UTILIZAÇÃO DO SORO DE QUEIJO NA PRODUÇÃO DE PROBIÓTICO

VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica

27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

UTILIZAÇÃO DO SORO DE QUEIJO NA PRODUÇÃO DE PROBIÓTICO

1_{Elizângela Maia e Sá,} 2_{PaulaRúbia Ferreira Rosa,} 3_{Ubirajara Coutinho Filho,} 3_{Vicelma Luiz Cardoso}

1

Bolsista de Programa de Ensino (PIBEG/UFU), discente do curso de Graduação em Engenharia Química

2

Bolsista de Pós-Graduação (FAPEMIG/UFU),discente do curso de Pós-Graduação em Engenharia Química

3

Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG

1,2,3

Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38408-100.

e-mail: [email protected]

RESUMO - O presente trabalho tem como objetivo avaliar a influência conjunta das variáveis concentração de lactose, pH e concentração de inoculo, na fermentação de soro de queijo. A cultura utilizada consistiu de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus, micro-organismos geralmente utilizados na produção de queijos, iogurte e outros. A otimização das variáveis foi realizada aplicando um planejamento composto central. Os experimentos foram realizados em frascos de vidro do tipo penicilina com 50 mL de volume, em mesa agitadora (100 rpm) e temperatura ambiente (28 ± 3oC). Nos testes preliminares utilizou-se soro in natura e no planejamento soro em pó. Os resultados dos testes preliminares mostraram que o melhor tempo de processo foi de 36 horas. Utilizando a técnica de superfície de resposta foi possível otimizar, dentro das faixas estudadas, as variáveis: concentração de lactose (35,8 g/L), de inóculo (1,3 g/L) e o pH (6,2) obtendo como resposta a concentração celular de 1,1 ± 1,2 1010 NMP/mL.

Palavras-Chave: fermentação láctea, soro de queijo, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus.

INTRODUÇÃO

No processamento do leite para a fabricação de certos derivados, como o queijo e caseínatos, um dos principais rejeitos líquidos é o soro lácteo que possui alta taxa de matéria orgânica e geram uma carga altamente poluente. Este subproduto é uma matéria prima rica e nobre do ponto de vista nutricional, com alto teor de proteínas e vitaminas. Produtos tais como soro em pó, proteína do soro, queijo, lactose, ácido láctico, álcool, vinagre, probióticos e alimentos especiais (concentrado protéico, bebidas etc.) podem ser obtidos do soro de queijo (Ribeiro, 2000).

Os probióticos constituem micro-organismos vivos que ao serem agregados como componentes da dieta exercem ação benéfica na flora intestinal microbiana tanto em animais como em humanos (Gueimonde et al., 2006). No caso de animais esta ação benéfica pode ser definida como ganho de peso, melhora na resistência a doenças e auxílio na recuperação de infecções microbianas (Balcázar et al., 2006) e para humanos ela está associada a melhora de gastroenterites resistentes, melhora do quadro a intolerância à lactose, estimulação do sistema imune, redução do colesterol sérico, prevenção da formação de câncer e substâncias carcinogênicas no intestino (Collins e Gibson, 1999).

Segundo a legislação brasileira vigente para alimentação humana (Anvisa, 2008) os micro-organismos utilizados no presente trabalho foram retirados da classificação de micro-organismos probióticos, mas esta mudança é controversa (Hauly et al., 2005) e o termo probiótico tem uma extensão maior que o uso exclusivo para alimentação humana (Balcazar et al., 2006).

O objetivo deste estudo foi otimizar as variáveis concentração de lactose, pH e concentração de micro-organismos, visando uma maior produção de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus, aplicando a técnica de superfície de resposta através de planejamento composto central, empregando bioreator tipo frasco de penicilina com 50 mL.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os micro-organismos foram adquiridos a partir de um produto comercial da marca Rich, utilizado para a produção de iogurte natural, tendo como ingredientes culturas superconcentradas de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus.

Meio de Cultura

Foi utilizado o meio de cultura seletivo para Lactobacillus conhecido como meio MRS, cuja composição em g/L foi a seguinte: peptona de caseína 10, extrato de carne 10, extrato de levedura 5, glicose 20, tween 80 1, K2HPO4 2,

acetato de sódio 5, citrato de amônia 2, MgSO4.7H2O 0,20 e MnSO4.H2O 0,05.

Teste Preliminar

No teste preliminar foi realizado empregando soro de queijo in natura produzido na fabricação do queijo tipo mussarela fornecido pela Cooperativa Agropecuária Ltda de Uberlândia (CALU). Neste soro foram feitas análises de pH e da concentração de lactose. O teste preliminar consistiu na determinação da concentração de proteína, de lactose e do crescimento celular em função do tempo, com a finalidade de avaliar o melhor tempo a ser adotado no planejamento de experimento. Após a amostragem do soro para as análises mencionadas anteriormente, foram realizadas fermentações em biorreator do tipo frasco de penicilina com volume total de 50 mL, com 40 mL de soro e 0,6 ± 0,05 g/L de inoculo, o que correspondia a um volume de 4 mL de inoculo para 40 mL de volume total de meio para fermentação no frasco de penicilina. As fermentações foram conduzidas em escala de bancada em incubadora rotativa com movimentos orbitais a temperatura ambiente de 28 ± 3oC e 100 rpm. Análises de concentração de lactose e de micro-organismos eram feitas a cada 12 h durante 3 dias.

Planejamento Experimental

Foi realizado um planejamento fatorial do tipo composto central (PCC) a dois níveis com três variáveis, acrescido de três réplicas no ponto central e ainda 6 experimentos nos pontos axiais, utilizando o α de ortogonalidade de 1,35, totalizando 17 experimentos Os experimentos foram realizados com o objetivo de verificar a influência conjunta das três variáveis (concentração de lactose, de micro-organismo e pH) na resposta crescimento de micro-organismos viáveis. O PCC foi realizado nas mesmas condições do teste preliminar, utilizando o soro em pó, gentilmente cedido pela empresa Cargill de Uberlândia. Os valores fixados no PCC para essas variáveis foram baseados nos resultados obtidos no teste preliminar.

Métodos Analíticos

As análises de lactose foram realizadas por espectrofotometria seguindo o método DNS (Miller, 1959).

Para a quantificação de células viáveis foi utilizado o método do número mais provável (NMP) com três tubos com meio de cultura MRS em frascos de penicilina de 10 mL (Bradbury, 1984).

Devido a precipitação das proteínas do soro de queijo a baixo valores de pH, para a determinação da biomassa, na concentração em g/L, foi realizado o seguinte procedimento: o meio de cultivo inicial sem micro-organismos foi autoclavado (113 ± 1oC por 10 minutos), o pH foi ajustado para o valor médio obtido no final das fermentações e a quantidade de proteína precipitada foi determinada após centrifugação a 18900 g por 15 minutos e secagem a 43 ± 2oC até massa constante (Tari et al., 2009). A concentração de micro-organismos era determinada subtraindo o valor de massa seca obtida no início e no final da fermentação e o valor do precipitado protéico determinado conforme descrito anteriormente.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

As análises do soro in natura mostraram que a concentração de lactose era de 36 ± 1 g/L, a de proteína de 2,9 ± 0,2 g/L e o pH de 6,5 ± 0,2. A Figura 1 ilustra as variações de concentrações de lactose, proteína e micro-organismo ao longo do tempo. Observa-se que a partir de 48 h não houve um crescimento de micro-organismo e nem consumo significativo de lactose. Assim, adotou-se como tempo de fermentação para os próximos ensaios 48 h. Vale ressaltar que todos os experimentos foram realizados em duplicata.

0 20 40 60 80 Tempo (h) 1 2 3 4 C o n ce n tr a çã o d e P ro te ín a e d e c e lu la ( g /L ) 16 20 24 28 32 36 C o n c e n tr a çã o d e L a c to s e ( g /L ) Conc. Proteína Conc. Lactose Conc. celular

Figura 1 - Concentração de lactose, de proteína e crescimento microbiano em função do tempo.

Planejamento Experimental

A Tabela 1 mostra a matriz planejamento, onde as variáveis estudadas foram: concentração de lactose (X1, g/L), pH (X2) e concentração de

inóculo (X3, g/L), e a variável resposta foi o

crescimento celular em número mais provável (NMP/mL).

Tabela 1 - Resultados de crescimento celular em diferentes condições experimentais de acordo com a matriz do planejamento composto central.

Exp X1 (g/L) X2 X3 (g/L) NMP/mL 1 -1 (20) -1 (5) -1 (0,5) 9,5 ± 2,1.106 2 -1 (20) -1 (5) +1 (1,5) 3,2 ± 2,4.107 3 -1 (20) +1 (8) -1 (0,5) 2,1 ± 2,6.106 4 -1 (20) +1 (8) +1 (1,5) 1,3 ± 3,1.107 5 +1 (40) -1 (5) -1 (0,5) 9,2 ± 1,1.108 6 +1 (40) -1 (5) +1 (1,0) 7,6 ± 1,8.109 7 +1 (40) +1 (8) -1 (0,5) 6,2 ± 1,5.107 8 +1 (40) +1 (8) +1 (1,5) 1,4 ± 1,8.109 9 -α (16,4) 0 (6,5) 0 (1,0) 3,2 ± 1,4.107 10 +α (43,531) 0 (6,5) 0 (1,0) 9,3 ± 2,2.109 11 0 (30) -α (4,4) 0 (1,0) 3,2 ± 2,7.107 12 0 (30) +α (8,52) 0 (1,0) 9,7 ± 2,6.108 13 0 (30) 0 (6,5) -α (0,3) 5,2 ± 2,3.106 14 0 (30) 0 (6,5) +α (1,7) 9,8 ± 1,7.109 15 0 (30) 0 (6,5) 0 (1,0) 9,7 ± 1,2.109 16 0 (30) 0 (6,5) 0 (1,0) 1,2 ± 1,8.1010 17 0 (30) 0 (6,5) 0 (1,0) 9,6 ± 1,1.109 Observa-se na Tabela 1, que os resultados

de crescimento celular variaram entre 8,1 107 NMP/mL (ensaio 3) a 3,5 1010 NMP/mL (ensaio 16). Verifica-se também, que os melhores resultados, de todas as respostas avaliadas, foram obtidos nos experimentos localizados no ponto central (experimentos 15, 16 e 17).

A partir dos resultados obtidos para o crescimento celular, efetuou-se uma regressão múltipla, tendo como fatores os termos isolados, as interações e os termos quadráticos. Após a realização da regressão no software Statistica 7, obteve-se a Equação 1.

M = 9,77.109 + 1,93.109 X1 – 2,3 .109 X12 – 4,98.108

X2 - 4,57.109 X22 + 1,83.109 X3 – 2,06.109 X32 - 8,79

.108 X1 X2 + 9,98.108 X1 X3 - 6,69.108 X2X3 (1)

O coeficiente de determinação (R2) foi de 87%, indica um ajuste adequado dos dados experimentais em relação ao crescimento de micro-organismo, mostrando que 87% da variabilidade dos dados foram explicadas pela equação empírica. Nesta regressão foram eliminados os parâmetros com nível de significância do teste t-student superiores a 10%, sendo as variáveis relacionadas a estes consideradas não relevantes. A Equação 2 representa a forma reduzida do modelo completo, com R2 de 81%.

M = 9,77.109 + 1,93.109 X1 – 2,23 .109 X12 -

4,57.109 X22 + 1,83.109 X3 – 2,06.109 X32 (1)

Como forma de ilustrar a influência das variáveis na concentração de micro-organismo, apresenta-se nas Figuras 2 e 3 as curvas de contorno das variáveis concentração de lactose, inóculo e pH em relação à resposta estudada.

A partir da Equação 1 foi feita a implementação de um algoritmo no software Maple 9.5 para calcular o ponto ótimo, visando maximizar a concentração de micro-organismo em função das variáveis estudadas. Os valores reais das variáveis no ponto de maximização foram: concentração de lactose de 35,8 g/L, pH 6,2 e concentração de inóculo de 1,3 g/L. A partir dos valores codificados das variáveis X1, X2 e X3 no

ponto de máximo determinou-se pela Equação 2, que o crescimento celular teórico neste ponto foi de 1,0 1010 NMP/mL.

Analisando as curvas de contorno (Figuras 2, 3 e 4), verifica-se, que as regiões de otimização, apresentam as seguintes faixas de concentrações de lactose 30 a 40 g/L, inóculo de 1,0 a 1,4 g/L e pH de 4,0 a 6,5.

8E9 6E9 4E9 2E9 0 -2E9 15 20 25 30 35 40 45 lactose(g/L) 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 p H

Figura 2 - Curva de contorno da variável pH em função da concentração de lactose.

8E9 6E9 4E9 2E9 0 -2E9 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 pH 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 in ó c u lo ( g /L )

Figura 3 - Curva de contorno da variável concentração de inóculo em função do pH.

6E9 4E9 2E9 0 -2E9 -4E9 -6E9 -8E9 15 20 25 30 35 40 45 lactose(g/L) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 in ó c u lo ( g /L )

Figura 4 - Curva de contorno da variável inóculo em função da concentração de lactose.

Estudo da Reprodutibilidade

Visando avaliar a reprodutibilidade dos resultados obtidos no PCC foram realizados experimentos na condição otimizada aplicando o

algoritmo do software Maple (X1 = 35,8 g/L,

X2 = 6,2 e X3 = 1,3 g/L), obtendo como resposta

1,1 ± 1,2 1010 NMP/mL. Como as variáveis concentração de inoculo e pH são de baixo custo e visando avaliar o crescimento celular em menor concentração de lactose, dentro da região de otimização, sem prejudicar o crescimento celular foi realizado também um experimento na concentração de lactose de 30 g/L, inóculo de 1,3 g/L e pH de 6,2 obtendo 1,1 ± 2,3 109 NMP/mL. Outro ponto avaliado foi na concentração de lactose de 33 g/L, inoculo 1,3 g/L e pH 6,2. Este ponto é interessante porque análises de concentração de lactose e medidas de pH no soro de queijo mussarela in natura apresentaram valores próximos a este, o resultado foi de 1,7 ± 1,6 1010 NMP/mL. Verifica-se que dentro da região de otimização os valores obtidos para a concentração micro-organismos foram da ordem de 1010 NMP/mL e no ponto em que a concentração de lactose foi de 30 g/L a concentração da biomassa em massa seca foi de 5 g/L. Os valores obtido foram superiores aos encontrados por Tari et al. (2009) que obteve valores de 4,35 g/L na temperatura de 35oC. Coutinho Filho et al. (2007) avaliando a concentração de célula em um produto probiótico comercial obteve 1010 células/g.

CONCLUSÃO

Os testes preliminares mostraram que o melhor tempo de processo foi de 48 horas. Utilizando a superfície de resposta foi possível determinar a região de otimização das variáveis estudadas. Os testes de reprodutibilidade mostraram que para a concentração de lactose entre 30 a 35,8 g/L, concentração de inoculo de 1,3 g/L e pH 6,2 a concentração de micro-organismos foi da ordem de 1010 NMP/mL. A utilização de soro de queijo para produção de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus, mostrou-se bastante promissora.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

propriedades funcionais e ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias brotativas e probióticos. http://www.anvisa.gov.br/ alimentos/comissões/tecno-lista-alega.html, acessado em julho de 2008.

BALCÁZAR, J.L., BLAS, I., RUIZ-ZARZUELA, I., CUNNINGHAM, D., VENDRELL, D., MÚZQUIZ, J.L., 2006. The role of probiotics in aquaculture, Veterinary Microbiology, 114 (3-4), 173-186.

BRADBURY, J.F., 1984. Genus Xanthomonas. In: Krieng, N.R., Holt, J.G. (Ed.), Bergey´S

Manual of Systematic bacteriology, v. 1, Williams & Wilkins, London.

COLLINS, M.D., GIBSON, G.R., 1999. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut, American Journal of Clinical Nutrition, 69 (5), 1052S-1057S.

COUTINHO FILHO, U., SANTOS, A.B., CARDOSO, V.L., 2007. Estudo da desativação térmica de simbiótico de uso veterinário. Anais do XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos - Sinaferm 2007, Curitiba. GUEIMONDE, M., JALONEN, L., HE, F.,

HIRAMATSU, M., SALMINEN, S., 2006. Adhesion and competitive inhibition and displacement of humanenteropathogens by selected lactobacilli, Food Research International, 39 (4), 467-471.

HAULY, M.C.O., FUCUS, R.H.B., FERREIRA, S.H.P., 2005. Suplementação de iogurte de soja com frutooligossacarídeos: características probióticas e aceitabilidade, Revista de Nutrição, 18 (5), 615-622.

MILLER, G.L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Analytical Chemistry, 31 (3), 426-428.

RIBEIRO, H.S., 2000. Obtenção e aplicação de concentrados protéicos de soro de leite bovino em produtos cárneos. Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP, Campinas – SP. (Tese de doutorado).

TARI, C., USTOK, F.I., HARSA, S., 2009. Optimization of the associative growth of novel yoghurt cultures in the production of biomass, β-galactosidase and lactic acid using response surface methodology, Internacional Dairy Journal, 19 (4), 236-243.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais), do CNPq e da CAPES – Brasil.