As proteínas são macromoléculas complexas, compostas de aminoácidos, e necessárias para os processos químicos que ocorrem nos organismos vivos. Estas moléculas especiais realizam as mais variadas funções no nosso organismo, desde o transporte de nutrientes e metabólitos à catálise de reações biológicas. São os constituintes básicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa “em primeiro lugar”.
As proteínas têm muitas funções importantes no organismo humano. São os principais componentes dos tecidos estruturais como a pele e o colágeno, encontrados em tecidos conjuntivos como tendões e ligamentos. O sangue necessita das proteínas para os glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e numerosos compostos do plasma. A imunidade do seu corpo também depende das proteínas, que são necessárias para a formação dos anticorpos e dos glóbulos brancos que combatem as doenças. As enzimas e os hormônios (por exemplo, a insulina) também são proteínas (ISTOÉ, 2002).
A deficiência de proteínas na dieta já foi um sério problema no passado, principalmente nos países em desenvolvimento, onde havia grande escassez de alimentos protéicos. Uma provável solução que tem diminuído esse fato é a utilização de fontes alternativas de proteínas e o desenvolvimento de tecnologias que permitem o melhor aproveitamento dos produtos protéicos ou das proteínas tradicionais.
A proteína de origem animal, pela sua qualidade nutricional, pode ser o foco para o desenvolvimento de tecnologias que permitam seu melhor aproveitamento. Nesse sentido, os concentrados de proteínas, a silagem enzimática e os isolados e hidrolisados de proteínas de pescado parecem ser promissores (KRISTINSSON e RASCO, 2000a). A produção mundial de pescado é de aproximadamente 130 milhões de toneladas por ano, sendo que 970 mil toneladas são capturadas no Brasil, das quais mais de 50% são considerados de baixo valor comercial ou subprodutos. Na região de Rio Grande, no sul do Brasil, cerca de 45 a 60 mil toneladas de pescado são capturadas por ano, correspondendo a 4,5 - 6% do total nacional. (FAO, 2005).
A aplicação de tecnologia enzimática para a transformação da carne de pescado em uma nova fonte protéica é um método alternativo para o melhor aproveitamento de espécies sem valor comercial, a fim de recuperar e modificar as proteínas para a produção de diversos ingredientes alimentícios e produtos de uso industrial. Para que esses produtos possam ser aplicados com êxito, é necessário conhecer as propriedades funcionais, que estão diretamente relacionadas com as características sensoriais e de textura dos alimentos adicionados de hidrolisados. O conhecimento das propriedades funcionais específicas dos hidrolisados tende a facilitar o
direcionamento da sua aplicação, contribuindo para um melhor aproveitamento, resultando em produtos de maior qualidade tecnológica e nutricional (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
A hidrólise de proteínas pode ser realizada com enzimas, ácidos ou álcali, mas a hidrólise enzimática é mais indicada que métodos químicos para a produção de hidrolisados com aplicações nutricionais. A modificação enzimática das proteínas, usando preparados de enzimas proteolíticas selecionadas para clivar ligações peptídicas específicas, é amplamente utilizada na indústria de alimentos (LAHL e BRAUN, 1994).
As propriedades funcionais de maior interesse para a indústria de alimentos são a solubilidade, a capacidade de retenção de água, a capacidade de emulsificação e de formação de espuma e ainda as propriedades sensoriais. Pela modificação das condições de reação enzimática das proteínas, é possível produzir hidrolisados com diferentes características funcionais (KRISTINSSON e RASCO, 1998).
Através da hidrólise da proteína de pescado, empregando proporções enzima/substrato e tempos de reação adequados, é possível produzir hidrolisados com estruturas moleculares e propriedades funcionais diferentes que podem encontrar
aplicações em vários produtos alimentícios. (KRISTINSSON e RASCO, 2000a),
Com o crescimento da população mundial e a pesca perto de exceder os limites sustentáveis de mais de 100 milhões de toneladas a cada ano, é extremamente importante que a utilização dos recursos marinhos se dê com mais precaução e inteligência, considerando que a demanda de produtos alimentícios será cada vez maior, principalmente por aqueles com proteína de alto valor nutricional e valor tecnológico
agregado (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
O município de Rio Grande é considerado uma área tradicional de captura de pescado e abriga diferentes indústrias pesqueiras que são responsáveis por parte do descarte de subprodutos da pesca (BRASIL, 2005).
Alguns dos subprodutos do processamento são espécies de baixo valor comercial, destinadas, na sua maioria, para fabricação de farinha de pescado juntamente com os demais resíduos da indústria, ou então são descartados no meio ambiente. Muitas indústrias processadoras de pescado investem parte do que arrecadam tratando seus subprodutos antes de descartá-los no oceano, por exemplo (KRISTINSSON e RASCO, 2000a). Porém, para que a indústria desenvolva processos para recuperar e
utilizar subprodutos, é necessário que os mesmos sejam viáveis e melhores que o seu
descarte (KRISTINSSON e RASCO, 2000b).
A possibilidade de recuperação e modificação das proteínas do músculo de pescado mediante hidrólise enzimática justifica o estudo das características físico-químicas que permitem o uso destes materiais como ingredientes funcionais. A utilização
de enzimas para hidrolisar proteínas alimentares é um processo empregado para aperfeiçoar ou modificar as propriedades funcionais, físico-químicas e sensoriais das proteínas nativas, sem comprometer seu valor nutritivo, melhorando sua absorção.
O conhecimento da relação do grau de hidrólise com alguma característica funcional específica do hidrolisado, permite elaborar produtos com propriedades funcionais previamente definidas. (SHAHIDI e KAMIL, 2001).
Diante disso, este estudo buscou oferecer uma alternativa à indústria em relação ao aproveitamento de biomassa de pescado, agregando valor à mesma através de processos economicamente acessíveis, visando sua aplicação em produtos amplamente consumidos, através do melhoramento de suas propriedades funcionais.
A partir destas considerações este trabalho teve como objetivo geral estudar a influência do grau de hidrólise enzimática sobre as propriedades funcionais de hidrolisados protéicos obtidos a partir de corvina (Micropogonias furnieri) com a utilização da enzima proteolítica Alcalase. Para isso, os objetivos específicos foram:
- Definir as condições da reação enzimática, (pH, tempo e temperatura), utilizando corvina como substrato e alcalase como enzima;
- Realizar reações enzimáticas com variação de fatores de maior influência para obtenção de hidrolisados com diferentes graus de hidrólise;
- Obter hidrolisados de corvina com diferentes graus de hidrólise para a avaliação das propriedades funcionais;
- Avaliar as propriedades funcionais de interesse tecnológico: solubilidade, capacidade de formação de espuma, capacidade emulsificante e capacidade de retenção de água e de óleo dos diferentes hidrolisados obtidos;
- Verificar como o grau de hidrólise influi sobre as propriedades funcionais medidas.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Pescado
Entende-se como pescado fresco, o produto obtido de espécies saudáveis e de qualidade adequada ao consumo humano, convenientemente lavado e que seja conservado somente pelo resfriamento a uma temperatura próxima a do ponto de fusão do gelo. O pescado é um importante elemento da dieta humana, pois é uma fonte de diversos componentes com elevado valor nutricional, como as proteínas, e os ácidos graxos da série ômega-3, que trazem inúmeros benefícios à saúde (BRASIL, 1997). 2.1.1 Consumo e produção de pescado
Recentemente estudos científicos veiculados em vários periódicos internacionais apontam para um colapso na pesca de recursos marinhos costeiros, em nível internacional. Na costa do Brasil, a tendência a diminuição da disponibilidade de pescado acompanha a restante do planeta. O Brasil apresenta um dos mais baixos índices de consumo de pescado. Este índice, dentre outros fatores, provalvemente deve-se à falta de conhecimento da importância do pescado na alimentação. As perspectivas da demanda mundial de pescado para consumo humano direto são determinadas pelo crescimento da população, mudanças de ingresso per capita e ritmo da urbanização (NEIVA, 2005).
Segundo a FAO (2005), a proteína de origem animal mais consumida mundialmente é o pescado, no entanto o Brasil apresenta um baixo consumo (6,7kg/per capita/ano), sendo que no Rio Grande do Sul este índice é ainda menor (2kg/per capita/ano), mais especificamente no sul do Rio Grande do Sul, o consumo é de 0,5 kg/per capita/ano, tendo-se o tradicionalismo e o nível cultural da população da região como os principais motivos do baixo consumo. Este índice torna-se um pouco mais elevado nas capitais (em torno de 15kg/per capita/ano), mas ainda baixo se comparado com outros países, onde o consumo de pescado pode chegar a mais de 40kg/per capita/ano.
Espécies de pescado de baixo valor comercial vêm sendo amplamente estudadas com a finalidade de transformar essa matéria-prima em produtos aceitáveis pela população, conduzindo a um maior consumo.
2.1.2 Corvina (Micropogonias furnieri)
A corvina (Micropogonias furnieri), é considerada um dos mais importantes recursos costeiros da plataforma sul do Brasil, podendo atingir 70 cm de comprimento. Apresenta ampla distribuição geográfica ocorrendo no Atlântico desde o México até a Argentina (ELSDON e GILLANDERS, 2002). O tamanho mínimo para captura da corvina
é de 25cm medido da extremidade da cabeça até a nadadeira caudal (BRASIL, 2003).
Possui grande tolerância às variações de salinidade, o que facilita a alimentação e melhores condições para proteger-se de predadores (CASTELLO, 1986). É um peixe onívoro e prefere uma dieta baseada em pequenos crustáceos como caranguejos e camarões (COSTA e ARAÚJO, 2003).
No ciclo de vida desta espécie os indivíduos jovens migram para as áreas estuarinas e os adultos alcançam o litoral para reproduzir. Dessa forma, o tamanho da população de corvina varia de um ano para outro em conseqüência da migração, a qual também ocorre devido a disponibilidade de alimento (COSTA e ARAUJO, 2003)
Segundo Badolato et al. (1994), a composição proximal da corvina varia em função das estações do ano, apresentando uma oscilação de 77,2 a 83,8% para o teor de umidade, 14,5 a 20,7% para proteína, 0,8 a 1% de gordura e 1 a 1,2% de cinzas. Estas variações também podem ocorrer devido a fatores como sexo, tamanho, ciclo reprodutor e alimentação. Yeannes e Almandos (2003), avaliando a composição química de diferentes espécies de peixes nacionais encontraram para a corvina valores médios de 79,1% para umidade, 19,2% de proteína, 1% de cinza e 0,8% de lipídios.
Esta espécie apresenta baixo rendimento no que se refere ao filé. Gonçalves e Passos (2003), utilizando a corvina (Micropogonias furnieri) na elaboração de produtos reestruturados encontraram rendimento de 32% para o filé, valor próximo ao encontrado por Stori (2000), que foi de 34,8%. Enquanto que Bruschi (2001), estudando o rendimento, composição química e perfil de ácidos graxos de pescados e seus resíduos obteve rendimento de 36% para o filé da corvina, valor este baixo considerando outras espécies como a pescada, sardinha e atum que apresentaram rendimentos 44%, 51% e 52% respectivamente. O rendimento do filé de corvina é baixo restando o resíduo que contém cerca de 10% de carne.
A utilização da corvina como matéria-prima se deve pela mesma ser considerada de baixo valor comercial. A espécie apresenta duas fases no seu desenvolvimento. Na primeira fase, quando jovem, possui uma carne branca e macia, mas na segunda fase, quando adulta, possui carne amarelada e mais rígida, e contaminada por cestóides que migram do intestino do pescado para o músculo, causando uma proteólise indesejada no
mesmo, o que leva a corvina a ser pouco aproveitada (GONÇALVES e PASSOS, 2003). O aspecto da corvina pode ser observado na Figura 1.
Figura 1: Corvina (Micropogonias furnieri) 2.2 Proteínas
Todas as proteínas são compostas de aproximadamente 20 aminoácidos, sendo que a proporção dos mesmos varia conforme a característica da fonte de proteína. A qualidade nutricional de qualquer proteína está ligada à sua composição de aminoácidos, digestibilidade e capacidade de fornecer aminoácidos essenciais nas quantidades requeridas pela espécie que consome a proteína. As proteínas são nutrientes essenciais aos organismos animal e humano, devendo estar presentes na alimentação em quantidades adequadas. Além do aspecto quantitativo, deve-se levar em conta o aspecto qualitativo das proteínas, ou seja, seu valor nutritivo (SGARBIERI, 1996).
Sabe-se que as proteínas fornecem aminoácidos, que são os elementos que as compõem. São usados para a formação de músculos e outros componentes do corpo que contêm proteínas, incluindo imunoglobulinas, albuminas, enzimas e hormônios. O organismo sintetiza aminoácidos não essenciais, enquanto outros que são essenciais precisam ser fornecidos por fontes alimentares. As proteínas e outros compostos contendo nitrogênio são constantemente degradados e reconstruídos. Todas essas perdas devem ser repostas por um suprimento contínuo de aminoácidos fornecidos pela dieta.
Cada animal, incluindo o homem, deve ter uma fonte adequada de proteínas para crescer e se manter. Como as proteínas são os constituintes principais de tecidos ativos do organismo, e este por sua vez depende das proteínas alimentares, a qualidade e quantidade destas substâncias indispensáveis são de grande importância para a dieta diária (MITCHELL et al., 1978). Em muitas partes do mundo, sobretudo nos países em desenvolvimento, as fontes alimentares de proteína especialmente proteínas de boa qualidade, são muito escassas. As proteínas há muito tempo foram reconhecidas como elementos estruturais indispensáveis de cada célula do organismo. No seu papel como enzimas, as proteínas controlam a degradação dos alimentos, para fornecerem energia e para síntese de novos compostos a fim de manter e reparar tecidos do corpo
(ROBINSON, 1991). Cada tipo de proteína possui uma estrutura molecular única que determina suas propriedades funcionais, em conjunto com as condições ambientais nas quais se apresentam tais propriedades (DEMETRIADES et al., 1997).
2.2.1 Proteínas do Pescado
O músculo de pescado, assim como o de outras espécies, é composto de proteínas de elevado valor nutritivo por conter alta proporção de aminoácidos essenciais, principalmente aqueles que são limitantes em proteínas de origem vegetal, como por exemplo, a lisina, um aminoácido limitante em cereais e farinha de trigo. (OGAWA e
MAIA, 1999; SGARBIERI, 1996). O músculo do pescado contém dois grupos principais
de proteínas: as proteínas solúveis do sarcoplasma e as proteínas estruturais das miofibrilas. Os principais componentes das proteínas estruturais são: actomiosina, tropomiosina, miosina e actina. As proteínas miofibrilares representam de 66 a 77 % das proteínas totais do músculo do pescado e apresentam alta funcionalidade quando comparadas com as proteínas sarcoplasmáticas (SIMÕES et al.,1998; CONTRERAS-GUZMÁN, 1994). As proteínas presentes em vísceras e cartilagens apresentam em geral, balanço de aminoácidos inferior ao das proteínas miofibrilares. No entanto, em produtos de pescado, a qualidade da proteína irá variar dependendo, da proporção de proteínas musculares neles contida (OGAWA e MAIA, 1999; SGARBIERI, 1996).
Segundo Ogawa e Maia (1999), a composição protéica da carne de pescado pode variar em função da espécie, tamanho, sexo, época do ano, entre outros. Porém, geralmente o músculo contém cerca de 20% de proteína. Ressalte-se que este percentual é um pouco menor na carne escura do que na carne branca, verificando-se o contrário em relação aos lipídeos. Bioquimicamente sabe-se que o músculo escuro tem maior proporção de proteína sarcoplasmática e do estroma que o músculo branco e que o conteúdo de glicogênio é mais alto em carnes escuras, e por isso, no rigor mortis, o pH atinge valores menores, na faixa de 5,6 a 6,0, comparado com o músculo branco com valores de 6,0 a 6,4.
Também o músculo escuro é mais rico em lipídeos, em taurina e em Fe, contendo mais nitrogênio extrativo, sobretudo histidina (OGAWA e MAIA, 1999). As proteínas sarcoplasmáticas representam aproximadamente 20-25 % da proteína total do músculo, são solúveis em água e como principais características estão a sua capacidade de adesão às proteínas miofibrilares, impedindo a formação de gel de alta elasticidade, baixa viscosidade, baixa capacidade de retenção de água e baixa capacidade de
particular atenção deve ser dada a preservação de aminoácidos sulfurados, uma vez que a concentração destes aminoácidos não é muito alta nas proteínas do pescado.
As proteínas miofibrilares são as proteínas contidas nas células musculares, formadoras dos tecidos esqueléticos e em grande parte, responsáveis pelo fenômeno de contração muscular. Do ponto de vista alimentar, as proteínas miofibrilares são as principais proteínas do músculo do peixe, e representam 10% do peso do músculo estriado e 60 a 75% do conteúdo de proteína total do músculo. A miosina e actina, que contribuem com cerca de 75% do total das proteínas miofibrilares, são responsáveis pela contração e relaxamento muscular (OGAWA e MAIA, 1999).
Segundo este mesmo autor, particular atenção deve ser dada na preservação de aminoácidos sulfurados, uma vez que a concentração destes aminoácidos não é muito alta nas proteínas do pescado. Conforme Shahidi e Kamil (2001), as proteínas de pescado podem ser utilizadas para diversos fins:
- fortificar o valor nutritivo de alimentos à base de cereais;
- preparação de pós e hidrolisados como agentes dietéticos e hipoalergênicos
e como ração animal;
- fornecer de maneira adequada a utilização de proteínas não-lácteas em
substitutos do leite para indivíduos jovens;
- contribuir para as propriedades atrativas de ração animal.
2.3 Enzimas
Enzimas são catalisadores bioquímicos essenciais para sobrevivência, pois aceleram reações químicas entre constituintes orgânicos das células. Existe uma grande variedade de enzimas disponíveis comercialmente que diferem em relação à fonte biológica, atividade, pureza, forma física e características tais como pH e temperatura ótima, além de seu preço. As enzimas utilizadas pela indústria de alimentos e em pesquisas são predominantemente as hidrolases, a maioria carboidrases, seguido das proteases e lípases. (WHITAKER, 1994).
Na ciência e tecnologia de alimentos, as enzimas são exploradas para realizar determinadas funções em processos e análises facilitando a conversão de matérias-primas em alimentos de alta qualidade. As enzimas tornam isso possível porque seu sítio ativo é altamente específico para certos substratos. As enzimas agem de maneira específica, formando um complexo com o substrato catalisando sua transformação
(KRISTINSSON e RASCO, 2000b).
A hidrólise de proteínas alimentares se dá por várias razões, incluindo características de melhoramento nutricional, retardamento da deterioração, aumento ou
diminuição da solubilidade, aumento de propriedades espumantes ou coagulantes, aumento da capacidade emulsificante, prevenção de interações indesejáveis, remoção de sabores ou odores e ingredientes tóxicos ou inibidores (LAHL e BRAUN, 1994).
2.3.1 Enzimas proteolíticas
As enzimas proteolíticas, proteases ou proteinases pertencem ao grupo das hidrolases as quais têm em comum o envolvimento da água na formação do produto. As proteinases catalisam a reação de hidrólise das ligações peptídicas das proteínas, ocorrendo a transferência de componentes do substrato para a água. Estas enzimas podem ter origem animal, vegetal ou microbiana (WHITAKER, 1994).
As proteases estão presentes entre as enzimas mais estudadas. Preparados de enzimas proteolíticas são economicamente, o mais importante grupo de enzimas e seu uso está bem estabelecido na indústria de alimentos. As proteases são caracterizadas de acordo com a especificidade de ligações peptídicas atacadas e o seu mecanismo de
ação (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
As enzimas proteolíticas derivadas de plantas e microrganismos são as mais apropriadas para o desenvolvimento de hidrolisados protéicos de pescado. As enzimas utilizadas na hidrólise da proteína de pescado possuem pelo menos uma característica em comum que é fazerem parte da categoria dos alimentos, e, se forem de origem microbiana, o organismo produtor tem que ser não-patogênico. A escolha da enzima é normalmente determinada pela combinação entre eficácia e economia (KRISTINSSON e
RASCO, 2000a). A hidrólise de proteínas de pescado com enzimas proteolíticas
selecionadas, possibilita o controle do grau de hidrólise da proteína do substrato. Usando proporções enzima-substrato e tempos de reação adequados é possível produzir hidrolisados com diferentes estruturas moleculares e diferentes propriedades funcionais que podem encontrar aplicações em vários produtos alimentícios (ONODENALORE e SHAHIDI, 1996).
Quatro principais classes de proteases são conhecidas, sendo denominadas pelo grupo funcional principal no seu sitio ativo: serina, tiol, carboxil e metalo. As proteases são caracterizadas em endoproteinases e exopeptidases. As endoproteinases hidrolisam as ligações peptídicas nas moléculas de proteínas, geralmente em resíduos específicos a fim de produzir peptídeos relativamente grandes. As exopeptidases
removem sistematicamente aminoácidos do nitrogênio terminal chamadas
aminopeptidases ou do carbono terminal chamadas carboxipeptidases. Para hidrolisar proteínas alimentares, geralmente são usadas endoproteinases, ocasionalmente combinadas com exopeptidases para realizar uma degradação completa (KRISTINSSON
e RASCO, 2000a). No processo de hidrólise, as enzimas proteolíticas são utilizadas para
solubilizar a proteína muscular do pescado, resultando em duas fases distintas, a solúvel e a insolúvel. A fração insolúvel é utilizada como ração animal, enquanto que a solúvel pode ser convertida em ingredientes e incorporada em alimentos. O hidrolisado solúvel pode ser submetido à desidratação, resultando numa forma mais estável, em pó, com alta concentração protéica. Tal produto é conhecido como hidrolisado protéico de pescado (DINIZ e MARTIN, 1996).
A Alcalase, uma enzima alcalina produzida por fermentação submersa de uma espécie selecionada de Bacillus licheniformis, desenvolvida pela Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dinamarca) para indústria de detergentes, tem sido estudada repetidamente por vários pesquisadores por ser uma das melhores enzimas usadas para preparar hidrolisados protéicos de pescado funcionais e outros hidrolisados protéicos (BENJAKUL e MORRISSEY, 1997; DINIZ e MARTIN, 1996; SHAHIDI et al., 1995). Apresenta atividade ótima à temperatura entre 50ºC e 70ºC, a valores de pH entre 6,0 e 10,0 (DINIZ e MARTIN, 1996).
As proteases que têm sido utilizadas na hidrólise das proteínas de pescado e que se encontram disponíveis no comércio são de diversas origens e apresentam máxima atividade proteolítica em variados pHs e temperaturas como observado na Tabela 1.
Tabela 1: Enzimas utilizadas na hidrólise de proteínas do pescado.
Protease Origem atividade proteolítica pH de máxima Temperatura (ºC) de máxima atividade proteolítica Microbiana
Alcalase Bacillus licheniformis 6,5-8,5 50-70
Neutrase Bacillus subtilis 5,5-7,5 45-55
Pronase Streptomyces griseus 7,0-9,0 37
Animal Quimiotripisina Bovina/suína 7,0-9,0 40 Pancreatina Bovina/suína 7,0-9,0 40 Pepsina Bovina/suína 2,0-4,0 40 Tripsina Bovina/suína 7,0-9,0 40 Vegetal
Bromelina Caule do abacaxi 5,0-8,0 50-60
Ficina Látex de figos 5,0-8,0 30-50
Papaína Mamão 5,0-7,0 65-80
2.3.2 Fatores relacionados com a hidrólise enzimática
O processo hidrolítico e as condições de reação diferem entre diferentes enzimas e substratos utilizados e também depende das propriedades desejadas para o hidrolisado. A temperatura e o pH do processo são normalmente ajustados para otimizar a cinética da enzima ou mistura de enzimas selecionadas. Uma protease comercial é adicionada em variadas concentrações dependendo da taxa de hidrólise necessária. Dada uma determinada enzima e um substrato em particular, qualquer processo de hidrólise envolve ao menos 5 variáveis independentes. Estas são, pH, temperatura, proporção enzima-substrato, concentração do substrato protéico em % ou unidades de
atividade por Kg, e tempo (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
2.3.2.1 pH
O pH do meio da reação é um fator importante na hidrólise enzimática. Este fator está em função da natureza dos grupos funcionais da enzima, principalmente os grupos dos sítios ativos da enzima, entretanto sofre influência da temperatura, pois influi no grau de associação/dissociação dos grupos funcionais. A força iônica do meio é outro fator que pode influir no pH em função da atividade iônica desse meio (WHITAKER, 1994).
A inativação química pode se dar tanto pela diminuição ou aumento do pH do meio, até um ponto onde as enzimas forem inativadas. Algumas enzimas são mais sensíveis para mudanças de pH do que para mudanças na temperatura. A alcalase é uma enzima relativamente termoestável, mas é muito sensível em pH ácido. A completa inativação da alcalase, portanto, é obtida pela redução do pH para o valor de 4 (SHAHIDI et al., 1995). Extremos de pH podem também, assim como temperaturas elevadas, ter efeitos negativos nas proteínas e peptídeos. Muitas proteínas se desdobram a valores de
pH menores que 5 e maiores que 10 (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
2.3.2.2 Temperatura
A temperatura é um dos fatores mais estudados na reação enzimática, e verifica-se que a temperatura da reação de hidróliverifica-se determina a atividade enzimática, portanto, recomenda-se utilizar temperaturas para máxima atividade das enzimas, ou utilizar um intervalo de temperatura em que a estabilidade das enzimas e dos substratos não seja comprometida (WHITAKER, 1994).
A temperatura na qual várias proteínas desnaturam e desdobram-se varia enormemente. Como as proteínas do músculo de pescado se adaptam a baixas temperaturas, elas não são estáveis ao calor. A desnaturação é normalmente indesejada porque resulta na alteração das propriedades físico-químicas, particularmente na perda
de solubilidade e funcionalidade da proteína (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
Os mesmos autores relatam que o término da reação enzimática pode ser um grande obstáculo na preparação de um hidrolisado protéico de pescado. A escolha do método de inativação deve ser cuidadosamente baseado na sensibilidade da enzima que está sendo estudada, em relação ao pH ou temperatura. Em alguns casos são utilizados uma combinação de temperatura elevada e pH baixo.
A inativação das enzimas é alcançada por meios químicos ou térmicos. Normalmente a pasta fluida do hidrolisado e as enzimas são transferidas para um banho quente, onde as enzimas são inativadas através da sua exposição a temperaturas entre 75 e 100°C por 5 à 30 minutos, dependendo do tipo de enzima (HOYLE e MERRITT, 1994).
2.3.2.3 Concentração enzima versus concentração de substrato
A relação enzima/substrato (E/S) é um fator importante na cinética da reação e influi também na recuperação do produto. A especificidade da enzima determina principalmente a natureza do produto, podendo resultar frações de diferentes pesos moleculares e conseqüentemente diferentes características funcionais. A natureza e o estado de desnaturação das proteínas do substrato são fatores determinantes na taxa de conversão da enzima influenciando na natureza do produto. Assim, podem resultar peptídeos de diferentes tamanhos ou, até mesmo, aminoácidos livres em função da natureza e do estado do substrato (WHITAKER, 1994).
Pelo aumento da concentração de proteases, até certo ponto e, desta forma, aumento do grau de hidrólise, a recuperação de nitrogênio solúvel aumenta. A concentração de substrato também possui efeitos negativos na recuperação das
proteínas. Linder et al. (1995), citados por Kristinsson e Rasco (2000a), encontraram que
mais de 8% de concentração protéica no sistema, sem considerar a enzima, pareceu ter um efeito inibidor na recuperação das proteínas.
Espécies de pescado magras, ou materiais derivados destas, são o substrato adequado para hidrólises enzimáticas, pois o problema de oxidação dos lipídios pode ser reduzido. O preparo de hidrolisado protéico de pescado com espécies gordas como arenque, sardinha e anchova, requererá tratamentos adicionais como centrifugação para
2.3.3 Grau de Hidrólise da reação enzimática
Segundo Panyam e Kilara (1996), a hidrólise enzimática da proteína resulta na diminuição do peso molecular, aumento do número de grupos ionizáveis e exposição de grupos hidrofóbicos que estavam protegidos na estrutura original da proteína.
Para acompanhar a cinética de reação e encontrar a medida da hidrólise, aplica-se o parâmetro chamado Grau de Hidróliaplica-se (GH). O critério quantitativo da reação de proteólise é o grau de hidrólise (NIELSEN e OLSEN, 2002), definido como a porcentagem de ligações peptídicas clivadas em relação ao total de ligações peptídicas (PILOSOF, 2000).
A vantagem de se usar o GH como parâmetro do processo é que o mesmo parece determinar, sem ambigüidade, as propriedades de um hidrolisado protéico para um dado sistema proteína-enzima. O GH demonstra tanto teórica como empiricamente que 4 variáveis do processo, substrato (S), proporção enzima/substrato (E/S), temperatura (T) e tempo (t), não precisam ser controladas, contanto que %GH seja
controlado. (ADLER-NISSEN, 1984, citado por KRISTINSSON e RASCO, 2000a). Assim,
fica claro que o GH é um método simples e rápido para medir a extensão da quebra das
proteínas (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
Quando o grau de hidrólise é atingido, é necessário terminar a reação enzimática. Isto é muito importante, caso contrário as enzimas continuam ativas no substrato hidrolisando as proteínas e es seguida os peptídeos (HOYLE e MERRITT, 1994).
Existem vários métodos de controle, mas sob condições industriais práticas existem poucos. O grau de hidrólise é mais comumente empregado para descrever a hidrólise de proteínas alimentícias.
2.4 Hidrolisados enzimáticos
Modificações químicas e enzimáticas têm sido usadas para melhorar as propriedades funcionais das proteínas (POMERANZ, 1991), no entanto, a hidrólise enzimática apresenta maiores benefícios e vantagens sobre a modificação química porque inclui a especificidade da enzima em relação ao substrato, havendo pouca probabilidade de ocorrer reações indesejáveis, que resultem na formação de produtos tóxicos, além de se processar sob condições mais brandas (PATEL et al., 1988).
Os hidrolisados protéicos são obtidos por ação enzimática ou por processo químico (ácido ou alcalino), obtendo-se uma mistura de peptídeos e aminoácidos. A hidrólise com enzimas é mais indicada para a produção de hidrolisados com aplicações
nutricionais, que métodos químicos. A hidrólise enzimática pode produzir hidrolisados com perfil de peptídeos bem definido, enquanto que as hidrólises ácida e alcalina podem destruir L-aminoácidos, produzindo D-aminoácidos e ainda formar substâncias tóxicas como lisino-alanina. Isso é especialmente crítico em hidrolisados protéicos, onde as proporções de aminoácidos, dipeptídeos e tripeptídeos são importantes para a absorção pelo organismo (LAHL e BRAUN, 1994). A hidrólise enzimática das proteínas musculares de pescado é caracterizada por uma rápida fase inicial, durante a qual, várias ligações peptídicas são hidrolisadas. Após, esta taxa de hidrólise enzimática decresce e atinge uma fase estacionária, na qual nenhuma hidrólise aparente ocorre (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
A hidrólise enzimática de proteínas de pescado é importante para o preparo de produtos com propriedades funcionais únicas e características benéficas relacionadas à saúde (SHAHIDI e KAMIL, 2001). Ela tem sido empregada para converter biomassa de pescado subutilizada, a qual é geralmente destinada à produção de ração animal ou fertilizantes, em produtos protéicos. Logo, a aplicação de tecnologia enzimática é um método alternativo para um melhor aproveitamento de espécies sem valor comercial, o que torna o custo baixo e eleva o valor protéico dos produtos disponíveis, sendo mais aceitáveis para o consumo humano, na forma de uma nova fonte alimentar (DINIZ e MARTIN, 1996).
Sampedro et al. (1986) consideraram que no processo de hidrólise enzimática se obtém duas frações, uma solúvel e outra insolúvel, sendo que a fração insolúvel pode ser usada como ingrediente para ração animal, enquanto o hidrolisado solúvel pode ser submetido à desodorização, concentração e desidratação, resultando em um pó mais estável, com alta concentração de proteína, normalmente denominado de hidrolisado protéico de pescado que pode ser utilizado como ingrediente para produtos alimentícios de consumo humano. Shahidi et al. (1995), descobriram que uma alta concentração de peptídeos solúveis de pescado na mistura reacional, liberados durante a fase inicial de hidrólise, reduz tanto a taxa de hidrólise quanto à recuperação das proteínas solúveis. Assim, a remoção de hidrolisado da mistura reacional deveria acentuar a taxa de hidrólise e a recuperação protéica.
Kristinsson e Rasco (2000a), informaram que a hidrólise protéica de pescado,
com enzimas proteolíticas selecionadas, fornece a possibilidade de controlar o grau de quebra da proteína no substrato, indicando como vantagens que a utilização de proporções enzima/substrato e tempos de reação adequados, permite a produção de hidrolisados com estruturas moleculares e propriedades funcionais diferentes, encontrando aplicações em várias formulações de alimentos.
A Figura 2 representa um processo típico de obtenção de hidrolisado protéico de
pescado sugerido por Kristinsson e Rasco (2000a).
Figura 2:Fluxograma do processo de obtenção de hidrolisado protéico de pescado. 2.5 Hidrolisados enzimáticos de pescado
A hidrólise de proteínas pode ser produzida com dois objetivos, alteração de propriedades funcionais e produção de pequenos peptídeos e aminoácidos para serem utilizados em alimentos dietéticos ou como agente flavorizante (KILARA, 1985). Shahidi et al. (1995), usaram Alcalase com sucesso para otimizar as condições de processo para produzir um hidrolisado protéico de capelin (Mallotus villosus). O hidrolisado produzido com alcalase exibiu uma recuperação superior da proteína comparada com as enzimas neutrase e papaína e também apresentou o menor conteúdo lipídico e propriedades funcionais excelentes.
Quaglia e Orban (1990), citados por Kristinsson e Rasco (2000b), estudaram
essas três enzimas sob condições ótimas de solubilização enzimática de proteína de sardinha. Os hidrolisados produzidos usando alcalase e papaína foram quase idênticos na recuperação de nitrogênio, que aumentou proporcionalmente com a concentração da
Matéria-prima
Homogeneização (ajuste pH e Temp.)
Fração Solúvel
Inativação (química/termicamente)
Desidratação
Hidrolisado Protéico de Pescado
Centrifugação Proteína não hidrolisada e
outros materiais insolúveis Enzimas
enzima. Os hidrolisados de alcalase e papaína apresentaram propriedades funcionais melhores e com maior valor nutricional do que com a neutrase.
As enzimas alcalase e neutrase foram estudadas por Benjakul e Morrissey (1997), em resíduo sólido branco de merluza em condições de pH 9,5 e 60°C e de pH 7,0, e 55°C. A alcalase teve uma atividade consideravelmente maior que a neutrase e produziu uma hidrólise mais eficiente. Condições ótimas para alcalase foram 20 unidades Anson (AU)/Kg, 1h de tempo de reação à 60°C e pH 9,5. O hidrolisado resultante teve um alto conteúdo protéico com excelente recuperação de nitrogênio superior a 70%, e uma composição de aminoácidos comparável ao músculo de pescado.
Novas enzimas têm mostrado um excelente potencial para hidrólise de proteínas de pescado para produção de hidrolisados protéicos de alta funcionalidade, incluindo a flavourzyme 1000L, fabricada pela Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark e a corolase
7089, da indústria Rohm Enzymes, Somerset, NJ. (KRISTINSSON e RASCO, 2000b).
Estudo de Hale (1969) reporta os efeitos de várias condições de processamento com enzimas proteolíticas comerciais avaliando o rendimento e a composição de hidrolisados protéicos de pescado solúveis em água. Ele concluiu que a hidrólise de abrótea crua com alcalase em pH 8,5 ou superior gerou o melhor balanço de aminoácidos essenciais e uma porcentagem maior de produto solúvel, seguido pelo hidrolisado obtido com pancreatina.
2.6 Efeito do grau de hidrólise nas propriedades funcionais de hidrolisados de pescado.
Uma das principais vantagens e objetivos da hidrólise enzimática das proteínas de pescado é modificar e melhorar suas propriedades funcionais. Essas propriedades dos hidrolisados protéicos de pescado são importantes especialmente se eles vão ser
usados como ingredientes de produtos alimentícios (GILDGERG, 1993). Existem
dois métodos para produzir hidrolisados a partir de proteínas de pescado, o processo autolítico e o processo de hidrólise acelerada. Em ambos os métodos as enzimas proteolíticas catalisam a ruptura hidrolítica das ligações peptídicas das proteínas e dos polipeptídios, produzindo peptídios de baixo peso molecular e/ou aminoácidos (MOHR, 1980; SIMPSON et al., 1991).
Estes dois métodos consistem em misturar o pescado moído com enzimas endógenas ou com proteases microbianas ou de vegetais incubadas em reatores sob condições ótimas de atividade enzimática. A escolha da enzima e das condições de processamento determinam as propriedades do produto, sendo que condições brandas como, períodos curtos de hidrólise e temperaturas moderadas são importantes para obter
propriedades emulsificantes e geleificantes dos produtos (MOHR, 1980; OWENS e MENDOZA, 1985).
A hidrólise prolongada e não controlada pode produzir peptídeos de cadeia curta com perda das propriedades funcionais das proteínas nativas, podendo contribuir desta forma com surgimento de um gosto amargo nos produtos obtidos. Por isso, o grau de hidrólise se torna importante na otimização dos parâmetros de processo no desenvolvimento do produto (VENUGOPAL e SHAHIDI, 1995). Em geral, as endopeptidases menos específicas das bactérias e dos vegetais, são mais eficientes na solubilização do músculo de pescado que enzimas mais específicas como pepsina e tripsina (MACKIE, 1982). Lahl e Braum (1994), verificaram que papaína, ficina e bromelina não foram seletivas quando comparadas com enzimas microbianas, que tendem a serem mais seletivas. Tanto a tripsina como a quimiotripsina apresentaram atividade de endo e exopeptidases com especificidade para clivar a ligação arginina-lisina.
Os mesmos autores citam como desvantagens que a hidrólise de proteína de lote comercial pode apresentar um alto custo pela utilização de grandes quantidades de enzimas, dificuldade no controle da extensão da reação (que pode resultar em produtos não-homogêneos, consistindo de frações de peso molecular variável), baixo rendimento, a necessidade de inativar enzimas pelo pH ou tratamento térmico no final das reações, (o que eleva os custos do processo) e ainda que as enzimas empregadas no processo não podem ser reutilizadas. Finalmente, eles consideraram que as operações do processo enzimático podem ser bem dimensionadas, desde que a especificidade da enzima, as condições da reação enzimática (temperatura, pH, meio reacional, tempo) e as condições da inativação da enzima sejam conhecidas.
2.7 Propriedades funcionais das proteínas
A funcionalidade das proteínas dos alimentos é definida como “aquelas propriedades funcionais e químicas que afetam o comportamento das proteínas nos alimentos durante o processamento, armazenamento, preparo e consumo” (KINSELLA, 1976). As propriedades físicas e químicas que governam a funcionalidade das proteínas incluem tamanho, forma, composição e seqüência de aminoácidos, carga líquida, distribuição das cargas, relação hidrofobicidade/hidrofilicidade a e capacidade de reagir com outros componentes. Tem se verificado, por exemplo, que a hidrólise de proteínas de pescado com proteases, resulta em produtos com melhores propriedades de solubilidade e melhores propriedades funcionais que dependem da solubilidade (DAMODARAM, 1996).
Sgarbieri (1998), explicou que o termo “funcionalidade” tem sido aplicado para se referir às propriedades não-nutritivas que conferem aos alimentos maior conveniência de manuseio, melhor aparência na apresentação e melhor aceitação pelo consumidor e que a maioria das propriedades funcionais influenciam o caráter sensorial de um alimento, em especial a textura. De acordo com este autor, a manifestação de funcionalidade, por certos componentes dos alimentos, irá depender de propriedades físicas e químicas desses componentes que são muito importantes para o preparo de determinados tipos de alimentos e sua aceitação pelo consumidor, como:
- Propriedades de hidratação, dependentes das interações com água como solubilidade, dispersibilidade, suculência, adsorção e retenção de água.
- Propriedades dependentes da interação entre macromoléculas e a água, como geleificação, textura, formação de estruturas viscoelásticas.
- Propriedades que dependem do tamanho e da forma das moléculas ou de partículas em suspensão como viscosidade, sensação tátil, modificada em função da transformação de material sólido em micropartículas.
- Propriedades que resultam da interação de um grande número de constituintes dos alimentos, tais como, a água, as proteínas, polissacarídeos como amido e componentes solúveis e insolúveis da fibra alimentar.
Mullally et al. (1995), informaram que a hidrólise enzimática da proteína de pescado gera uma mistura de aminoácidos livres, di-, tri-, e oligopeptídios, aumenta o número de grupos polares e a solubilidade do hidrolisado e, portanto, modifica as características funcionais das proteínas, melhorando suas qualidades funcionais e biodisponibilidade. A escolha do substrato e das proteases empregadas e o grau de hidrólise da proteína afetam as propriedades físico-químicas do hidrolisado resultante. A hidrólise de produtos com enzimas é um meio atraente de oferecer melhores propriedades funcionais e nutricionais às proteínas de alimentos. A Tabela 2 mostra algumas das mais importantes propriedades das proteínas e suas aplicações nos alimentos.
As propriedades funcionais das proteínas também são influenciadas por diversos parâmetros intrínsecos, além de fatores relacionados a metodologias utilizadas no seu estudo. Os dados disponíveis são bastante variáveis e muitas vezes conflitantes, devido a fatores interferentes como pH, força iônica, concentração de proteína e temperatura do meio (DUARTE et al,. 1998).
Tabela 2: Propriedades funcionais de proteínas nos alimentos e suas aplicações
Propriedade Aplicação
Emulsificação Carnes, molhos de salada
Hidratação Massas, carnes
Viscosidade Bebidas, massas
Geleificação Salsichas, sobremesas de geléia, queijos
Espumosidade Coberturas, merengues, pães-de-ló
Propriedades texturais Alimentos texturizados
Solubilidade Bebidas
Fonte: Sgarbieri,1998.
2.7.1 Solubilidade
A solubilidade é uma propriedade física e também funcional muito importante, além do que influi em outras propriedades funcionais, em graus diferentes (SGARBIERI, 1998). A solubilidade é provavelmente a propriedade funcional mais importante das proteínas e dos hidrolisados protéicos. Muitas das outras propriedades funcionais, como emulsificação e a formação de espuma, são afetadas pela solubilidade, sendo, portanto um excelente indicador da funcionalidade do hidrolisado protéico, do seu potencial e da
limitação de sua aplicação (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
Segundo Sgarbieri (1998), alguns dos fatores que afetam a solubilidade das proteínas são: pH, distribuição de cargas, força iônica ou concentração de sais, temperatura e natureza do solvente. O pH afeta a densidade e a distribuição das cargas na molécula da proteína de tal forma que no pH do ponto isoelétrico (pI), a proteína apresentará um mínimo de solubilidade, devido ao número de cargas positivas e negativas ser igual, portanto, elas se neutralizam intramolecularmente. Nessas condições, as moléculas de proteína apresentam menor afinidade pela água, atraindo-se mutuamente e formando uma massa insolúvel que precipita.
De acordo com o autor, à medida que o pH torna-se mais ácido ou mais alcalino, há predominância, respectivamente, de cargas positivas ou negativas, havendo interação mais forte das moléculas de proteína com a água e também uma maior repulsão entre moléculas de proteína, aumentando significativamente a solubilidade. A diferença de comportamento na solubilidade das proteínas se deve as propriedades físicas, químicas
e estruturais dessas proteínas. As proteínas miofibrilares de pescado possuem pI entre
Ele relata ainda, que a solubilidade aumenta abruptamente a partir de pH 11, sugerindo que essas proteínas poderão estar formando complexos insolúveis e que somente a predominância de cargas negativas em pHs fortemente alcalinos geram forças de repulsão eletrostática capazes de promover a dissociação dos complexos e solubilização.
A temperatura aumenta a solubilidade das proteínas até o ponto em que começa a ocorrer desnaturação térmica. A desnaturação da molécula da proteína coloca grupos hidrofóbicos em contato com o solvente, ocasionando diminuição de solubilidade, podendo haver coagulação e precipitação. Temperaturas acima de 50ºC podem provocar desnaturação e diminuição de solubilidade nas proteínas de acordo com o autor.
2.7.2 Capacidade de formação de espuma
As espumas alimentares consistem em gotas de ar dispersas e envolvidas em líquido que contém um surfactante que diminui a tensão interfacial e de superfície do líquido (KINSELLA, 1976). As propriedades de formação de espuma se relacionam com as propriedades de superfície que as proteínas apresentam (KRISTINSSON e RASCO,
2000a). A capacidade de formar espuma estável em presença de ar é uma propriedade
funcional importante das proteínas em muitos produtos alimentícios do tipo bolos de anjo, suspiros, suflês, vários tipos de coberturas de bolos e sobremesas, além de bebidas como cervejas. Várias substâncias tensoativas como detergentes e saponinas são formadoras de espumas, mas em alimentos, as proteínas são as mais importantes (SGARBIERI, 1998).
A qualidade espumante de uma proteína deve ser estudada quanto a estabilidade e densidade de sua espuma e quanto ao volume formado da mesma sob certas condições. A capacidade de formação de espuma é medida pelo aumento do volume de uma dispersão de proteína como resultado da incorporação de ar por batimento, agitação ou aeração. Proteínas ideais para formação de espuma têm a propriedade de formar membranas extensíveis em torno das bolhas de ar passando por um certo grau de desnaturação que parece ser crítico para a estabilização das espumas e de sua estrutura tridimensional (SGARBIERI, 1998).
Um bom critério para a avaliação da estabilidade da espuma é a medida do tempo em que ocorre algum evento, como o tempo decorrido desde a formação até a ruptura total das bolhas. Obtém-se, neste caso, o tempo de vida da espuma, determinado por dois processos que são o afinamento e o colapso dos filmes. Soluções diversas podem formar espumas cujo tempo de vida pode ser de apenas alguns segundos ou de até centenas de meses. A evolução dos processos vai depender da natureza química do
agente espumante, considerando-se que seu papel consiste basicamente em estabilizar os filmes de espuma, e do controle de efeitos externos (FIGUEREDO et al., 1999).
As propriedades da espuma de hidrolisados protéicos de pescado tem sido pouco estudadas. Shahidi et al. (1995), e Onodenalore e Shahidi (1996), citados por Kristinsson e Rasco (2000a) estudaram a formação de espuma e a estabilidade da
espuma de hidrolisados protéicos de tubarão e capelin. Em ambos processos, a Alcalase foi a protease utilizada para hidrólise. O hidrolisado protéico de capelin obteve uma boa formação de espuma, de 90%, com 12% de grau de hidrólise. O hidrolisado protéico de carne de tubarão apresentou uma maior porcentagem de formação de espuma, 106%, e o hidrolisado de polpa lavada de tubarão mostrou uma capacidade de formação de espuma de 130%. O hidrolisado protéico de capelin teve uma estabilidade de espuma maior após 30 segundos quando comparada com a proteína hidrolisada de tubarão. 2.7.3 Capacidade emulsificante
Emulsões são definidas como misturas de pelo menos dois líquidos imiscíveis, estando um deles disperso no outro em forma de minúsculas gotículas. Os materiais imiscíveis são usualmente a água e um óleo ou gordura líquida. Como a água e o óleo são imiscíveis, há necessidade de agitação mecânica para que se forme uma dispersão homogênea dos dois líquidos. Contudo, essa dispersão não constituirá uma emulsão em virtude da tendência natural de separação dos dois líquidos. Uma emulsão alimentícia deverá ser estável por, pelo menos, alguns meses. O leite é um exemplo de emulsão alimentícia estável, em que as partículas de gordura estão dispersas em solução aquosa. O líquido que aparece disperso em forma de gotícula constitui a fase dispersa, descontínua ou interna (SGARBIERI, 1998).
Para este autor, a capacidade de emulsificação é normalmente definida como o volume de óleo (mL) que pode ser emulsionado pelo hidrolisado protéico (g), antes que ocorra a inversão da fase ou colapso da emulsão. Como os hidrolisados protéicos de pescado produzem emulsões de baixa viscosidade, a maneira mais apropriada de medir esta propriedade é através do método de titulação, medindo a resistência elétrica durante a titulação do óleo. O repentino aumento da resistência é observado quando o máximo da capacidade de emulsificação é alcançado.
A estabilidade da emulsão refere-se à habilidade de uma emulsão de resistir a mudanças em suas propriedades ao longo do tempo e depende das características físico-químicas das moléculas das proteínas e das propriedades hidrodinâmicas e viscoelásticas do filme de proteína formada (SGARBIERI, 1998). A medida envolve uma mistura de hidrolisado com o óleo e água, centrifugação, e medida total do volume da
emulsão, onde a estabilidade é expressa como a diferença entre o volume total da emulsão e o volume de água com relação ao volume total (KRISTINSSON e RASCO, 2000a).
As propriedades de emulsificação estão diretamente ligadas às propriedades de superfície, o que demonstra o quão eficiente são os hidrolisados na sua ação de diminuir a tensão interfacial entre componentes hidrofóbicos e hidrofílicos. As proteínas adsorvem na sua superfície as gotas de óleo formadas durante a homogeneização transformando-se em uma membrana protetora que previne a coalescência das gotas (DEMETRIADES et al., 1997). Os hidrolisados apresentam esta “atividade superficial” promovendo a formação de emulsões óleo em água, pois eles possuem grupos funcionais hidrofílicos e hidrofóbicos sendo também solúveis em água (WILDING et al., 1984).
As propriedades de emulsificação das proteínas hidrolisadas são melhoradas quando a extensão da hidrólise é cuidadosamente controlada, já que uma hidrólise extensiva resulta numa drástica perda das propriedades emulsificantes (MAHMOUD, 1994). A distribuição dos pesos moleculares dos hidrolisados mostra que altos conteúdos de frações protéicas de elevado peso molecular desempenham um papel importante na estabilidade das emulsões. Os hidrolisados com grau de hidrólise baixo possuem hidrofobicidade superficial maior, como foi demonstrado experimentalmente com hidrolisados de sardinha, obtidos por ação da alcalase, de baixo grau de hidrólise, apresentando melhor capacidade emulsificante que caseinato de sódio comercial (QUAGLIA e ORBAN, 1990). Estes autores relatam que há uma relação entre o grau de hidrólise e as propriedades de emulsificação dos hidrolisados protéicos de pescado. A hidrólise enzimática possui uma influência negativa na capacidade de formar uma emulsão estável à medida que o grau de hidrólise aumenta. Hidrolisados com diferentes distribuições de pesos moleculares demonstraram que um conteúdo maior de frações protéicas de alto peso molecular desempenha um papel importante no que diz respeito à estabilização da emulsão.
A hidrólise parcial das proteínas geralmente aumenta o número de grupos polares e hidrofílicos, diminui o peso molecular, altera a estrutura globular das proteínas podendo expor maior número de grupos hidrofóbicos. Estas alterações podem afetar as propriedades emulsificantes (NIELSEN, 2002).
2.7.4 Capacidade de retenção de água
A capacidade de retenção de água é um fenômeno importante na tecnologia de alimentos, pois a água absorvida em pequenas quantidades não atua como solvente, mas contribui para dar corpo e aumentar a viscosidade (Cândido et al., 1998), ou seja,
refere-se à habilidade das proteínas de embeber água e retê-la dentro da matriz protéica como acontece com os géis protéicos de músculo bovino e de pescado, sendo possível correlacioná-la com a capacidade de ligar a água (DAMODARAN, 1996). A capacidade de retenção de água das proteínas é de grande importância na indústria de alimentos devido a que a retenção de água em um alimento normalmente melhora sua textura. Deve-se observar que o estado de desnaturação das proteínas também influencia na capacidade de retenção de água.
Para Kristinsson e Rasco (2000a), as propriedades funcionais das proteínas em
um sistema alimentício dependem, em parte, da interação proteína-água dependendo o resultado final de como e quanto às proteínas ligam e mantém água no sistema. Os hidrolisados protéicos de pescado possuem excelente capacidade de retenção de água, sendo adequados para certas formulações de alimentos.
Em um estudo de Kristinsson e Rasco (1998), hidrolisados protéicos de salmão com diferentes graus de hidrólise (5, 10 e 15%) foram adicionados a pastas de salmão moído, sendo que esses produtos apresentaram perdas de água de 1% após o congelamento e descongelamento, armazenados durante 48 dias, quando comparados com o controle que apresentou perdas de 3%.
2.7.5 Capacidade de retenção de óleo
A absorçãode gordura é uma propriedade funcional muito considerada. No caso
dos hidrolisados, estes são misturados com uma quantidade específica de excesso de gordura por um tempo determinado, e em seguida centrifugados com força centrífuga
baixa, sendo a quantidade de gordura adsorvida,expressa em mililitros de gordura ligada
por grama de proteína do hidrolisado (SHAHIDI et al.,1995; KRISTINSSON e RASCO, 1998).
De acordo com Donadel e Prudencio-Ferreira (1999), a absorção de gordura varia em função do número de grupos hidrofóbicos expostos da proteína e, provavelmente, as cadeias laterais não polares das proteínas tem afinidade com as cadeias hidrofóbicas da molécula de óleo, contribuindo para a absorção.
O mecanismo de absorção de gordura comprovada por este método, é atribuído principalmente à captura física do óleo sendo maior a gordura absorvida para maior densidade protéica (KINSELLA, 1976). A capacidade de ligação de gordura das proteínas se correlaciona com a hidrofobicidade superficial. A absorção de gordura de hidrolisado protéico de salmão, obtidos com diferentes graus de hidrólise foi estudada por Kristinsson e Rasco no ano de 1998, verificando que os hidrolisados protéicos de pescado em todos
os casos apresentaram uma excelente absorção de gordura, maior que os concentrados protéicos de albumina de ovo e de proteína de soja.
Em estudo de CHO et al. (2004), foram avaliadas as propriedades funcionais de gelatina de tubarão (Isurus oxyrinchus). As propriedades analisadas foram CRA e CRO, onde foram comparados três tipos de gelatina, sendo elas, gelatina da cartilagem, gelatina de grau analítico e gelatina obtida em aditivos alimentares. Os autores verificaram que a CRO da gelatina obtida da cartilagem de tubarão foi maior do que as outras duas gelatinas. Para eles, a CRA e a CRO são propriedades funcionais que estão relacionadas com textura pela interação entre componentes como água, óleo e outros compostos.
2.8 Propriedades Nutricionais
Os métodos de preparação dos hidrolisados protéicos podem ter um profundo efeito nas suas propriedades funcionais, assim como nas suas propriedades nutricionais. Eles podem aumentar o potencial dos pescados de baixo custo comercial agregando valor ao produto, apresentando bom perfil de aminoácidos essenciais e boas
propriedades funcionais (KRISTINSSON e RASCO, 2000a). As proteínas de pescado
podem ser usadas para fortificar o valor nutricional dos alimentos a base de cereais, para preparar produtos em pó e hidrolisados com finalidades dietéticas e hipoalergênicas, assim como para a alimentação animal (SHAHIDI e VENUGOPAL, 1994), e também para proporcionar uma maneira promissora de usar proteínas não lácteas como substitutos lácteos para animais jovens (REBECA et al., 1991), e por contribuir nas propriedades sensoriais atrativas para ração animal. Onodenalore e Shahidi (1996), informaram que a hidrólise enzimática de proteínas de pescado é importante para o preparo de produtos com propriedades funcionais únicas e com características benéficas a saúde.
A hidrólise enzimática controlada de proteínas tem atingido considerável importância na ciência dos alimentos e nutrição, muitas vezes melhorando as propriedades funcionais e nutricionais dos alimentos. Ela também melhora a digestibilidade sem afetar o valor nutritivo das proteínas (KRISTINSSON e RASCO,
2000b). Cândido e Sgarbieri (2003), elaboraram um concentrado protéico de carne
mecanicamente separada de pescado eviscerado e o compararam com um hidrolisado protéico de pescado obtido com a enzima flavourzyme, o qual foi preparado com um grau de hidrólise abrangendo de 3,5 a 4,5%. A parte insolúvel dos hidrolisados apresentou melhor perfil de aminoácidos que a fração solúvel. O valor nutricional determinou que a fração insolúvel não diferiu do hidrolisado total, e foi consideravelmente maior que o da fração solúvel.
A qualidade nutricional de hidrolisado protéico em pó de tilápia foi analisada por Abdul-Hamid et al. (2002), utilizando duas temperaturas diferentes de secagem, 150°C e
180°C.A temperatura mais alta utilizada resultou num decréscimo no conteúdo de todos
os aminoácidos analisados para o hidrolisado. Todavia, a qualidade protéica dos dois hidrolisados foi alta, com valores de digestibilidade in vitro de 88,4 e 92% respectivamente. Dentre os métodos de avaliação da qualidade nutricional das proteínas tem-se o poder de proteólise ou digestibilidade da proteína in vitro. Segundo Sgarbieri (1996), a digestibilidade de uma proteína deve ser entendida como sendo a parte ou porção da proteína que pode ser hidrolisada pelas enzimas digestivas até aminoácidos e que portanto, estaria disponível biologicamente, desde que não houvesse nenhuma interferência na absorção dos aminoácidos pelo organismo humano.
3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material
3.1.1 Matéria-prima
A matéria-prima utilizada para a obtenção dos hidrolisados foi a corvina (Micropogonias furnieri), espécie de baixo valor comercial, doada pela indústria PESCAL S.A, localizada na cidade de Rio Grande, RS.
3.1.2 Reagentes
Os reagentes químicos utilizados durante o processamento assim como nas análises químicas formam todos de qualidade analítica (P.A).
3.1.3 Enzima
A enzima proteolítica utilizada foi a Alcalase 2.4L, fornecida pela Novozymes Latin América Ltda.
3.1.4 Infra-estrutura
O trabalho experimental foi desenvolvido nos laboratórios de Tecnologia de Alimentos e de Bioquímica Tecnológica, localizados no Campus Cidade da Fundação Universidade Federal do Rio Grande (FURG), RS.
3.2 Métodos
3.2.1 Obtenção dos filés e da polpa de corvina
O pescado foi transportado em recipiente com gelo até o Laboratório de Tecnologia de Alimentos da FURG. Foi realizada uma pré-lavagem com o intuito de retirar as sujidades superficiais antes de se iniciar a etapa de descabeçamento e evisceração, feita de modo que não houvesse contaminação do pescado pelas vísceras, seguida da filetagem. Os filés limpos foram acondicionados em embalagens de polietileno e armazenados sob congelamento em freezer horizontal em temperatura de -18 ºC.
3.2.2 Determinação da atividade específica da enzima
A atividade específica da enzima foi determinada conforme Gildberg et al. (2002), Rebeca et al., (1991), e Gildberg e Raa (1983), usando caseína como substrato.
Realizou-se uma hidrólise com caseína (2%) e outra com o filé de pescado como substrato (2% proteína) a uma temperatura de 40ºC, pH 7,0 (tampão fosfato 0,2M, vide Anexo E) e 1% de enzima (p/p), durante um intervalo de duas horas. A atividade enzimática foi expressa como unidade de atividade (U) que corresponde à quantidade em gramas de enzima capaz de liberar ou produzir 1µmol de tirosina por minuto, nas condições do experimento.
3.2.3 Caracterização fisico-química 3.2.3.1 Da matéria-prima
Os filés foram descongelados em refrigerador por 14 horas, homogeneizados em triturador de facas duplas (Arno, modelo PL, “pic-liq”) e caracterizados fisicamente mediante a determinação de pH e rendimento. O pH foi medido através da utilização de potenciômetro de bancada e o rendimento foi calculado a partir do peso dos filés obtidos em relação ao peso inicial do pescado. A composição proximal do filé de corvina foi determinada de acordo com a metodologia oficial da AOAC (1995), onde proteínas foram determinadas pelo método de Kjeldahl (N x 6,25), lipídios pelo método de Soxhlet, cinzas por método gravimétrico em mufla 550-600ºC e umidade por método gravimétrico em estufa 105ºC. Todas as determinações foram realizadas em triplicata.
3.2.3.2 Dos hidrolisados
Os hidrolisados foram caracterizados fisicamente mediante a determinação do rendimento. Quanto à caracterização química determinaram-se os maiores componentes, de acordo com a metodologia oficial da AOAC (1995), onde proteína foi determinada pelo método de Kjeldahl (N x 6,25), cinzas por método gravimétrico em mufla 550-600ºC e umidade por método gravimétrico em estufa 105ºC. Todas as determinações foram realizadas em triplicata.
3.2.4 Obtenção do hidrolisado protéico de pescado
Para a determinação das faixas de trabalho da reação enzimática, para atingir graus de hidrólise adequados sem prejudicar as características funcionais e nutricionais dos hidrolisados consultou-se a literatura científica (GBOGOURI et al., 2004, DINIZ E MARTIN, 1996). Foram realizados inicialmente, testes para obtenção de hidrolisados com a protease alcalase, nas faixas ótimas de pH e temperatura da enzima.
3.2.4.1 Testes preliminares e definição das condições de hidrólise enzimática Para determinar o tempo de hidrólise, foram realizados testes preliminares. Inicialmente foram realizados dois experimentos para obter hidrolisados em diferentes graus de hidrólise, que se denominou teste preliminar 1 (T1). As condições de reação empregadas foram: pH 8,0, concentração de enzima 2,5% (p/p), concentração de substrato 1,5% (p/v), e tempo de 60 minutos em temperaturas de 50 e 55ºC. Foram tomadas amostras de hidrolisados nos tempos de 15, 30, 45 e 60 minutos, determinando-se o grau de hidrólideterminando-se em cada tempo. Testes posteriores foram realizados com o objetivo de obter valores maiores de grau de hidrólise, que se denominou teste preliminar 2 (T2) onde foram pesquisadas novas condições de reações, alterando a concentração de enzima [E] e a concentração de proteínas do substrato [S], com base na literatura (GBOGOURI et al., 2004). As condições da reação foram: pH 8,0, temperatura 50ºC, [E]: 4%, 6% e 8% (p/p) e [S]: 3%, 4% e 5% (p/v).
3.2.4.2 Fluxograma geral dos hidrolisados protéicos
O fluxograma geral utilizado no processo de obtenção dos hidrolisados protéicos de pescado pode ser visualizado na Figura 3. As reações enzimáticas foram conduzidas com a enzima em estudo, em valores ótimos de pH e temperatura estabelecidos com base na literatura e através dos testes preliminares, variando-se as concentrações de substrato e de enzima.
Figura 3: Fluxograma da produção de hidrolisado enzimático de pescado. Na Figura 4, observa-se o sistema utilizado para as reações de hidrólise, composto por um reator de vidro encamisado (A), aberto com capacidade de 1000mL,
conectado a um banho ultratermostático (Quimis, modelo 214. D2) (B) para controle de
temperatura e um agitador eixo-élice (Quimis, modelo Q-215 D2K) (C).
Figura 4: Sistema utilizado para as reações de hidrólise enzimática. Vísceras, pele, espinhos, escamas Pescado inteiro Pré-Lavagem Descabeçamento e Evisceração Lavagem Água Polpa Filetagem Resíduo Resíduo
Adição de solvente /Ajuste do pH
Homogeneização Reação Enzimática Inativação Desidratação Adição da enzima Térmica TCA
Hidrolisado Protéico de Pescado Controle de pH e T
A
B C
(A) reator de vidro encamisado (B) banho ultratermostático (C) agitador eixo-élice
