Avaliação dos polimorfismos e expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes com doença arterial

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. VICTOR HUGO REZENDE DUARTE. AVALIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS E EXPRESSÃO DE RNAm DO TREML4 EM LEUCÓCITOS DE PACIENTES COM DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA.. Natal – RN 2017. 1.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. VICTOR HUGO REZENDE DUARTE. AVALIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS E EXPRESSÃO DE RNAm DO TREML4 EM LEUCÓCITOS DE PACIENTES COM DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmaceuticas. Orientador: Prof. Dr. Vivian Nogueira Silbiger Co-orientador: Prof. Dr. André Ducati Luchessi. Natal – RN 2017. 2.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Duarte, Victor Hugo Rezende. Avaliação dos polimorfismos e expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes com doença arterial / Victor Hugo Rezende Duarte. - Natal, 2017. 103f.: il. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacéuticas)-Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientadora: Profa. Dra. Vivian Nogueira Silbiger. Coorientador: Prof. Dr. André Ducati Luchessi.. 1. Doença cardiovascular - Dissertação. 2. Extensão da lesão coronariana - Dissertação. 3. TREML4 - Dissertação. 4. Polimorfismos - Dissertação. 5. Expressão de RNAm - Dissertação. 6. Índice de Friesinger - Dissertação. I. Silbiger, Vivian Nogueira. II. Luchessi, André Ducati. III. Título. RN/UF/BSCCS. CDU 616.12:575.1. 3.

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(5) “Renda-se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei. Não se preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento. - Clarisse Lispector”. 5.

(6) AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, pelo seu imenso amor e proteção, por nunca ter desistido de mim, por auxiliar os meus passos e ter me dado forças para prosseguir nesta jornada; Aos meus amados pais, Clesenilton (In memorian) e Elineide, pelo amor, carinho e educação que sempre me ofertaram, pela força e auxílio oferecido em momentos difíceis, pelo companheirismo e pela compreensão de minha natureza tão complexa e finalmente por estimularem e acreditarem fielmente na minha capacidade; Aos meus irmãos, Alícia, Maria Clara, Yure, Valéria e Vitória, pela presença constante e por se alegrarem com minhas conquistas; Aos meus avós Maria do Socorro e Hildo Pereira (In memorian), Francisa Duarte e Raimundo Duarte (In memorian) por todo amor e carinho oferecido e por todos os ensinamentos compartilhados. Tios e primos por me apoiarem e torcerem pelo meu sucesso; A meus orientadores, Profa. Dra. Vivian Nogueira Silbiger e Prof. Dr. André Ducati Luchessi, pela oportunidade, acolhimento, paciência, dedicação e orientações durante minha trajetória, pelas contribuições e ensinamentos prestados. Aos professores Mário Hirata e Rosário Hirata, por acreditar em meu estudo e por todas as colaborações prestadas. Aos membros da banca por terem aceitado o convite e por todas as colaborações prestadas. Aos meus amigos, estes que são tesouros em minha vida, sempre me apoiando, vibrando junto comigo cada conquista alcançada e por entenderam a minha ausência em muitos momentos importantes: Thais, Neiva, Luana, Cleyton, Mayara, Jarlene, Tinda, Netinha, Ricardo, João Paulo, Joaquim, Maria clara e Thaynara. As najinhas pelos CHOICES AND MOMENTS, assim como pela companhia nos momentos difíceis passados juntos, galera (Iago, Carol, Nana, Marina, Jéssica Nayara) obrigado por tudo, vocês são dez. Às amigas Mychelle e Jessica Santos, pelas palavras, pelos carinhos compartilhados e pelo apoio, assim como ao trio das superpoderosas IC’s (Ayda, Ana Paula e Conceição, vulgo tininha) por todo auxílio e carinho. A todos que compõe o Laboratório de Bioanálises e Biotecnologia Molecular- LBBM, pelos momentos de aprendizagem, conhecimentos compartilhados e pela amizade construída. A CAPES pela concessão da minha bolsa de mestrado. Enfim,atodos que contribuíram, acreditaram e torceram por esta conquista. Meu muito obrigado!. 6.

(7) RESUMO As proteínas da família triggering receptor expressed on myeloid cells (TREM) são associados com o risco e progressão da aterosclerose. Em resultados prévios observamos que a alta expressão do TREML4está relacionada com fase inicial da Síndrome Coronariana Aguda (SCA).Neste estudo, investigamos a relação dos polimorfismos e a expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes estratificados de acordo com a extensão das lesões das atrérias coronárias. Foram incluídos pacientes com doença arterial coronariana (DAC) (n=151), com idades entre 30 e 74 anos, submetidos à angiografia coronária eletiva. A extensão da lesão coronariana foi avaliada através do índice de Friesinger. Os polimorfismosrs2803495 (A> G), rs2803496 (T> C) e aexpressão do RNAm do TREML4 em leucócitos foram analisadas por qRT-PCR. A expressão de TREML4 foi maior em pacientes com lesões coronarianas graves em relação aos sem lesão, baixas e intermediárias, (p <0.05). Indivíduos portadores do alelo G do rs2803495 (genótipos AG / GG) e do alelo C do rs2803496(genótipos TC / CC) apresentaram uma expressão de RNAm de TREML4 positiva (Alelo G: OR = 2.4, 95% CI 1.0-5.7, p < 0.05; e Alelo C: OR = 7.8, 95% CI = 2.9-20.9, p < 0.01, respectivamente).Entretanto, os polimorfismos do TREML4 não foram associados com as extensões das lesões coronárias. Em conclusão, a expressão aumentada de mRNA de TREML4 nos leucócitos é influenciada por polimorfismos e está associada a lesões mais graves das artérias coronárias, sugerindo seu papel como potencial biomarcador para investigar a extensão da lesão coronariana em pacientes com DAC. Palavras chaves: Doença cardiovascular; Extensão da lesão coronariana; TREML4, Polimorfismos; Expressão de RNAm; Índice de Friesinger.. 7.

(8) ABSTRACT The members of the triggering receptor expressed on myeloid cells (TREM) family are associated with the risk and progression of atherosclerosis. We previously reported the upregulation of TREML4 in the early phase of theacute coronary syndrome. Here, we investigated the relationship of TREML4 polymorphisms and mRNA expression in blood leukocytes of patients stratificate accordingto the extension of coronary artery lesion. Patients with coronary artery disease (CAD) (n = 151), aged 30 to 74 years and undergoing elective coronary angiography,were selected. The extension of coronary lesion was assessed by the Friesinger index.TREML4 rs2803495 (A>G) and rs2803496 (T>C) variants andleukocyte mRNA expression were analyzed by qRT-PCR. TREML4 expression was higher in patients with major coronary artery lesions compared to subjects without or with low and intermediate lesions, (p < 0.05). Subjects carrying rs2803495 G allele (AG/GG genotypes) and rs2803496 C allele (TC/CC genotypes) were more prone to have positive TREML4 mRNA expression (Allele G: OR = 2.4, 95% CI 1.0-5.7, p < 0.05; allele C: OR = 7.8, and 95% CI = 2.9-20.9, p < 0.01, respectively).However, TREML4 polymorphisms were not associated with the extent of coronary lesion.In conclusion, increased TREML4 mRNA expression in blood leukocytes is influenced by gene polymorphisms and it is associated with more severe coronary artery lesions, suggesting its role as potential biomarker to investigate the extent of coronary lesion in CAD patients.. Keywords: Cardiovascular disease; Extension of coronary lesion; TREML4, gene polymorphisms; mRNA expression;FriesingerIndex. 8.

(9) LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Dados clínicos e laboratoriais dos pacientes com DAC……….........................29 TABELA 2 - Relação dos polimorfismos do TREML4 com a extensão da lesão coronária em pacientes com DAC..................................................................................................................32 TABELA 3- Relação dos polimorfismos do TREML4 com a expressão de RNAm de leucócitos em pacientes com CAD…………………………………………………………...33. 9.

(10) LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - A progressão de uma lesão aterosclerótica.......................................................21 FIGURA 2 - A influência da extensão das lesões das artérias coronárias sobre a expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes com DAC.....................................................31. 10.

(11) LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS ACTB. Beta actina. Ag. Antígeno. BMDMS. Macrófagos derivados de medula óssea de murinos. CAC. Calcificação arterial coronariana. DNCT. Doenças crônicas não transmissíveis. DAC. Doença arterial coronarina. CD. Células dendríticas. cDNA. DNA complementar. CEP-HOUL. Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes. CID. Código internacional de doenças. DAP12. DNAX-activating protein 12. DCV. Doenças cardiovasculares. DEPEC. Dietilpirocarbonato. DNA. Ácido desoxirribonucleico. dNTPs. Trifosfatos de Desoxinucleótidos. dUTP. Trifosfato de desoxiuridina. EDTA. Ácido etilenodiaminotetracético. EHW. Equilíbrio de Hardy-Weinberg. GAPDH. Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. HDL. lipoproteína de alta densidade. HOUL. Hospital Universitário Onofre Lopes. IL-10. Interleucina 10. IL-1β. Inteleucina 1 beta. IL-6. Interleucina 6. IL-8. Interleuina 8. IMC. Índice de massa corpórea. INCOR. Instituo do coração. INF. Interferon. INF-α. Interferon alfa. LDL. lipoproteína de baixa densidade. LPS. Lipopolissacarídeos. MK. Megacariócitos. NHC. Natal Hospita Center. 11.

(12) OMS. Organização mundial de saúde. RNA. Ácido ribonucléico. RNAm. RNA mensageiro. SCA. Síndrome coronariana aguda. SNP. Polimorfirmos de um único nocleotideo. sTLT-1. TREM-like transcript-1solúvel. sTREM. Triggering receptors expressed on myeloid cells solúvel. TLR. Toll like. TLR13. Toll like 13. TLR-2. Toll like 2. TLR-4. Toll Like 4. TLR7. Toll Like 7. TLR9. Toll Like 9. TLT-4. TREM-like transcript-4. TNF. Fator de necrose tumoral. TREM. Triggering receptors expressed on myeloid cells. TREM1. Triggering receptors expressed on myeloid cells1. TREM2. Triggering receptors expressed on myeloid cells2. TREM3. Triggering receptors expressed on myeloid cells3. TREM4. Triggering receptors expressed on myeloid cells4. TREML. triggering receptor expressed on myeloid cells-like. TREML1. triggering receptor expressed on myeloid cells-like 1. TREML2. triggering receptor expressed on myeloid cells-like 2. TREML3. triggering receptor expressed on myeloid cells-like 3. TREML4. triggering receptor expressed on myeloid cells-like 4. 12.

(13) 1 2 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 3 3.1 3.2 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 5 5.1 5.2 6 7 8 9. 10. SUMÁRIO INTRODUÇÃO............................................................................................................. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA................................................................................ DOENÇAS CARDIOVASCULARES E ATEROSCLEROSE.................................... FAMÍLIA TREM.......................................................................................................... TREM e TREML........................................................................................................... TREM1 e TREML1....................................................................................................... TREM2 e TREML2....................................................................................................... TREM3 e TREML3....................................................................................................... TREM4 e TREML4....................................................................................................... OBJETIVOS.................................................................................................................. Objetivo geral................................................................................................................ Objetivo específicos...................................................................................................... METODOLOGIA......................................................................................................... Casuística e Aspectos éticos.......................................................................................... Critérios de inclusão e exclusão.................................................................................... Variáveis analisadas...................................................................................................... Avaliação bioquímica e determinação dos parâmetros laboratoriais............................ Extração do RNA total.................................................................................................. Síntese do cDNA e expressão gênica............................................................................ Genotipagem.................................................................................................................. Análises estatísticas ...................................................................................................... RESULTADOS............................................................................................................. Dados clínicos e laboratoriais………………………………………………................ Expressão do RNAm e Polimorfismos do TREML4…................................................ DISCUSSÃO……………………………………………………………………….... CONCLUSÕES............................................................................................................ REFERÊNCIA............................................................................................................. ANEXOS...................................................................................................................... Certificado de aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa......................................... Questionário Clínico.................................................................................................... Termo de Consentimento Livre e Esclarecido............................................................. APÊNCIDES............................................................................................................... Artigo 1........................................................................................................................ Cover Letter.................................................................................................................. Normas da Revista – PLOS ONE................................................................................ Artigos puclicados em colaboração.............................................................................. Artigos em colaboração submetidos…………………………………………............. Artigos em colaboração (fase de escrita)........................................................................ 14 15 15 15 17 17 20 20 21 23 23 23 24 24 24 24 26 27 27 28 29 29 29 31 34 37 38. 13.

(14) 1. INTRODUÇÃO As doenças cardiovasculares (DCV) são um grupo de doenças crônicas não transmissíveis que apresentam um perfil epidemiológico semelhante às grandes endemias do século passado sendo a maior causa de morbimortalidade em todo o mundo (WHO,2016). Clinicamente as DCV são caracterizadas como desordens que acometem o coração, vasos sanguíneos e incluem: doença arterial coronária, doença cerebrovascular, doença arterial periférica e outras condições, como hipertensão e trombose (WHO,2016). Atualmente, a principal causa do desenvolvimento de DCV é a aterosclerose (XAVIER et al., 2013). A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela formação de placas constituídas por células espumosas, células imunológicas, células endoteliais vasculares, células de tecido muscular liso, plaquetas, matriz extracelular, um núcleo rico em lipídeos com extensa necrose e fibrose de tecidos circundantes. Fatores de risco podem pode ser desencadear a aterosclerose, como dislipidemia, hipertensão arterial, diabetes e tabagismo(COCHAIN; ZERNECKE, 2017; LUSIS, 2000; XAVIER et al., 2013). O avanço tecnológico aliado à ciência vem proporcionando uma expansão crescente nos diagnósticos das DCV. A Biologia Molecular tem proporcionado estudos com resultados significativos e importantes que tem contribuído para a confirmação de diversos métodos de diagnóstico para doenças complexas. Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos a fim de se buscar genes que possam atuar como marcadores destas doenças, possibilitando prever o seu desenvolvimento e até mesmo diferenciar situações clínicas antes indistinguíveis. O TREM e TREML são proteínas de superfície celular, membros da família das imunoglobulinas, denominadas Triggering receptors expressed on myeloid cells (TREM) e TREM like transcript (TREML), respectivamente.(CHENG ET AL. 2016; JOFFRE ET AL. 2016). Esses receptores fazem parte de um grupo de genes localizados no mesmo cluster gênico, localizados no cromossomo 6p21.11 em humanos(CHENG ET AL. 2016; OWENS ET AL. 2017). TREML4 (Triggering receptor expressed on myeloides cells like 4) é uma proteína, membro da superfamília das imunoglobulinas, altamente expressa em células mielóides e linfóides, tais como monócitos, macrófagos, CD8+ e CD24+, RESPECTIVAMENTE (BRISEÑO ET AL. 2016; IDOYAGA ET AL. 2014). Altos níveis de expressão do TREML4 também foram associados à estímulos de receptores do tipo toll (TLR7, TLR9, TLR13) e IL18, assim como o TREML4 parece apresentar um papel importante na regulação da sinalização por TLR7, sendo sua expressão. 14.

(15) importante na resposta antiviral e em doenças autoimunes mediadas por TLR7 (RAMIREZORTIZ ET AL. 2015). Nas doenças cardiovasculares o TREML4 foi descrito inicialmente em 2013 por Silbiger e colaboradores, utilizando um total de84 indivíduos com Síndrome Coronariana Aguda (SCA)e , 47 indivíduos sem Infarto agudo do miocárdio(IAM) (grupo controle), demonstraram que altos níveis de expressão do TREML4 no indivíduos com SCA quando comparados ao grupo controle.. (SILBIGER ET AL. 2013).Posteriormente, Sen e. colaboradores (2014), demonstrou este gene e seus polimorfismos como potenciais biomarcadores de calcificação aterial coronariana (CAC)(SEN, BOELTE, BARB, JOEHANES, ZHAO, CHENG, ADAMS, TEER, ACCAME, CHOWDHURY, SINGH, KAVOUSI, PEYSER, QUIGLEY, PRIEL, LAU, KUHNS, YOSHIMURA, JOHNSON, HWANG, CHEN, ARAI, GREEN, MULLIKIN, KOLODGIE, O’DONNELL, VIRMANI, MUNSON, MCVICAR, AND BIESECKER 2014). A partir desses estudos, foi possível constatar relação deste gene (TREML4) com o processo de calcificação de artérias e com a aterosclerose. Contudo, o papel deste gene ainda não está esclarecido, demonstrando a necessidade de novas investigações deste gene e seus polimorfismos na gênese das DCV. 2.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1DOENÇAS CARDIOVASCULARES E ATEROSCLEROSE Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) 17,5 milhões de pessoas morreram por alterações cardiovasculares em 2012, representando 31% de todas as mortes globais por doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) (WHO, 2016). Com base nesse perfil epidemiológico, a OMS estabeleceu como meta até o ano de 2025, a redução de 25% da DCNT dentre elas as DCV (MCKEE M ET. AL., 2014). No ano de 2014 no Brasil as doenças do aparelho circulatório levaram a 340.284 óbitos, sendo 12.411 referentes a doenças das artérias, das arteríolas e capilares segundo o Código Internacional de Doenças (CID-10), informações do Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde – DATASUS. No Rio Grande do Norte (RN), sua porcentagem é aindamaior, onde cerca de 58,6% dos potiguares têm causa de morte definida por DCV. Em números totais isso representa 1.875 mil mortes no ano de 2011 a cada cem mil habitantes no RN(DATASUS, 2016). A hipótese que mais difundida para explicar a gênese da aterosclerose é baseada na “resposta a injuria”. A etapa inicial é a disfunção das células endoteliais que aumentam a permeabilidade da camada íntima às lipoproteínas plasmáticas, favorecendo o influxo e. 15.

(16) retenção de lipoproteínas de baixa densidade (low density liproprotein, LDL) para o espaço subendotelial. Consequentemente, estas partículas sofrem oxidação e um processo inflamatório é instalado. Citocinas inflamatórias são liberadas e moléculas de adesão leucocitárias são expressas, promovendo a atração de monócitos e linfócitos para íntima da parede arterial. (MEHTA; SALDEEN; RAND, 1998; XAVIER et al., 2013). O microambiente inflamatório apresenta papel central na formação na placa aterosclerótica (RUBINI GIMENEZ; TWERENBOLD; MUELLER, 2015). Com a migração de monócitos para o espaço subendotelial e conseguinte diferenciação em macrófagos, estas células captam as moléculas de LDL oxidadas e sem controle da quantidade recebida, tornando-se células espumosas. Por conseguinte, células musculares lisas de a camada média endotelial recebem estímulos quimiotáticos e migram para a camada íntima onde se proliferam e passam a produzir citocinas, fatores de crescimento e liberar matriz extracelular, favorecendo a formação de uma capa fibrosa na placa aterosclerótica (COCHAIN; ZERNECKE, 2017; LUSIS, 2000; MEHTA; SALDEEN; RAND, 1998; RUBINI GIMENEZ; TWERENBOLD; MUELLER, 2015). Ao final desse processo, temos a placa aterosclerótica plenamente desenvolvida. Em sua constituição encontramos então, elementos celulares, componentes da matriz extracelular, pontos de calcificação, núcleo lipídico e necrótico, formado principalmente por produtos de células mortas. Entretanto, essa placa também apresenta proteínas do sistema de coagulação e fibrinólise (metaloproteinases) envolvidas na inflamação e trombose, podendo favorecer a ruptura da placa e oclusão de vasos (LUSIS, 2000; RUBINI GIMENEZ; TWERENBOLD; MUELLER, 2015; XAVIER et al., 2013) (Fig 1.) Após o seu desenvolvimento as placas ateroscleróticas podem ser estáveis ou instáveis. As estáveis caracterizam-se por uma grande quantidade de colágeno, favorecendo a formação de uma em capa fibrosa espessa, poucas células inflamatórias e núcleo lipídico e necrótico em menores proporções. As placas instáveis apresentam alta atividade inflamatória, grande atividade proteolítica, núcleo fortemente lipídico e necrótico, e uma capa fibrótica delgada. A ruptura desta placa favorece um microambiente altamente trombogênico, e uma consequente foração de um trombo, processo este, denominado de aterotrombose (XAVIER et al., 2013).. 16.

(17) Figura 1. A progressão de uma lesão aterosclerótica. Adaptado: Javier Sanz & Zahi A. Fayad, 2008. ICAM, Molécula de adesão intercelular; VCAM, Molécula de adesão vascular; LDL, lopoproteína de baixa densidade; MMP, metaloproteínase de matriz.. 2.2. FAMÍLIA TREM 2.2.1. TREM e TREML Os receptores TREM e TREML são expressos em uma variedade de células da linhagem mielóide incluindo neutrófilos, monócitos, macrófagos, microglia, osteoclastos e células dendríticas, assim como em megacariócitos e plaquetas. Assim, essas proteínas parecem apresentar papel chave em processos imunológicos, em especial durante a resposta imune inata(FORD AND MCVICAR 2010). Além disso, membros desta família já foram associados com a DNAX-activating protein 12 (DAP12) estimulando a produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, como a interleucina 8 (IL-8), CCL-2, CCL-7 e degranulação de neutrófilos(JOFFRE ET AL. 2016; WASHINGTON ET AL. 2017; YUAN ET AL. 2017).. 17.

(18) Contudo, o papel dessa família em processos inflamatórios ainda não está elucidado. Em doenças inflamatórias crônicas como o Alzheimer, membros desta família e os seusSingle Nucletide Polimorfirms (SNP) parecem apresentar papel importante na sua gênese. O SNP rs75932628, por exemplo, foi descrito como fator de risco ao desenvolvimento de Alzheimer em caucasianos quanto comparados a não caucasianos (CHENG ET AL. 2016). Owens e colaboradores (2017) sugerem que a expressão do gene e da proteína TREM podem alterar a sinalização de receptores que podem influenciar na inflamação, assim como a família tem expressão diferenciada em células da microglia (OWENS ET AL. 2017).Além disso, há uma evidência para o papel do TREM no processo inflamatório regulando a função da integrina via Plexin-A1, assim como através de sinais inflamatórios associados à adesão ou motilidade de leucócitos. Diversos efeitos biológicos desta família são mediados pela integração de sinais inflamatórios gerados durante a interação entre células imunes assim como com a matriz extracelular (FORD AND MCVICAR 2010). 2.2.2. TREM-1 e TREML1 TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells-1) é um imunoreceptor proteico, da família das imunoglobulinas com domínio tipo V, expresso em monócitos, macrófagos e neutrófilos(NURDEN ET AL. 2009). A ativação do receptor TREM parece amplificar uma resposta pró-inflamatória em alguns tipos celulares através de ligantes tipoToll Like (TLR) e Lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos. O TREM-1 ainda mostrou-se associado com outros processos imunológicos importantes como a fagocitose e liberação de citocinas, e a sua ativação sinérgica com LPS pode estimular a produção de citocinas próinflamatórias.(DOWER ET AL. 2017). Murakami et al. (2006) indicam ainda que a expressão do TREM-1 é fortemente ligada a lesões inflamatórias agudas e crônicas na pele, fluidos biológicos. e. tecidos. infectados. por. bactérias. Gram-positivas,. Gram-negativas. e. fungos(GIBOT 2005; MURAKAMI ET AL. 2006). O TREM-like transcript-1 (TLT-1/TREML1) é um gene encontrado no mesmo locus do TREM1, cujo seu domínio extracelular apresenta aproximadamente 202 de aminoácidos e é homólogo com os demais membros da família TREM (YOON ET AL. 2012). O TLT-1 é mais expresso em megacariócitos (MK) e parece desempenhar função importante da regulação da homeostase vascular dos receptores TREM(WASHINGTON ET AL. 2017), assim como sua forma solúvel (sTLT1) parece ligar-se ao fibrinogênio aumentando a agregação plaquetária in vitro(Derive et al. 2017). Outros estudos descrevem ainda, que os transcritos do TREML (TREM like) são homologos entre humanos e ratos e que são os únicos. 18.

(19) receptores inibitórios dentro do cluster TREM, desempenhando um papel importante na regulação da função das células mielóides (WASHINGTON, QUIGLEY, AND MCVICAR 2002). O papel desses genes em processos biológicos ainda não está elucidado. No entanto, os níveis de TREM-1 nas superfícies celulares são aumentados em reposta aos níveis de LPS e outros estímulos microbianos. A sua forma solúvel (sTREM-1) é liberado pelas plaquetas ativadas e pode prevenir uma inflamação prolongada e sustentada (DERIVE ET AL. 2017), assim como pode estar aumentada em pacientes com sepse o que sugere este gene como um marcador útil para o diagnostico de sepse nosocomiais(GÓMEZ-PIÑA ET AL. 2017). Por exemplo, em infecções ocasionadas por Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus o aumento da expressão do TREM1 resulta na liberação de citocinas pró-inflamatórias. Assim, bloqueio do TREM1 pode impedir o choque séptico induzido por LPS (ALLCOCK ET AL. 2003). Existem ainda hipóteses que a mensuração local das concentração de sTREM-1 podem servir para avaliar uma variedade de infecções localizadas (SANKAR AND WEBSTER 2013). Na presença de Toll like-2 (TLR-2) ou Toll Like-4 (TLR-4) a ativação de TREM-1 amplia a produção de citocinas pró-inflamatórias (fator de necrose tumoral [TNF], Interleucina-1β [IL-1β]) e inibe a liberação de Interleucina 10 (IL-10)(GIBOT 2005). As plaquetas influenciam na aterogênese aderindo às células endoteliais e níveis aumentados de sTLT-1 podem controlar a hemostasia aumentando a polimerização da actina e a agregação plaquetária ao endotélio. Assim, o aumento de sTLT-1 pode ser um facilitador para a aterotrombose, tanto ativando quimiotaticamente outras plaquetas, quando auxiliando na fixação de trombos no endotélio vascular (ESPONDA ET AL. 2015). 2.2.3. TREM2 E TREML2 TREM-2 (triggering receptor expressed on myeloid cells-2) e TREML2 (triggering receptor expressed on myeloid cells-like 2) são expressas especialmente em células dendríticas derivadas de monócitos imaturos, osteoblastos e células da microglia. Atuam modulando a resposta imune inata, amplificando ou atenuando sinais induzidos pelo receptor tipo toll (TLR) e desempenhando assim um fundamental na regulação de respostas inflamatórias(KING ET AL. 2017; ZHENG ET AL. 2016). Entretanto o seu envolvimento em processos imunobiológicos não está elucidado. O TREM2 parece ser suprimido por lipopolissacarídeos celulares(ZHENG ET AL. 2016). A sua presença é crítica para a maturação de células dendríticas e migração para os nódulos linfáticos, assim como auxiliando na apresentação de antígenos (Ag) às células T. Em. 19.

(20) seres humanos, a deficiência de TREM-2 foi relatada como envolvida no aparecimento de sintomas de doenças neurodegenerativas como osteodisplasia lipomembranosa poliquística (doença de Nasu-Hakola)(KING ET AL. 2017). O TREML2 foi descrito apresentando um papel similar ao receptor B7-H3, coestimulando células T murinas. Entretanto, em humanos esta proteína não serve como um receptor co-estimulador para B7-H3(LEITNER ET AL. 2010). Por outro lado, outros estudos descrevem o TEM-2 como capaz de suprimir a produção de fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina 6 (IL-6) de macrófagos e promover um estado anti-inflamatório, assim como sendo mais expresso em líquido cefalorraquidiano, do que em tecido sanguíneo (FORD AND MCVICAR 2010). TLT2 é expresso no início do desenvolvimento dos linfócitos B, sendo mais expresso em células B do tipo B1. Além disso, essa proteína é presente em neutrófilos e macrófagos da medula óssea e sua expressão é aumentada frente a estímulos inflamatórios (KING ET AL. 2017). As proteínas TLT-2 de ratos e humanos apresentam similaridade de 80% e são 60% homólogas a domínios de imunoglobulinas (Ig) (KYUNG H. YI AND LIEPING CHEN 2010). Apesar dos papéis diversos apresentados para o TREM2 e TREML2 as suas funções em processos inflamatórios e na resposta imune inata não está elucidado, sendo necessárias novas investigações. 2.2.4. TREM3 e TREML3 O TREM-3(triggering receptor expressed on myeloid cells-3) é uma proteína que contém um domínio único similar a imunoglobulinas e um resíduo transmembranar de lisina. Em rato, o TREM-3 encontra-se no genoma adjacente ao TREM-1. O TREM-3 mais é expresso em monócitos, macrófagos e células T, e sua expressão é aumentada após a exposição à LPS e diminuída após o tratamento com interferon (IFN). Além disso, o TREM-3 pode se associar a DAP-12 fornecendo um sinal de ativação celular. Estruturalmente, o TREM-3 é 32% homologo ao TREM-1 e 20% ao TREM-2 (CHUNG, SEAMAN, AND DAWS 2002). TREML3 (triggering receptor expressed on myeloid cells-like 3) por outro lado, codifica uma proteína de 18 kDa com aproximadamente 165 aminoácidos e difere dos outros membros da família TREM, pois está localizada em uma região. entre dois éxons.. Estruturalmente, essa proteína apresenta similaridade de 90% com outras proteínas da mesma família, tais como, o TLT4 (ALLCOCK ET AL. 2003).. 20.

(21) 2.2.5. TREM4 E TREML4 O triggering receptor expressed on myeloid cells 4(TREM4) é uma proteína constituída por 198 aminoácidos. Nos murinos, o TREM4 está localizado entre os genes TREM1 e FOXP4 e codifica uma proteína rica em treonina localizada entre o domíneo Ig e a região transmembranar. O geneTREM4 apresenta níveis de expressão maiores em órgão como baço, timo, intestino delgado, fígado e pulmão(KASAMATSU ET AL. 2016). No sistema imunológico, o TREM4 é mais expresso em macrófagos e células dendríticas (CD) e parece estar envolvido durante respostas inflamatórias. Além disso, o TREM4 pareceestar envolvido na produção de interferon-α (IFN-α) a partir de células dendríticas plasmocíticas induzidas poruma tirosina quinase 3. Níveis elevados de RNAm do TREM4 foram encontrados emmacrófagos derivados de medula óssea de murinos (BMDMs) e a sinalização de receptores do tipo toll-like(TLR) parecem influenciar a expressão do TREM4(KASAMATSU ET AL. 2016). TREML4 (Triggering receptor expressed on myeloides cells like 4) é uma proteína, membro da superfamília das imunoglobulinas, altamente expressa em células mielóides e linfóides, tais como monócitos, macrófagos, CD8+ e CD24+, respectivamente (BRISEÑO ET AL. 2016; IDOYAGA ET AL. 2014). Entre humanos e ratos os aminoácidos do TREML4 apresentam uma similaridade de 40%, entretanto o TREML4 humano é truncado devido a inserção de um códon de terminação em sua sequencia de nucleotídeos(NETEA AND VAN DE VEERDONK 2015; RAMIREZ-ORTIZ ET AL. 2015) O RNAm de TREML4e a proteína, foram descritos predominantemente expressos no baço. TREML4, como outros membros da família TREM, possui a capacidade de associar-se à molécula adaptadora DAP12 e a forma solúvel do TREML4s possui afinidade por células necróticas (HEMMI ET AL. 2009B). Altos níveis de expressão do TREML4 também foram associados à estímulos de receptores do tipo toll (TLR7, TLR9, TLR13) e IL18, assim como o TREML4 parece apresentar um papel importante na regulação da sinalização por TLR7, sendo sua expressão importante na resposta antiviral e em doenças autoimunes mediadas por TLR7 (RAMIREZ-ORTIZ ET AL. 2015). Desta forma, o desenvolvimento de agonistas TREML4 específicos, podem ser úteis para decifrar as principais vias de sinalização amplificação de TLR e IFN mediada, enquanto que os antagonistas de TREML4 podem ter aplicações terapêuticas na diminuição de doenças inflamatórias autoimunes (RAMIREZ-ORTIZ ET AL. 2015). Em 2013, um estudo transcriptômico realizado por Silbiger e colaboradores, utilizando um total de84 indivíduos com Síndrome Coronariana Aguda (SCA), 47 indivíduos sem IAM. 21.

(22) (grupo controle), de ambos os sexos com idade entre 30 a 65 anos, atendidos no Instituto Dante Pazzanese do Estado de São Paulo, Brasil, foi possível destacar que 599 genes estavam diferentemente expressos nas primeiras 48 h após IAM através avaliação da expressão gênica global utilizando microarranjos de DNA (Affymetrix). Trinta e três genes foram selecionados e submetidos à validação técnica, sendo que destes, 20 genes foram submetidos à validação biológica pela PCR em tempo real, dentre eles o TREML4, demonstrando que este gene parece apresentar um papel importante em estágios iniciais da SCA(SILBIGER ET AL. 2013). No estudo de Sen e colaboradores (2014), posterior a descrição do gene TREML4 por Silbiger e colaboradores (2013) foi demonstrado que este gene pode ser considerado com um biomarcador de calcificação aterial coronariana (CAC) através da análise do sequenciamento genômico pela plataforma Illumina GAIIX e validado através da técnica Digital Multiplexed Measurement of gene expression em 852 indivíduos com CAC, onde destes 48 apresentavam alto risco para ao desenvolvimento da DCV (SEN, BOELTE, BARB, JOEHANES, ZHAO, CHENG, ADAMS, TEER, ACCAME, CHOWDHURY, SINGH, KAVOUSI, PEYSER, QUIGLEY, PRIEL, LAU, KUHNS, YOSHIMURA, JOHNSON, HWANG, CHEN, ARAI, GREEN, MULLIKIN, KOLODGIE, O’DONNELL, VIRMANI, MUNSON, MCVICAR, AND BIESECKER 2014). A partir desse estudo integrativo realizado por Sen k e colaboradores em 2014, foi possível constatar relação do gene (TREML4) com o processo de calcificação de artérias através de uma associação entre a transcriptômica, genômica e proteômica. Ainda nesse estudo, definiu-se os polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP,Single Nucleotide Polymorphism) rs2803495 e rs2803496 como fundamentais para confirmação da hipótese de uma relação entre a expressão do TREML4 e a presença desses SNPs, onde os mesmos estariam regulando negativamente e positivamente o processo de CAC(SEN K ET AL. 2014).Contudo, o papel deste gene ainda não está esclarecido, demonstrando a necessidade de novas investigações deste gene e seus polimorfismos em DCV.. 22.

(23) 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Genotipar ospolimorfismosrs2803495 e rs2803496 e avaliar a expressão do RNAm do TREML4em leucócitos de pacientes estratificados de acordo com a extensão das lesões das atrérias coronárias, com a finalidade de associar este gene como potencial biomarcador precoce para doença aterial coronariana.. 3.2. Objetivos específicos -. Avaliar dados sociodemográficos dos pacientes sem lesão e diferentes extensões de lesão aterosclerótica para caracterizar a população;. -. Avaliar o perfil lipídico, glicêmico, hepático e renal dos pacientes sem lesão e diferentes extensões de lesão coronária;. -. Avaliar a relação dos parâmetros clínicos e laboratoriais com estratificação do índice de Friesinger.. -. Classificar as lesões das artérias coronárias de acordo com o índice de Friesinger, na cinecoronariografia;. -. Analisar a expressão do RNAm do TREML4 em pacientes sem lesão e diferentes extensões de lesão coronária;. -. Analisar a genotipagem dos SNPs (rs2803495 e rs2803496) do TREML4 e verificar a correlação existente ente a presença desses polimorfismos e a expressão do gene com a extensão da lesão coronária.. -. Correlacionar a estratificação de risco e o grau das lesões das artérias coronárias com a expressão diferencial de RNAm e com a genotipagem.. 23.

(24) 4. METODOLOGIA 4.1. CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS Trata-se de um estudo observacional prospectivo não controlado, realizado no entre os anos de 2011 a 2017 com um total de 280 pacientes onde, somente 151 pacientes foram incluídos, com idade entre 30 a 74 anos, que foram ao setor de Hemodinâmica dos Hospitais: Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), Hospital Universitário Onofre Lopes, Instituto do Coração (INCOR) e Natal Hospital Center (NHC), para. a realização de. cinecoronariografia. O presente projeto seguiu às diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na resolução do Conselho Nacional de Saúde nº 466/12 e nº340/04; sendo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL) sob o número de protocolo 520/11 (Anexo 4), CAAE: 0001.0.051.294-11. Os indivíduos selecionados e que aceitaram participar do estudo foram informados sobre o protocolo do mesmo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 6) e responderam a um questionário (Anexo 5), acordando a participação. 4.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO Foram incluídos no estudo: pacientes de 30-74 anos (parâmetro utilizado para cálculo do Escore de Framingham, escore para estimativa de doenças cardiovasculares em 10 anos) de ambos os sexos, que tivessem realizando a cinecoronariografia pela primeira vez e não tivessem doenças pré-estabelecidas (doença cardíaca, câncer, doença renal). Foram excluídos do estudo os pacientes que apresentavam qualquer das seguintes condições: insuficiência renal crônica; insuficiência hepática, distúrbio endócrino (tireóide), com exceção de diabetes mellitus; doenças inflamatórias; neoplasia; doença hematológica; hipercolesterolemia familiar conhecida ou presente em membros da família; miocardiopatia, incluindo doença de Chagas; valvopatia; doença congênita; e pericardiopatia. 4.3. VARIÁVEIS ANALISADAS Exames laboratoriais foram realizados: glicemia, lipidograma, uréia, creatinina, ácido úrico, alanina aminotransaminase e aspartato aminotransaminase. Quanto a extensão da doença coronariana, após a cinecoronariografia, o grau da lesão foi avaliado pelo índice de Friesinger. O escore quantificou as lesões das artérias coronárias, utilizando uma variação de 0 a 15 pontos. Cada um das três artérias coronárias principais. 24.

(25) (descendente anterior, circunflexa e coronária direita) foi marcada separadamente, recebendo uma pontuação de zero a cinco: 0) nenhuma anormalidade arteriográfica; 1) irregularidades da artéria ou estenose menor que 30%, 2) estenose de 30-68%, 3) múltiplas lesões ou pelo menos dois segmentos com estenose de 30-68%, 4) estenose de 69-100%, exceto oclusão dos segmentos proximais e 5) obstrução total (ou oclusão) de um segmento proximal (lesão de 100%)(BAMPI ABA ET AL.,2009; DUARTE ET AL, 2016). Após a interpretação dos laudos, os pacientes foram classificados conforme a pontuação, sendo agrupados em grupos: O – sem lesão, 1-4: poucas lesões; 5-9: lesões intermediárias e 10-15: lesões graves ou importantes, como adaptação de Chagas e colaboradores (BAMPI ABA ET AL.,2009; CHAGAS ET AL. 2011; DUARTE ET AL. 2016). Todos os pacientes selecionados foram submetidos à anamnese clínica completa com exame físico. Foram considerados portadores de hipertensão arterial, diabetes mellitus, dislipidêmico, tabagista, obeso, etilista, sedentário, os pacientes que se incluiam em um ou mais itens descriminados abaixo: 1) Hipertensão arterial sistêmica - o paciente que mencionou este fator de risco emitido por médico, com medidas de pressão arterial igual ou maior que 140 /90 mmHg e/ou que estivesse em uso de medicação anti-hipertensiva(SIMÃO A ET AL., 2013); 2) Diabetes Mellitus - o paciente que mencionou este fator de risco emitido por médico (informação do prontuário) em qualquer fase da vida e/ou que fazia tratamento com hipoglicemiantes orais ou insulina(MILECH A ET AL., 2016); 3) Dislipidemias - considerou-se dislipidêmico o paciente portador de dislipidemia em algum momento de sua vida e/ou relatado por médico sobre o nível de colesterol ou triacilglicerol elevado e, que realizou tratamento dietético e/ou usou medicamentos hipolipemiantes (XAVIER et al., 2013); 4) História familiar para doença coronária precoce - pacientes com relato de doença coronária em pais ou irmãos, abaixo dos 55 anos em homens, ou de 65 anos em mulheres(SIMÃO A ET AL., 2013); 5) Tabagismo – o paciente era classificado como: “não fumante”, quando o indivíduo tinha administrado menos de 100 cigarros ao longo da sua vida; “ex-fumante”, quando o indivíduo tinha fumado pelo menos 100 cigarros ao longo da sua vida, mas não tinha fumado no ano passado e “fumante”, quando o indivíduo tinha fumado mais de 100 cigarros ao longo da sua vida e continuou a fumar (INCA, 2011); 6) Obesidade - o critério de obesidade foi adotado com base no índice de massa corpórea (IMC). O IMC foi calculado dividindo o peso em quilogramas pelo quadrado da. 25.

(26) altura em metros. O sobrepeso para adultos foi atribuído para aqueles que apresentavam IMC > 25,0 Kg/m²e obesidade para aqueles que apresentavam IMC > 30,0 Kg/m² (WHO 2000), já idosos o sobrepeso foi para aqueles com IMC > 27,0 Kg/m² (LIPSCHITZ 1994) e obesidade para aqueles > 30,0 Kg/m². O peso foi determinado com roupas leves, sem sapatos, utilizando balança Omron HBF-514C (Omron Healthcare, Japão) e a altura mensurada com um antropômetro de 1,92 m; 7) Etilismo - foi classificado de acordo com o tipo de bebida alcoólica e o número de porções consumidas em um mês. Uma porção era definida como uma lata de cerveja; uma taça de vinho; uma dose de rum, vodka, uísque, ou qualquer outra bebida destilada(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014); 8) Sedentarismo- os pacientes foram considerados sedentários quando não praticavam regularmente atividade física (os indivíduos precisavam praticar pelo menos 150 minutos semanais de atividade física de intensidade moderada ou pelo menos 75 minutos semanais de atividade. Atividade com duração inferior a 10 minutos não é considerada para efeito do cálculo da soma diária de minutos despendidos pelo indivíduo com exercícios físicos)(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014);. Em relação aos medicamentos; os de uso diário foram considerados como medicação prévia ambulatorial. Foi dada especial atenção ao uso de medicamentos comuns a pacientes com elevado risco para doença cardiovascular, como: ácido acetil salicílico, betabloqueador, bloqueador dos canais de cálcio, nitrato, estatina, tienopiridínico, inibidor da enzima conversora da angiotensina, digitálicos e diurético, uma vez que a casuística do grupo não comportava pacientes infartados. 4.4.. AVALIAÇÃO. BIOQUÍMICA. E. DETERMINAÇÃO. DOS. PARÂMETROS. LABORATORIAIS Foram coletadas 16 mL de amostras de sangue periférico de todos os pacientes do estudo, após jejum de 12 à 14 horas, utilizando sistema de coleta a vácuo. Para realização das dosagens bioquímicas de glicose, colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDL), triacilglicerois, ácido úrico e uréia foram utilizados conjuntos de regentes da empresa Labtest (Lagoa Santa, MG, BR) por meio do método de ponto final(BASQUES FWA, 2011). AST, ALT e creatinina foram quantificados por meio de conjuntos de reagentes também da empresa Labtest (Lagoa Santa, MG, BR) pelo método cinético(SCHUMANN G ET AL. 2002). Todas as. dosagens. foram. realizadas. por. espectrometria. em. analisadores. bioquímicos. semiautomáticos (BIO-200) (Bioplus, Lagoa Santa, MG, BR) e (BIO-100) (Bioclin, Quibasa. 26.

(27) Química Básica Ltda, MG, BR) e automáticos Labmax Plenno (Labtest, Minas Gerais, Brazil).. O. LDL. foi. calculado. segundo. a. fórmula. de. Friedewald. e. colaboradores(FRIEDEWALD WT ET AL., 1972). Todas as análises foram realizadas no Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular (LBBM) da Faculdade de Farmácia da UFRN. Como controle interno dos ensaios bioquímicos foi utilizado duas preparações liofilizadas, em matriz humana proteica, contendo vários analitos, Qualitrol H1 (Bioplus, Lagoa Santa, MG, BR) e Controle Interno – Control Lab (Control Lab, Rio de Janeiro, RJ, BR). 4.5. EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL O RNA intracelular dos leucócitos presentes em 4 ml sangue periférico foi mantido estável através da utilização da solução RNAlater (Life TechnologiesTM, CA, EUA), a sua obtenção foi realizada utilizando o conjunto de reagente comerciais denominada RiboPureTM – Blood kit (Life TechnologiesTM, CA, EUA). As colheitas foram realizadas de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O RNA extraído foi quantificado através do fluorímetro Qubit® 2.0 Fluorometer (InvitrogenTM,CA, EUA), a fim de avaliar a concentração de ácidos nucléicos não degradados. Avaliou-se a integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose a 1,0% contendo formaldeído a 2,2M e tampão MOPS [MOPS a 20mM (pH 7,0), acetato de sódio a 8mM e EDTA a 1mM (pH 8,0)] preparado com água esterilizada tratada com DEPEC (SAMBROOK J, RUSSEL DW, 2001). As amostras de RNA total obtidas formam armazenadas a -80°C até o seu processamento. As extrações de RNA e quantificações foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular do programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN (LABIOMOL). 4.6. SÍNTESE DO cDNA E EXPRESSÃO GÊNICA A quantificação da expressão do gene TREML4 foi realizada pela transcrição reversa do RNAm seguida pela PCR em tempo real. A partir 4ml de sangue total, 1µg de RNA foi obtido o cDNA através do conjunto de reagentes utilizando High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Life TechnologiesTM, CA, EUA) constituído de iniciadores aleatórios (random primers), dNTPs, a enzima transcriptase reversa e tampão. A reação de transcriptase reversa foi executada com o termociclador MyCiclerThermalCycler (Bio-Rad, CA, EUA) de acordo com as seguintes etapas: 25° por 5. 27.

(28) minutos, 42° por 30 minutos e 85° por 5 minutos. O cDNA obtido foi armazenado a -20°C até a etapa de amplificação. O sistema TaqManTM(Life TechnologiesTM, CA, EUA) foi utlizado para realização da amplificação do cDNA realizada por PCR em tempo real. A análise da expressão gênica foi realizada pelo método de quantificação relativa, utilizando o gene ACTB (β- actina) como referência endógena após análise em relação aos outros dois genes controle (GAPDH e 18S) através do programa Genorm Software e NormFinder. Os iniciadores e as sondas marcadas com fluoróforo foram fornecidos pelo serviço “Assay by design” através do código HS01080584_G1(TREML4)), (Life TechnologiesTM, CA, EUA) (TOTH PP, 2007) As reações de PCR em tempo real foram realizadas no termociclador 7500 Fast RealTime PCR System (Life TechnologiesTM, Foster City, EUA). As reações de amplificação continham. iniciadores. a. 90nM. e. sonda. marcada. com. FAMTM (fluoróforo. 6-. carboxifluoresceína) a 250nM. Os demais reagentes foram fornecidos pela Life TechnologiesTM em solução 2 vezes concentrada, denominada TaqMan® Universal Master Mix, contendo dNTPs, com dUTP, AmpErase® UNG (Uracil N- glicosilase), enzima AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, e tampão de reação Gold PCR Buffer. O volume final por reaçã por reação foi 20 µL e os ensaios foram realizados em duplicata. A programação de PCR em tempo real escolhida é constituída de: (1) um ciclo de 2 minutos a 50°C; (2) um ciclo de 10 minutos a 95°C; 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C, onde os sinais de fluorescência emitidos pelos fluoróforos das sondas TaqMan® foram detectados pelo equipamento nesta etapa. Os dados são analisados utilizando o programa 7500 Software v2 0.5 (Life TechnologiesTM, CA, EUA) que gera curvas semilogarítmicas dos sinais de amplificação. A quantificação relativa da expressão gênica é realizada utilizado o método comparativo com o ciclo threshold (CT), sendo a fórmula utilizada de 2-∆CT, onde ∆CTé igual à diferença entre o CT do gene alvo e o CT do gene controle(RIDKER, P. M., ET AL.,2000). 4.7. GENOTIPAGEM Os polimorfismos foram determinados por discriminação alélica pelo sistema TaqMan® utilizando a reação em cadeia da polimerase em tempo real no equipamento ABI 7500. Fast real time PCR System (AppliedBiosystems). As condições de amplificações. adotadas para todos os 2 SNPs (rs2803495 e rs2803496) tiveram início uma fase de 10 minutos a 95o C, seguida por 40 ciclos de desnaturação por 15 segundos a 92o C e extensão de 90 segundos a 60o C. A discriminação alélica foi realizada pelo software 7500 SDS. 28.

(29) (AppliedBiosystems). Os iniciadores e sondas marcadas com fluorófuros FAM e VIC foram fornecidos pelo serviço “Assay by design” através dos códigos C_27302616_10e C_27302614_10 (Life TechnologiesTM, CA, EUA).. 4.8. ANÁLISES ESTATÍSTICAS A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS® 22.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). A distribuição normal foi avaliada utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov. As variáveis contínuas com distribuição normal foram apresentadas com média e desvio padrão e foram comparadas utilizando teste t ou ANOVA seguido de teste de Tukey. As variáveis com distribuições não normais foram apresentadas como mediana, utilizando o teste de KruskalWallis seguido do teste de Mann-Whitney. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste do qui-quadrado. A análise de genotipagem foi realizada utilizando o pacote R package v.3.3.1 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2015). Utilizou-se a análise Qui-quadrado para testar o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e para comparar as freqüências dos alelos e as distribuições de genótipos. A regressão logística foi realizada usando o pacote SNPassoc package v.1.9-2.O valor de p considerado significativo foi <0,05. O desequilíbrio de ligação foi realizado utilizando o software HAPLOVIEW® 4.2 (MIT, MA, EUA) (BARRETT JC ET AL. 2005). 5. RESULTADOS 5.1. DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS Os dados clínicos e laboratoriais dos pacientes com CAD estão apresentados na Tabela 1. A avaliação da extensão da lesão das artérias coronárias demonstrou que 42 pacientes apresentaravam pequenas lesões, 46 lesões intermediárias e 26 graves lesões. Trinta e sete pacientes não apresentaram lesão aterosclerótica. Os pacientes com lesões intermediárias e graves apresentaram idade aumentada quando comparados aos indivíduossem lesão (p = 0,002 e p = 0,001, respectivamente). Os indivíduos com lesões intermediárias apresentaram pressão sistólica maior do que aqueles sem lesão (p = 0,01).Pacientes com lesão baixa apresentaram maior IMC do que aqueles sem lesão (p = 0,02). Outras variáveis clínicas e parâmetros bioquímicos não diferiram entre os grupos (p> 0,05)(Tabela 1).. 29.

(30) Table 1.Dados clínicos e laboratoriais dos pacientes com DAC. Variáveis. Extensão da lesão coronariana Sem lesões (37) Lesões baixas (42) Lesões intermediárias (46) Lesões graves(26). p-valor. Idade. 54 ± 10a, b. 59 ± 11. 61 ± 9a. 63 ± 7b. < 0.010. Sexo, masculino %. 48.6 (18). 64.3 (27). 56.5 (26). 50.0 (13). 0.502. IMC, kg/m2. 29.2 ± 4.9c. 25.8 ± 5.7c. 27.1 ± 4.7. 27.7 ± 4.3. 0.034. Obesidade, %. 35.1 (13). 9.8 (4). 19.6 (9). 12.5 (3). 0.083. Dislipidemia, %. 77.8 (28). 81.0 (34). 70.5 (31). 76.9 (20). 0.709. Diabetes, %. 30.6 (11). 23.8 (10). 37.8 (17). 46.2 (12). 0.246. Hipertensão, %. 75.7 (28). 83.3 (35). 87.0 (40). 88.5 (23). 0.475. Pressão Diastólica, mmHg. 80 ±10. 84 ± 17. 89 ±17. 83± 20. 0.126. Pressão Sistólica, mmHg. 135 ±23d. 140± 21. 153± 36d. 141± 21. 0.022. Atividade física, %. 67.6 (25). 54.8 (23). 65.2(30). 72.0 (18). 0.478. Alcoolismo, %. 66.7 (24). 64.3 (27). 78.3 (36). 69.2 (18). 0.504. Tabagismo, %. 13.5 (5). 28.6 (12). 28.3 (13). 26.9 (7). 0.358. Histórico familiar de DAC % 45.9 (17). 42.9 (18). 47.8 (22). 42.3 (11). 0.957. Glicose, mg/dl. 107.2 ± 41.9. 106.7± 42.3. 133.7± 76.5. 119.6± 45.1. 0.082. Colesterol total, mg/dl. 173.3 ± 36.3. 179.7± 53.0. 187.4± 55.5. 180.7± 52.0. 0.654. Colesterol HDL, mg/dl. 37.5 ± 12.6. 36.7 ± 11.7. 34.0 ± 10.5. 39.5 ± 11.6. 0.244. Colesterol LDL, mg/dl. 101.4± 33.2. 106.3± 45.3. 118.0± 49.9. 112.5± 42.9. 0.358. Triglicerideos, mg/dl. 171.6± 98.6. 187.86 ± 119.1. 181.4± 125.3. 143.5± 72.6. 0.470. AST, U/L. 36.0± 19.7. 31.5 ± 13.7. 30.8 ± 15.3. 32.3 ± 17.5. 0.518. ALT, U/L. 31.5 ± 19.8. 33.4 ± 15.0. 27.7 ± 19.3. 27.8 ± 16.6. 0.419. Uréia, mg/dl. 36.7 ± 10.8. 37.0 ± 9.6. 37.8 ± 10.6. 41.5 ± 16.6. 0.362. Creatinina, mg/dl. 0.88 ± 0.25. 0.94 ± 0.25. 0.89 ± 0.21. 0.87 ± 0.31. 0.590. Ácido úrico, mg/dl. 5.0± 1.7. 4.9± 1.6. 4.5± 1.7. 4.6± 1.4. 0.465. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão ou a percentagem para as variáveis categóricas (número de pacientes). A amostras com perfil paramétricio foi realize o teste ANOVA. As amostras não-paramétricas foram realizadas pelo teste de Kruskal-Wallis.As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste Qui-quadrado. P-. 30.

(31) valores iguais ou inferiors a <0,05 foram considerados estatisticamente significativos em todos os testes estatísticos. Índice de massa corporal (IMC), lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL), aspartato aminotransferase (AST), alanina transaminase (ALT). a. , p=0.002, Sem leões vs Lesões intermediárias - Pós-teste de Tukey.. b. , p=0.001,Sem lesões vs Lesões graves - Pós-teste de Tukey.. c. , p= 0.02, Sem lesões vs Lesões baixas - Pós-teste de Tukey.. d. , p= 0.01, Sem lesões vs Lesões intermediárias- Pós-teste de Tukey.. 5.2. EXPRESSÃO DO RNAmE POLIMORFISMOS DO TREML4 Os pacientes com lesões graves apresentaram maiores níveis de RNAm de TREML4 nos leucócitos do que aqueles com lesões intermediárias (1.4 vezes) ou baixas (1.2 vezes) (p <0,05) (Fig. 2). Os indivíduos com lesãoes graves também uma expressão 1,4 vezes maior de TREML4 do que aqueles sem lesões (p <0,01). Não foram encontradas diferenças significativas nos níveis de mRNA entre pacientes com lesões intermediárias e baixas, quando comparados os com pacientes sem lesões (p> 0,05). p < 0.01 p < 0.05. Expressão de RNAm do TREML4. 5.0 ×10 -3. p = 0.01. 4.0 ×10 -3. 3.0 ×10 -3. 2.0 ×10 -3. 1.0 ×10 -3. 0 Sem lesões. Lesões baixas. Lesões intermediárias. Lesões graves. Extensão da Lesão Coronariana. Figure 2.A influência da extensão das lesões das artérias coronárias sobre a expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes com DAC. Os dados estão apresentados em. 31.

(32) mediana e intervalo interquartil, comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e Mann Whitney. A expressão relativa foi calculada utilizando o método 2-deltaCT, utilizando o ACTB como gene de referência. Os grupos foram compostos por: sem lesões (13), lesões baixas (15), lesões intermediárias (20) e lesões graves (9) lesões da artéria. Foram excluídos os Outliers.. As freqüências de genótipos dos polimorfismos do TREML4 (rs2803495 e rs2803496) apresentam-se no Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), indicando que o método de amostragem foi adequado eo número de casos é representativo. As freqüências de polimorfismos de acordo com a extensão da lesão da artéria coronária estão apresentadas na Tabela 2. As freqüências alélicas e genótipos foram semelhantes entre os grupos estudados e não houve desequilíbrio de ligação entre rs2803495 e rs2803496 (D '= 0,59). Table 2. Relação dos polimorfismos do TREML4 com a extensão da lesão coronária em pacientes com DAC. Polimorfismos. Extensão da lesão coronária. Total rs2803495 A/G. Sem lesões. Lesões. Lesões. Intermediáriass. graves. Lesões baixas. p-valor. N = 136. N = 33. N = 39. N = 40. N = 22. 77.9 (106). 78.8 (26). 82.1 (32). 75.6 (31). 73.9 (17). Genótipos, % AA (Codominante). 0.813 AG. 20.6 (28). 21.2 (7). 17.9 (7). 22.0 (9). 21.7 (5). GG. 1.5 (2). 0. 0. 2.4 (1). 4.3 (1). AA. 77.9 (106). 78.8 (26). 82.1 (32). 75.6 (31). 73.9 (17). AG+GG. 22.1 (30). 21.2 (7). 17.9 (7). 24.4 (10). 26.1 (6). A. 88.2 (134). 89.4. 91.0. 86.6. 84.8. G. 11.8 (2). 10.6. 9.0. 13.4. 15.2. N = 134. N = 31. N = 39. N = 40. N = 23. 76.9 (103). 83.9 (26). 71.8 (28). 80.5 (33). 69.6 (16). (Dominante) Alelos, %. 0.863. 0.702. rs2803496 C/T Genótipos, % TT. 0.526. (Codominante). 32.

(33) (Dominante). CT. 22.4 (30). 16.1 (5). 28.2 (11). 17.1 (7). 30.4 (7). CC. 0.7 (1). 0. 0. 2.4 (1). 0. TT. 76.9 (103). 83.9 (26). 71.8 (28). 80.5 (33). 69.6 (16). CT+CC. 23.1 (31). 16.1 (5). 28.2 (11). 19.5 (8). 30.4 (7). T. 88.1 (133). 91.9. 85.9. 89.0. 84.8. C. 11.9 (1). 8.1. 14.1. 11.0. 15.2. 0.492. Alelos, %. 0.620. Número de indivíduos em parênteses. As frequências foram comparadas através do teste de Qui-quadrado. Menos de 10% de todos não foram genotipados.. A análise de regressão logística foi utilizada para investigar a relação entre os polimorfismos de TREML4 e sua expressão de RNAm em leucócitos do sangue periférico, como mostrado na Tabela 3. Os indivíduos portadores do alelo rs2803495 G (genótipos AG + GG) têm maior probabilidade de ser classificado no grupo expressor do que os portadores de genótipo AA (OR = 2,4, IC 95% = 1,0-5,7, p = 0,05). Contudo, a polimorfismo rs2803495 não foi associada ao padrão de expressão (baixa expressão e alta expressão) de RNAm de TREML4 em leucócitos (p> 0,05) (Tabela 3). Tabela 3.Relação dos polimorfismos do TREML4 com a expressão de RNAm de leucócitos em pacientes com CAD. Baixa Não expresso Polimorfismos. rs2803496 C/T. OR p-valor expressão. (N= 67). Alta. OR. Genótipos (N= 84). rs2803495 A/G. Expresso. expressão. (95%CI). AA. 85.1 (63). 69.8 (44). 1 ( ref.). AG+GG. 14.9 (11). 30.2 (19). 2.4 (1.0-5.7). TT. 91.9 (68). 59.0 (36). 1 ( ref.). CT+CC. 8.1 (6). 41.0 (25). 7.8 (2.9-20.9). p-valor (95%CI). (N= 34). (N= 33). <0.05 71.9 (23). 67.7 (21). 1 ( ref.). 32.3 (10). 1.2 (0.4-3.5). 40.0 (12). 1 ( ref.). 60.0 (18). 5.1 (1.5-15.6). - 28.1 (9) <0.01 77.4 (24) - 22.6 (7). 0.72. -. <0.01. Análise de regressão logística univariada.OR, Odds ratio; IC, intervalo de confiança.. A análise do rs2803496 mostrou que os portadores de alelo C (genótipos CT + CC) têm alta probabilidade de estarem no grupo expressor quanto comparados com indivíduos portadores de genótipo TT (OR = 7,8, IC95% = 2,9-20,9, p <0,01). Além disso, o alelo C foi. 33. -.

(34) associado com elevados níveis de expressão do RNAm(OR=5.1, 95%CI= 1.5-15.6, p<0.01) (tabela3).. 6. DISCUSSÃO Neste estudo 151 pacientes com DAC foram classificados de acordo com a presença e a extensão da lesão coronariana. 75,5% dos pacientes foram detectados com lesões ateroscleróticas (n = 114), destes 27,8% (n = 42) apresentaram baixas lesões ateroscleróticas, 30,5% (n = 46) lesões intermediárias e 17,2% (n = 26) lesões graves. Entre os dados clínicos e laboratoriais, apenas a idade, o IMC e a pressão sistólica foram signicantemente diferentes entre os pacientes com lesão aterosclérósticas quando camparados com aqueles sem lesão. Chagas e colaboradores em 2011 estudaram 337 pacientes submentidos à angiografia coronariana por suspeita de DAC e observaram que medidas antropométricas não estavam relacionadas com a extensão das lesões coronarianas (CHAGAS ET AL., 2011). Além disso, outros autores também observaram que entre os fatores de risco clássicos, apenas o sexo, idade, pressão sistólica e tabagismo, estavam associados à extensão aterosclerótca mensurada pelo índice de Friesinger. Desta forma, esses resultados corroboram com nossos achados e reforçam a hipótese de que os fatores de risco clássicos para as DCV não são suficientemente sensíveis para avaliar a extensão da lesão coronariana em pacientes com DAC, ressaltando aimportância de estudos para elucidar novos biomarcadores não invasivos para avaliação de lesões ateroscleróticas. O TREM e TREML são receptores de um único domínio que são semelhates imunoglobulinas e que apresentam uma região variável semelhante, um domíneo transmembranar e uma cauda citoplasmática curta, sem papel de sinalização conhecidos. Estes receptores são expressos predominantemente em células mielóides. Estudos têm demonstrado que o cluster dos genes TREM estão envolvidos no desenvolvimento da aterosclerose, em especial, dois membros o TREM-1 e TREM-2. Ambas essas isoformas, estão envolvidas no processo inflamatório da imunidade inata induzido po receptores tipo Toll (TLR).Considerando então, que a inflamação é um componente importante no processo da aterosclerose, a relação entre o TREM-1 e TREM-2 com a formação da placa aterosclerótica(ALLCOCK RJN ET AL., 2003;GOLOVKIN AS ET AL., 2014) e polimorfismos do TREM-1 também tem sido descrito como associados com o desevolvimento de DAC (GAETANO M ET AT., 2016).. 34.

(35) Em um estudo anterior, demonstramos um aumento significativo na expressão do RNAm do TREML4 em leucócitos de pacientes com SCA em relação ao grupo controle (SILBIGER ET AL., 2013). Assim, o papel deste gene na presença e na progressão das DCV ainda não está completamente elucidado, visto que apenas dois estudos avaliaram o papel do TREML4 nas DCV. Desta forma, estudos de expressão de RNAm em sangue perférico têm sido bastante eficazes para detectar marcadores de processo inflamatório vascular e outros indicadores de lesão tecidual que refletem dados celulares em qualquer parte do corpo (TANG Y ET AL., 2003). Neste estudo, a expressão do RNAm de TREML4 foi correlacionada com a extensão da lesão coronariana. Pacientes com lesões graves apresentaram maior expressão de TREML4 do que os demais grupos (Fig. 2).Sen K et al (2014) avaliaram subpopulações de leucócitos em pacientes com CAC e também apresentaram maiores níveis de expressão de TREML4 pela qRT-PCR em leucócitos humanos (SEN, SHURJO K. ET AL., 2014). A CAC é um processo intimamente e conhecido, relacionado com a aterosclerose (BUDOFF MJ ET AL., 2009). Estes resultados sugerem que a expressão de TREML4 pode estar envolvida na progressão e extensão das lesões coronarianas, assim como suas consequências, como o desvolvimento de CAC. Portanto, a expressão do TREML4 pode ser um potencial marcador de severidade da aterosclerose e ainda ser útil para monitorar pacientes com DAC. Os polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) do TREML4, também já foram descritos como assocaidos com o aumento de risco à desenvolver CAC (SEN, SHURJO K. ET AL., 2014). Em nossa população estudada 22,1% dos pacientes com DAC são portadores dos genótipos rs2803495 AG + GG e a freqüência de alelos menores (MAF) do alelo G é de 11,8% (Tabela 2).Estes resultados são semelhantes aos encontrados numa população europeia na fase 3 do projeto 1000 Genomas (http://www.internationalgenome.org/), em que 21,2% dos indivíduos eram portadores de genótipos AG + GG ea frequência do alelo G Foi de 13,0%. O SNP rs2803496 também apresentou freqüências semelhantes para o genótipo CT + CC (23,1%) eo alelo C (11,9%), comparáveis aos encontrados na população européia (16,2% e 11,0%, respectivamente). Contudo, os polimorfismos TREML4 rs2803495 e rs2803496 mostraram similar freqüência de genótipos entre os grupos de pacientes com diferentes extensões de lesões coronarianas. Este resultado sugere que não existe relação entre estas variantes eo grau de lesão aterosclerótica nas artérias coronárias. Sen e colaboradores (2014) observaram que o alelo o alelo G rs2803495, não estava associado a um risco aumentado de CAC (SEN, SHURJO K. ET AL., 2014).. 35.