversos alimentos, mas os sumos, as frutas e os produtos hortícolas são as suas principais fontes (Rao e Rao, 2007). A Tabela 3.1 apresenta os alimentos que são fontes naturais dos principais carotenoides.

Tabela 3.1- Fontes naturais dos principais carotenoides (Burri et al., 2016; Amorim-Carrilho et al., 2014; Courraud et al., 2013; Fish, 2012; Tanaka et al., 2012; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Zeb e Mehmood, 2004; Paiva e Russell, 1999; Sajilata et al., 2008; Parada et al., 2007).

Carotenoides Fontes naturais

α-caroteno Couve-galega, nabo, espinafre, alface, manga, meloa, melão, pimenta, abóbora, cenoura, batata-doce, brócolos, feijão-verde, óleo de palma

β-caroteno Cenoura, batata-doce, abóbora, brócolos, feijão-verde, espinafre, melão, manga, damasco, pimenta, couve, óleo de palma, nêspera, couve-de-bruxelas, kiwi, alface

β-criptoxantina Mandarina, mamão, milho, ervilhas, gema de ovo, pitanga, pera, caqui, ameixas, abobora, laranja, pêssego, tangerina

Licopeno Tomate, melancia, goiaba, toranja vermelha, azeitona, pêssego, papaia, pitanga, damasco

Luteína Espinafre, couve-galega, couve-de-bruxelas, milho, diospiro, brócolos, gema de ovo, pimenta vermelha, repolho, pêssego, ameixas, abobora, feijão-verde, brócolos, kiwi, alface, ervilhas

Zeaxantina Espinafre, couve-galega, couve, milho, diospiro, brócolos, gema de ovo, pêssego, ameixas, abobora, feijão-verde, brócolos, kiwi, alface, ervilhas, repolho, manga

10 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa De uma forma geral, as frutas cor de laranja são ricas em β-criptoxantina, os legumes de cor verde escura em luteína, o tomate em licopeno e a gema de ovo em zeaxantina (Rao e Rao, 2007; Zeb e Mehmood, 2004; Rodriguez-Amaya, 2001; Tanaka et al., 2012).

O β-caroteno é o carotenoide predominante nos alimentos, principalmente nos frutos e vegetais, umas vezes em maior e outras vezes em menor concentração. Em alguns alimentos encontra-se acompanhado de α-caroteno normalmente em menor concentração. Na cenoura, é o principal carotenoide.

O licopeno é o principal carotenoide presente em muitos frutos de cor vermelha, mas a sua principal fonte provém do tomate e os seus derivados. Eles constituem cerca de 85% do total de licopeno consumido e podem ser encontrados em pratos como chili com carne e pizza. O ketchup, por exemplo, é também um dos grandes contribuidores para a ingestão de licopeno na alimentação (Krinsky e Johnson, 2005; Johnson, 2002; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Gerster, 1997; Rodriguez-Amaya, 2001; Zeb e Mehmood, 2004).

A luteína é o carotenoide mais abundante/predominante nas folhas, vegetais verdes e flores amarelas (Rodriguez-Amaya, 2001). Apesar da luteína e da zeaxantina serem derivados do β-caroteno, a luteína é mais predominante nos alimentos do que a zeaxantina. Legumes de cor verde escura são uma fonte rica em luteína, seguida de β-caroteno. Na alface a concentração da luteína é ligeiramente maior ou mesmo igual à do β-caroteno (Rodriguez-Amaya et al., 2006). Os dois alimentos deste grupo que apresentam maior concentração de luteína e zeaxantina são o espinafre e a couve. Outras fontes incluem brócolos, ervilhas, couves de bruxelas, gema de ovo (Krinsky e Johnson, 2005; Johnson, 2002).

No entanto, a composição de carotenoides nos frutos e produtos hortícolas varia de acordo com a variedade da planta, grau de maturação, tempo de colheita, condições de armazenamento e processamento (Paiva e Russell,1999).

Biodisponibilidade e bioacessibilidade dos carotenoides

Os carotenoides quando atingem o seu local de ação no organismo humano, passam a ser biologicamente ativos, apresentado inúmeros benefícios para a saúde (Rodriguez-Amaya, 2015). É neste contexto que a biodisponibilidade e a bioacessibilidade são conceitos importantes que devem ser avaliados.

A biodisponibilidade é descrita como a fração da quantidade de carotenoides ingerida pelo organismo humano, que se encontra livre para funções biológicas ou armazenamento. A bioacessibilidade refere-se à fração dos carotenoides ingeridos que, durante o processo de digestão, é libertada a partir da matriz alimentar, tornando-se dessa forma acessível para absorção intestinal (Amaya, 2015; Rodriguez-Amaya et al., 2006; O’Connell et al., 2007; Fernández-García et al., 2012; Lemmens et al., 2014).

A biodisponibilidade de carotenoides é influenciada por diversos fatores, entre os quais se destacam a natureza da matriz alimentar, tipo, estrutura e quantidade de carotenoide, interação com outros carotenoides, presença de outros componentes na dieta (fibra, gordura), método de processamento (Rodriguez-Amaya, 2016; Rodriguez-Amaya, 2015; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Reboul et al., 2006; O’Connell et al., 2007; Stinco et al., 2012; Verrijssen et al., 2014; Thakkar e Failla, 2008; Castenmiller e West, 1998).

O estudo sobre a biodisponibilidade de carotenoides é bastante complexo. Estes estudos podem variar entre indivíduos, uma vez que podem ser afetados por diversos fatores, como por exemplo, fatores genéticos ou má absorção de lípidos. A absorção adequada de carotenoides presentes numa determinada matriz alimentar requer as seguintes etapas: 1) digestão da matriz alimentar, 2) formação de micelas lipídicas no trato gastrointestinal, 3) absorção dos carotenoides pelas células da mucosa intestinal, 4) transporte dos carotenoides para o sistema linfático (Amaya, 2016; Rodriguez-Amaya, 2015; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Thakkar e Failla, 2008; van den Berg et al., 2000).

Os métodos que são usados para avaliar a biodisponibilidade englobam estudos efetuados em seres humanos e em animais. Os estudos efetuados em seres humanos são os que melhor avaliam a biodisponibilidade, contudo, estes estudos são extremamente complexos, dispendiosos, invasivos, com um tempo de duração considerável, eticamente questionáveis e muitas vezes com resultados inconclusivos. Os estudos efetuados em animais não são considerados ideais devido às diferenças de metabolismo em relação aos seres humanos. Contudo, a área de investigação tem apostado em métodos mais económicos, reprodutíveis, rápidos e simples, como modelos

in vitro. Estes modelos simulam o ambiente durante a digestão no organismo humano e

permitem a análise de um grande número de amostras em pouco espaço de tempo. O modelo mais usado para analisar a bioacessibilidade de carotenoides é um modelo de digestão estática com absorção celular, na presença de células Caco-2. Este modelo que foi desenvolvido por Garrett et al. (1999) simula um pequeno ambiente intestinal, que permite estudar o mecanismo de absorção e transporte (Rodriguez-Amaya, 2015; Van

12 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa Buggenhout et al., 2010; Donhowe et al., 2014; Granado-Lorencio et al., 2007; Lee et al., 1999).

Importância dos carotenoides para a saúde

Vários estudos epidemiológicos associam a ingestão de alimentos contendo carotenoides a inúmeros benefícios para a saúde, nomeadamente a diminuição do aparecimento e propagação de vários tipos de cancro. Tem sido descrito na literatura que alguns carotenoides, quando ingeridos através de frutas e legumes, exercem uma ação preventiva para um elevado número de doenças (Yahia, 2010; Rao e Rao, 2007). Deste modo, tem sido reportado que os carotenoides desempenham funções biológicas importantes relacionadas em grande parte com a ação antioxidante e com a atividade de pró-vitamina A que alguns carotenoides apresentam (Rao e Rao, 2007; Rodriguez-Amaya, 1997, Gammone et al., 2015). Também tem sido mencionado na literatura outras funções biológicas como a capacidade de regular a transcrição de genes, a melhoria na resposta imunitária e na comunicação das junções comunicantes. Estas funções biológicas estão relacionadas com a prevenção e a redução de vários tipos de doenças como cancros, doenças cardiovasculares, degeneração macular, cataratas, doenças da pele associadas a exposição UV (Cooperstone e Schwartz, 2016; Rao e Rao, 2007; Bendich e Olson, 1989).

Funções biológicas

- Atividade pró-vitamina A

A carência em vitamina A é um dos principais problemas de saúde pública em muitos países em vias de desenvolvimento. Estima-se que afeta em todo o mundo cerca de 127 milhões de crianças e 7,2 milhões de mulheres em período de gestação. A vitamina A é um nutriente muito importante para o organismo humano, sendo essencial no desempenho de funções a nível de visão, desenvolvimento embrionário, crescimento e sistema imunitário (Cooperstone e Schwartz, 2016; Yunusa e Attah, 2016; Stahl e Sies, 2005, Rodriguez-Amaya, 1997).

A carência em vitamina A pode levar ao aparecimento de várias doenças como anemia, enfraquecimento do sistema imunitário, aumento da sensibilidade às doenças infeciosas, xeroftalmia (Cervantes-Paz et al., 2016; Cooperstone e Schwartz, 2016).

Estima-se que a ingestão de carotenoides provenientes de frutas e vegetais fornecem cerca de 30% da DDR de vitamina A em países desenvolvidos, enquanto nos países em vias de desenvolvimento a contribuição destes produtos é maior representando 85% da DDR. Nos países desenvolvidos, a maior fonte de vitamina A são os produtos de origem animal como ovos, leite e seus derivados, óleo de fígado de peixe, entre outros (Yunusa e Attah, 2016; Cervantes-Paz et al., 2016).

Depois de ingerida, a vitamina A é absorvida no intestino, esterificada e conservada no fígado. Nas frutas e vegetais, a vitamina A encontra-se na forma de pró-vitamina A que pode ser metabolizada em vitamina A nos seres humanos e outros animais (Omenn,1998).

Das 700 estruturas de carotenoides conhecidas, apenas algumas podem ser convertidas em retinol, pela intervenção da enzima β-caroteno-15-15’-mono-oxigenase (EC 1.13.11.21) (Fernandéz-García et al., 2012). Esta atividade é restrita apenas para os carotenoides que apresentam atividade de pró-vitamina A, isto é, para os carotenoides que possuem um anel β-ionona que não esteja substituído e uma cadeia poliénica com 11 átomos de carbono, como é o caso do α-caroteno, caroteno e criptoxantina. O β-caroteno é o que exibe maior atividade de pró-vitamina A uma vez que contém o equivalente a duas moléculas de retinol, enquanto os outros dois contêm apenas o equivalente a uma molécula de retinol (Cervantes-Paz et al., 2016; Cooperstone e Schwartz, 2016; Burri, 2015; Fernandéz-García et al., 2012; Rodriguez-Amaya e Kimura, 2004).

- Ação antioxidante

Os carotenoides fazem parte da classe de antioxidantes não enzimáticos que possuem a capacidade de neutralizar espécies reativas de oxigénio (ROS) que são originadas durante o metabolismo aeróbio e processos patológicos. As ROS provocam a oxidação de macromoléculas biológicas fundamentais e os lípidos insaturados que se encontram nas membranas celulares são os seus principais alvos. Quando se encontram em quantidades elevadas no organismo humano, as ROS provocam o stress oxidativo das células e do tecido. O stress oxidativo é um fator crítico e o principal responsável pelo processo patogénico de muitas doenças, que ocorre quando, em determinadas situações, as defesas não são suficientes (Majeed et al., 2016; Stahl e Sies, 2005; Agarwal e Rao, 2000).

Dessa forma, os carotenoides poderão desempenhar potencialmente um papel de proteção e prevenção de doenças degenerativas como vários tipos de cancro, diabetes doenças cardiovasculares e de visão (Stahl e Sies, 2003; Rao e Agarwal, 1999; Tapiero

14 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa et al., 2004; Xavier e Pérez-Gálvez, 2016; Majeed et al., 2016; Stahl e Sies, 2005; Halliwell, 1996; Fiedor e Burda, 2014; Bendich e Olson, 1989).

Os carotenoides são muito provavelmente os antioxidantes mais envolvidos na neutralização do oxigénio singleto e dos radicais peroxilo (Stahl e Sies, 2003; Fiedor e Burda, 2014; Tapiero et al., 2004).

A capacidade na captura do oxigénio singleto pelos carotenoides depende essencialmente do número de ligações duplas conjugadas característico de cada carotenoide. Foi reportado na literatura maior eficiência em carotenoides com nove ou mais ligações duplas conjugadas. O licopeno é um dos carotenoides mais eficientes na captura do oxigénio singleto (Cooperstone e Schwartz, 2016; Stahl e Sies, 2003; Young e Lowe, 2001; Rodriguez-Amaya e Kimura, 2004; Stahl e Sies, 1996).

Para que a capacidade antioxidante dos carotenoides seja considerada eficiente, é necessário que os carotenoides estejam presentes no plasma humano em concentrações suficientes e no local específico onde as ROS são geradas (Erdman et al., 2009).

Prevenção de doenças

Uma alimentação saudável desempenha um papel muito importante na prevenção de inúmeras doenças crónicas.

Como exemplo, as doenças cardiovasculares, nomeadamente a doença arterial coronária é uma das principais causas de morte nos países desenvolvidos (Yoshihara et al., 2010; Gammone et al., 2015).

Os principais fatores de risco associados a doença arterial coronária são: hipertensão, tabagismo, diabetes, obesidade e hipercolesterolemia (Gammone et al., 2015).

Na literatura, existem evidências que associam o consumo de licopeno a uma diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Petyaev, 2016; Rao e Rao, 2007; Bramley, 2000; Kohlmeier et al., 1997).

A oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) desempenha um papel crucial na patogénese da doença arterial coronária uma vez que provoca a modificação das LDL o que contribui para o desenvolvimento inicial da doença arterial coronária. Dessa forma, o consumo de antioxidantes, nomeadamente do licopeno poderá permitir a diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares pela inibição da modificação das LDL. Como o licopeno é transportado pelas LDL no plasma, muitos autores sugerem que

desempenha um papel de proteção contra oxidação destas proteínas (Yadav et al., 2016; Ried e Fakler, 2011; Krinsky e Johnson, 2005; Tapiero et al., 2004).

O cancro é a maior causa de morte assinalada em todo o mundo (WHO, 2016). Em 2012, foram registadas cerca de 8,2 milhões de mortes devido a esta doença (WHO, 2016). Até 2030, prevê-se cerca de 13,2 milhões de mortes relacionadas com o cancro (Bray et al., 2012).

Em 1981 surgiram na literatura os primeiros relatos que associavam a ingestão de β-caroteno à redução do risco de desenvolvimento de doenças cancerígenas (Peto et al., 1981). Desde esta altura, inúmeros estudos epidemiológicos investigaram a relação entre os níveis de carotenoides no plasma humano com a redução do risco de desenvolvimento de muitas doenças como o cancro da mama, cancro do cólon e do reto, cancro da próstata, cancro do pulmão, entre outros (Cooperstone e Schwartz, 2016; Panic et al., 2016; Boeke et. al., 2014; Pannellini et al., 2010).

O risco de aparecimento e desenvolvimento de certos tipos de cancro pode ser reduzido através de uma alimentação saudável, rica em alimentos que contenham compostos com atividade antioxidante. Alguns estudos epidemiológicos defendem a ideia de que a ingestão de carotenoides presentes na dieta alimentar, nomeadamente o licopeno presente no tomate, apresenta uma proteção contra o risco de desenvolvimento do cancro da próstata (Bendich, 2013). O efeito antioxidante é um dos mecanismos de ação que mais contribuem para o efeito protetor (Fiedor e Burda, 2014).

Existem muitos estudos na literatura que defendem a relação entre a ingestão de luteína e zeaxantina presentes na dieta alimentar com a diminuição do risco de desenvolvimento da degeneração macular relacionada com a idade (DMRI). Estes estudos defendem que a luteína e a zeaxantina possuem a capacidade de prevenir e/ou retardar esta doença degenerativa. A DMRI é uma doença que provoca perda de visão central. É uma das principais causas de deficiência visual, cegueira irreversível em idosos e cataratas. A luteína e zeaxantina, que são os carotenoides responsáveis pela coloração da mácula onde se encontram presentes em elevadas concentrações, atuam na retina como poderosos antioxidantes, reduzindo os danos do stress oxidativo para as células da retina (Bernstein et al., 2016; Murillo e Fernandez, 2016; Nwachukwu et al., 2015; Chucair et al., 2007).

16 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa

Fatores que influenciam a composição em carotenoides

dos alimentos

A estação do ano, o clima, e outros fatores como o estado de maturação, a variedade, localização geográfica, meio de cultivo, processamento e armazenamento, são os principais fatores que influenciam a composição em carotenoides nos alimentos. Entre os fatores citados, oclima é um dos mais importantes, uma vez que influencia diretamente as plantas, os animais e o solo (Rodriguez-Amaya, 2016; Walsh et al., 2015; Maiani et al., 2009; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001).

Estação do Ano

A época do ano em que são colhidos os frutos e os produtos hortícolas exercem uma grande influência no teor em carotenoides apresentado por esses produtos (Walsh et al., 2015).

Para muitos frutos e produtos hortícolas, a exposição ao sol e a altas temperaturas favorece a carotenogénese, mas também pode promover a fotodegradação que provoca a redução do teor em carotenoides. Isto acontece porque nos tecidos fotossintéticos, quando expostos a diferentes condições climáticas, podem ocorrer dois processos distintos: a biossíntese e a fotodegradação (Amaya et al., 2008; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Azevedo e Rodriguez-Rodriguez-Amaya, 2005). Em produtos hortícolas (folhosos) cultivados em campos abertos, foi reportado que o teor em carotenoides é inferior no verão o que sugere que a exposição excessiva ao sol e a altas temperaturas favorece a fotodegradação (Rodriguez-Amaya et al., 2008; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Azevedo e Rodriguez-Amaya, 2005; Heinonen et al., 1989).

Contudo, em amostras de produtos hortícolas cultivadas em estufas revestidas de polietileno (proteção plástica) foi reportado teores superiores em carotenoides para amostras recolhidas na estação do verão o que sugere que o revestimento em polietileno permitiu uma proteção contra a exposição excessiva a temperaturas elevadas do verão favorecendo a carotenogénese (Walsh et al., 2015; Rodriguez-Amaya et al., 2008; Azevedo-Meleiro e Rodriguez-Amaya, 2005).

Em contrapartida, para amostras recolhidas na estação de inverno foi reportado teores inferiores em carotenoides o que sugere que o revestimento em polietileno reduziu a possibilidade de exposição ao sol não favorecendo a carotenogénese (Walsh et al., 2015; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Kimura e Rodriguez-Amaya, 2003).

Desta forma, o que se encontra reportado na literatura é que o uso de revestimento plástico tanto pode proporcionar a proteção contra a fotodegradação no verão como a redução da biossíntese de carotenoides no inverno (Walsh et al., 2015).

Alguns autores reportaram estudos sobre o efeito da sazonalidade na composição em carotenoides de várias amostras de alimentos da mesma espécie, nomeadamente de couves, tomates e abacates. Nestes estudos, o que se verifica é que independentemente da localização geográfica, da variedade, do meio e das técnicas de cultivo, a estação do ano exerce influência na composição em carotenoides (Walsh et al., 2015; Lu et al., 2009; Raffo et al., 2006; Azevedo e Rodriguez-Amaya, 2005; Martinez-Valverde et al., 2002; Mϋller, 1997). No anexo 1 estão apresentados os teores em carotenoides obtidos por diversos autores.

Em Portugal, muitos frutos e produtos hortícolas estão disponíveis nas diferentes estações do ano, apresentando-se no Anexo 2 a época mais aconselhável para o consumo desses produtos. ( http://www.deco.proteste.pt/alimentacao/produtos-alimentares/dicas/fruta-legumes-epoca-ideal).

Outros fatores

Para uma dada espécie, é possível existirem diferenças na sua composição. Essas diferenças que tanto podem ser qualitativas como quantitativas e são resultado da sua variabilidade natural, mas também da sua variedade. Na literatura, encontram-se documentadas algumas dessas diferenças principalmente em frutos e produtos hortícolas. Alguns autores analisaram a influência da variedade na composição em carotenoides de algumas uvas, tomate, brócolos e batata-doce e reportaram diferenças significativas tanto a nível quantitativo como qualitativo (Kim et al., 2015; Bunea et al., 2012; Singh et al., 2007; Hart e Scott, 1995; Rouseff et al., 1992).

O estado de maturação de muitos frutos e produtos hortícolas também afeta consideravelmente a composição em carotenoides. A maturação dos frutos é normalmente acompanhada por um aumento da carotenogénese, isto é, da biossíntese de carotenoides que provoca um acréscimo no teor em carotenoides. Este aumento é facilmente visível quando se observa, por exemplo, a mudança de coloração de um fruto (Walsh et al., 2015; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001; Fraser et al., 1994). Alguns autores reportaram estudos realizados em frutos (manga, fruta-pão e kiwi) e verduras (folhas de couve, alface, espinafre da Nova Zelândia) recolhidos em diferentes estágios de maturação. Para a fruta-pão, a manga e as folhas de alface, o que se verifica

18 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa é que processo de maturação conduz a um aumento no teor em carotenoides (Englbeger et al., 2013; Azevedo-Meleiro e Amaya, 2005; Mercadante e Rodriguez-Amaya, 1998). No entanto para o kiwi, as folhas de couve e espinafre da Nova Zelândia, essa relação não é verificada uma vez que o processo de maturação conduz a um decréscimo no teor em carotenoides. (Lefsrud et al., 2007; Azevedo e Rodriguez-Amaya, 2005). O kiwi apresenta teores em carotenoides inferiores com a maturação por conservar a sua cor verde (Rodriguez-Amaya, 2001).

Relativamente a localização geográfica, o clima é um dos fatores mais influenciados pela localização geográfica. Os diferentes tipos de clima (frio, quente, temperados) dependem da localização geográfica. Diversos autores reportaram estudos sobre o efeito da localização geográfica na composição em carotenoides dos alimentos. Rodriguez-Amaya

et al. (2008) reportaram que as mangas da mesma variedade produzidas em climas

quentes do nordeste do Brasil apresentaram teores superiores em carotenoides comparativamente com os frutos produzidos em climas temperados, nomeadamente a Sudeste do Brasil. Wall et al. (2006) reportaram também uma variação significativa nos teores em carotenoides para diferentes variedades de bananas e papaias recolhidas em várias localizações.

O meio de cultivo também exerce uma grande influência na composição em carotenoides de frutos e produtos hortícolas. O teor em carotenoides de legumes e vegetais difere quando comparamos a agricultura biológica com a agricultura convencional que faz uso de agroquímicos como fertilizantes (Walsh et al., 2015, Rodriguez-Amaya et al., 2008; Rodriguez-Amaya et al., 2006). Mercandante e Rodriguez-Amaya (1991) realizaram um estudo para a comparação da composição em carotenoides utilizando a agricultura convencional e a biológica em amostras de couves da mesma variedade e com o mesmo grau de maturação. O estudo revelou diferenças significativas no teor em carotenoides e foi registado um maior teor em amostras de couve cultivadas em meio biológico. Em contrapartida, Kimura e Rodriguez-Amaya (2003) registaram um maior teor em carotenoides nas amostras de alfaces produzidas a partir da agricultura tradicional, comparativamente com a agricultura hidropónica. Beltrán-González et al. (2008) reportaram teores superiores de carotenoides em amostras de sumo de tangerinas produzidas por meio da agricultura biológica. Também Lester e Buslig (2007) reportaram um maior teor em licopeno em amostras de uvas cultivadas em agricultura convencional, em comparação com a agricultura biológica.

As alterações que se verificam nos carotenoides após o processamento dos alimentos dependem em grande parte do tipo de alimento, do método utilizado, da temperatura e do tempo. O processamento e o armazenamento dos alimentos podem levar a oxidação

ou isomerização as quais provocam alterações na composição em carotenoides (Rodriguez-Amaya, 2016; Walsh et al., 2015; Maiani et al., 2009; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001).

O processo de biossíntese de carotenoides continua após a colheita, decorrendo durante o armazenamento de muitas frutas. Para tal, é necessário que as frutas se mantenham intactas de forma a preservar o sistema enzimático responsável pela carotenogénese (Walsh et al., 2015; Maiani et al., 2009; Rodriguez-Amaya et al., 2008; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001). Quanto aos produtos hortícolas, o processo de biossíntese de carotenoides é interrompido após a colheita, dando lugar a degradação principalmente se o armazenamento for efetuado a altas temperaturas que provocam a degradação das folhas (Walsh et al., 2015; Maiani et al., 2009; Rodriguez-Amaya et al., 2008; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001).

Deste modo, as condições de armazenamento e também de processamento dos alimentos exercem uma grande influência na composição e teor de carotenoides nos alimentos (Walsh et al., 2015; Maiani et al., 2009; Rodriguez-Amaya et al., 2008; Rodriguez-Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001).

Durante o armazenamento ou processamento de alimentos, ocorrem perdas na composição em carotenoides devido a processos de isomerização, oxidação enzimática e não enzimática (decomposição térmica). O fenómeno de isomerização é desencadeado maioritariamente durante os processos térmicos (ex: cozedura, fritura, fervura) e também devidos a processos físicos (ex: corte, trituração) à ação de ácidos orgânicos e através do calor e luz, condições que provocam uma perda de atividade de provitamina A (Rodriguez-Amaya et al., 2006).

Fenómenos de oxidação enzimática e não enzimática são desencadeados pela ação da luz, calor, presença de metais, enzimas e peróxidos e podem ser inibidos pela ação de antioxidantes. A oxidação enzimática ocorre logo após o descasque, corte e trituração. É recomendado o consumo ou o processamento térmico dos alimentos logo após essas operações. As condições de processamento, a temperatura de armazenamento, o uso de embalagens que permitem o contacto com a luz e com oxigénio aumentam o risco de oxidação (Amaya et al., 2008; Amaya et al., 2006; Rodriguez-Amaya, 2001).

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Métodos analíticos para a determinação de carotenoides

Uma vez que os carotenoides diferem nas suas propriedades (polaridade, estabilidade, biodisponibilidade, atividade antioxidante) e funções, é essencial a quantificação e identificação precisa e rigorosa dos carotenoides individuais (Rodriguez-Amaya, 2016; Amorim-Carrilho et al., 2014; Rivera e Canela-Garayoa, 2012).

O procedimento mais comum para extração dos carotenoides da matriz é a aplicação de um solvente orgânico. Na seleção do solvente mais adequado, é necessário estar atento às diferentes polaridades dos carotenoides e à estrutura da matriz analítica. Além disso, a suscetibilidade dos carotenoides à oxidação deve ser considerada ao desenvolver um método para extração uma vez que os carotenoides em solução podem ser muito sensíveis à exposição à luz, ao calor, a ácidos ou ao oxigénio (Amorim-Carrilho et al., 2014).

Apesar da extração líquido-líquido e a extração sólido-líquido serem as técnicas mais frequentemente aplicadas em amostras de alimentos, outros métodos de extração foram também relatados para análise de carotenoides como: extração com fluidos supercríticos (SFE), extração líquida pressurizada (PLE), extração acelerada de solvente (ASE), extração assistida por ultra-sons (EAU) e extração assistida por micro-ondas (MAE). Estes métodos têm sido usados como alternativas de extração ambientalmente melhores (Amorim-Carrilho et al., 2014; Li et al., 2013; Sun et al., 2012; Bohoyo-Gil, 2012).

As amostras de produtos naturais contêm tipicamente os carotenos não polares e as xantofilas mais polares. Seja qual for o método utilizado, o processo cromatográfico deve ser capaz de lidar com esta gama de polaridade (Machmudah e Goto, 2013).

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase inversa com um detetor de fotodíodos ultravioleta visível (UV/Vis) tem sido a técnica analítica preferida, mas a cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC) tem vindo a ser cada vez mais utilizada (Rodriguez-Amaya, 2016).

A técnica HPLC acoplada à espectrometria de massa (MS) e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) têm sido úteis na identificação inequívoca de isómeros geométricos de carotenoides (Rodriguez-Amaya, 2016).

Métodos de extração e saponificação

A saponificação (hidrólise alcalina) é um passo destinado a remover clorofilas e lípidos indesejados e hidrolisar os ésteres de ácidos gordos de xantofilas, tais como β-criptoxantina, luteína e zeaxantina, o que pode simplificar a separação cromatográfica. Por este motivo como as xantofilas podem ser encontradas na sua forma livre ou numa forma de ácidos gordos esterificados, são frequentemente analisados após a saponificação (Amorim-Carrilho et al., 2014; Kopec et al., 2012).

A saponificação só deve ser incluída no procedimento analítico se for indispensável. É desnecessário, por exemplo, na análise de vegetais folhosos, tomate e cenoura, que são materiais de baixo teor lipídico e essencialmente isentos de ésteres de carotenol. Se necessário, este passo deve ser cuidadosamente avaliado e otimizado, e a subsequente lavagem cuidadosamente efetuada para evitar a perda de carotenoides na fase aquosa que é descartada (Rodriguez-Amaya, 2016; Amorim-Carrilho et al., 2014).

Como os carotenoides são compostos lipofílicos, não são solúveis em água. São geralmente extraídos usando uma mistura de solventes orgânicos. Os solventes utilizados dependem da matriz da amostra e da polaridade relativa dos carotenoides de interesse. As xantofilas polares, tais como a luteína, são mais solúveis em álcoois, enquanto que os carotenos não polares, tais como o β-caroteno, são mais solúveis em solventes hidrofóbicos como por exemplo o éter de petróleo e n-hexano (Kiokias e Varzakas, 2016; Kopec et al., 2012, Quirós e Costa, 2006; Rodriguez-Amaya, 2001).

Uma grande variedade de misturas de solventes tem sido utilizada por diferentes investigadores para extrair os carotenoides dos alimentos, como por exemplo, acetona / diclorometano, acetona / etanol, acetona / hexano, acetona / éter de petróleo, hexano / éter dietílico, hexano / etanol / acetona / tolueno, metanol / Tetrahidrofurano (THF), hexano / acetato de etilo. Contudo, a mistura de etanol / hexano (4:3) tem sido uma das combinações mais comuns em amostras de alimentos (Amorim-Carrilho et al., 2014; Kopec et al., 2012).

Para uma extração eficiente, a mistura de solventes deve ser capaz de penetrar na matriz alimentar e dissolver eficazmente os diferentes carotenoides presentes na amostra, sem os alterar ou degradar (Rodriguez-Amaya, 2016).

No entanto, como os carotenoides são encontrados numa grande variedade de alimentos, os procedimentos de extração devem ser adaptados à amostra a ser analisada (Rodriguez-Amaya, 2016; Machmudah e Goto, 2013).

22 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa A extração de carotenoides com solventes orgânicos gera grandes quantidades de resíduos cuja eliminação é um problema ambiental. Uma alternativa ecológica aos métodos de extração líquido-líquido anteriormente mencionados é a extração com fluido supercrítico CO2 (SFE) (Rodriguez-Amaya, 2016; Kopec et al., 2012).

O dióxido de carbono é o fluido supercrítico mais utilizado, uma vez que apresenta uma baixa temperatura crítica (31°C) que o torna ideal para a extração de compostos termicamente instáveis. No entanto, o dióxido de carbono apresenta uma polaridade baixa e torna a extração de compostos polares muito difícil. Esta limitação pode ser resolvida através da adição de um modificador orgânico, tal como metanol ou etanol, a fim de aumentar a solubilidade (Rodriguez-Amaya, 2016; Mezzomo e Ferreira, 2016; Machmudah e Goto, 2013; Kopec et al., 2012; Mathiasson et al., 2002). Foi demonstrado que os modificadores de solventes aumentam a eficiência de SFE devido ao aumento da solubilidade do analito no CO2 supercrítico, diminuindo a sua interação com a matriz

alimentar. No entanto, ainda são necessários mais estudos de otimização e de validação (Mezzomo e Ferreira, 2016; Kopec et al., 2012; Spanos et al., 1993).

3.6.1.1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Nas últimas décadas, a análise de alimentos pela técnica de (HPLC) foi amplamente revista e continua a ser o método preferido para separar, identificar e quantificar carotenoides em alimentos e amostras biológicas permanecendo, hoje, o principal método analítico (qualitativo e quantitativo) para análise de carotenoides em matrizes complexas (Finkel’shtein, 2016; Kopec et al., 2012).

A técnica de HPLC é versátil, robusta, e amplamente utilizada para o isolamento de produtos naturais. Esta técnica cromatográfica é utilizada em fitoquímica e química analítica para identificar, quantificar e purificar os componentes individuais da mistura (Bhardwaj et al., 2015; Gupta et al., 2012).

O princípio da técnica de HPLC consiste na injeção de uma amostra em solução numa coluna com material poroso (fase estacionária) e um líquido (fase móvel) que é bombado a alta pressão para a coluna (a pressão pode atingir 40 MPa). A separação da amostra baseia-se nas diferenças das taxas de migração através da coluna resultante da diferente partição da amostra entre a fase estacionária e móvel (Bhardwaj et al., 2015; Gupta et al., 2012; Kumar et al., 2015).

O sistema utilizado neste tipo de cromatografia é constituído por um injetor, um sistema de bombagem, uma coluna cromatográfica, um detetor e sistema de recolha e processamento de dados. Conforme se pode verificar na figura 2.

Figura 3.2 – Sistema de análise por HPLC (Adaptado de Bhardwaj et al., 2015).

Durante o desenvolvimento do método, é necessário selecionar um conjunto de condições iniciais (detetor, coluna, fase móvel). A coluna é, naturalmente, a peça de partida e central de um cromatógrafo. Uma coluna adequadamente selecionada pode produzir uma boa separação cromatográfica, que fornece uma análise precisa e confiável (Gupta et al., 2012; Kumar et al., 2015).

A escolha da melhor coluna requer conhecimento sobre as características químicas da fase estacionária, capacidade de retenção dos compostos, tamanho de partícula e a dimensão da coluna. Existem vários tipos de matrizes para suporte da fase estacionária, incluindo sílica, polímeros, alumina e zircónio. A sílica é a matriz mais comum para colunas de HPLC. As matrizes de sílica são robustas e não tendem a comprimir sob pressão. A sílica é quimicamente estável na maioria dos solventes orgânicos e em sistemas de baixo pH (Gupta et al., 2012; Kumar et al., 2015).

A natureza da fase estacionária determina se a coluna a ser utilizada é de fase normal (NP-HPLC) ou fase inversa (RP-HPLC). A cromatografia de fase normal utiliza uma fase estacionária polar e uma fase móvel não polar (p.e. hexano). Uma coluna típica tem um diâmetro interno de cerca de 4,6 mm, e um comprimento de 150 a 250 mm (Kumar et al., 2015).

24 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa Na cromatografia de fase inversa o solvente utilizado na fase móvel (p.e. mistura água e metanol) apresenta uma polaridade superior ao enchimento da fase estacionária (sílica modificada). Assim, os componentes que apresentam maior polaridade são eluídos em primeiro, pois apresentam uma maior afinidade com a fase móvel. Na fase inversa, o tamanho da coluna é semelhante, mas a sílica é modificada e tornada não-polar, ligando-se a hidrocarbonetos de cadeia longa - tipicamente com 8 ou 18 átomos de carbono (colunas C8 e C18) (Kumar et al., 2015).

Existem diversos tipos de detetores que podem ser utilizados em sistemas de HPLC cuja função é detetar a presença de um composto na mistura que sai da coluna proporcionando um sinal elétrico a um dispositivo de aquisição de dados. Os principais tipos de detetores utilizados em HPLC são índice de refração (IR), UV-VIS, fluorescência, eletroquímico, detetores de condutividade e espectrómetro de massa (Bhardwaj et al., 2015; Gupta et al., 2012; Kumar et al., 2015). Neste trabalho, foi utilizado o detetor UV/Vis com uma rede de díodos.

As vantagens de HPLC incluem eficiência, tempos de corrida de curta duração e sensibilidade. A técnica de HPLC de fase inversa é de longe a mais comum na análise de carotenoides, embora alguns métodos de fase normal tenham sido desenvolvidos para a separação de misturas de xantofilas (Rodriguez-Amaya, 2016; Finkel’shtein, 2016; Kopec et al., 2012).

A deteção por UV/Vis utilizando uma rede de díodos (DAD) é mais comum para análise de carotenoides por HPLC, embora outros detetores, como detetores eletroquímicos (ECD), fluorescência e MS possam também ser usados (Finkel’shtein, 2016, Hrvolová et al., 2016, Irakli et al., 2016; Boboyo-Gil et al., 2012; Irakli et al., 2011).

A técnica de HPLC de fase inversa em colunas C18 tem sido o modo preferido para separar e analisar carotenoides (Machmudah e Goto, 2013).

As colunas C18 permitem a separação de uma ampla gama de analitos, especialmente aqueles com cadeias relativamente curtas e pesos moleculares baixos. A popularidade da coluna C18 deriva das suas interações hidrofóbicas fracas com os analitos, compatibilidade com a maioria dos solventes e com a faixa de polaridade dos carotenoides e uma ampla disponibilidade comercial (Kumar et al., 2016; Machmudah e Goto, 2013).

As colunas C30 são uma escolha particularmente boa para uma melhor separação e alta resolução de isómeros geométricos dos carotenos menos polares, principalmente licopeno e β-caroteno. No entanto, quando aplicadas à análise geral de carotenoides, as colunas C30 permitem obter perfis semelhantes aos obtidos com colunas C18

convencionais, mas com tempos de corrida cromatográfica mais longos. As limitações na aplicação de colunas C30 são, por conseguinte, a sua capacidade para separar apenas isómeros geométricos de carotenoides com uma gama limitada de polaridade e os seus tempos longos de corrida cromatográfica (geralmente 60-100 min, em oposição a 10-25 min para colunas C18 (Rodriguez-Amaya, 2016; Amorim-Carrilho et al., 2014; Kopec et al., 2012, Sander et al., 2000).

A eluição dos carotenoides pode ser feita em modo isocrático ou em gradiente. A eluição em gradiente tem as vantagens de maior poder de resolução e sensibilidade melhorada. No entanto, tem várias desvantagens: maior complexidade; exigência de equipamento mais sofisticado e dispendioso; necessidade de reequilíbrio de coluna entre corridas; reprodutibilidade frequentemente fraca. A eluição isocrática é rápida e resulta em tempos de linha de base estáveis e mais reprodutíveis. É o método mais adequado para análises de rotina (Rodriguez-Amaya, 2016; Machmudah e Goto, 2013; Rivera e Canela-Garayoa, 2012).

A regulação da temperatura é recomendada para manter a reprodutibilidade. As variações na temperatura da coluna resultam numa flutuação substancial dos tempos de retenção dos carotenoides. A temperatura também pode influenciar a seletividade (Machmudah e Goto, 2013).

As propriedades mais importantes a serem consideradas na seleção da fase móvel para a análise de carotenoides são a polaridade, viscosidade, volatilidade e toxicidade. O acetonitrilo tem sido amplamente utilizado devido à sua baixa viscosidade (baixo ruído na deteção na zona do UV), requer uma pressão da coluna inferior e, em geral, boa forma de pico (Amorim-Carrilho et al., 2014; Machmudah e Goto, 2013).

3.6.1.2. Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência

A técnica de HPLC-DAD fornece um grande conjunto de dados fiáveis e detalhados sobre a composição de carotenoides dos alimentos. No entanto, devido a problemas ambientais e económicos, existe uma procura contínua por métodos mais rápidos que usam menos solventes orgânicos (Rodriguez-Amaya, 2016).

Desenvolvimentos tecnológicos em termos de colunas e instrumentação levaram a UHPLC. A técnica de UHPLC, em comparação com a técnica de HPLC, utiliza colunas com partículas de menor diâmetro, mais curtas, menores tempos de separação fazendo com que as análises sejam mais rápidas (10 min), com caudais mais reduzidos e menor