AUTORES
AUTHORS
RESUMO
SUMMARY
PALAVRAS-CHAVE
KEY WORDS
Utilizando Cromatografia em Fase Gasosa
Phytosterol Quantification in Imported
Olive Oils Available on the Campinas
Market, Using Gas Chromatography
*
Denise Fabiana Silvestre BECKER Lireny Aparecida Guaraldo GONÇALVES
Renato GRIMALDI Gabriela Bonfante FERNANDES Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Departamento de Tecnologia de Alimentos. e-mail: denisef@fea.unicamp.br, lireny@fea.unicamp.br Fone/Fax: (19) 3289-1186
O azeite de oliva apresenta composição em fitosteróis bastante característica, a qual tem sido utilizada para detectar adulteração com outros óleos. Neste trabalho foram testadas condições analíticas para adequação da metodologia de determinação de fitosteróis aplicada ao azeite de oliva. A técnica para obtenção da fração esterólica engloba a saponificação do azeite de oliva adicionado de padrão interno, isolamento dos esteróis por cromatografia em camada delgada (CCD), extração dos esteróis da sílica gel e injeção do resíduo sem derivatização em cromatógrafo de fase gasosa equipado com coluna capilar LM-5 (5% fenil 95% metilpolisiloxane, 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno, 0,3 µm de espessura de filme). Diante da condição cromatográfica estipulada (isoterma de 300ºC) obteve-se boa resolução dos componentes, que puderam obteve-ser identificados e quantificados através da relação direta com a área do padrão interno. Assim, foi possível avaliar a identidade de 25 marcas de azeites de oliva disponíveis no comércio de Campinas, importados da Argentina, Espanha, Itália e Portugal, sendo que 24 destas foram envasadas na origem. As determinações foram realizadas em duplicata, obtendo-se um coeficiente de variação menor que 10% entre elas. O resultado do percentual dos principais fitosteróis mostrou que é possível detectar fraude no azeite de oliva com outros óleos vegetais, em função do teor de beta-sitosterol que deve ser no mínimo 93%, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2000). Através do teor de esteróis totais, associado à composição em esteróis, foi possível detectar adulteração em três marcas de azeite, das 25 analisadas.
Olive oil presents a very peculiar phytosterol composition, which has been used to detect adulteration with other oils. In this study, the analytical conditions of the methodology were tested for their adequacy to determine phytosterols in olive oil. The technique for obtaining the sterol fraction involved the saponification of the olive oil containing an added internal standard, sterol isolation by thin layer chromatography (TLC), sterol extraction from the silica gel and injection of the residue without derivation into a gas chromatograph equipped with a LM-5 capillary column (5% phenyl 95% methylpolysiloxane, 30 m length, 0.25 mm internal diameter, 0.3 µm film thickness). Using the chromatographic condition stipulated (isotherm at 300ºC), good component resolution was obtained, the components being identified and quantified by direct comparison with the area of the internal standard, of known concentration, or by means of an internal standard curve, both showing similar results. In this way the identities of 25 olive oil brands available on the Campinas market were evaluated, imported from Argentina, Spain, Italy and Portugal, of which 24 were bottled at origin. The determinations were performed in duplicate, obtaining a coefficient of variation smaller than 10%. The results for the percentage of the main phytosterols revealed that it was possible to detect fraud in olive oil containing other vegetable oils in terms of the beta-sitosterol content, which should be at least 93%, according to the Brazilian National Agency for Sanitary Vigilance (2000). From the total sterol content, associated with the sterol composition, it was possible to detect adulteration in three of the 25 brands of olive oil analysed.
Azeite de oliva; Fitosteróis; Adulteração, cromatografia a gás. Olive oil; phytosterols; adulteration, gas chromatography.
1. INTRODUCÃO
O azeite de oliva apresenta composição em esteróis bastante particular, que tem sido utilizada para detectar adulteração com outros óleos. Segundo ANTONIASSI e colaboradores (1998), nos trabalhos realizados no Brasil para avaliação da qualidade ou adulteração do azeite de oliva, a composição em esteróis não estava sendo considerada, provavelmente por se tratar de uma análise longa e de alto custo.
A determinação de esteróis é uma das técnicas mais empregadas na detecção de adulteração de azeites de oliva. Como todas as metodologias, técnicas complementares são necessárias para o julgamento da genuinidade de um azeite, visto que, dependendo do processamento pode-se remover grande parte dos esteróis, e estes óleos ao serem misturados ao azeite passam despercebidos na análise da fração esterólica. A determinação dos subprodutos de degradação da matéria insaponificável e glicerídica são ferramentas úteis para detecção de óleos tratados para conter baixo teor de esteróis. Os principais produtos de degradação dos esteróis são: estigmasta-3,5-dieno, estigmastatrieno, campestadieno e campestatrieno, estes formados a partir do beta-sitosterol, estigmasterol, campesterol e brassicasterol, respectivamente (TRUJILLO-QUIJANO, COSTA, 1995).
Segundo ABIDI (2001), para avaliar a mistura de fitosteróis com uma diversidade de outros componentes não saponificáveis em alimentos lipídicos e óleos vegetais é preciso utilizar técnicas analíticas seguras para extração, isolamento, separação, purificação, detecção e quantificação dos analitos. O isolamento e concentração dos esteróis presentes na matriz requer extração com solvente, extração por fluido supercrítico, ou fracionamento por fluido supercrítico seguido de várias etapas de limpeza e processos cromatográficos. Para subseqüente caracterização e quantificação a fração isolada pode ser purificada e isolada por ampla variedade de técnicas cromatográficas, incluindo cromatografia em coluna, cromatografia em fase gasosa, CCD, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase normal ou em fase reversa. Os esteróis podem ser detectados por detector de ionização de chama, detector de ultravioleta (UV), detector de infravermelho, detecção por ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa. Com o advento de tecnologias sofisticadas, a complexa mistura de esteróis pode ser eficientemente separada.
TOIVO e colaboradores (1998) desenvolveram um método para identificar e quantificar esteróis em óleos vegetais e na gordura do leite. Após saponificação da amostra, adicionaram betulina como padrão interno e procederam a extração da fração de esteróis utilizando coluna aberta de fase reversa C18. Os esteróis foram derivatizados e determinados por cromatografia em fase gasosa.
Com o intuito de se detectar fraudes em azeites de oliva com outros óleos vegetais de composição química parecida, recentemente outras técnicas analíticas têm sido empregadas isoladamente ou associadas a outras metodologias, visando complementar informações e elucidar a adulteração.
LÓPEZ-DÍEZ, BIANCHI e GOODACRE (2003)
avaliaram a capacidade da técnica de espectroscopia de Raman, juntamente com análises quimiométricas, em diferenciar azeite de oliva de diferentes cultivos e óleo de avelã, bem como quantificar o nível de avelã presente em mistura com azeite de oliva.
CHRISTY e colaboradores (2004) estudaram a adulteração em azeite de oliva com óleo de milho, soja, girassol e avelã utilizando a técnica de espectroscopia no infra vermelho próximo em combinação com a quimiometria e observaram que a composição da mistura destes óleos é classificada em função do conhecimento prévio do adulterante utilizado. Quando a identidade do adulterante é desconhecida, outras técnicas devem ser empregadas.
GARCÍA-GONZÁLES e colaboradores (2004) utilizaram a técnica de redes neurais baseados nos dados obtidos da RMN 1H e 13C para detectar adulteração em azeite de oliva. Fez-se a classificação correta do óleo de avelã, azeite de oliva puro e misturas do azeite com 2 e 20% de avelã e um modelo matemático foi validado, assumindo um limite de detecção ao redor de 8%.
SAYAGO, MORALES e APARICIO (2004) utilizaram a técnica de espectrofluorimetria associada à análise multivariada para avaliar a genuinidade do azeite de oliva em mistura com óleos de avelã.
Neste trabalho pretende-se testar a metodologia para determinação e quantificação de fitosteróis em azeites de oliva, onde será considerada a eficiência do processo de extração dos esteróis das amostras, a capacidade da coluna em separar com boa resolução os componentes esterólicos e o uso de padrão interno como compensador das perdas do analito que ocorrem durante as várias etapas analíticas que compõem a metodologia. A avaliação do perfil de esteróis em azeite de oliva visa detectar adulteração do azeite com outros óleos vegetais, bem como a adição do próprio óleo de oliva refinado ou obtido por processos de extração não coerentes com a especificação do tipo de azeite apresentada no rótulo. Além disso, a adequação desta metodologia torna-se um instrumento de análise importante para os órgãos de vigilância que pretendem avaliar a legitimidade dos azeites de oliva importados de vários países com destino ao consumo interno no Brasil.
2. MATERIAL E MÉTODO
2.1 AZEITES DE OLIVA
Foram analisadas 25 amostras de azeite de oliva adquiridas no comércio de Campinas, no período de março a maio de 2003. Destas apenas uma marca foi envasada no Brasil, as demais foram envasadas no país de origem.
Os azeites eram procedentes da Argentina, Espanha, Itália e Portugal, sendo que 14 marcas apresentavam-se como azeite de oliva extra virgem, 8 como azeite de oliva e 3 como azeite de oliva puro.
Estas informações estão resumidamente dispostas nas Tabelas de 1 a 3, separadas pela classificação especificada na embalagem do produto. O nome comercial das amostras de azeite foi substituído por letras. As amostras de mesma marca
que apresentavam diferença na categoria do azeite e/ ou volumes variados, foram diferenciadas por números. Todas estas informações foram obtidas da rotulagem dos azeites analisados.
Com base na legislação brasileira que regulamenta o setor de óleos de origem vegetal (ANVISA, 2000), a classificação do azeite de oliva varia em função do processo de obtenção do óleo e da acidez do azeite de oliva designado como virgem, por ser um azeite extraído por prensagem a frio do fruto da oliveira.
A classificação do azeite de oliva como “azeite extra virgem” significa dizer que o óleo foi obtido por processos mecânicos de extração e o mesmo possui acidez, expressa em ácido oléico, não superior a 1,0 g/100g. A determinação “azeite de oliva”, por outro lado, é uma mistura de azeite de oliva refinado com azeite de oliva virgem, podendo ser extra, fino ou comum, em função da acidez.
A determinação “azeite de oliva puro” não se encaixa na classificação em vigor no país, ficando em aberto a especificação destas marcas. Os parâmetros avaliados neste trabalho foram comparados posteriormente com a legislação para se determinar o tipo de azeite condizente com a especificação presente no rótulo. Os limites para estes azeites foram os mesmos para os classificados na legislação como azeite de oliva.
2.2 PADRÕES CROMATOGRÁFICOS:
Beta-sitosterol: 60% de pureza (Sigma, S-5753); Campesterol (Sigma, C-5157); Estigmasterol (Fluka, 85860); padrão interno (PI) Dihidrocolesterol (5á-cholestan-3ol; â-cholestanol): 95-97% de pureza, (Sigma, D-6128); Colesterol (5- cholesten-3â-ol): 99% de pureza, (Sigma, C-8667).
Utilizou-se sílica gel 60 (Merck) para confecção das cromatoplacas de vidro preparativas de 20 x 20 cm, solução etanólica de 2,7-diclorofluoresceína a 0,2% como revelador e os componentes da matéria insaponificável foram visualizados em cabine com lâmpada ultravioleta a 365 nm (“Original Hanau“ 220V, 50 Hz 85W). A etapa de identificação e quantificação dos fitosteróis ocorreu em cromatógrafo a gás da marca Agilent 6850 Series- GC System, com injetor automático acoplado a detector FID, com software Agillent Chemstation Plus, version A.08xx para integração e registro do cromatograma, utilizando coluna capilar de sílica fundida LM 5 (5% fenil 95% metilpolisiloxane, 30 m, 0,25 mm de diâmetro interno, 0,3 µm de espessura de filme).
2.3 MÉTODOS
Determinação da composição e conteúdo de esteróis mediante cromatografia em fase gasosa com coluna capilar Regulamento da Comunidade Européia (2003). Esta metodologia está resumidamente apresentada nas Figuras 1 e 2, com as seguintes modificações: (i) dispensou-se a etapa de lavagem do extrato insaponificável com água destilada para remoção do resíduo de sabão (ii) as placas cromatográficas não foram tratadas com solução alcoólica de KOH a 0,2 N; (iii) a etapa de derivatização dos esteróis não foi realizada.
Condições cromatográficas: Temperaturas do injetor, forno e detector de 280ºC, 300ºC e 300ºC, respectivamente;
Tabela 1 Dados retirados dos rótulos de Azeites de Oliva Extra Virgem
( ) Dados não disponíveis na embalagem do produto.
D1 e D2, mesma marca, apresentada em 250 e 500 mL, respectivamente. N1 e N2, mesma marca, contendo alecrim e orégano, respectivamente.
_ A B1 D1 D2 E1 F1 H L1 M N1 N2 P1 R1 T LOCAL DE ENVASE Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem PAÍS PRODUTOR Portugal Itália Espanha Espanha Portugal Itália Portugal Espanha Espanha Itália Itália Argentina Portugal Portugal ACIDEZ DECLARADA até 1,0% _ até 1% até 1% até 1,0% _ até 0,7% até 0,75% até 1% até 1% até 1% _ até 0,5% _ MARCA
Tabela 2 Dados retirados dos rótulos de Azeites de Oliva MARCA ACIDEZ DECLARADA _ até 1,5% _ até 1,0% _ _ até 1,5% até 1,5% PAÍS PRODUTOR Espanha Espanha Portugal Espanha Argentina Espanha Portugal Portugal LOCAL DE ENVASE Origem Origem Origem Origem Origem Origem Origem Brasil D3 D4 J L2 P2 Q R2 S
( ) Dados não disponíveis na embalagem do produto. D3 e D4, mesma marca, sendo D3 denominada “Suave Sabor”.
_ B2 E2 F2 ACIDEZ DECLARADA _ até 1,5% _ PAÍS PRODUTOR Itália Portugal Itália LOCAL DE ENVASE Origem Origem Origem MARCA
Tabela 3 Dados retirados dos rótulos de Azeites de Oliva Puro
AZEITE DE OLIVA (5 g)
Adição de 0,5 mL de P I
Adição de 5 mL de KOH aq a
50% e 30 mL de etanol a 95%
SAPONIFICAÇÃO
(refluxo por 1 hora)
EXTRAÇÃO
(50 mL de éter de petróleo / 4 vezes)
Fase aquosa
Fase orgânica
(dispensa-se as lavagens
com água)
Descarte
MATÉRIA
INSAPONIFICÁVEL
Evaporação
do solvente
CCD da matéria
insaponificável diluída
em 1 mL de hexano
Fase móvel - hexano / éter etílico (65: 35, v/v)
Revelação com solução etanólica a 0,2% de
2,7 - diclorofluoresceína
Visualização em luz UV - 365 nm
IDENTIFICAÇÃO E SEPARAÇÃO da fração esterólica,
mediante raspagem da sílica da cromatoplaca.
EXTRAÇÃO dos esteróis com clorofórmio (10 mL/ 1 vez) e
éter etílico (± 5 mL/ 4 vezes)
Evaporação do solvente
Diluição do resíduo (1 mL hexano HPLC)
Análise por CROMATOGRAFIA
EM FASE GASOSA
Figura 1 Principais etapas para a obtenção da matéria insaponificável do azeite de oliva.
Figura 2 Principais etapas para o isolamento e recuperação da fração esterólica em azeite de oliva, partindo-se da cromatografia em camada delgada (CCD).
fluxo de Hélio de 1,1 mL/ min; Pressão na coluna: 25,86 psi; Velocidade média: 35 cm/ s; Hidrogênio: 30 mL/ min; Ar: 300 mL/ min; Make up (N2)= 20 mL/ min; Split: 50:1; Volume de injeção: 1 ìL; Tempo de corrida: 30 minutos.
3. RESULTADOSS E DISCUSSÃO
Fração de Esteróis
Colesterol (Padrão)
Fitosteróis (Amostra)
3.1 Obtenção da matéria insaponificável e fração de esteróis
A metodologia oficial internacional para obtenção da matéria insaponificável recomenda a lavagem do extrato insaponificável com água destilada para remoção do resíduo de sabão. Esta etapa não foi realizada em função da formação de emulsão e aumento da possibilidade de perdas dos analitos. Recomenda-se ainda tratar as placas cromatográficas com solução alcoólica de KOH a 0,2 N. Porém, com o uso de placas preparativas confeccionadas artesanalmente tal procedimento tornou-se impraticável em função da fragilidade da sílica impregnada. Foram testados isolamentos da fração esterólica utilizando placas industrializadas previamente tratadas com KOH e placas preparativas sem tratamento, observando-se que em placas não tratadas a separação mostra-se eficiente e não gera dúvidas quanto à delimitação da banda de fitosteróis (Figura 3).
Figura 3 Cromatoplaca da matéria insaponificável de azeite de oliva revelada com solução de sulfato de cobre saturada, para efeito de ilustração das bandas dos componentes insaponificáveis, principalmente os fitosteróis, separados em placa sem tratamento com KOH.
3.2 Separação dos componentes esterólicos
Isolou-se da cromatoplaca a banda correspondente à fração esterólica, identificada mediante aplicação de um padrão de esterol (colesterol a 5%) nas laterais da placa na mesma altura de aplicação da amostra. Após a extração dos esteróis da sílica, a separação dos seus componentes foi realizada mediante cromatografia em fase gasosa em coluna capilar de sílica fundida, a qual mostrou-se eficiente na separação, promovendo boa resolução dos picos correspondentes aos diferentes fitosteróis.
A metodologia oficial européia recomenda a derivatização dos esteróis através de reação química destes com uma mistura de piridina - hexametildisilazano trimetilclorosilano, 9:3:1 (v/v/v). Avaliou-se que a separação por cromatografia em fase gasosa de amostras não derivatizadas foi tão boa quanto a de amostras derivatizadas (Figura 4). Portanto, a etapa de derivatização dos fitosteróis foi retirada do procedimento adotado neste trabalho.
A condição cromatográfica estabelecida para determinação de fitosteróis e o uso de coluna capilar de sílica fundida de polaridade média (LM-5 - 5% fenil 95% metil polisiloxano, 30m x 0,25mm x 0,3 µm), mostraram-se eficientes, pois obteve-se ótima resolução dos picos dos componentes esterólicos.
Testes complementares mostraram que, no caso de amostras de azeite de oliva com picos que antecedem o pico de padrão interno, há indicativo da presença de tocoferóis. Contudo, não há dúvidas de que a separação dos componentes esterólicos não sofre interferência de outros compostos, uma vez que o processo cromatográfico utilizado na metodologia mostrou-se eficaz na resolução dos analitos.
A Figura 5 representa um cromatograma obtido a partir da avaliação do comportamento de uma mistura de padrões de Tocoferol, analisado para certificar a não interferência destes compostos na identificação dos esteróis. A Figura 6 representa um cromatograma da fração esterólica de um azeite de oliva, que não foi isolada perfeitamente. No entanto, os compostos presentes não interferiram na determinação e quantificação dos esteróis presentes.
3.3 Quantificação dos fitosteróis
O u s o d e s o l u ç ã o d e p a d r ã o i n t e r n o (Dihidrocolesterol) desde o início da preparação da fração insaponificável constitui-se em uma medida que garante a correção das perdas decorrentes das várias etapas da metodologia, o que possibilita também a quantificação dos componentes esterólicos.
Segundo LOGNAY e colaboradores (1992), para a determinação de esteróis em óleos vegetais é necessário o uso de padrão interno antes da etapa de saponificação, a uma concentração apropriada, de modo que a altura do seu pico seja proporcional ou semelhante à do composto a ser determinado.
Conforme a legislação vigente, o teor individual para os fitosteróis é dado em porcentagem, ficando a quantificação em mg/ kg de azeite expressa apenas para esteróis totais. Portanto, a quantificação dos fitosteróis em óleos vegetais é obtida calculando-se o percentual de cada componente, tendo
Coluna LM-5 (5% fenil 95% metil polisiloxano, 30m x 0,25mm x 0,3 µm), em isoterma de 300ºC. PI: padrão interno. Outros= sitostanol + delta 5-avenasterol + delta 5,24-estigmastadienol
Coluna LM-5 (5% fenil 95% metil polisiloxano, 30m x 0,25mm x 0,3 µm), em isoterma de 300ºC. como 100% a somatória das áreas de todos os picos de
esteróis, ou correlacionando a área do pico do padrão interno, de concentração conhecida, com a somatória das áreas dos picos de esteróis, obtendo-se deste modo a quantidade de esteróis totais em mg por quilograma de óleo analisado.
3.4 Aplicação da metodologia em amostras de azeite de oliva
Vinte e cinco marcas de azeite de oliva foram avaliadas quanto a sua composição em fitosteróis e a identificação dos componentes foi realizada mediante
Figura 4 Cromatograma de mistura de padrões de esterol e padrão interno (PI) sem derivatização, obtido por cromatografia em fase gasosa com coluna LM-5.
Figura 5 Cromatograma de uma mistura de padrões de tocoferol, determinados nas mesmas condições utilizadas para a determinação dos fitosteróis em azeite de oliva.
Coluna LM-5 (5% fenil 95% metil polisiloxano, 30m x 0,25mm x 0,3 µm), em isoterma de 300ºC. ND: composto não determinado; PI: padrão interno; Outros: sitostanol + delta 5-avenasterol + delta 5,24-estigmastadienol
Coluna LM-5 (5% fenil 95% metil polisiloxano, 30m x 0,25mm x 0,3 µm), em isoterma de 300ºC. PI= padrão interno; Outros= Sitostanol+ delta 5-avenasterol+ delta 5,24- estigmastadienol
comparação com o tempo de retenção dos padrões injetados isolados ou em mistura (Figura 4).
O percentual dos principais fitosteróis presentes nas amostras de azeite de oliva analisadas está disposto na Tabela 4, segundo a categoria expressa na embalagem do produto.
De acordo com a legislação, para se quantificar beta-sitosterol em azeite de oliva, deve-se somar as áreas dos picos correspondentes ao delta-5,23-estigmastadienol, colesterol, sitosterol, sitostanol, delta 5-avenasterol e delta-5,24-estigmastadienol a fim de se obter um teor mínimo de 93%.
Figura 6 Cromatograma da fração esterólica de um azeite de oliva contendo tocoferóis (ND) como contaminantes da banda isolada durante a extração dos fitosteróis da matéria insaponificável.
Segundo ANTONIASSI e colaboradores (1998), a adulteração de azeite de oliva virgem pela adição de óleos de sementes pode ser identificada pelo aumento dos teores de campesterol e estigmasterol e redução do teor de beta-sitosterol.
Os resultados encontrados são valores médios de duplicatas de cada marca analisada por uma única injeção, apresentando um coeficiente de variação menor que 10% entre as duplicatas. Os cromatogramas obtidos apresentaram boa
CATEGORIA
AZEITE
DE OLIVA
EXTRA
VIRGEM
AZEITE DE
OLIVA
AZEITE DE
OLIVA
PURO
AMOSTRAS
A
B1
D1
D2
E1
F1
H
L1
M
N1
N2
P1
R1
T
D3
D4
J
L2
P2
Q
R2
S
B2
E2
F2
Campesterol (%)
2,3
2,4
2,5
2,2
2,5
2,6
2,5
2,8
3,0
2,3
3,0
3,8
2,4
3,3
2,8
2,8
2,4
2,5
3,5
3,1
2,6
3,0
2,5
3,2
2,8
Estigmasterol (%)
0,7
0,4
0,5
0,7
0,6
0,7
0,6
0,6
0,6
1,0
0,6
1,2
0,6
0,7
0,9
1,0
1,2
0,7
1,0
1,1
1,5
1,5
1
0,8
0,7
Beta-sitosterol (%)*
96,4
93,6
95,0
95,0
93,0
95,0
96,4
96,1
95,7
93,0
95,5
93,9
94,5
93,0
94,0
95,2
95,0
94,0
88,0
95,0
94,0
95,0
96,0
95,3
94,5
(*) Soma de delta-5,23-estigmastadienol+ colesterol+ sitosterol+ sitostanol+ delta 5-avenasterol+ delta-5,24-estigmastadienol (ANVISA) Valores sublinhados e em negrito se encontram fora dos limites recomendados.
Tabela 4 Percentual dos principais fitosteróis presentes em 25 marcas de azeite de oliva disponíveis no comércio de Campinas, agrupadas conforme categoria apresentada na rotulagem.
separação dos componentes, o que não ocasionou dificuldade na identificação dos compostos mediante injeção prévia de soluções padrão (Figura 7).
A ANVISA (2000) determina que o percentual de Campesterol em azeites de oliva deve ser de no máximo 4%, o de Estigmasterol deve ser inferior ao de Campesterol e um mínimo de 93% para Beta-sitosterol e isômeros. Logo, pode-se observar que as marcas aqui avaliadas mostraram-se dentro dos limites estabelecidos, ficando abaixo dos teores
AMOSTRAS
A
B1
D1
D2
E1
F1
H
L1
M
N1
N2
P1
R1
T
mg/kg
1576
1779
1695
1211
1656
1388
1680
1702
1527
1727
1947
2187
1621
1462
AMOSTRAS
D3
D4
J
L2
P2
Q
R2
S
mg/kg
1619
1512
1442
1516
2292
1434
1293
1694
AMOSTRAS
B2
E2
F2
mg/kg
1541
1535
1572
CATEGORIA DO AZEITE DE OLIVA
EXTRA VIRGEM
AZEITE DE OLIVA
AZEITE DE OLIVA PURO
Esteróis totais
Esteróis totais
Esteróis totais
recomendados apenas a marca P2, procedente da Argentina e identificada como “Azeite de Oliva”.
Também foi determinada a quantidade de esteróis totais nestas 25 amostras de azeite de oliva e os resultados estão disponíveis na Tabela 5, respeitando a classificação dos azeites mencionada nos rótulos das embalagens.Tabela 5- Teor de esteróis totais em 25 marcas de azeite de oliva disponíveis no comércio de Campinas, agrupados conforme categoria do azeite presente na rotulagem.
Segundo a legislação brasileira (ANVISA, 2000), o limite mínimo para todas as categorias de azeite é de 1000 mg/ kg, ficando fora desta regra apenas os óleos obtidos por extração com solvente do bagaço e/ou caroço da azeitona que devem possuir um teor mínimo de 1800 mg/ kg. Com base neste limite, os azeites das marcas N2, P1 e P2 apresentaram teor elevado para esteróis totais, indicando fraude por adição de óleo de bagaço de oliva. Além disso, o azeite da marca P2 já foi considerado adulterado com outro óleo vegetal por apresentar teor de beta-sitosterol abaixo do recomendado para azeite de oliva legítimo.
A aplicação da metodologia de quantificação de fitosteróis na avaliação da qualidade de amostras de azeite de oliva mostrou ser um bom exercício da técnica, sendo possível detectar adulteração em três azeites (N2, P1 e P2), das 25 marcas avaliadas.
Por se tratar de um produto caro, bastante apreciado pelo brasileiro e por não existir até o momento órgãos competentes que apliquem esta metodologia como rotina de trabalho na avaliação de pureza e qualidade do azeite de oliva, torna-se comum a adulteração deste produto com outros óleos vegetais, ou com azeite de oliva de qualidade inferior. A aplicação desta técnica na avaliação da qualidade e legitimidade dos azeites comercializados no país é um instrumento de interesse para os órgãos de vigilância, tendo em vista que todo o azeite consumido no Brasil é importado da Europa ou Argentina.
4. CONCLUSÕES
Tabela 5 Teor de esteróis totais em 25 marcas de azeite de oliva disponíveis no comércio de Campinas, agrupados conforme categoria do azeite presente na rotulagem.
ABIDI, S. L. Chromatographic analysis of plant sterols in foods and vegetable oils (Review). Journal of Chromatography A, Amsterdam, v. 935, p. 173-201, 2001.
ANTONIASSI, R.; PEREIRA, D. A.; SZPIZ, R. R.; JABLONKA, F. H.; LAGO, R. C. A. Avaliação das características de identidade e qualidade de amostras de azeite de oliva. Brazilian Journal of Food Technology, Campinas, v. 1, n. 1, 2, p. 32- 43, jan/ dez,1998.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº 482, de 23 de setembro de 1999, Brasília, nº 3029, publicada em 20/06/2000.
CHRISTY, A. A.; KASEMSUMRAN, S.; DU, Y.; OZAKI,Y. The detection on quantification of adulteration in olive oil by near- infrared spectroscopy and chemometrics. Analytical Sciences, v. 20, p. 935-940, 2004.
GARCÍA-GONZÁLES, D. L.; MANNINA, L.; D'IMPERIO, M.; SEGRE, A. L.; APARICIO, R. Using 1H and 13C NMR techniques and artificial neural networks to detect the adulteration of olive oil with hazelnut oil. European Food Res Technol, v. 219, p. 545-548, 2004.
LOGNAY, G.; SEVERIN, M.; BOENKE, A.; WAGSTAFFE, P. J. Edible fats and oils reference materials for sterols analysis with particular attention to cholesterol. Part 1- Investigation of some analytical aspects by experienced laboratories. Analyst, London, v. 117, p. 1093- 1097, 1992.
LÓPEZ-DÍEZ, E. C.; BIANCHI, G.; GOODACRE, R. Rapid quantitative assessment of the adulteration of virgin olive oils with hazelnut oils using Raman spectroscopy and chemometrics. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, p. 6145-6150, 2003.
Regulamento (CE) nº 1989/2003 DE LA COMISIÓN de 6 de noviembre de 2003 por el que se modifica el Regulamento (CEE) nº 2568/91 relativo a las características de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus métodos de análisis.
SAYAGO, A.; MORALES, M. T.; APARICIO, R. Detection of hazelnut oil in virgen olive oil by a spectrofluorimetric method. European Food Res Technol, v. 218, p. 480-483, 2004.
TOIVO, J.; PIIRONEN, V.; KALO, P.; VARO, P. Gas chromatographic determination of major sterols in edible oils and fats using solid- phase extraction in sample preparation. Chromatographia, v. 48, n. 11/12, p. 745- 750, 1998.
TRUJILLO-QUIJANO, J. A.; COSTA, P. Critérios de pureza em azeites de oliva. Óleos & Grãos. São Caetano do Sul, ano V, p. 17-24, jan/fev, 1995.
