UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO
Gisele Kristina dos Santos Varela
Estudo comparativo do efeito do meio condicionado de células estromais mesenquimais derivadas da derme e do tecido adiposo
humanos no reparo cutâneo in vitro
Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção do grau de Mestre em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Orientadora: Prof. Dra. Andréa Gonçalves Trentin
Coorientadora: Dra. Bianca Luise Teixeira
Florianópolis 2018
Á minha família por todo apoio, carinho e amor.
AGRADECIMENTOS
Á Universidade Federal de Santa Catarina pela oportunidade de realizar uma pós-graduação pública de qualidade, e por ter esta experiência única de vivenciar a pesquisa.
À minha orientadora Prof. Dra. Andrea Gonçalves Trentin que me deu a oportunidade de trabalhar no seu laboratório e por ter aceitado me orientar durante o mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida. Aos diversos profissionais da UFSC que contribuíram para minha pesquisa e formação, pessoal da limpeza, manutenção, secretaria e coordenação. Em especial aos profissionais do LAMEB pela atenção e auxílio nos experimentos.
À minha coorientadora Dra. Bianca Luise Teixeira por aceitar o meu convite e por ter me ajudado tanto no cotidiano. Obrigado pelos ensinamentos, conversas e apoio de sempre. Você foi fundamental para a realização deste trabalho!
Agradeço a todas as pessoas que fazem parte do LACERT, pela ajuda nos experimentos, conversas, momentos de descontração e apoio de sempre, vocês foram fundamentais para deixar os meus dias mais alegres. As aprendizagens foram tantas e o trabalho em equipe foi fundamental para manter a calma nos momentos difíceis.
Á Diana pelos ensinamentos e dicas preciosas no dia a dia, á Helena Debiazi Zomer por ser a grande responsável por toda a ideia do meu projeto e por ter me auxiliado tanto com as dúvidas mesmo que às vezes de longe. Aos colegas do laboratório Adriane, Camila, Débora, Gabriel, Juliano, Laís e Maiara. Em especial gostaria de agradecer a Priscilla pela sua amizade, conselhos, conversas e apoio de sempre. Conte sempre comigo para o que precisar!
Ao Rodrigo, por me apoiar e me ajudar nos momentos difíceis e nunca me deixar desistir, por alegrar os meus dias com o seu carinho e amor, pelos momentos especiais, e por sempre me fazer olhar para frente e traçar novos objetivos. Muito obrigado por tudo!
Acima de tudo e todos, á minha família! A minha irmã Milena que me ouviu nos momentos de angústias e de felicidade e que mesmo sendo tão jovem me deu sábios conselhos, me ajudou a treinar para todos os seminários das disciplinas da pós-graduação e me deu todo o apoio que ninguém se não ela faria, muito obrigada maninha! Aos meus pais Anildo e Ivonete, que me apoiaram e incentivaram a ser perseverante diante das dificuldades, e me ensinaram a sempre ver o lado bom das coisas, se hoje cheguei até aqui é porque vocês me deram a educação necessária. Obrigado por tudo, amo muito vocês!
“O insucesso é apenas uma oportunidade para recomeçar de novo com mais inteligência.”
Henry Ford
RESUMO
VARELA, G. K. S. Estudo comparativo do efeito do meio condicionado de células estromais mesenquimais derivadas da derme e do tecido adiposo humanos no reparo cutâneo in vitro. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e do Desenvolvimento) – Universidade Federal de Santa Catariana, Florianópolis, 2018.
As células estromais mesenquimais (CEM) são células multipotentes encontradas em vários tecidos do organismo humano. A facilidade de obtenção e isolamento, alta capacidade de propagação em cultura e de migrar para locais de lesão, facilita a utilização destas células para possíveis aplicações terapêuticas. As CEM estão envolvidas no processo de reparo tecidual principalmente de forma parácrina, ou seja, pela secreção de fatores solúveis. Por este motivo, diversos estudos sugerem que as CEM podem ser substituídas pelo seu meio condicionado (mc), o qual contém fatores solúveis e vesículas extracelulares secretados pelas CEM. O objetivo deste estudo foi avaliar comparativamente, em abordagens in vitro, a ação do meio condicionado das células estromais mesenquimais derivadas da derme (CEM-d) e do tecido adiposo (CEM-ta) humanos no reparo tecidual cutâneo. Para isto, o mc-CEM-d e o mc-CEM-ta foram avaliados quanto ao potencial de promover a proliferação e a migração de queratinócitos e fibroblastos, e de estimular a formação de tubos por células endoteliais. Os resultados obtidos mostram que o mc-CEM-d foi mais eficiente que o mc-CEM-ta em estimular a migração de queratinócitos e fibroblastos em ensaios de fechamento de lesão (cell scratch) e em promover a formação de tubos por células endoteliais. Já o mc-CEM-ta foi mais eficiente em promover a proliferação de queratinócitos e fibroblastos. Desta forma, foi possível verificar que o meio condicionado das diferentes fontes de CEM analisadas possuem propriedades biológicas semelhantes com algumas características distintas no potencial terapêutico de reparo em lesões cutâneas.
Palavras-chave: célula estromal mesenquimal, meio condicionado, reparo tecidual.
ABSTRACT
VARELA, G. K. S. Comparative study of the effect of the conditioned medium of mesenchymal stromal cells derived from human dermis and adipose tissue on in vitro cutaneous repair. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e do Desenvolvimento) – Universidade Federal de Santa Catariana, Florianópolis, 2018.
Mesenchymal stromal cells (MSC) are multipotent cells found in various tissues of the human body. The facility of obtaining and isolating, high capacity of propagation in culture and of migrating to sites of injury facilitates the use of these cells for possible therapeutic applications. The MSC are involved in the process of tissue repair mainly in a paracrine way, that is, by the secretion of soluble factors. For this reason, several studies suggest that MSC can be replaced by its conditioned medium (cm), which contains soluble factors and extracellular vesicles secreted by MSC. The objective of this study was to compare the action of conditioned medium of dermal-derived mesenchymal stromal cells (DSC) and human adipose tissue (ASC) on cutaneous tissue repair in vitro approaches. For this cmDSC and cmASC were evaluated for potential to promote the proliferation and migration of keratinocytes and fibroblasts, and to stimulate the formation of endothelial cell tubes. The results obtained show that cmDSC was more efficient than cmASC in stimulating the migration of keratinocytes and fibroblasts in scratch assays and in promoting tube formation by endothelial cells. On the other hand, cmASC was more efficient at promoting the proliferation of keratinocytes and fibroblasts. In this way, it was possible to verify that the conditioned medium of the different sources of MSC analyzed have similar biological properties with some distinct characteristics in the therapeutic potential of repair in cutaneous lesions.
Keywords: mesenchymal stromal cell, conditioned medium, tissue repair.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fases do reparo tecidual cutâneo. ... 25 Figura 2. Nichos de CEM na pele. ... 28 Figura 3. Mecanismos de ação das CEM no reparo tecidual. ... 30 Figura 4. Eficiência do isolamento e do potencial de amplificação das CEM-ta e CEM-d. ... 47 Figura 5. Proliferação celular das CEM-d e CEM-ta. ... 48 Figura 6. Eletroforese em gel de poliacrilamida das proteínas totais dos meios condicionados. ... 50 Figura 7. Efeito dos mc-CEM-d e mc-CEM-ta sobre a proliferação de fibroblastos dérmicos humanos. ... 52 Figura 9. Efeito do mc-CEM-d e mc-CEM-ta no fechamento da lesão em culturas de fibroblastos dérmicos humanos. ... 56 Figura 10. Efeito do mc-CEM-d e mc-CEM-ta no fechamento da lesão em culturas de queratinócitos humanos. ... 58 Figura 11. Efeito do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na formação de tubos em células endoteliais. ... 60
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANOVA – Análise de variância
ASC – Adipose Stromal Cell BrdU – 5-bromo-2-deoxiuridina BSA – Albumina sérica bovina
CEM – Células estromais mesenquimais
CEM-d – Células estromais mesenquimais derivadas da derme
CEM-ta– Células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo CEPSH – Comitê de Ética na Pesquisa em Seres Humanos
CONEP – Comissão Nacional de Ética em Pesquisa DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO – Dimetilsulfóxido
DSC – Dermal Stromal Cell
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético EGF – Fator de crescimento epidermal FGF - Fator de crescimento de fibroblastos HU – Hospital Universitário
IL-8 – Interleucina-8
KGF – Fator de crescimento de queratinócitos
mc – Meio condicionado
mc-CEM – Meio condicionado das células estromais mesenquimais mc-CEM-d – Meio condicionado das células estromais mesenquimais derivadas da derme
mc-CEM-ta – Meio condicionado das células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo
MCPs – Proteínas quimiotáticas de monócitos MEC – Matriz extracelular
MSC – Mesenchymal Stromal Cell PBS – Tampão Fosfato Salina
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas PS – Penicilina e Estreptomicina
SBF – Soro Bovino Fetal
TGF-β – Fator de crescimento transformante beta UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 23
1.1. Estrutura da pele ... 23
1.2. Reparo tecidual cutâneo ... 23
1.3. Células-tronco ... 25
1.4. Células estromais mesenquimais (CEM) ... 26
1.5. CEM derivadas da derme e do tecido adiposo humanos ... 27
1.6. Meio condicionado das células estromais mesenquimais ... 30
2. JUSTIFICATIVA ... 33 3. HIPÓTESE CIENTÍFICA ... 33 4. OBJETIVOS ... 35 4.1. Objetivo geral ... 35 4.2. Objetivos específicos ... 35 5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 35
5.1. Obtenção das amostras de CEM ... 35
5.2. Isolamento das células ... 36
5.2.1. CEM derivadas da derme humana (CEM-d) ... 36
5.2.2. CEM derivadas do tecido adiposo humano (CEM-ta) ... 37
5.2.3. Fibroblastos dérmicos humanos ... 37
5.3. Cultivo celular e criopreservação ... 37
5.3.1. CEM-d e CEM-ta ... 38
5.3.2. Fibroblastos dérmicos humanos ... 38
5.3.4. Células endoteliais humanas (HUVEC) ... 39
5.4. Análise da eficiência de isolamento e do potencial de amplificação ... 39
5.5. Capacidade de proliferação das CEM-d e CEM-ta ... 40
5.6. Obtenção do meio condicionado das CEM-d (mc-CEM-d) e CEM-ta (mc-CEM-ta) ... 40
5.7. Quantificação das proteínas totais presentes no meio condicionado ... 41
5.8. Ensaio de proliferação de fibroblastos e queratinócitos ... 41
5.9. Capacidade de proliferação dos queratinócitos ... 42
5.10. Ensaio de fechamento de lesão in vitro (cell scratch) ... 43
5.11. Análise do potencial de formação de tubos em células endoteliais ... 43
5.12. Análise estatística ... 43
6. RESULTADOS ...45
6.1. Análise da eficiência de isolamento e do potencial de amplificação ... 45
6.2. Análise da capacidade de proliferação celular das CEM-d e CEM-ta ... 48
6.3. Avaliação comparativa dos teores proteicos do mc-CEM-d concentrado e não concentrado ... 49
6.4. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na proliferação de fibroblastos dérmicos humanos ... 50
6.5. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na proliferação e sobrevida dos queratinócitos humanos ... 53
6.6. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta no ensaio de fechamento de ferida sobre fibroblastos dérmicos humanos ... 55
6.7. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta no ensaio de
fechamento da lesão sobre queratinócitos humanos ... 57
6.8. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na formação de tubos em células endoteliais ... 59
7. DISCUSSÃO ... 61
7.1. As CEM-ta possuem maior eficiência de isolamento e as CEM-d maior potencial de amplificação ... 62
7.2. O meio condicionado concentrado das CEM-d possui maior teor de proteínas ... 63
7.3. O mc-CEM-ta estimula a proliferação de fibroblastos dérmicos humanos ... 64
7.4. O mc-CEM-ta estimula a proliferação de queratinócitos humanos ... 64
7.5. O mc-CEM-d estimula o fechamento da lesão em fibroblastos dérmicos humanos ... 65
7.6. O mc-CEM-ta e mc-CEM-d estimulam o fechamento da lesão em queratinócitos humanos ... 66
7.7. O mc-CEM-d promove a formação de tubos por células endoteliais ... 67
8. CONCLUSÕES ... 69
REFERÊNCIAS ... 69
23
1. INTRODUÇÃO 1.1. Estrutura da pele
A pele é o maior órgão do corpo humano correspondendo a cerca de 16% do peso corporal dos indivíduos. Este órgão multifuncional recobre toda a superfície do corpo, sendo a primeira barreira de proteção do organismo. A pele é responsável pelo controle da regulação hídrica, defesa do corpo contra agentes externos como micro-organismos, radiação solar, ações mecânicas e químicas. Além disso, auxilia na termorregulação e transmite sensações recebidas do ambiente para o sistema nervoso central por meio dos mecanoreceptores (BARONI et al., 2012; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2014).
A pele é constituída externamente pela epiderme e internamente pela derme. A epiderme, de origem ectodérmica, é composta por queratinócitos que formam um fino epitélio estratificado pavimentoso, além de melanócitos e células de Langerhans e de Merkel (BARONI et al., 2012). Adjacente à epiderme fica a derme, de origem mesodérmica, que consiste em uma camada de tecido conjuntivo, composta principalmente por fibroblastos e uma matriz extracelular (MEC) formada por colágeno, glicosaminoglicanos e elastina. Além disso, é muito bem vascularizada, contendo células do endotélio vascular e do sistema imune. Na profundidade da derme estão os anexos epidérmicos, que são os folículos pilosos e glândulas sebáceas e sudoríparas. Assim, a derme confere integridade estrutural, elasticidade e nutrição para a pele (ARDA et al., 2014; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2014). Subjacente à derme está o tecido subcutâneo, formado pelos tecidos conjuntivo frouxo e adiposo. Este último, composto principalmente por adipócitos, é responsável pelo isolamento térmico e reserva energética (ARDA et al., 2014; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2014), além de prover defesa mecânica e auxiliar na síntese de diversos hormônios (COELHO et al., 2013).
1.2. Reparo tecidual cutâneo
A epiderme e a derme mantêm a homeostasia da pele, formando uma barreira protetora ao ambiente externo. Uma vez alterado este equilíbrio, como em razão de uma lesão, o processo de reparo é imediatamente ativado (EMING et al., 2014). O reparo tecidual pode ocorrer por regeneração, com a recomposição da funcionalidade do
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tecido, ou pela cicatrização, com o restabelecimento da homeostasia do mesmo, mas com perda da sua atividade funcional (KO et al., 2011; EMING et al., 2014). O processo de reparo tecidual envolve uma cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a reconstituição do tecido. Ele é dividido em três fases distintas, porém sobrepostas: fase inflamatória, proliferativa e de remodelamento (GURTNER et al., 2008; KO et al., 2011).
Na fase inflamatória os componentes da cascata de coagulação e do sistema imune são responsáveis pela prevenção da perda de sangue e fluidos.A hemostase é alcançada através da deposição de plaquetas e posterior depósito de fibrina (EMING et al., 2014). Diversos fatores de crescimento e citocinas estão envolvidos no processo inflamatório e estes atuam recrutando neutrófilos e macrófagos para o sítio da lesão. Embora os neutrófilos e macrófagos tenham grande participação na fase inflamatória, sua importância ainda não é completamente entendida (GURTNER et al., 2008). Porém, sabe-se que existem duas populações de macrófagos que atuam no reparo tecidual, classificados como macrófagos M1, com perfil pró-inflamatório, e macrófagos M2, com perfil anti-inflamatório. Estes diferem quanto ao seu estado de polarização e funções imunológicas, dependendo do microambiente no qual estão envolvidos (SALINA et al., 2014).
Na fase proliferativa do reparo tecidual, queratinócitos migram sobre a derme lesionada, depois novos vasos sanguíneos são formados e a matriz de fibrina é substituída por tecido de granulação. Em etapas mais tardias desse processo, fibroblastos atraídos para as bordas das lesões diferenciam em miofibroblastos, que são células contráteis e tendem a fechar a ferida. Os fibroblastos ainda interagem com miofibroblastos e produzem matriz extracelular em sua maioria formada por colágeno do tipo III (GURTNER et al., 2008; XUE; JACKSON, 2015).
Na fase tardia, de remodelamento, as células endoteliais, macrófagos e miofibroblastos presentes na ferida entram em apoptose, deixando uma massa de matriz extracelular com poucas células e muito colágeno. Finalmente, depois de alguns meses essa matriz extracelular é remodelada pelas metaloproteinases e seus inibidores, e o colágeno III, muito presente na ferida, é substituído por colágeno I, mais resistente e predominante na cicatriz madura (GURTNER et al., 2008; EMING et al., 2014; XUE; JACKSON, 2015). O remodelamento da matriz extracelular ocorre lentamente, e envolve etapas sucessivas de produção, digestão e orientação das fibras de colágeno (Figura 1).
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Figura 1. Fases do reparo tecidual cutâneo.
1. Fase inflamatória: prevenção da perda de sangue e recuperação da homeostase do tecido pela deposição de plaquetas e matriz de fibrina. Células do sistema imune são recrutadas para a lesão, fazem o debridamento e secreção de citocinas e fatores de crescimento. 2. Fase proliferativa: queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais migram para a área lesionada, novos vasos são formados e inicia-se a formação do tecido de granulação e a produção de MEC. 3. Fase de remodelamento: contração da superfície da lesão e completa reepitelização, a MEC é remodelada e o colágeno III é substituído pelo colágeno I. Abaixo da figura, caixas comparam como as fibras de colágeno encontram-se dispostas e a aparência da pele, na pele íntegra, cicatriz normal, cicatriz hipertrófica e queloides.
Fonte: adaptado de Xue e Jackson (2015).
1.3. Células-tronco
A manutenção da homeostase de qualquer tecido após uma lesão depende principalmente da presença e da integridade das células-tronco (WONG et al., 2012). As células-células-tronco são células indiferenciadas que apresentam como características capacidade de proliferação acentuada, autorrenovação, produção de diferentes linhagens celulares, e regeneração de tecidos (SCHWINDT et al., 2005; RIEKSTINA et al., 2008; BYDLOWSKI et al., 2009).
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As células-tronco são classificadas em células-tronco embrionárias totipotentes e pluripotentes que podem dar origem a todos os tecidos do embrião, sendo as primeiras capazes de originar também os tecidos extraembrionários, e células-tronco fetais e adultas multipotentes que possuem o potencial de se diferenciar em vários fenótipos derivados do mesmo folheto embrionário, como adipócitos, osteócitos e condrócitos (BYDLOWSKI et al., 2009; CHAGASTELLES; NARDI, 2011).
Embora as células-tronco embrionárias tenham um considerável potencial terapêutico, elas podem gerar muitos problemas, como rejeição imunológica, diferenciação em um fenótipo indesejado e desenvolvimento de tumores. Desta forma, são consideradas menos seguras aos pacientes, devido ao seu alto potencial de diferenciação e proliferação. Além de haver muitas controvérsias éticas, políticas e religiosas sobre o uso de células-tronco embrionárias (DOSS et al., 2004; ESPINOZA; PETERSON, 2012).
Consequentemente, muitos estudos estão sendo realizados para identificação de células-tronco em tecidos adultos, devido ao fato delas poderem ser utilizadas em transplantes autólogos, diminuindo a chance de uma possível rejeição imunológica e o uso de imunossupressores. Além do que, as células-tronco adultas não estão relacionadas com a formação de teratomas, e não possuem problemas de questionamentos éticos (CHAGASTELLES; NARDI, 2011). Dessa forma, é possível obter o desenvolvimento de novas estratégias de regeneração e reparo tecidual, uma vez que estas células, mesmo com menor potencial de diferenciação, mantêm in vitro suas características de auto-renovação, proliferação e diferenciação (BAKSH et al., 2004; RABIE et al., 2007).
1.4. Células estromais mesenquimais (CEM)
Em 1968, Friedestein e colaboradores isolaram pela primeira vez células a partir da medula óssea, que possuíam como características: morfologia fibroblastóide, capacidade de formar colônias aderentes ao plástico, e também de formar ossos. Inicialmente, foram denominadas células estromais da medula óssea, baseado na hipótese de que vários tecidos de origem mesenquimal poderiam ser gerados a partir delas (FRIEDENSTEIN et al., 1968; BIANCO et al., 2008).
Em 1990, o conceito de células-tronco mesenquimais foi descrito pela primeira vez por Caplan (CAPLAN, 1991). Porém, recentemente, as células-tronco mesenquimais também têm sido
27 denominadas células estromais mesenquimais (CEM ou MSC, do inglês Mesenchymal Stromal Cell) (SIDNEY et al., 2014). Neste trabalho usaremos a sigla em português: CEM. As CEM são células multipotentes e estão presentes em diversos tecidos como: adiposo (LIN, 2012), medula óssea (STRIOGA et al., 2012), cordão umbilical (CAVALLO et al., 2011), polpa dentária (XIAO; TSUITSUI, 2013), músculo esquelético (TAMAKI et al., 2015) e pele (CHEN et al., 2015). Estas células são excelentes candidatas para uso em terapia celular devido às suas características de autorrenovação, capacidade de diferenciação celular, propriedades imunomoduladoras, facilidade de coleta e baixa imunogenicidade, o que as torna mais seguras aos pacientes se comparadas às células-tronco embrionárias (MARTI et al., 2011; CHAN; LAN, 2016).
As CEM possuem as características propostas pelo “Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy”: adesão ao plástico, morfologia fibroblastoide, expressão dos marcadores mesenquimais (CD105, CD90 e CD73), ausência dos marcadores hematopoiéticos (CD45, CD34), e ainda potencial de diferenciação em diversos tipos celulares provenientes do folheto embrionário mesodérmico, como adipócitos, osteócitos e condrócitos (DOMINICI et al., 2006; SALEM; THIEMERMANN, 2010).
1.5. CEM derivadas da derme e do tecido adiposo humanos
Atualmente, acredita-se que grande parte dos tecidos adultos possui um compartimento tronco, isto quer dizer que existem células-tronco que estão distribuídas em diversos tecidos do corpo (WONG et al., 2012). Diante disto, CEM de diversos locais do organismo humano têm sido isoladas e testadas em estudos in vitro e in vivo, sendo consideradas promissoras para a regeneração de tecidos (KO et al., 2011; HU et al., 2013). Na pele também têm sido identificados muitos nichos de CEM, como na epiderme, derme e seus apêndices(Figura 2) (WONG et al., 2012).
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Figura 2. Nichos de CEM na pele.
Populações de CEM (indicadas em verde) têm sido identificadas em vários nichos da pele: na camada basal da epiderme, no bulge e papila dermal do folículo piloso, na derme e tecido subcutâneo adiposo (hipoderme).
Fonte: adaptado de Wong e colaboradores (2012).
Os nichos de CEM existentes na pele e tecido adiposo humanos são de grande potencial para o uso na medicina regenerativa, no entanto, os esforços devem ser direcionados para uma melhor caracterização das células residentes em cada nicho, com o objetivo de identificar marcadores em comum. Ao mesmo tempo, examinar se as células de um determinado nicho têm melhor potencial para gerar ou regenerar um determinado tipo de tecido e, em caso afirmativo, quais características dessas células lhes proporcionam essa capacidade única (VAPNIARSKY et al., 2015).
Nesse sentido, em 2001, as células estromais mesenquimais derivadas da derme (CEM-d ou DSC do inglês Dermal Stromal Cell) foram isoladas da pele humana pela primeira vez por três grupos independentes de pesquisa (TOMA et al., 2001; SHI; CHEN, 2001; YOUNG et al., 2001). Porém, receberam menos enfoque se comparadas com CEM de outras fontes, permanecendo muitas questões ainda desconhecidas em relação a suas propriedades biológicas. Mas alguns
29 trabalhos já sugeriram o seu potencial terapêutico no reparo de lesões cutâneas (WONG et al., 2012; JEREMIAS et al., 2014; CHEN et al., 2015).
Também em 2001, as células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (CEM-ta ou ASC do inglês Adipose Stromal Cell) foram isoladas pela primeira vez por Zuk e colaboradores, e desde então veem sendo amplamente estudadas no reparo de tecidos (ZUK et al., 2001). Apresentando vantagens devido a sua acessibilidade, abundância e segurança aos pacientes, se comparadas com as células da medula óssea, por exemplo, já que a coleta desta última é mais invasiva e dolorosa, resultando em uma quantidade celular cerca de cem vezes menor do que as obtidas a partir de CEM-ta (KIM et al., 2011; LIN, 2012; CHEN et al., 2015b). Em relação as CEM-ta e CEM-d nenhum estudo se dedicou a comparar as diferenças biológicas entre estas duas fontes de células até o momento.
De forma geral, as CEM regulam as respostas do sistema imune por meio da liberação de biomoléculas que afetam a proliferação, migração e sobrevivência das células envolvidas no processo de reparo tecidual (HU et al., 2013; RANI et al., 2015). Portanto, possuem um papel ativo nas fases de inflamação, proliferação e remodelamento. Sabe-se que atuam por meio de seu efeito parácrino, ou seja, secreção de fatores de crescimento e citocinas, ou de sua diferenciação em células do tecido afetado (Figura 3) (WANG et al., 2014; ZHU et al., 2017).
Porém, acredita-se que o seu efeito ocorre principalmente de forma parácrina, pois as CEM nem sempre são encontradas no local da lesão poucos dias após o transplante, devido à baixa sobrevivência destas células na lesão (RANI et al., 2015; ZHU et al., 2017). Desta forma, estudos recentes sugerem que terapias com CEM podem ser substituídas pela aplicação do seu meio de cultivo, denominado meio condicionado (mc) (LI et al., 2015; GNECCHI et al., 2016). O meio condicionado é constituído por componentes acelulares, moléculas e vesículas extracelulares, o que faz com que sua manipulação clínica seja mais simples do que a de células vivas e sua aplicação terapêutica facilitada pela menor imunogenicidade (TAMAMA; KERPEDJIEVA, 2012).
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Figura 3. Mecanismos de ação das CEM no reparo tecidual.
Quando ocorre uma lesão as CEM são recrutadas para o local e podem atuar de forma direta pela sua diferenciação em células do tecido afetado, ou ainda, de forma indireta via secreção de fatores de crescimento.
Fonte: Adaptado de Wang e colaboradores (2014).
1.6. Meio condicionado das células estromais mesenquimais
O mc-CEM é composto por diversos fatores solúveis, como citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, além de algumas proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que podem ser secretados diretamente ou liberados dentro de vesículas extracelulares pelas CEM em seu meio de cultivo (ROCCO et al., 2016). O mc-CEM possui o potencial de induzir a proliferação e a migração celular de queratinócitos e fibroblastos, o aumento da angiogênese e a diminuição da inflamação (TAMAMA et al., 2012; LI et al., 2015; FURUTA et al., 2016).
Neste sentido, as vesículas extracelulares desempenham um papel chave na sinalização celular, exercendo efeitos específicos na manutenção da homeostase, modulação da resposta imune, inflamação, progressão do câncer, angiogênese e coagulação, tanto em condições fisiológicas como patológicas (JONG et al., 2014; YÁÑEZ-MÓ et al., 2015). Além disso, acredita-se que elas possam ser as responsáveis pelos efeitos do meio condicionado na regeneração de tecidos, porém, os processos e mecanismos moleculares envolvidos precisam ser melhor investigados (JUN et al., 2014; KONALA et al., 2016).
31 A respeito do papel do meio condicionado, as células endoteliais participam do processo de reparo pela formação de novos vasos durante a fase inflamatória, são atraídas para a lesão em resposta ao estímulo de vários fatores secretados pelas CEM, entre eles VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular), FGF (Fator de crescimento de fibroblastos) e TGF-β (Fator de crescimento transformante beta) (RADKE et al., 2009), que atuam promovendo a diferenciação e a formação de novos tubos, aumentando assim a angiogênese.
O TGF-β, também conhecido por promover a diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, é um fator descrito como um dos componentes do mc-CEM-ta (FAULKNOR et al., 2015), porém, este fator ainda não foi descrito na literatura como secretado pelas CEM-d, assim como outros fatores de crescimento e citocinas como, por exemplo, o KGF (Fator de crescimento de queratinócitos) e PDGF (Fator de crescimento derivado de plaquetas) (KIM et al., 2011; LIN, 2012). Desta forma, concluímos que o mc-CEM-ta vem sendo amplamente estudado, e com isso muitos fatores de crescimento já foram identificados como seus componentes, a exemplo do EGF (Fator de crescimento epidermal), VEGF, FGF, entre outros (KIM et al., 2011; LIN, 2012).
Assim sendo, acredita-se que os meios condicionados de ambas as fontes, CEM-d e CEM-ta, possuam grande potencial terapêutico no reparo de tecidos devido à quantidade de fatores de crescimentos e citocinas secretados em seu meio de cultivo e que estão envolvidos nas fases do reparo tecidual. Além disso, ambos apresentam vantagens na sua utilização, pela menor imunogenicidade, facilidade de obtenção e manipulação clínica, se comparados com o mc de outras fontes, como a medula óssea (CHEN et al., 2015b).
Sabe-se que as CEM obtidas de nichos diferentes exibem particularidades na sua proliferação, migração e diferenciação, que devem ser levados em consideração ao planejar seu uso em terapias celulares (AL-NBAHEEN et al., 2015). Desta forma, uma melhor caracterização das diferentes fontes de CEM é necessária, já que existe a probabilidade de seu meio condicionado ter funcionalidades distintas, que podem vir a interferir nas suas propriedades biológicas e eficácia terapêutica (VAPNIARSKY et al., 2015).
Nesse sentido, os estudos do mc-CEM são importantes para definir a sua função no reparo tecidual, com o objetivo de identificar quais os seus componentes, e de que forma estes agem na regeneração de tecidos. Para utilização do meio condicionado em estudos in vivo e clínicos é essencial entender se há diferenças entre as fontes de CEM, e
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qual seria a mais apropriada para cada abordagem terapêutica, e ainda compreender os processos e mecanismos moleculares envolvidos em seus efeitos (LEE et al., 2009).
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2. JUSTIFICATIVA
As CEM estão envolvidas no processo de reparo tecidual principalmente de forma parácrina, ou seja, pela secreção de fatores de crescimento e citocinas ou até mesmo pela produção e liberação de vesículas extracelulares. Diversos estudos sugerem que as CEM podem ser substituídas pelo seu meio condicionado, porém, o efeito das CEM-d e do seu meio condicionado no reparo de lesões cutâneas ainda é pouco compreendido. Além disso, muitos fatores de crescimento e citocinas, descritos como componentes do mc-CEM-ta, ainda não foram descritos para mc-CEM-d. Em contrapartida, as CEM-ta já foram amplamente estudadas e muitos dos componentes do seu meio condicionado já identificados.
Contudo, acredita-se que o meio condicionado de ambas as fontes, CEM-d e CEM-ta, possuam grande potencial no reparo de tecidos devido à quantidade de fatores solúveis que contém, além disso, apresentam facilidade de obtenção e manipulação clínica, como também menor imunogenicidade. O meio condicionado de CEM de diferentes fontes podem apresentar funcionalidades distintas, que podem interferir nas suas propriedades biológicas e eficácia terapêutica. Portanto, é necessário realizar ensaios funcionais para verificar as propriedades biológicas do mc-CEM-d e mc-CEM-ta visando futuras aplicações terapêuticas no reparo de lesões cutâneas.
3. HIPÓTESE CIENTÍFICA
I - O meio condicionado das CEM-d e CEM-ta influencia diferencialmente a proliferação e a migração de queratinócitos e fibroblastos, e a formação de tubos por células endoteliais.
II - O meio condicionado das CEM-d e CEM-ta influencia de maneira semelhante a proliferação e migração de queratinócitos e fibroblastos, e a formação de tubos por células endoteliais.
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4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo geral
Avaliar comparativamente a ação do meio condicionado (mc) das células estromais mesenquimais derivadas da derme (CEM-d) e do tecido adiposo (CEM-ta) humanos (mc-CEM-d e mc-CEM-ta, respectivamente) no reparo tecidual cutâneo in vitro.
4.2. Objetivos específicos
- Comparar a eficiência de isolamento e amplificação das CEM-d e CEM-ta;
- Analisar comparativamente os efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na proliferação e migração de queratinócitos e fibroblastos in vitro;
- Analisar comparativamente os efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na formação de tubos por células endoteliais in vitro.
5. MATERIAIS E MÉTODOS 5.1. Obtenção das amostras de CEM
Foram utilizadas amostras de CEM provenientes da derme e tecido adiposo humanos, doadas por pacientes (sexo feminino, idades entre 24 e 57 anos) submetidos à cirurgia de abdominoplastia realizadas no Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (HU-UFSC). Os fibroblastos humanos foram obtidos de fragmentos de pele da região temporal de pacientes (sexo feminino, idades entre 48 e 60 anos) submetidos à cirurgia de lifting facial (ritidoplastia) realizadas no HU-UFSC. As amostras foram doadas com o consentimento dos pacientes por meio de assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1). Os fragmentos de pele foram coletados e mantidos a 4ºC em recipiente estéril, contendo meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco) acrescido de 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina, PS) (100U/mL) (Gibco) e transportados para o Laboratório de Células Tronco e Regeneração
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Tecidual (LACERT) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), onde foram realizados os procedimentos de cultura celular.
Os procedimentos estão de acordo com os princípios éticos estabelecidos pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), tendo sido julgados e aprovados pelo Comitê de Ética na Pesquisa em Seres Humanos (CEPSH) da UFSC, sob parecer 1.076.626 (Anexo 2).
5.2. Isolamento das células
5.2.1. CEM derivadas da derme humana (CEM-d)
As amostras foram manipuladas em cabine de segurança biológica na sala de cultura celular do LACERT/UFSC. Os fragmentos de pele foram lavados em tampão fosfato salina (PBS) em placa de Petri. O tecido adiposo subcutâneo foi separado da pele e processado para a obtenção das CEM-ta conforme descrito a seguir. Para o isolamento das CEM-d, foi utilizado protocolo adaptado previamente descrito por Toma e colaboradores (2001). Para isso, a epiderme foi removida do fragmento de pele com o auxilio de material cirúrgico (pinça, tesoura) e a derme isolada foi seccionada em fragmentos pequenos de aproximadamente 1 cm2 os quais foram submetidos à dissociação mecânica (tesoura e bisturi) durante 1 hora (h). Os fragmentos da derme foram colocados em tubo de 15 mL e incubados em tripsina/EDTA a 0,25% por 1 h a 37ºC. Após este período, foi adicionado meio de cultura DMEM com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Vitrocell), para bloquear a ação enzimática. A solução foi filtrada em membrana com poros de 70 µm (cell strainer, BD) e em seguida centrifugada por 5 minutos (min) a 392 xg á temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o pellet contendo as células ressuspendido em meio completo consistindo de DMEM, SBF a 10% e 1% de PS. A suspensão de células foi semeada em garrafas de cultura de 25cm2 e a cultura mantida em estufa a 37ºC com 5% de CO2 e 95% de umidade. Após 48 h, o meio foi trocado para remoção das células não aderentes. Esta cultura primária foi denominada passagem 0 (P0).
37 5.2.2. CEM derivadas do tecido adiposo humano (CEM-ta)
Para o isolamento das CEM-ta, foi utilizado protocolo adaptado previamente descrito por Yang e colaboradores (2011). Para isso, o tecido adiposo obtido como descrito anteriormente, foi seccionado com o auxílio de material cirúrgico (tesoura e bisturi) e os fragmentos incubados em colagenase do tipo IV (Gibco) por 1 hora a 37ºC. Após este período, foi adicionado DMEM com 10% de SBF para bloquear a reação enzimática. A solução foi filtrada em membrana com poros de 70 µm e em seguida centrifugada por 5 min a 392 xg á temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o precipitado celular contendo a fração estromal celular foi incubado durante 10 min em solução de lise de hemácias. A solução foi centrifugada a 392 xg por 5 min, o sobrenadante foi descartado e o pellet contendo as células ressuspendido em meio completo (DMEM + 10% SBF + 1% PS). As células foram plaqueadas em garrafas de cultura de 25cm2 em meio completo e mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO2 e 95% de umidade. Após 48 h, o meio foi trocado para remoção das células não aderentes. Esta cultura primaria foi denominada passagem 0 (P0).
5.2.3. Fibroblastos dérmicos humanos
Para o isolamento dos fibroblastos dérmicos humanos, foi utilizado protocolo adaptado previamente descrito por Seluanov e colaboradores (2010). Os fragmentos de pele foram cortados em pedaços de aproximadamente 1cm2 e incubados com 12,5 U/mL de dispase II (Gibco) overnight, a 4°C. Após este período, a epiderme e o tecido adiposo foram removidos, restando apenas a derme, que foi seccionada em pequenos fragmentos e estes colocados em placas de cultivo contendo DMEM suplementado com 20% de SBF e mantidos em estufa nas condições ideais de cultivo (37ºC com 5% de CO2 e 95% de umidade) para permitir a migração dos fibroblastos para a placa de cultura. Após observação de células aderidas à placa, o meio de cultivo foi substituído por DMEM suplementado com 10% de SBF e trocado a cada 3 dias. Para os experimentos foram utilizados fibroblastos isolados de três doadores. Este processo de isolamento dos fibroblastos dérmicos humanos foi realizado pela Dra. Diana Heck durante o seu trabalho de doutorado e doados para a realização deste estudo.
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5.3.1. CEM-d e CEM-ta
Após confluência das culturas em P0, as células provenientes da derme e do tecido adiposo foram descoladas da placa de cultura por incubação em tripsina/EDTA 0,25% por 3-5 min a 37ºC. A reação foi paralisada com acréscimo de DMEM contendo 10% de SBF e a solução centrifugada durante 5 min a 392 xg, em temperatura ambiente. O pellet celular foi ressuspendido em meio completo e as células semeadas em uma nova garrafa de cultivo de 75 cm2, considerada passagem 1 (P1). O procedimento foi repetido até a passagem 6 (P6).
As células provenientes da derme e do tecido adiposo foram criopreservadas entre P1 e P6. Para tanto, as células foram descoladas da placa de cultivo com auxílio de tripsina/EDTA a 0,25%, centrifugadas (392 xg por 5 min) e ressuspendidas em meio de congelamento consistindo de 90% de SFB e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). Um milhão de células em 1 mL foram transferidas para um criotubo o qual foi colocado em um recipiente de congelamento lento (CoolCell® Cell Freezing Container) e mantido em freezer -80ºC durante 48 h. A seguir, os criotubos foram transferidos e armazenados em nitrogênio liquido.
Os experimentos descritos abaixo foram realizados em triplicata utilizando células da derme e tecido adiposo em P1 a P6, provenientes de, no mínimo, três doadores correspondendo assim à triplicata técnica e biológica.
5.3.2. Fibroblastos dérmicos humanos
Assim que os fibroblastos atingiram a confluência, foram descolados da placa de cultivo com solução de tripsina/EDTA a 0,05%, a 37ºC por 5 min. A atividade enzimática foi bloqueada pela adição de DMEM suplementado com 10% de SBF. A suspensão celular foi então centrifugada durante 5 min a 392 xg em temperatura ambiente e o precipitado contendo os fibroblastos ressuspenso em DMEM suplementado com 10% de SBF e semeados em placa de cultura. Ao atingir confluência de 90%, os fibroblastos foram novamente tripsinizados e replaqueados em menor densidade para expansão ou criopreservados em SBF com 10% de DMSO armazenados em freezer -80ºC durante 48 h e, posteriormente, em nitrogênio liquido. Os experimentos foram realizados em triplicata utilizando fibroblastos em P1 a P4, provenientes de no mínimo três doadores.
39 5.3.3. Queratinócitos humanos (HaCaT)
Para os experimentos de avaliação do meio condicionado das CEM-d e CEM-ta, foram utilizados queratinócitos humanos da linhagem HaCaT (ATCC), que foram criopreservados em nitrogênio líquido e descongelados, conforme a necessidade, pela adição de 1 mL de meio de cultivo (DMEM + 10% de SBF) aquecido a 37ºC. As células foram centrifugadas durante 5 min a 392 xg em, temperatura ambiente, para retirada do meio de criopreservação, ressuspensas e plaqueadas em DMEM suplementado com 10% de SBF. Após 5 dias, as células foram novamente retiradas da placa com tripsina/EDTA 0,25% e replaqueadas nas condições de cada experimento.
5.3.4. Células endoteliais humanas (HUVEC)
Para os experimentos de avaliação do meio condicionado das CEM-d e CEM-ta na formação de vasos, foram utilizadas células endoteliais humanas da linhagem HUVEC (ATCC), doadas pela Prof. Dra. Tania Pasa. Estas foram criopreservadas em nitrogênio líquido e descongeladas pela adição de 1 mL de meio de cultivo (DMEM + 10% de SBF) aquecido a 37ºC. As células foram então centrifugadas durante 5 minutos a 392 g em temperatura ambiente para retirada do meio de criopreservação, ressuspensas e plaqueadas em DMEM suplementado com 10% de SBF. Após 5 dias, as células foram novamente retiradas da placa com tripsina/EDTA 0,25% e replaqueadas nas condições de cada experimento.
5.4. Análise da eficiência de isolamento e do potencial de amplificação Para avaliar a eficiência de isolamento, as CEM-d e CEM-ta foram fotografadas em P0 a P3, em intervalos de 7 dias, durante 28 dias. O número de células e o tempo para a confluência em cada passagem (até P5) foram anotados para avaliação do potencial de amplificação.
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5.5. Capacidade de proliferação das CEM-d e CEM-ta
As curvas de proliferação celular foram realizadas com o objetivo de avaliar os perfils de proliferação das CEM-d e CEM-ta. Para isso, foi utilizado protocolo previamente descrito por Bahn e colaboradores (2012), com algumas adaptações. As células foram plaqueadas em P2, na densidade de 1x104 células por poço, em placa de 6 poços. Foi contado o número de células de um poço a cada 24 h até a obtenção da confluência. Para a contagem, as células foram tripzinizadas e quantificadas em câmara de Neubauer. O procedimento foi realizado em duplicata para as células de cada doador. A análise gráfica foi realizada com auxilio do software GraphPad Prism 5.
5.6. Obtenção do meio condicionado das d (mc-d) e CEM-ta (mc-CEM-CEM-ta)
Os mc-CEM-d e mc-CEM-ta foram obtidos conforme descrito anteriormente (YOON et al., 2010; EDWARDS et al., 2014; LI et al., 2015) com modificações. Para isto, CEM-d e CEM-ta entre P3 e P5 foram cultivadas em placas de 150 cm2 em DMEM e SBF a 10% até atingir confluência de 80%. O meio foi descartado e as células lavadas duas vezes com PBS e mantidas por 48 h em DMEM sem SBF. Após este período, o meio de cultura que corresponde ao meio condicionado foi recolhido e submetido a três centrifugações (300xg por 10min, 2000xg por 10min e 10000xg por 30min), e filtrado (0,22 μm) para remover os restos celulares. Alíquotas de 300 uL de meio condicionado foram armazenadas em freezer -80ºC até o uso.
Parte das amostras de meios condicionados foi concentrada 5 vezes, utilizando o filtro Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Ultracel 3K (Millipore), conforme instruções do fabricante. Resumidamente, os filtros foram umedecidos com água ultrapura e o meio condicionado adicionado ao filtro. As amostras foram centrifugadas a 5000 xg por 45 min a 4ºC, aliquotadas e armazenadas em freezer -80ºC. As células produtoras foram contabilizadas e o meio condicionado equalizado pelo número de células. Para os experimentos, foi utilizado um pool de pelo menos três doadores ajustados para a mesma quantidade de células produtoras.
41 5.7. Quantificação das proteínas totais presentes no meio condicionado
As proteínas totais presentes no mc-CEM-d e mc-CEM-ta foram quantificadas utilizado o kit DC Protein (Bio-Rad) conforme instruções do fabricante. O ensaio é baseado na reação com solução alcalina de tartarato de cobre (reagente A) seguida de redução pelo reagente de Folin (reagente B) gerando uma solução cromogênica de intensidade proporcional à concentração proteica das amostras, quantificada em termos de absorbância por espectrofotometria.
Foi realizada uma curva padrão de albumina sérica bovina (BSA) diluída em DMEM sem SBF nas concentrações de 0,1 mg/mL a 1,5 mg/mL. Para isto, 5 μL de cada amostra de meio condicionado foram dispostos em placa de 96 poços e acrescidos de 25 μL do reagente A e 200 μL do reagente B. Após 15 min, as absorbâncias foram lidas em leitora de microplacas (SpectraMax Paradigm) em comprimento de onda ajustado para 750nm.
Posteriormente, 5 ug de proteínas dos mc-CEM-d e mc-CEM-ta foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A eletroforese foi realizada com corrente fixa de 20 mA e voltagem 100 mV até a separação das amostras no gel. Em seguida, foi realizada a coloração com azul de Coomassie, por meio do Kit Piece Midi Gel Power Staining, conforme instruções do fabricante. Por fim, o gel foi fotografado e analisado com auxílio do programa ImageJ.
5.8. Ensaio de proliferação de fibroblastos e queratinócitos
O potencial do mc-CEM-d e mc-CEM-ta em induzir a proliferação de fibroblastos e queratinócitos humanos in vitro foi avaliado por incorporação de BrdU (5-bromo-2-deoxiuridina), um análogo da timidina que se incorpora ao DNA das células que estão proliferando. Foi utilizado protocolo previamente descrito por Deskins e colaboradores (2013), com algumas adaptações. As células foram cultivadas em placas de 96 poços na concentração de 1x103 células/poço em meio completo durante 24 h para permitir a aderência e garantir as mesmas condições celulares em todos os poços. Após este período, o meio de cultivo foi totalmente removido e substituído pelo mc-CEM-d e mc-CEM-ta, como controle foi utilizado DMEM sem SBF. Após 24 h, a solução de BrdU (1:100, Invitrogen) foi adicionada às culturas e incubadas por 24 horas em estufa a 37°C e 5% CO2.
42
Posteriormente, as culturas foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído 4% por 30 min. Em seguida, as células foram lavadas novamente com PBS, incubadas com ácido clorídrico durante 30 min a 37°C, e depois permeabilizadas com PBS-Triton X-100 (0,25%) por mais 30 min. Os sítios inespecíficos foram bloqueados com 5% de SBF em PBS durante 1 h e, posteriormente, as células foram submetidas à marcação imunocitoquímica com o anticorpo primário anti-BrdU (IgG2a de rato, Abcam) durante 14 h a 4°C. Após, as células foram lavadas três vezes com PBS-Tween 20 (0,05%), e incubadas com anticorpo secundário anti-IgG1 (Alexa Fluor 488 anti-IgG de rato, Invitrogen) por 1 h, á temperatura ambiente.
Os núcleos foram corados com 4’,6-diamino-2-fenilindole (DAPI, Sigma) e a proliferação celular foi expressa como proporção de células BrdU positivas, obtida por contagem direta dos núcleos corados com DAPI a partir de fotomicrografias obtidas em microscópio epifluorescente invertido (Olympus IX83). Três experimentos independentes foram realizados em triplicata com quantificação de, pelo menos, cinco campos de cada poço. Posteriormente, a análise gráfica foi realizada com auxílio do programa GraphPad Prism 5.
5.9. Capacidade de proliferação dos queratinócitos
A curva de crescimento foi realizada para avaliar o potencial do mc-CEM-d e mc-CEM-ta em induzir a proliferação de queratinócitos in vitro. Para isso, foi utilizado protocolo previamente descrito por Bahn e colaboradores (2012), com algumas adaptações. As células foram plaqueadas na densidade de 1x104 células por poço, em placa de 96 poços na presença de mc-CEM-d e mc-CEM-ta. Como controles foram utilizados DMEM com ou sem SBF. Foram contadas as células totais dos poços da placa de cultivo a cada 24 h, durante 4 dias quando a confluência foi atingida.
Para a contagem das células, o meio foi retirado, a cultura lavada com PBS e solução de tripsina/EDTA a 0,25% adicionada. Após 3-5 min em estufa a 37ºC, foi acrescentado DMEM com 10% de SFB para bloqueio da atividade enzimática. A solução foi homogeneizada com o auxílio de pipeta e 10 μL coletados para contagem em câmara de Neubauer. O procedimento foi realizado em duplicata e a análise gráfica realizada com auxílio do programa GraphPad Prism 5.
43 5.10. Ensaio de fechamento de lesão in vitro (cell scratch)
O potencial do mc-CEM-d e mc-CEM-ta em induzir o fechamento de lesão em fibroblastos e queratinócitos foi avaliado pelo ensaio de cell scratch, utilizando protocolo descrito por Zhang e colaboradores (2013). Para isto, as células foram cultivadas em DMEM sem SBF em placas de 24 poços na densidade de 5x104 e 1x105 células por poço para fibroblastos e queratinócitos, respectivamente. Após atingirem confluência de 60% e 80% para fibroblastos e queratinócitos, respectivamente, foi realizada uma lesão na monocamada celular com uma ponteira estéril de 100 μL. Em seguida as placas foram lavadas com PBS e mantidas em 600 μL de DMEM sem SBF (controle) ou mc-CEM-d ou mc-CEM-ta. As áreas da lesão foram fotografadas imediatamente e 24 e 48 h após a injúria em microscópio invertido (Olympus IX83). As imagens obtidas foram analisadas pelo programa ImageJ.
5.11. Análise do potencial de formação de tubos em células endoteliais O potencial de neovascularização foi avaliado pelo ensaio de formação de túbulos com a linhagem celular HUVEC, utilizando protocolo com modificações descrito por Edwards e colaboradores (2014). Inicialmente, uma placa de 96 poços foi coberta com 50 µl de Geltrex (Gibco) líquido, a qual foi colocada em estufa para solidificar e polimerizar a 37°C durante 1 hora. Células HUVEC foram então semeadas na densidade de 2x104 células por poço em mc-CEM-d ou mc-CEM-ta. Como controle foi utilizado DMEM sem SBF. Após 3 e 6 horas, a formação de túbulos e pontos de ramificações foram fotografados e quantificados por meio da contagem do número de túbulos fechados.
5.12. Análise estatística
As variáveis contínuas foram expressas como médias ± erro padrão e comparadas entre os grupos usando a análise de variância (ANOVA) de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni. A significância estatística foi definida como um valor de p<0,05 em todos os experimentos. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 5.
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6. RESULTADOS
6.1. Análise da eficiência de isolamento e do potencial de amplificação Resultados anteriores do LACERT sugerem que tanto CEM-d como as CEM-ta podem ser excelentes fontes de células obtidas a partir de descartes de abdominoplastias (ZOMER et al., 2018). Para a realização deste trabalho, foram realizadas 12 coletas de pele abdominal humana, dessas foi possível estabelecer 9 linhagens de CEM-d e 7 linhagens de CEM-ta. A metodologia adotada para obtenção das células mostrou-se adequada e a média de idade dos pacientes foi de 35 anos para os doadores das CEM-d e 37 anos para os doadores das CEM-ta (Quadro 1).
Durante o processo de isolamento das CEM-d e CEM-ta algumas particularidades foram percebidas, como a diferença na quantidade de células no período inicial do cultivo. Aos 7 dias de cultivo primário, as CEM-ta atingiram a confluência e foram subcultivadas em passagem 1 (P1) (Figura 4A). As CEM-d, por outro lado, levaram em média 28 dias para atingir confluência em cultura primária (Figura 4B). Nas passagens subsequentes, no entanto, as CEM-d proliferavam rapidamente enquanto as CEM-ta eram menos proliferativas, com citoplasma amplo e espalhado (uma característica de senescência) a cada passagem celular e consequentemente ocupando maior espaço na placa de cultura, resultando em um número menor de células. Desse modo, foi possível observar que as CEM-d e CEM-ta possuem morfologias diferentes, pois as primeiras são mais finas e alongadas e as segundas têm um citoplasma mais volumoso ocupando maior espaço na placa de cultura (Figura 4B).
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Quadro 1. Dados das coletas da derme e tecido adiposo abdominal humanos. Data da coleta Idade dos pacientes
CEM-d Resultado CEM-ta Resultado
12/06/17 24 anos PAC 20 Efetiva PAC 20 Contaminou 27/07/17 44 anos PAC 21 Efetiva PAC 21 Contaminou 05/08/17 45 anos PAC 22 Efetiva PAC 22 Contaminou 05/08/17 55 anos PAC 23 Efetiva PAC 23 Efetiva 09/08/17 57 anos PAC 24 Contaminou PAC 24 Efetiva 28/08/17 51 anos PAC 25 Contaminou PAC 25 Contaminou 11/09/17 32 anos PAC 26 Contaminou PAC 26 Contaminou 29/09/17 28 anos PAC 27 Efetiva PAC 27 Efetiva 08/01/18 36 anos PAC 28 Efetiva PAC 28 Efetiva 08/01/18 27 anos PAC 29 Efetiva PAC 29 Efetiva 04/04/18 24 anos PAC 30 Efetiva PAC 30 Efetiva 16/04/18 34 anos PAC 31 Efetiva PAC 31 Efetiva 17/04/18 44 anos PAC 32 Contaminou PAC 32 Contaminou
Média total 9 culturas 7 culturas Média das efetivas 35 anos 37 anos
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Figura 4. Eficiência do isolamento e do potencial de amplificação das CEM-ta e CEM-d.
Imagens representativas do isolamento e cultivo das CEM-ta e CEM-d em passagens iniciais (P0 a P3) em diferentes períodos de tempo. (A) Aos 7 dias de cultivo primário as CEM-ta atingem confluência, enquanto as CEM-d levam em torno de 28 dias para chegar ao mesmo estágio (B). Escala: 200 µm
A
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6.2. Análise da capacidade de proliferação celular das CEM-d e CEM-ta As CEM-d e CEM-ta em P2 foram semeadas em placas de 6 poços, sendo um poço por dia quantificado até a confluência de 100%, o que ocorreu após 7 dias. Os resultados obtidos nas contagens resultaram em um aumento progressivo da proliferação celular. Os dois primeiros dias não foram analisados, devido à baixa densidade celular. As análises realizadas nos dias 3 a 7 mostraram que apesar do número de CEM-d ser maior que o número de CEM-ta, apenas no 7º dia a diferença foi estatisticamente significativa. Nesse dia, o número de células foi de 38,4x104 para as CEM-d e de 10,4x104 para as CEM-ta, com diferença de aproximadamente 4 vezes no número de células entre as duas linhagens (Figura 5). Mesmo assim, esses resultados sugerem que apesar de levar mais tempo para atingir a confluência em cultura primária as CEM-d apresentam maior taxa de proliferação celular que as CEM-ta nas passagens subsequentes.
Figura 5. Proliferação celular das CEM-d e CEM-ta.
Representação gráfica do potencial proliferativo das CEM-d e CEM-ta, no intervalo de tempo de 3 a 7 dias de cultivo. Os valores representam a média ± erro padrão de 3 experimentos independentes em triplicata, *p <0,05 por ANOVA duas vias seguido de teste de Bonferroni.
49 6.3. Avaliação comparativa dos teores proteicos do mc-CEM-d concentrado e não concentrado
Inicialmente, foi realizada a quantificação do conteúdo proteico somente do mc-CEM-d concentrado e não concentrado por meio de um teste de espectrofotometria. Os resultados obtidos mostraram que o meio condicionado não concentrado possui, em média, uma concentração proteica de 48,3 ug/uL, enquanto o meio condicionado concentrado tem 40,6 ug/uL. Estes resultados sugerem que o método de quantificação utilizado não foi eficiente.
Para confirmar os resultados deste teste, foi realizada a separação das proteínas do meio condicionado, concentrado 5 vezes e não concentrado, por eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração com azul de Coomassie, aplicando-se o mesmo volume das amostras no gel (15 uL). Neste ensaio, verificou-se que o mc concentrado contém uma quantidade maior de proteínas que o mc não concentrado (Figura 6A).
Para avaliar qual o melhor método de quantificação de proteínas, foram realizadas as quantificações proteicas por espectrofotometria, e posteriormente por coloração com coomassie blue após eletroforese em gel de poliacrilamida. Desta vez, o volume de meio condicionado aplicado no gel foi normalizado por dosagem proteica obtida a partir do teste de espectrofotometria (5 ug de proteína total). Desta forma, foi possível realizar uma avaliação mais precisa da quantidade de proteínas nos meios condicionados avaliados. A partir deste teste foi observado que o método de quantificação por espectrofotometria não é o mais confiável, pois mesmo dosando as proteínas e aplicando a mesma quantidade no gel, as bandas obtidas variaram muito em sua intensidade (Figura 6B).
Desta maneira, a normalização do meio condicionado nos experimentos subsequentes deste trabalho foi realizada pela contagem das células produtoras, padronizando-se o volume de meio condicionado produzido por 2,3 milhões de células. Este número de células produtoras foi adotado empiricamente, devido à baixa densidade celular das CEM-ta, a fim de tornar possível as comparações entre as duas culturas utilizando um número de células em comum.
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Figura 6. Eletroforese em gel de poliacrilamida das proteínas totais dos meios condicionados.
Imagens representativas das proteínas totais contidas no mc-CEM-d concentrado e não concentrado (A) e nos mc-CEM-d e CEM-ta (B) após corrida em gel de poliacrilamida 10% corado com Coomassie blue. Em (A) foi aplicado 15 uL de amostra por poço, e as amostras correram por todo gel, para avaliação do padrão proteico. Em (B) foi aplicado 5 µg de proteína total (quantificados por teste de espectrofotometria) por poço, e as amostras apenas entraram no gel e a corrida foi finalizada.
6.4. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na proliferação de fibroblastos dérmicos humanos
Considerando os resultados acima, o meio concentrado 5x possui maior teor de proteínas totais do que o não concentrado. Diante disso, os experimentos seguintes de comparação dos CEM-d e mc-CEM-ta foram realizados apenas com o meio condicionado concentrado 5x. Para avaliar comparativamente o potencial do CEM-d e mc-CEM-ta em aumentar a proliferação celular foi realizado o ensaio de incorporação de BrdU. A proliferação dos fibroblastos foi representada
A
51 pela porcentagem de células BrdU positivas em relação ao total de células marcadas com DAPI, tendo sido observado valores de 9,87% de proliferação celular no controle, 15,19% nas células tratadas com o mc-CEM-d e 35,22% para os tratados com o mc-CEM-ta, demonstrando que o mc-CEM-ta é 2,3 vezes mais eficaz na indução da proliferação de fibroblastos do que o mc-CEM-d, e 3,5 vezes mais eficaz que o controle (Figura 7)
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Figura 7. Efeito dos mc-CEM-d e mc-CEM-ta sobre a proliferação de fibroblastos dérmicos humanos.
(A) Imagens representativas das células BrdU (verde) positivas em relação ao total de células marcadas com DAPI (azul). (B) Representação gráfica da porcentagem de células BrdU positivas em relação ao total de células, que indica a proliferação celular de fibroblastos tratados com o CEM-d e o mc-CEM-ta. Os valores representam a média ± desvio padrão de 3 experimentos independentes em triplicata, *p<0,05 **p<0,01 por teste t, em relação ao controle(CTRL). Escala: 200 µm.
A
B A
53 6.5. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na proliferação e sobrevida dos queratinócitos humanos
Para avaliar os efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta na proliferação de queratinócitos foi realizado inicialmente o ensaio de incorporação de BrdU. Porém, verificou-se que todas as células foram negativas para BrdU. O ensaio foi repetido com diferentes tempos de incubação do BrdU e concentração de células, obtendo-se os mesmos resultados. Diante das dificuldades técnicas de realização do ensaio de incorporação do BrdU com queratinócitos, foi realizada então uma curva de proliferação celular.
Os resultados demonstram que os queratinócitos são de fato muito sensíveis à ausência de soro, alterando sua morfologia e apresentado morte celular quando cultivados em DMEM sem SBF. O controle mantido em DMEM com SBF continuava apresentando a morfologia hexagonal, característica dos queratinócitos, com uma curva crescente de proliferação celular durante o período analisado. Ao contrário, as células mantidas em DMEM sem SBF mantiveram o número inicial de células ao longo dos 3 primeiros dias, decaindo significativamente após o 4º dia (Figura 8A). Estes resultados indicam que o SBF é fundamental para a sobrevida e proliferação dos queratinócitos em cultura.
A seguir, avaliou-se o possível efeito dos CEM-d e mc-CEM-ta no crescimento da população de queratinócitos. Os resultados obtidos mostraram um aumento progressivo no número de células tratadas com mc-CEM-d e mc-CEM-ta nos dias 1 e 2 de cultivo, que se manteve superior ao controle (DMEM sem SBF). Já no dia 3, o número de células tratadas com mc-CEM-d diminuiu drasticamente, ao contrário dos queratinócitos tratados com mc-CEM-ta que manteve os valores constantes (Figura 8B).
Diante destes dados, podemos inferir que o mc-CEM-ta é mais eficaz em aumentar e manter a sobrevida dos queratinócitos em cultura do que o mc-CEM-d. Porém, é verificado que nas primeiras 24 horas o mc-CEM-d tem efeito positivo que a seguir é reduzido drasticamente. Já o mc-CEM-ta se destaca por conseguir manter a sobrevida dos queratinócitos até o terceiro dia de cultivo, caindo levemente apenas no quarto dia.
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Figura 8. Curva de proliferação de queratinócitos tratados com mc-CEM-d, mc-CEM-ta e controles.
(A) Representação gráfica do potencial proliferativo dos queratinócitos humanos tratados com DMEM com SBF e DMEM sem SBF como controle (CTRL), no intervalo de tempo de 1 a 4 dias de cultivo. (B) Representação gráfica do potencial proliferativo dos queratinócitos tratados com mc-CEM-d e mc-CEM-ta durante 4 dias de cultivo. Os valores representam a média ± erro padrão de 2 experimentos independentes em triplicata, *p <0,05 **p <0,01 ***p <0,001 por ANOVA duas vias seguido de teste de Bonferroni.
A
55 6.6. Avaliação dos efeitos do mc-CEM-d e mc-CEM-ta no ensaio de fechamento de ferida sobre fibroblastos dérmicos humanos
O ensaio do cell scratch foi realizado para avaliar o potencial do mc-CEM-d e mc-CEM-ta, já que este ensaio mimetiza o comportamento migratório das células após uma lesão. Os resultados demostraram que o mc-CEM-d estimulou o fechamento da lesão na monocamada de fibroblastos em 24 e 48 h (Figura 9A). Após as 24 h de tratamento, os percentuais de fechamento da ferida no controle foram de 27%, e de 29% e 42% com mc-CEM-ta e mc-CEM-d, respectivamente. Já em 48 h de tratamento, os percentuais de fechamento foram de 40% no controle, e 45% e 55% com mc-CEM-ta e mc-CEM-d, respectivamente (Figura 9B). Apesar das diferenças não serem estatisticamente significativas, pode-se inferir que o mc-CEM-d parece apresentar um maior potencial de indução do fechamento da lesão sobre fibroblastos, se comparados ao controle e ao mc-CEM-ta.
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Figura 9. Efeito do mc-CEM-d e mc-CEM-ta no fechamento da lesão em culturas de fibroblastos dérmicos humanos.
A) Imagens representativas da lesão após 0, 24 e 48 h. B) Gráfico dos percentuais de fechamento da ferida in vitro, tratados mc-CEM-d e mc-CEM-ta, e DMEM sem SBF como controle (CTRL). Os valores representam a média ± erro padrão de 3 replicatas (4 campos/replicata). *p <0,05 por ANOVA duas vias seguido de teste de Bonferroni. Escala: 200 µm.
A
