Universidade Federal Fluminense

DALA KEZEN VIEIRA HARDMAN LEITE

AVALIAÇÕES DAS CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS,

CITOLÓGICAS, CLÍNICAS E SEMINAIS DE FELINOS

DOMÉSTICOS (Felis catus, LINNAEUS, 1758) E

SELVAGENS (Leopardus tigrinus, SCHREBER, 1775),

Leopardus geoffroyi, d’ORBIGN & GERVAIS, 1843 e Puma

yagouaroundi, E. GEOFFROYI, 1803). FELIDAE

CARNIVORA

Niterói

2009

AVALIAÇÕES DAS CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS,

CITOLÓGICAS, CLÍNICAS E SEMINAIS DE FELINOS

DOMÉSTICOS (Felis catus, LINNAEUS, 1758) E

SELVAGENS (Leopardus tigrinus, SCHREBER, 1775),

Leopardus geoffroyi, d’ORBIGN & GERVAIS, 1843 e Puma

yagouaroundi, E. GEOFFROYI, 1803). FELIDAE

CARNIVORA

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Anatomia Patológica Veterinária

Orientadora: Profª. Drª.

Ana Maria Reis Ferreira

Niterói

2009

Avaliações das características histológicas, citológicas, clínicas e seminais de felinos domésticos (Felis catus, Linnaeus, 1758) e selvagens (Leopardus

tigrinus, Schreber, 1775), Leopardus geoffroyi, D’Orbign & Gervais, 1843 e Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803). Felidae Carnívora

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Anatomia Patológica Veterinária

Aprovado em: 30 de julho de 2009.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Alcides Pissinatti

Centro de Primatologia do Rio de Janeiro

Prof. Doutor Felipe Zandonadi Brandão

Universidade Federal Fluminense

Profª. Doutora Vera Lúcia Teixeira de Jesus

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Profª. Doutora Marcela Freire Vallim de Mello

Universidade Federal Fluminense

Profª. Doutora Daniela de Carvalho Martins

Universidade do Grande Rio - UNIGRANRIO

Prof. Doutor João Batista da Cruz (examinador prévio)

In memorium

Professora Ana Maria Reis Ferreira, amiga, que, com sua orientação precisa, viabilizou esta tese, através de seu incentivo, exigência e crença em minha capacidade, e por ter aberto meus olhos quando necessário.

Professores João Batista da Cruz, Felipe Zandonadi Brandão, Vera Lúcia Teixeira de Jesus, Marcela Freire Vallim de Mello e Daniela de Carvalho Martins, por me darem à honra de participarem de minha banca.

À Universidade Castelo Branco, principalmente ao meu amigo e coordenador Dr. Jonimar Paiva. Ao Joni que me incentivou, apoiou e acreditou em mim.

Diretoria do Zoológico do Rio de Janeiro, pela colaboração e confiança depositada em nosso trabalho, com especial referência ao diretor Vitor Hugo. Agradeço aos médicos-veterinários, Luis Fedulo e Daniela, e ao biólogo Anderson, pelas valiosas colaborações. Em especial, ao colega e amigo Daniel, que me mostrou o caminho do Zoo e por ter aguçado minha vontade de trabalhar com os felinos selvagens. Meu marido, que me acompanhou, participou e incentivou esse trabalho e a minha vida. Não tenho palavras para dizer o quanto meu agradecimento é especial, marido, pai e amigo. Foram dias e noites ao meu lado, meu ponto de equilíbrio nos mais diversos momentos. Esse projeto é nosso. Agradeço do fundo do meu coração. Eterno amor...

Minha filha Amandinha e ao bebezão Henriquinho. Filhinha, eu dedico essa tese a você, por estar sempre presente, com palavras meigas, sorrisos e perguntando se está tudo certo. Ao bebezão que chegou para ficar no meio dessa trajetória, com aquele super sorriso. Filhinhos, eu peço desculpas pela ausência em alguns momentos.

Meu pai, que sempre me amou demais, que acreditou em mim, me deu força, me incentivou a ser médica-veterinária. Sei que, de onde estiver, estará sorrindo e dizendo: “Dala, essa é mais uma etapa que você venceu”. Adoro-te.

Minha mãe, que me ensinou a trilhar o caminho dos estudos, alguém que admiro por sua força, amor e alegria. Aos meus irmãos, Marinho, Raulzinho e Biba, por sempre me darem força e amor. Cada um com suas palavras meigas. A minha “irmã” Rita, por estar sempre ao meu lado.

Meus sogros, por me apoiarem com todo carinho, além de cuidarem dos meus filhos.

Marcos Pires (Marcão), melhor anestesista, amigo, presença imprescindível e indispensável na sedação dos animais. Seu profissionalismo, carinho e alto astral foram fundamentais para o sucesso do experimento e bem estar dos animais.

não é possível expressar por palavras.

Rosaura, amiga de graduação, mestrado e trabalho, amiga de sempre. Obrigada pela contribuição, pelo profissionalismo e carinho.

Fabi, pelo profissionalismo, ensinamento e paciência nas estatísticas e, atualmente, pelo carinho e amizade.

A equipe da UCB, Anna Paula, Cláudia Emília, Jorge, Kiki, Liliane e Rodrigo pelo profissionalismo, cooperação e o carinho. Obrigado pela força.

Professora Ana Beatriz (UFF), pela cooperação, atenção e sabedoria dos cálculos estatísticos.

Meus professores, pelos ensinamentos. Neuci e Tânia, por abrirem o caminho apaixonante da andrologia. Joãozinho, por acreditar em mim, auxiliar e pela força.

Nenzinha, que me viu crescer, ir ao colégio, universidade, sempre carinhosa comigo e com minhas “roupas” de veterinária. Anja e Ceiça, por me ajudarem com o bebezão.

Monitora Flávia e principalmente as alunas Aline, Ana Maria e Bianca que participaram desde o início do projeto. No início aprendendo, durante trabalhando e no final tornando-se pessoas indispensáveis. Não esquecendo, claro do “pão com mortadela” no final. Sucesso como médicas-veterinárias.

Mônica, pelo seu carinho e força no projeto.

Soraya, por, nos momentos difíceis, ter cooperado com seu profissionalismo, carinho e amizade.

Minhas colegas do doutorado, Carol, Dani e Alline, por me acolherem com todo carinho.

Secretária Thereza, pela dedicação, carinho e eficiência, e com seus e-mails enviados ao decorrer do curso.

A todos os felinos domésticos e selvagens que participaram do experimento, agradeço a eles, que apesar de inconscientes e involuntários foram fundamentais para realizar essa pesquisa.

sete pequenos felinos selvagens, adultos: cinco gatos-do-mato pequenos (Leopardus tigrinus, Schreber, 1775), um gato-do-mato grande (Leopardus geoffroyi, d’Orbign & Gervais, 1843) e um gato jaguarondi (Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803), da Fundação RIOZOO (RJ). O objetivo geral do trabalho foi avaliar a fertilidade (capacidade reprodutiva) de felinos domésticos e selvagens, através de exames andrológicos e citologia testicular, com punção por agulha fina sem aspiração. Foram realizados exame andrológico completo e citologia testicular. Durante os exames, estes foram anestesiados com ketamina (5 mg/kg), xilazina (0,5 mg/kg) e atropina (0,04 mg/kg), associada com lidocaína 2% sem vasoconstritor peridural (6 mg/kg). As amostras de sêmen foram coletadas por eletroejaculação e examinadas quanto às características macroscópicas (volume, coloração e odor) e microscópicas (motilidade, vigor e morfologia). Após os exames foi realizada a punção sem aspiração dos testículos. A maioria dos animais apresentou normalidade no exame clínico e na biometria testicular. Na citologia testicular foram encontradas células da linhagem espermática e Sertoli. A coloração dos ejaculados variou de transparente a branco leitoso, o odor não apresentou alterações e o pH do sêmen variou de 6,0 a 7,0. A média da motilidade observada nos felinos domésticos foi de 60,0 ± 29,91% e dos selvagens de 80,0 ± 12,65%. O vigor variou de 0 a 5. A média e o respectivo desvio padrão dos defeitos maiores observados nos felinos domésticos foram de 22,57 ± 13,44% e os dos selvagens de 14,75 ± 4,13%. Nos felinos domésticos os defeitos menores foram de 16,20 ± 6,82% e dos selvagens de 17,00 ± 6,27%. A média do total de defeitos nos felinos domésticos foi 38,78 ± 17,11% e nos selvagens foi 31,75 ± 8,50%. Na macroscopia dos felinos domésticos, os testículos apresentaram o formato ovalado em 70% e na microscopia 88% tinham hemorragias focais e 10% dos túbulos seminíferos apresentavam-se pouco desenvolvidos. No teste de Mann-Whitney não foi verificada diferença estatisticamente significativa (p>0,05) nas características avaliadas, não havendo diferenças significativas entre os felinos domésticos e selvagens. Conclui-se que, 60% dos felinos domésticos são férteis; nos selvagens somente o gato jaguarondi, teve sua capacidade reprodutiva comprometida; o protocolo anestésico utilizado foi bastante eficaz em todos os procedimentos. Não houve correlação entre o perímetro escrotal medido e as características seminais; a técnica de eletroejaculação nos felinos permitiu obter ejaculado de boa qualidade; o exame clínico e a análise seminal foram essenciais para avaliação da fertilidade do macho. A punção sem aspiração mostrou-se ser uma técnica simples, rápida e eficiente; a citologia testicular é um importante método auxiliar no diagnóstico de casos de subfertilidade e infertilidade.

Palavra chaves: felino doméstico e selvagem; sêmen; eletroejaculação; histopatologia; citologia, testículo.

nonaspiration fine needle cytology. Twenty-five domestic cats (Felis catus, Linnaeus,1758), of various ages, presented for clinical evaluation at the University Veterinary Clinic were examined. Seven adult small wild felids were also examined: five oncillas (Leopardus tigrinus, Schreber, 1775), one Geoffroy’s cat (Leopardus geoffroyi, d’Orbign & Gervais, 1843), and one jaguarundi (Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803), all belonging to the “Fundação RIOZOO” (RJ). All animals were submitted to a complete andrological examination and testicular cytology. The animals were kept under anesthesia throughout the whole procedure with the use of ketamine (5 mg/kg), xylazine (0.5 mg/kg) and atropine (0.04 mg/kg) as well as epidural anesthesia with 2% lidocaine without vasoconstrictor (6 mg/kg). Semen samples were collected using the electroejaculation method and examined regarding its macroscopic characteristics (volume, color and odor) as well as microscopic characteristics (motility, vigor and morphology). Following the examination, a testicular cytology using nonaspiration fine needle cytology was performed on both testicles. Testicular cytology revealed cells from the spermatic lineage as well as Sertoli cells. The color of the ejaculate varied from transparent to milky white, while odor showed no alterations and seminal pH varied between 6.0 and 7.0. Mean sperm motility was 60% in domestic cats and 80% in wild felids. Vigor varied between 0 and 5. The average and standard deviation primary defects observed were 22,57 ± 13,44% for domestic cats and 14,75 ± 4,13% for wild felids. The domestic cats secondary defects were 16,20 ± 6,82% and the wild 17,00 ± 6,27%.Mean total sperm defects observed were 38.78 ± 17,11% for domestic cats and 31.75 ± 8,50% for wild felids. Regarding the macroscopic evaluation of the testicles of domestic cats, 70% of the animals had oval-shaped testicles and in the microscopic evaluation, focal hemorrhaging was observed in 88% of cats and 10% of the seminiferous tubules were found to be underdeveloped. The Mann-Whitney test demonstrated that there was no significant difference (p>0.05) between the studied groups. It was concluded that 60% of domestic cats were fertile; within the wild felids, the jaguarondi was the only cat to present compromised reproductive capability; the anesthetic protocol used in this study was found to be efficient for andrological evaluation; there is no correlation between mensurated scrotal perimeter and seminal characteristics; the electroejaculation technique in felids allows for the collection of a good quality semen sample for evaluation; the clinical examination and seminal analysis were essential for fertility evaluation of the male individuals. Testicular cytology using nonaspiration fine needle cytology proved to be a fast, simple and efficient technique; testicular cytology is an important complementary method for the diagnosis of subfertility and infertility.

Keywords: domestic feline and salvage; semen; electroejaculation; histopathology; cytology; testis.

LISTA DE FIGURAS, GRÁFICOS E TABELAS

MATERIAL E MÉTODOS

Figura 1 – Monitoramento do plano anestésico e das funções vitais no felino doméstico (Felis catus)...

Figura 2 – Avaliação de reflexo medular através do pinçamento interdigital dos membros posteriores, para verificar ausência de sinais sensitivos ou motores no felino doméstico (Felis catus)...

Figura 3 – Estágio inicial do protocolo anestésico do animal com centralização de globo ocular no felino doméstico (Felis catus)...

Figura 4 – Protusão de terceira pálpebra associada à miose, indicando plano anestésico ideal no felino doméstico (Felis catus)...

Figura 5 – Exame clínico da bolsa escrotal e testículos no felino doméstico (Felis catus)...

Figura 6 – Teste para avaliação da mobilidade dos testículos no felino doméstico (Felis catus)...

Figura 7 – Presença de espículas na glande peniana do gato doméstico (Felis catus)...

Figura 8 – Presença de espículas na glande peniana do gato-jaguarondi (Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803)...

Figura 9 – Medida da perímetro escrotal no felino doméstico (Felis catus)... 070 070 072 072 074 074 075 075 077

Figura 11 – Coleta de sêmen com eletroejaculador de um gato doméstico (Felis catus)...

Figura 12 – Coleta de sêmen com eletroejaculador de um gato-do-mato grande (Leopardus geoffroyi, d’Orbign & Gervais, 1843)...

Figura 13 – Avaliação da motilidade e do vigor (100x) no gato doméstico (Felis catus)...

Figura 14 – Coleta para citologia testicular sem aspiração por agulha fina no gato doméstico (Felis catus)...

079

079

082

082

RESULTADOS

Gráfico 1 – Porcentagem de felinos avaliados de acordo com a espécie...

Tabela 1 – Valores da média, desvio padrão, mínimo e máximo das características da biometria testicular de felinos domésticos e selvagens...

Gráfico 2 – Análise descritiva dos achados da circunferência escrotal dos felinos domésticos e selvagens...

Gráfico 3 – Análise descritiva dos achados da biometria testicular quanto à largura do testículo direito dos felinos domésticos e selvagens...

Gráfico 4 – Análise descritiva dos achados da biometria testicular quanto ao comprimento do testículo direitodos felinos domésticos e selvagens...

Gráfico 5 – Análise descritiva dos achados da biometria testicular quanto à largura do testículo esquerdo dos felinos domésticos e selvagens...

086 088 088 089 089 090

Gráfico 7 – Porcentagem dos felinos domésticos e selvagens com ejaculados e azoospérmicos...

Tabela 2 – Valores da média, desvio padrão, mínimo e máximo do espermiograma de felinos domésticos e selvagens...

Gráfico 8 – Porcentagem da patologia espermática dos defeitos maiores dos felinos domésticos...

Gráfico 9 – Porcentagem da patologia espermática dos defeitos menores dos felinos domésticos...

Gráfico 10 – Porcentagem da patologia espermática dos defeitos maiores dos felinos selvagens...

Gráfico 11 – Porcentagem da patologia espermática dos defeitos menores dos felinos selvagens...

Figura 15 – Sêmen de felino doméstico. Presença de espermatozóides normais. Giemsa, 1000x...

Figura 16 – Sêmen de felino doméstico. Contorno anormal, fortemente enrolado e cauda dobrada. Giemsa, 1000x…………...

Figura 17 – Sêmen de felino selvagem. Defeito de peça intermediária, gota protoplasmática distal e cabeça isolada normal. Giemsa, 1000x……..

Figura 18 – Sêmen de felino selvagem. Presença de espermatozóide normal e cauda fortemente enrolada. Giemsa, 1000x... Figura 19 – Sêmen de felino selvagem. Espermatozóide normal, cauda dobrada, defeito de peça intermediária e piriforme. Giemsa, 1000x...

091 093 094 094 096 096 097 097 097 097 097

Tabela 3 – Frequência da descrição macroscópica dos testículos direito e esquerdo dos felinos domésticos (n=25) avaliados...

Figura 21 – Testículo ovalado com superfície de corte de tonalidade pardacenta com áreas lineares enegrecidas. Gato doméstico (Felis catus).

Figura 22 – Testículo arredondado com superfície de corte de tonalidade pardacenta com focos enegrecidos. Gato doméstico (Felis catus)…...

Tabela 4 – Frequência da descrição histopatológica (microscópica) dos testículos direito e esquerdo dos felinos domésticos...

Tabela 5 – Frequência da descrição histopatológica (microscopia) dos epidídimos dos felinos domésticos...

Figura 23 – Testículo. Felino doméstico (adulto). Presença de túbulos seminíferos. HE, 100x...

Figura 24 – Testículo. Felino doméstico (adulto). Presença de hemorragia. HE, 400x...

Figura 25 – Luz dos túbulos epididimários sem espermatozóides. Epidídimo. Felino doméstico (idade inferior a 12 meses). HE, 400x……..…

Figura 26 – Testículo. Felino doméstico (adulto) Luz dos túbulos epididimários com espermatozóides. Epidídimo. Felino doméstico (adulto). HE, 400x………...………....

Tabela 6 – Valores da média, desvio padrão, mínimo e máximo da citologia testicular de felinos domésticos e selvagens...

099 100 100 101 102 103 103 103 103 107

Figura 28 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Presença de Células de Sertoli, espermatócito. Panótico, 1000x…………..

Figura 29 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Espermatócitos, espermátides iniciais. Panótico, 1000x………..

Figura 30 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Células multinucleadas, espermátides iniciais e finais. Panótico, 1000x...

Figura 31 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Células de Sertoli, espermatogônia, células multinucleadas. Panótico, 1000x...

Figura 32 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Espermátides iniciais e finais. Panótico, 1000x………...

Figura 33 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Presença de espermátides finais e espermatozóides. Panótico, 1000x…....

Figura 34 – Punção sem aspiração - Testículo de felino doméstico. Presença de Células de Sertoli. Panótico, 1000x………...

Tabela 7 – Correlação das variáveis, CE (cm), motilidade, vigor, defeitos maiores e menores, total de defeitos, espermatogônia, espermatócitos primários, espermátides iniciais e finais, células multinucleadas, espermatozóides e células de Sertoli de felinos domésticos e selvagens...

Gráfico 12 – Correlação entre o percentual da motilidade e vigor...

Gráfico 13 – Correlação entre o percentual da motilidade e o percentual de defeitos totais... 108 108 108 109 109 109 109 111 112 112

ACR - Acrossoma BI - Bilateral

CAAF - Citologia aspirativa por agulha fina CAU DOBRADA - Cauda dobrada

CBRA - Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CE - Circunferência escrotal

CITO - Espermatócito primário CONTAN - Contorno anormal CSA - Citologia sem aspiração DEF> - Defeitos maiores DEF< - Defeitos menores D - Direito

E - Esquerdo

ENRCAB - Cauda enrolada na cabeça FENR - Cauda fortemente enrolada GIG/CURTO - Gigante/curto/largo GÔNIA - Espermatogônia

GPD - Gota protoplasmática distal GPP - Gota protoplasmática proximal ISOL NORM - Cabeça Isolada normal ISOL PAT - Cabeça isolada patológica MULTI - Células multinucleadas MOT - Motilidade

PAAF - Punção aspirativa por agulha fina PCAB - Patologia de cabeça

PI - Patologia de peça intermediária PIR - Piriforme

SERTOLI - Células de Sertoli SPTZ - Espermatozóides SUB - Subdesenvolvido

TDC - Comprimento do testículo direito TDL - Largura do testículo direito

TIDE INIC - Espermátide inicial TIDE FINAL - Espermátide final TOTAL DEF - Total de defeitos

UCB - UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO UNI - Unilateral

1 INTRODUÇÃO

2 OBJETIVOS

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1. DESCRIÇÃO E COMPORTAMENTO DAS ESPÉCIES DE FELINOS SELVAGENS... 3.1.1. Gato-do-mato pequeno (Leopardus tigrinus, Schreber, 1775)... 3.1.2. Gato-do-mato grande (Leopardus geoffroyi, d’Orbign & Gervais, 1843)... 3.1.3. Gato jaguarondi (Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803)... 3.2 PUBERDADE E CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DO

SISTEMA GENITAL MASCULINO (OU MORFOFISIOLOGIA DO SGM)... 3.3 ESPERMATOGÊNESE... 3.4 COLETA E AVALIAÇÃO DO SÊMEN... 3.4.1 Avaliação do sêmen... 3.4.1.1 Volume... 3.4.1.2 Coloração... 3.4.1.3 pH... 3.4.1.4 Motilidade... 3.4.1.5 Vigor... 3.4.1.6 Concentração... 3.4.1.7 Morfologia... 3.5 PUNÇÃO ASPIRATIVA POR AGULHA FINA (PAAF) E PELO

MÉTODO DE PUNÇÃO SEM ASPIRAÇÃO ...

3.6 HISTOPATOLOGIA... 018 025 025 025 027 027 027 028 029 029 032 037 048 048 048 049 049 050 051 051 054 064

4.2 METODOLOGIA... 4.2.1 Contenção medicamentosa... 4.2.2 Exame andrológico... 4.2.2.1 Exame clínico... 4.2.3 Coleta e avaliação do sêmen...

4.2.3.1 Motilidade……….…… 4.2.3.2 Vigor... 4.2.3.3 Morfologia espermática………. 4.2.3.4 Exame citológico – Método de punção sem aspiração... 4.2.3.5 Exame Anátomo-histopatológico………. 4.2.3.6 Análise estatística...

5 RESULTADOS

6 DISCUSSÃO

7 CONCLUSÕES

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

PRODUÇÃO CIENTÍFICA

ANEXO

1 INTRODUÇÃO

O conhecimento da fisiologia e de patologias reprodutivas dos machos felinos é importante ferramenta para a aplicação de técnicas de reprodução assistida. Gatos domésticos têm sido utilizados como modelo experimental para o estudo da reprodução em homens, em primatas e em felinos selvagens ameaçados de extinção. Os conhecimentos obtidos servem de suporte para o avanço de metodologias terapêuticas inovadoras, e até revolucionárias, com aplicação em enfermidades reprodutivas e no aperfeiçoamento de biotécnicas avançadas de reprodução assistida (FARSTAD, 2000; JORDAN, et al. 2001; RODRIGUES, 2001; TSUTSUI et al., 2002; FRANÇA & GODINHO, 2003; LUVONI et al., 2003; SILVA et al., 2003; SWANSON, 2006; TSUTSUI, 2006; FAYER-HOSKEN, 2007).

Hoje no mundo, existem 37 espécies de felídeos (mamíferos carnívoros da família Felidae), distribuídas por todos os continentes, exceto Austrália e Antártida. Quase todas estão ameaçadas de extinção em algum grau, com a exceção do gato doméstico (Felis catus), cujas diferentes raças se adaptaram à convivência com o ser humano e ao ambiente urbano. No caso dos felinos

selvagens, a situação atual das populações de algumas das espécies é tão grave que há mais indivíduos em cativeiro do que em vida livre (GENARO et al., 2001).

Quando se fala em felinos brasileiros, as pessoas pensam logo na onça-pintada, maior e mais conhecido representante da família no país. No entanto, a maioria delas não sabe que, além das grandes onças, vivem nas florestas e em campos nacionais outras espécies de gatos selvagens, todas em risco de extinção. Daí, a importância de estudos realizados em zoológicos e criadouros para aprofundar o conhecimento sobre esses belos animais e aumentar sua taxa de reprodução em cativeiro e em vida livre.

Geralmente ocupando o topo da pirâmide, os mamíferos da ordem carnívora são animais de suma importância para o equilíbrio dos ecossistemas em que vivem. No Brasil, existem 26 espécies de mamíferos carnívoros dentro das famílias Felidae (onças, gatos-do-mato grande e pequeno, jaguarondi, maracajá e jaguatirica, lince e outros), Canidae (lobo-guará, cachorro do mato e outros), Mustelidae (ariranha, lontra) e Procyonidae (quati, guaxinin). Em diferentes graus, todas elas estão ameaçadas de extinção, devido à fragmentação e à destruição do habitat natural, o que acarreta em diminuição da troca de informação genética e/ou na extinção da raça em determinado local mais afetado pelas agressões sofridas.

Em cativeiro, o reduzido número de animais e o alto grau de parentesco entre eles, somados às doenças, alterações comportamentais, deficiências nutricionais, além do tipo genético, do estresse e do baixo sucesso reprodutivo, têm sido uma barreira para a sobrevivência da espécie. É importante ressaltar que a

perda da diversidade genética, resultante do cruzamento dos poucos animais em cativeiros, também contribui para reduzir o sucesso na reprodução. Considerando a importância da propagação de animais em cativeiro para a preservação da espécie, a reprodução desses indivíduos torna-se um componente indispensável para sua conservação (MORATO et al., 1998; PAZ et al., 2003).

A família Felidae é dividida em duas subfamílias (Felinae e Pantherinae), 13 gêneros e 36 espécies, sendo que, dentre estas, dez são neotropicais e oito ocorrem naturalmente no território brasileiro. As espécies neotropicais são divididas em três linhagens: jaquatirica, puma e pantera. O novo arranjo taxonômico dos Felídeos neotropicais, nativos do Brasil, sugerida por Wozencraft, é: gênero Leopardus: Leopardus pardalis, Linnaeus (1758) – jaquatirica; Leopardus wiedii, Schinz (1821) – gato-maracajá; Leopardus tigrinus, Schreber (1775) – gato-do-mato pequeno; Leopardus geoffroyi, d’Orbign & Gervais (1843) – gato-do-mato grande; Leopardus colocolo, Molina (1810) – gato-palheiro. Gênero Puma: Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi (1803) – gato-mourisco ou jaguarondi; Puma concolor, Linnaeus (1771) – suçuarana. Gênero Panthera: Panthera onca, Linnaeus (1758) – onça pintada (CUBAS et al., 2007). Todos os felinos neotropicais e citados estão presentes no zoológico do município do Rio de Janeiro, com exceção do gato-maracajá e do palheiro.

Exceto por poucos trabalhos, o estudo científico sobre pequenos felinos tem sido negligenciado no país, quando comparado ao dos parentes de maior porte. Esse estado de quase total desconhecimento torna ainda mais crítica a situação dessas espécies, já bastante ameaçadas. Embora tais animais se adaptem com

relativa facilidade em cativeiro, mostram baixa taxa de natalidade, com a agravante de que a maior parte dos filhotes não sobrevive ao primeiro mês de vida, segundo estudos da Sociedade de Zoológicos Brasileiros e da Associação da Mata Ciliar. A necessidade de conhecerem-se melhor essas espécies de menor porte levou o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), em 1995, a criar – em colaboração com a Sociedade de Zoológicos Brasileiros (SZB), a Associação Mata Ciliar (AMC) e a Universidade de São Paulo (USP) – o grupo de trabalho especial para Pequenos Felinos Brasileiros. (MORATO et al., 2004)

O isolamento de populações e de material genético pode levar à diminuição da variabilidade genética, o que, segundo vários autores, além de afetar a espermatogênese – interesse direto desta pesquisa – e a ovulação, é passível de aumentar a susceptibilidade à doença, morbidade e mortalidade perinatal. Há um consenso de que a manutenção da diversidade genética na espécie é dependente da reprodução (MORATO et al., 1998; RODRIGUES, 2001; MORATO et al., 1998; SILVA et al., 2003;MORATO et al., 2004).

A contribuição de machos para a eficiência reprodutiva dos felinos é de grande importância, uma vez que o estudo do sêmen resguarda o potencial genético e auxilia nas biotécnicas da reprodução; daí, a ênfase dada a esse segmento no decorrer da realização deste estudo. A fertilização in vitro, técnica que tem ajudado humanos com dificuldade de reprodução há alguns anos, pode ser grande esperança de espécies de felinos selvagens ameaçados de extinção. A técnica tem

sido testada em jaquatiricas e gatos-do-mato pequenos, animais que habitam três grandes e sofridos ecossistemas brasileiros: Mata Atlântica, Cerrado e Amazônia.

Para se predizer a capacidade reprodutiva de um macho, caracterizando-o ccaracterizando-omcaracterizando-o aptcaracterizando-o a integrar um prcaracterizando-ograma reprcaracterizando-odutivcaracterizando-o, caracterizando-ou para que se ccaracterizando-onfirme a presença de enfermidades ligadas ao aparelho reprodutivo, a avaliação seminal é o procedimento de escolha. Existe a necessidade de maiores informações quanto à biometria testicular, características seminais, morfologia espermática e punção testicular em felinos. O conhecimento das características morfofisiológicas e patologias reprodutivas testiculares no gato (modelo experimental) irão contribuir nos casos de infertilidade humana.

Alguns fatores podem levar à infertilidade, como variações na produção espermática, concentração, morfologia e motilidade de espermatozóides, azoospermia, problemas infecciosos e dificuldade para a ejaculação, patologias como Degeneração Testicular, Hipoplasia Testicular e tumores.

Métodos seguros de colheita de sêmen devem ser desenvolvidos de forma a garantir o bem-estar do animal e a segurança dos técnicos. A escolha do anestésico para contenção do animal é fundamental para que, por um lado, ocorra uma sedação eficaz e sem sofrimentos e, por outro, se evite a contaminação no ejaculado e/ou a diminuição do volume.

A qualidade do sêmen está diretamente relacionada à fertilidade e à quantidade de crias a serem geradas. Com o desenvolvimento e a expansão de técnicas de reprodução animal, como transferência de embriões, criopreservação do

sêmen, fertilização in vitro e clonagem, a avaliação quantitativa e objetiva do sêmen e dos espermatozóides tem se tornado cada vez mais necessária.

A punção aspirativa, ou citologia aspirativa por agulha fina (CAAF), é considerada um método simples e rápido na obtenção de amostras de diferentes órgãos ou tecidos. Este estudo também procura descrever a técnica da punção não aspirativa por agulha fina, devido ao interesse cada vez maior no desenvolvimento de diferentes técnicas de punção testicular, de modo a ser cada vez mais seguro e com o mínimo de consequência para a vida reprodutiva futura do paciente (DAHLBOM et al., 1997; LEME & PAPA, 1997; PAZ et al., 2003).

O cativeiro impõe aos animais selvagens condições muito diferentes das encontradas em seus ambientes naturais. Agressividade, estereotipias, inatividade e alimentação deficiente são fatores que contribuem negativamente na fertilidade. A preocupação com o bem-estar dos animais, simulando condições mínimas do seu habitat natural, reduz alterações comportamentais e reprodutivas (MORATO, et al., 2001; CAMPOS et al., 2005).

A crescente degradação ambiental que a espécie humana vem promovendo, incluindo a destruição de florestas, de cerrados e de outros ecossistemas, e sua substituição pela pecuária, precisa ser estancada. Se a exploração dos recursos naturais pelo homem não for racionalizada, a ameaça se estenderá não só aos felinos, mas à maior parte da biodiversidade do planeta. Outra tentativa de se reverter o quadro é a realização de mais estudos com animais em cativeiro, não só para tentar sua reprodução, mas também para buscar informações

novas sobre fisiologia, genética, nutrição e outros aspectos biológicos das diversas espécies.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL:

• Avaliar a fertilidade (capacidade reprodutiva) dos felinos selvagens e domésticos através dos exames andrológicos e citologia testicular.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Descrever uma metodologia para contenção química do gato doméstico (Felis catus,), pequenos felinos selvagens (Leopardus tigrinus, Leopardus geoffroy e Puma yagouaroundi), a fim de estabelecer um exame clínico do sistema genital masculino, coleta de sêmen e coleta de material por punção não aspirativa testicular por agulha fina.

• Descrever a biometria testicular dos felinos domésticos e selvagens e estimar os coeficientes de correlação entre o perímetro escrotal medido e as características seminais.

• Descrever os achados clínicos e as características seminais (exame andrológico) dos felinos domésticos e selvagens.

• Descrever os achados citológicos testiculares pelo método de punção por agulha fina sem aspiração (PSA) em felinos domésticos e selvagens.

• Descrever os achados macroscópicos e microscópicos dos testículos dos felinos domésticos.

• Correlacionar os achados dos exames andrológicos, e citologia testicular dos felinos domésticos com os felinos selvagens.

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1. Descrição e comportamento das espécies de felinos selvagens

3.1.1. Gato-do-mato pequeno (Leopardus tigrinus, Schreber, 1775)

Com tamanho, silhueta e pegada muito próximos ao do gato doméstico, o gato-do-mato pequeno (Leopardus tigrinus, Schreber, 1775) atinge, no máximo, 3,0 Kg, o que faz dele o menor integrante da família no Brasil (felinos neotropicais). Sua pelagem segue o padrão da família (gatos pintados), mas exibe rosetas características, que o distinguem tanto de jaguatirica quanto do gato-do-mato grande. A cor da pelagem varia de diferentes tonalidades de ocre a cinza, apresentando fileiras de rosetas e pintas marrons ou negras, porém com menor tendência de se unirem em listras horizontais no flanco. O pêlo é firme e curto (MORAIS, 1999; SILVA & ADANIA, 2007).

Como acontecem com a maioria dos pequenos felinos nacionais, seus hábitos são poucos conhecidos. Acredita-se que se alimentam de pequenos roedores e pássaros e, dependendo da abundância dos itens no ambiente, podem

também se alimentar de pequenos primatas, lagartos e artrópodes. Dados de cativeiro sugerem hábitos noturnos, apesar de os itens da dieta indicar considerável atividade diurna (SILVA & ADANIA, 2007).

Originalmente, era encontrado em todo o Brasil, ocupa áreas de florestas úmidas sempre verdes e montanhosas; embora tenha sido observado em outros tipos de florestas, bem como em ambientes diferentes, como o pantanal e a caatinga (OLIVEIRA, 1998). Aparentemente, a distribuição geográfica do gato-do-mato é naturalmente descontínua ou fragmentada. O limite norte de sua ocorrência foi registrado no norte da Costa Rica, ocorrendo em praticamente toda América Central e na do Sul, até o seu limite sul, no norte da Argentina (MORAIS, 1999; SILVA & ADANIA, 2007).

3.1.2. Gato-do-mato grande (Leopardus geoffroyi, d’Orbign & Gervais, 1843)

Apresenta pelagem com pintas e não com rosetas, o que facilita sua identificação. Vive apenas no sul do Brasil e nas regiões fronteiriças com o Paraguai e a Bolívia, podendo atingir 4,0 kg. É também chamado de geoffroy em função do nome científico, que homenageia o naturalista francês Etiéne Geoffroy-Saint-Hilaire (1772-1844). O animal ocupa tanto áreas de matas quanto de campos abertos, têm hábitos arborícolas e, segundo alguns relatos, parece ser ótimo nadador. Alimentam-se, principalmente, de pequenos mamíferos, pássaros e peixes. Informações sobre a fisiologia reprodutiva da espécie são bastante escassas(SILVA & ADANIA, 2007).

3.1.3. Gato jaguarondi (Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803)

De nome indígena, o gato jaguarondi ou gato-mourisco (Puma yagouaroundi, E. Geoffroyi, 1803) também é diferente dos gatos pintados, tendo uma pelagem pardacento-amarronzada uniforme (com variações de tons). Alcança até 7,0 kg e suas pernas curtas lhe dão um aspecto geral bem diferente do observado nos outros gatos selvagens brasileiros. Vive em florestas e áreas de vegetação secundária (em regeneração, após a ocupação do homem), mas seus hábitos são também poucos conhecidos. É encontrado em quase todo o país e não mostra ser bom escalador. Estudos sugerem que uma mesma área pode ser dividida por mais de um animal dessa espécie, fugindo ao padrão normal dos demais felinos brasileiros. O gato mourisco alimenta-se, basicamente, de pequenos mamíferos, mas caça também aves, répteis e outros pequenos animais (SILVA & ADANIA, 2007).

3.2 PUBERDADE E CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DO

SISTEMA GENITAL MASCULINO

A puberdade no macho compreende o momento em que ele se torna capaz, pela primeira vez, de produzir números suficientes de espermatozóides viáveis para fecundar uma fêmea.

A hipófise, as gônadas e os tecidos-alvos dependentes de esteróides são capazes de responder a hormônios estimuladores antes da puberdade; portanto, considera-se que o hipotálamo tem papel fundamental na iniciação da puberdade. É o evento final de um processo contínuo de alterações endócrinas, que se iniciam

logo após o nascimento. Alguns autores defendem a teoria de que a puberdade ocorre quando o complexo hipotalâmico-hipofisário do animal se torna dessensibilizado à inibição por retroalimentação dos esteróides gonadais. Embora numerosos fatores influenciem a modulação do sistema endócrino pelo sistema nervoso central, os principais fatores que afetam a idade da puberdade em animais domésticos são raça, peso e estação de nascimentos (JOHNSTON et al., 2001; DAVIDSON & STABENFELDT, 2008).

A anatomia reprodutiva dos gatos domésticos machos é semelhante à de felinos selvagens, apesar de dados individuais por espécie serem escassos (WILDT et al., 1998 apud MORAIS, 1999). O sistema reprodutor é formado por bolsa escrotal, testículos, cordão espermático, epidídimos, ductos deferentes, glândulas sexuais acessórias (glândulas bulbo uretrais e próstata) e pênis. Os órgãos atuam em conjunto para produzir os espermatozóides e liberá-los no sistema genital feminino (ELLENPORT, 1986; JOHNSTON et al., 2001).

A bolsa escrotal de felinos é perineal, localizada medianamente no trajeto entre a região inguinal e o ânus. Sua pele é normalmente pigmentada e revestida por densa cobertura de pêlos. Os testículos ao nascer já devem estar presentes na bolsa escrotal e são relativamente pequenos, ovalados e lateralmente compridos. Ficam em posição horizontal dentro da bolsa escrotal, com eixo longo oblíquo e com as extremidades caudais. O epidídimo é grande e está intimamente inserido ao longo da margem dorsolateral de cada testículo (ELLENPORT, 1986; FELDMAN & NELSON, 1996; JOHSNTON et al., 2001; DYCE et al., 2004).

Os testículos estão na bolsa escrotal, mas só serão palpáveis a partir da sexta a oitava semanas de vida. As células de Leydig estão maduras aos cinco meses de idade, sendo os espermatozóides encontrados no ejaculado logo após esse período (FELDMAN & NELSON, 1996). Quanto à biometria, os testículos possuem em média 1,5 x 1,0 x 1,0 cm cada (JOHNSTON et al., 2001). As medidas do comprimento e largura de cada um são úteis para a estimativa do volume testicular (HOWARD et al., 1986; WILDT, 1996), o qual tem boa correlação com a produção espermática em várias espécies (ROBERTS, 1986), apesar de WILDT et al. (1996) não terem encontrado correlação significativa entre o volume testicular e a qualidade do ejaculado entre machos felinos de uma espécie. Os testículos normais são lisos, firmes e simétricos, em tamanho e forma (FELDMAN & NELSON, 1996; JOHNSTON et al., 2001).

O ducto deferente do gato doméstico não possui ampolas e, como não há relato de exceções dentro da família Felidae, acredita-se que esta característica seja comum a todas as espécies. Nos felinos em geral, as glândulas sexuais acessórias são representadas pela próstata e por um par de glândulas bulbo-uretrais. A próstata tem formato globular e localiza-se próximo ao ponto de junção do ducto deferente com a uretra, circundando o colo da bexiga urinária e parte da uretra. As glândulas bulbouretrais são pequenas, com o tamanho aproximado de uma ervilha, e estão localizadas caudalmente à próstata. Abrem-se no canal urogenital, próximo a base do pênis, porém sua contribuição para o volume seminal é mínima (ELLENPORT, 1986; JOHNSTON, 1991; JOHSNTON et al., 2001).

O pênis dos felinos é composto por corpo e glande. Entretanto, durante a ereção, o pênis tem um aumento considerável, curvando-se para baixo e para frente, mudando sua orientação para o sentido cranial. Nos dois terços craniais da glande existe um grande número (100-200) de espículas penianas. O desenvolvimento destas espículas é dependente dos androgênios testiculares, aparecendo, no gato doméstico, ao redor de 12 semanas e atingindo seu tamanho máximo no indivíduo adulto (ELLENPORT, 1986; FELDMAN & NELSON, 1996).

3.3 ESPERMATOGÊNESE

A espermatogênese é um processo longo, no qual as células germinativas diplóides, localizadas na base dos túbulos seminíferos, se dividem por mitose para manter seu próprio número. De maneira cíclica, as células produzem uma progênie que sofre divisão meiótica e diferenciação em espermátides haplóides, que são liberadas posteriormente como espermatozóides. A espermatogênese é dividida em três etapas, a saber: espermatocitogênese, meiose e espermiogênese. A espermatocitogênese compreende as divisões mitóticas das espermatogônias tipo A, que produzem outras espermatogônias, que ainda não estão no processo de produção de espermatozóides, de forma que mantêm uma população de células-tronco. Essas divisões de células-tronco são responsáveis pela capacidade de o macho produzir espermatozóides, de modo contínuo, durante sua vida adulta. Depois, a espermatogônia do tipo A torna-se tipo B, divide-se em mitose, produzindo espermatócitos primários, que, por sua vez, se dividem pela primeira meiose em espermatócitos secundários, em poucas horas, e formam espermátides, que contêm uma cromátide de cada um dos cromossomos haplóides. As espermátides

recém-formadas continuam a diferenciar-se, sem se dividirem, para formar espermátides maduras, por meio da espermiogênese. Esse evento ocorre logo antes da liberação das espermátides como espermatozóides no lúmen dos túbulos seminíferos (CASTRO et al., 2002; DAVIDSON & STABENFELDT, 2008).

Através da avaliação histológica, observou-se que a espermatogênese ocorre, aproximadamente com 20 semanas de idade. O animal pode ejacular com sete meses de idade, mas idade média para a cobertura varia com as condições físicas, o peso corporal e a estação do ano (precocidade). A média da puberdade do gato doméstico ocorre entre 8 e 10 meses ou com o peso variando entre 2,5 a 3,0 quilos (ROBERTS, 1986; JOHNSON, 1994; OLIVEIRA, 1998; JOHNSTON et al., 2001). A maturidade sexual dos felinos selvagens é atingida entre 18 e 20 meses de idade (OLIVEIRA, 1998; WILDT et al., 1998apud MORAIS, 1999).

A espermatogênese ocorre no interior dos túbulos seminíferos, os quais são responsáveis pela produção dos gametas masculinos. A sequência de eventos envolve uma série de modificações nucleares e citoplasmáticas (BANKS, 1992; DAVIDSON & STABENFELDT, 2008. O processo da espermatogênese tem sido mais evidente em gatos entre 12 e 36 meses de idade, pela maior concentração de espermatozóide (SIEMIENIUCH & WOCCLAWEK-POTOCKA, 2007).

SILVA et al. (2009) avaliaram dados histológicos e morfométricos em testículos de gatos orquietomizados. Os gatos com quatro meses de idade apresentaram túbulos seminíferos pouco desenvolvidos e com ausências de luz, epitélio seminífero baixo, células de Sertoli indiferenciadas e tecido intersticial

escasso; e, aos cinco meses, começaram a diferenciar-se um pouco. Entre seis e sete meses, apresentaram início da espermatogênese; as células de Leydig apareceram maiores, poliédricas com citoplasma vacuolizado e núcleo claro e o tecido intersticial era esparso e com poucos vasos sanguíneos. Os gatos adultos apresentaram túbulos seminíferos com maior diâmetro, epitélio germinativo alto e luz tubular pequena; as células de Leydig apareceram com dimensões variadas, poliédricas, com citoplasma vacuolizado, núcleo claro e nucléolo evidente e espaço intertubular seminífero variado, com muitos vasos sanguíneos. O diâmetro dos túbulos seminíferos variou entre os animais jovens e adultos.

Os testículos são os locais de espermatogênese no animal adulto e apresentam função endócrina e exócrina. A função exócrina é uma glândula tubular composta, enovelada, cujo produto de secreção é o espermatozóide. A porção endócrina é representada pelas células de Leydig e pelas células de sustentação de Sertoli. A espermatogênese é o resultado da diferenciação de espermatogônia em espermatozóide, bem como da manutenção do número de espermatogônias. Em um corte longitudinal dos túbulos seminíferos normais é possível observarem-se diversos estágios de desenvolvimento dos espermatozóides. Todas as funções testiculares são profundamente influenciadas pelo sistema neuroendócrino (ROBERTS, 1986; JOHNSON, 1994; HENSON, 2003; BASTIDAS & APONTE, 2004; CASTRO et al., 2002; CATTELAN et al., 2005).

Na sua função endócrina, os testículos são responsáveis pela síntese de esteróides, entre eles os estrógenos – produto final obtido da transformação de andrógenos pelo complexo microssomial chamada aromatase. Em ratos imaturos, a

atividade aromatase está localizada na maior parte nas células de Sertoli e, em ratos adultos, está nas células de Leydig (CARREAU et al., 2007).

Os testículos estão envoltos por uma túnica albugínea, composta por tecido conjuntivo. A túnica albugínea é contínua com tecido conjuntivo frouxo dos septos testiculares. Estes septos dividem o testículo em lóbulos; dentro desses lóbulos, encontram-se os túbulos seminíferos e seus ductos, no qual os túbulos se irradiam do mediastino testicular. Os túbulos são revestidos por epitélio estratificado, formado pela zona basal, intermediária e superficial.

No epitélio seminífero, uma rigorosa arquitetura é observada entre diferentes gerações da linhagem espermatogênica, que são estruturadas e mantidas por uma população constante de células de Sertoli. A presença e os constituintes das zonas dependem da atividade espermatogênica dos túbulos. As células compreendem: espermatogônias, espermatócitos primários, espermatócitos secundários, espermátides, espermatozóides e células de Sertoli. As células de Leydig estão localizadas fora dos túbulos seminíferos e são responsáveis pela produção de testosterona (BANKS, 1992; BITTENCOURT et al., 2004; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; DAVIDSON & STABENFELDT, 2008).

A célula de Sertoli ocupa um papel fundamental na morfofisiologia da espermatogênese, e suas funções incluem desde a sustentação física das células germinativas até a produção de inúmeros fatores parácrinos e autócrinos, que modulam a produção espermática. Em onças pardas, por exemplo, cada célula de Sertoli é capaz de sustentar aproximadamente 12,5 células germinativas, das quais

7,3 são espermátides arredondadas. Este último valor aproxima-se dos valores mais baixos encontrados para este parâmetro nas espécies domésticas, porém acima do observado para o gato doméstico (GUIÃO-LEITE & PAULA, 2003).

COSTA et al. (2008) estudaram quatro onças pintadas (Panthera onca) para determinar a duração da espermatogênese. Para tal, os animais foram anestesiados com tiletamina/zolazepam (10 mg/kg), e receberam uma aplicação intratesticular de H3 – thymidine previamente a orquiectomia. Após a castração, observaram que os testículos pesaram 17,7 ± 2,2 g e o volume dos túbulos seminíferos e células de Leydig foram, respectivamente, 74,7 ± 3,8 e 16,7 ± 1,6%. O ciclo dos estágios foi caracterizado com base na forma e posição do núcleo da espermátide, na presença de divisões meióticas e na composição do epitélio do seminífero.

Foram caracterizados oito estágios da espermatogênese, de acordo com a morfologia tubular e o desenvolvimento cromossômico. Cada ciclo espermático (4,5 ciclos) e o processo espermatogênico inteiro foram de aproximadamente 12,8 ± 0,01 e 57,7 ± 0,07 dias, respectivamente. O número de células de Sertoli e células de Leydig por grama de testículos foi 29,0 ± 4,0 x 106. Foram encontradas oito espermátides para cada célula de Sertoli, uma vez que a produção diária espermática por grama de testículo foi de 16,9 ± 1,2 x 106. No presente estudo, foram compreendidas as funções testiculares, incluindo as características do ciclo do epitélio seminífero e a duração da espermatogênese e das células de Sertoli na onça pintada.

3.4 COLETA E AVALIAÇÃO DO SÊMEN

Foi estimado que 20,0 % dos gatos podem ser treinados para que se tenha sêmen coletado por meio de vagina artificial, que consiste num pequeno tubo de borracha em cuja extremidade é preso um tubo coletor. Quando o macho monta a fêmea e ocorre ereção, a abertura da extremidade enrolada do bulbo de borracha é oferecida ao macho para a intromissão do pênis. A ejaculação segue-se dentro de segundos e pode-se coletar aproximadamente 0,2 a 0,8 ml de sêmen (DOOLEY & PINEDA, 1986; DOOLEY et al., 1991; FELDMAN & NELSON, 1996; JOHNSTON et al., 2001; ZAMBELLI & CUNTO, 2006).

Em 1936, na Austrália, foi realizada a primeira coleta de sêmen pelo método de eletroejaculação por Gunn em ovinos; entretanto, somente no final da década de 60, foi cientificamente utilizado em onça pintada (CARVALHO, 1968), para, na década de 70, sê-lo em gatos domésticos (PLATZ & SEAGER, 1978; MIES FILHO, 1982). Em 1945, HAPLAND & CASSOU modificaram o eletrejaculador para uso em bovinos e suínos. A modificação realizada pelos pesquisadores reduziu significativamente a extensão das excitações necessárias das coletas de sêmen, podendo realizar a coleta com o animal na posição de estação, reduzindo os riscos de acidentes e de fraturas (MIES FILHO, 1982).

A eletroejaculação é o método de eleição para obtenção de sêmen em felinos. Apesar disso, a primeira eletroejaculação em onça pintada não obteve bons resultados. Posteriormente, um estudo (MORATO et al., 1998) com seis indivíduos obteve melhores resultados, ainda sem que os animais fossem anestesiados,

expondo técnicos e animais aos riscos de acidentes. Desde a padronização da técnica, 28 espécies de felinos selvagens foram avaliadas, incluindo-se a onça pintada(CARVALHO, 1968; MORATO et al., 1998; MIYA et al., 2007; PIRES et al., 2007). O método baseia-se na indução do reflexoejaculador através de estímulos elétricos, com a introdução de uma sonda trans-retal lubrificada, conectada a um estimulador elétrico, no assoalho da ampola retal; no caso de felinos, os animais deverão estar anestesiados (MORATO & BARNABE, 1998; SILVA, 2008).

Utilizado para avaliação de exames andrológicos e, principalmente, para coleta de sêmen em animais ameaçados de extinção, o método abarca o congelamento do sêmen, na inseminação artificial, de forma a eliminar o contato físico com a fêmea e, consequentemente, reduzir riscos de transmissão de doenças (PLATZ & SEAGER, 1978; MORAIS, 1999; TEBET, 2004; COSTA & PAULA, 2005). Tem sido utilizada em protocolos para seres humanos, em casos de problemas neurológicos decorrente de injúria espinhal, cirurgias retroperineais, esclerose múltipla ou neuropatias diabéticas, que resultam na falta de ejaculação (PINEDA et al., 1984; PINEDA & DOOLEY, 1984; BARNABE et al., 2002; VALLE et al., 2004).

O aparelho destinado a pequenos felinos consiste num eletrodo trans-retal com 12,0 cm x 1,0 cm de diâmetro, com três tiras longitudinais de aço inoxidável (cada uma delas com 5,0 cm de comprimento), orientadas em torno do eletrodo a 120, 180 e 240 graus, sendo este acoplado a uma fonte de energia. Estímulos de um a oito volts e cinco a 250 mA são aplicados e cada eletroejaculação consiste em séries de 60 estímulos. Os primeiros 40 estímulos são aplicados a 2,0 volts, 20 a 30 mA e são seguidos imediatamente com 20 estímulos de 3,0 volts, 30 a

40 mA. Deve-se fazer um intervalo de aproximadamente dois segundos entre cada série de estímulo. O estímulo não deve ultrapassar oito volts, pois, do contrário, resulta em ejaculados contaminados com urina. CARVALHO, 1968; PINEDA et al., 1984; PINEDA & DOOLEY, 1986; DOOLEY & PINEDA, 1986; FELDMAN & NELSON, 1996; AXNER et al., 1996; JOHNSTON et al., 2001; TEBET et al., 2006; LEITE et al., 2006; ZAMBELLI et al., 2006). Alguns autores, como PINEDA et al. (1984), citam a coleta de sêmen através da eletroejaculação com aplicação de 80 estímulos. A sonda deve possuir o tamanho adequado ao porte das espécies, sendo aproximadamente do mesmo diâmetro das fezes (WILDT, 1996).

Na coleta pelo método da vagina artificial o sêmen é mais concentrado do que o método da eletroejaculação, e suas características seminais podem variar, onde no método da eletroejaculação temos o aumento do volume, devido ao maior estímulo às glândulas acessórias. A cor normal do sêmen em gatos é de aspecto branco leitoso, e o pH é ligeiramente básico entre 7,0 e 8,0. Para avaliação do sêmen, uma alíquota (0,5 µl) é examinada imediatamente após a coleta, para que sejam determinadas as características microscópicas, como motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática (ROOT et al., 1994; FELDMAN & NELSON, 1996; SANTOS & VANNUCCHI, 1997; FUNEZ, 2000; JOHNSTON et al., 2001; LUVONI et al., 2003; LEITE et al., 2006; VIEIRA et al., 2007).

Na família dos felídeos selvagens, houve coleta em onças pintadas, mais precisamente na Panthera onca (CARVALHO, 1968; MORATO et al., 1998, PAZ et al., 2000; MORATO et al., 2001; PAZ et al., 2003), em pumas, Puma concolor (WILDT et al., 1988), em tigres, Panthera tigris (DONOGHUE et al., 1992), em tigres

siberianos, Panthera tigrinus altaica (SCHMEL et al., 1990 apud SILVA, 2008), em leopardos da neve, Panthera uncia (ROTH et al., 1994), em leopardos, Panthera pardus (JAYAPRAKASH et al., 2001), em gato-leopardo, Felis bengalensis (HOWARD & WILDT, 1990), em leopardos nebulosos, Neofelis nebulosa (WILDT et al., 1988; PUKAZHENTHI et al., 2006), em jaquatiricas, Leopardus pardalis (MORAIS, 1999; MORAIS et al., 2002; TEBET, 2004), em gato-do-mato pequeno, Leopardus tigrinus (MORAIS et al., 2002; ERDMANN, 2005; VIEIRA et al., 2009).

MORATO et al. (1998)utilizaram 10 onças pintadas, machos adultos (sete a 10 anos), da Fundação Parque Zoológico de São Paulo e do Parque Zoológico Municipal de Sorocaba, com objetivo de avaliarem, sistematicamente, a técnica de colheita de sêmen, a fim de caracterizar-se o ejaculado desses animais. Os animais foram contidos quimicamente, com associação tiletamina-zolazepam, na proporção de 10 mg/kg. A eletroejaculação foi realizada 54 vezes, obtendo-se ejaculado em 100% dos procedimentos, havendo contaminação com urina em duas colheitas (3,7%), confirmada com diminuição do pH e coloração amarelada. O pH normal médio foi de 7,0. A coloração do ejaculado variou entre transparente e esbranquiçado. O volume médio foi de 7,42 ± 3,69 mL, motilidade média de 62,6 ± 11,0%, vigor 2,71 ± 0,52 e a porcentagem de espermatozóides com morfologia normal de 46,7 ± 5,8%. Os autores concluíram pela eficiência da técnica na obtenção do ejaculado e observaram elevado índice de anormalidades espermáticas, quando comparado com o resultado de outros autores. Howard (1993) relata que elevados índices de anormalidades espermáticas são comuns na família Felidae. Geralmente, as alterações de qualidade espermática estão diretamente relacionadas a três grandes fatores: genético, nutricional e ambiental. Quanto ao

aspecto nutricional, os autores citam que as dietas fornecidas pela maioria dos zoológicos sul-americanos são baseadas em carne bovina ou frango, sem suplementação mineral e vitamínica, diminuindo, com isso, a concentração espermática e aumentando a porcentagem de espermatozóides morfologicamente anormais, quando comparada à dos animais que recebem dietas suplementadas.

MORATO et al. (1999) examinaram quatro onças pintadas (Panthera onca), idade entre sete e 10 anos de idade, machos adultos que foram submetidos a avaliação seminal, quantificação hormonal e biometria testicular a cada dois meses pelo período de um ano. Os animais foram anestesiados com tiletamina/zolazepan (10 mg/kg). A coleta de sêmen foi realizada pelo método de eletroejaculação e analisada quanto ao pH, volume total, motilidade, vigor, espermatozóides totais e morfologia. Antes da eletroejaculação, foram coletadas amostras de sangue, e o plasma estocado a -200C, para posterior realização do radioimunoensaio para dosagem de testosterona. A avaliação dos testículos foi realizada pela palpação digital dos mesmos, a consistência classificada em duro, normal e flácido. A biometria testicular constou na medição do comprimento e largura dos testículos, e os valores obtidos foram combinados para obtenção de volume testicular. Quanto às amostras do sêmen, o índice de espermatozóides morfologicamente anormais foi elevado (média de 51%), e obtiveram baixos índices de motilidade (50,6%) e vigor (2,2). Baseado no total de 28 coletas, o volume médio do ejaculado foi de 8,6 ± 1,3 mL, contendo concentração espermática com média de 3,9 ± 0,7 x 106 sptz/mL e pH igual a 7,0. Os defeitos morfológicos encontrados foram de cabeça (acrossomo, knobbed sperm, cabeça gigante, subdesenvolvido, gotas protoplasmática proximal e distal) e de peça intermediária. Não houve correlação entre as características

seminais, níveis plasmáticos de testosterona e volume testicular. Em relação à estação do ano, não houve alteração na qualidade seminal, testosterona sérica e volume testicular. Os resultados sugeriram que as onças pintadas mantidas em cativeiro não são sazonais e que coleta e avaliação espermática podem ser realizadas em qualquer período do ano, sem que haja perda na qualidade seminal.

MORATO et al. (2001) coletaram amostras de sêmen e de sangue em 14 onças pintadas (Panthera onca), sendo seis de vida livre e oito de cativeiro, e compararam as características reprodutivas entre as duas populações. Quanto às amostras de sêmen foram analisadas o volume, motilidade, vigor, concentração, total de espermatozóides e morfologia espermática. A concentração de testosterona foi determinada pelo radioimunoensaio. Embora o volume em onças pintadas de cativeiro fosse maior do que os de vida livre, as onças de vida livre apresentaram maior produção total de espermatozóides (59,3 ± 12,8 x 152,0 ± 88,0 x 106 sptz /mL, respectivamente), com melhor viabilidade e vigor (2,8 ± 0,1 x 3,5 ± 0,2) e mais espermatozóides morfologicamente normais (73,5 ± 3,9 x 5,0 ± 1,1%, respectivamente). A concentração de testosterona foi semelhante nas duas populações. Os autores obtiveram sucesso na coleta de sêmen de onças pintadas de vida livre e nas avaliações das características reprodutivas. Os resultados também indicaram que a qualidade seminal das onças pintadas que vivem em zoológicos são inferiores, quando comparados aos animais de vida livre.

JAYAPRAKASH et al. (2001) coletaram e avaliaram 11 amostras de sêmen de leopardos indianos (Panthera pardus), em diferentes zoológicos, com o método de eletroejaculação. Os animais foram anestesiados com ketamina (200

mg/kg) e xylazina (125mg/kg). Os ejaculados foram coletados separadamente e, no final de cada estímulo, as características foram analisadas quanto ao volume, pH, densidade, número de espermatozóides móveis (motilidade); por último, foi realizada a criopreservação, sendo este, após o procedimento. A motilidade foi analisada com o auxílio do programa CASA (HTM-IVOS, Version 10, Hamilton-Thorne Inc, Bervelt, Mass). Não houve efeitos colaterais com o animal, após a anestesia, nem após a coleta seminal com o eletroejaculador (boa qualidade seminal). Apenas 58,8 %± 16,6% apresentaram móveis no ejaculado, espermatozóides morfologicamente normais (70,43%) e 13,59% de espermatozóides pleomórficos. As anormalidades mais comuns foram: defeitos de cabeça, gotas protoplasmáticas e defeitos de peças intermediárias. Observou variações entre os indivíduos.

MORATO et al. (2004) avaliaram os efeitos de diversas estações do ano nas funções testiculares e endócrinas de onça pintada (Panthera onca). Foram coletadas amostras de fezes três vezes por semana, e avaliadas a atividade estereidogênica e a concentração de andrógenos. Foram observadas alterações somente nas concentrações de andrógenos, com maior concentração na época de chuva (380ng/ml x 483,8 ng/ml). As amostras de sêmen também foram coletadas de todos os machos (n=5), duas vezes por semana, nas diferentes estações de ano (seca e chuva). As amostras apresentaram resultados semelhantes, como: motilidade (57,0 ± 4,5%), concentração (6,3 ± 2,4 x 106 mL) e morfologia espermática normal (60,8 ± 3,1%). Há diferenças na concentração de andrógenos entre os diferentes períodos de seca e chuva. Silva et al., 2003 realizaram a avaliação andrológica de uma onça Pintada, na qual o animal foi submetido à

anestesia, seguido de análise da genitália e do sêmen coletado por eletroejaculação. Os padrões encontrados foram semelhantes aos dos autores anteriores.

HAAG et al. (2009) coletaram 55 amostras de fezes em quatro florestas diferentes do Brasil e da Argentina, para estudos genéticos e ecológicos em jaguar (Panthera onca) e em puma (Puma concolor), com o objetivo de auxiliarem na perpetuação e conservação das espécies ameaçadas de extinção. O maior obstáculo foi identificarem no campo de qual animal seriam as fezes.

Em estudo YOGEV et al., 2004 avaliaram a variabilidade estacional na qualidade dos parâmetros seminais pré e pós-descongelamento de doadores de banco de sêmen. Foram analisados dois ejaculados durante o mês de março, na primavera (92 machos); de junho, no verão (97 machos), de setembro, no outono (81 machos) e de dezembro, no inverno (97 machos). Diferenças entre os meses do ano foram encontradas na concentração espermática e morfologia normal dos espermatozóides, sendo altos valores em março e dezembro e baixos em setembro. Em relação ao volume e ao percentual de motilidade espermática, não foram encontradas diferenças nas diversas estações. A criopreservação de sêmen doado foi mais eficaz durante o inverno e a primavera.

ERDMANN (2005) descreveu os parâmetros andrológicos de 12 gatos-do-mato pequenos, Leopardus tigrinus, após ter avaliado protocolos anestésicos e processado e congelado o sêmen dos felinos de alta qualidade seminal para testar dois meios diluidores. Quanto ao protocolo anestésico, utilizou tiletamina/zolazepan, na dose 6,7 mg/kg, associado ao cloridrato de xilazina, nas doses de 0,6 mg/kg; 0,9

mg/kg e 1,3mg/kg; todos obtiveram resultados eficazes, seguros e presença de espermatozóides em todos os felinos. De um total de 32 colheitas, houve contaminação com urina em 10 colheitas (31,2%), sendo 7% das alíquotas contaminadas desprezadas. O autor encontrou os seguintes valores: volume 0,13 ± 0,2 mL; motilidade 73,44 ± 3,71; vigor 3,48 ± 0,11; pH 7,58 ± 0,07; concentração espermática 436,41 ± 95,8 x 106 sptz/mL; espermatozóides morfologicamente normais 55,86 ± 3,34 %.

Nos animais que apresentaram motilidade acima de 60% e concentração 20 x 106 mL, foram avaliados os diluentes BIOXEL e TYB para criopreservação do sêmen, tendo uma melhor resposta o TYB. O índice de teratospermia foi elevado (44,14%). Dos 11 animais avaliados, três eram normospérmicos, dois eram caracterizados teratospérmicos e o restante variou o índice de pleomorfismo espermático. Segundo TEBET (2004) e MIYA et al. (2007), houve maior incidência de defeitos de cauda dobrada, cauda enrolada e cauda fortemente dobrada em seus experimentos.

Quanto ao peso corporal, ERDMANN (2005) encontrou, nos gatos-do-mato pequenos, peso médio de 2,82 ± 0,08 kg, ficando entre as médias dos autores TEBET (2004), que obteve 2,2 ± 0,4, e MORAIS et al. (2002), que encontraram 3,0 kg. Na avaliação morfológica do sistema genital masculino, foram encontrados pênis de aspecto normal, com presença de espículas em todos os animais.

A consistência dos testículos, na maioria dos animais, foi normal, com exceção de um dos felinos que apresentou consistência levemente mais flácida,