UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
Fábio Cassola
Caracterização morfoanatômica e do perfil químico de três espécies de Justicia L. (Acanthaceae) sob diferentes condições de cultivo
CAMPINAS 2017
Fábio Cassola
Caracterização morfoanatômica e do perfil químico de três espécies de Justicia L. (Acanthaceae) sob diferentes condições de cultivo
Orientadora: Prof.ª Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer
CAMPINAS 2017
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, na área de fármacos, medicamentos e insumos para saúde.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO FÁBIO CASSOLA E ORIENTADO PELA PROF.ª DRA. JULIANA LISCHKA SAMPAIO MAYER.
Campinas, 01 de setembro de 2017
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.ª Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer (orientadora)
Prof.ª Dra. Ana Lúcia Tasca Góis Ruiz
Prof.ª Dra. Letícia Silva Souto
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esse trabalho aos meus pais João (do pé de feijão) e Maria (um dom, uma certa magia) e a todos os meus pequenos sonhadores que me ajudaram direta ou indiretamente na construção deste sonho.
AGRADECIMENTOS
Gostaria primeiramente de agradecer à minha orientadora Prof.ª Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer, pelos ensinamentos, apoio e amizade ao longo desses dois anos. Muito obrigado por acreditar no meu potencial mesmo eu possuindo outra formação acadêmica. É com grande admiração que eu digo que você foi parte fundamental na realização de um sonho e eu serei eternamente grato por isso.
À minha coorientadora Prof.ª Dra. Vera Lúcia Garcia, por aceitar a participação (e coorientação) no projeto, pelos ensinamentos, companheirismo e carinho proporcionado. Eu tenho profunda admiração pela força que a senhora carrega consigo, a qual levo como exemplo para enfrentar as ocasiões de adversidade.
Aos colegas do departamento de Biologia Vegetal pela amizade, pelos momentos de diversão e por todo o apoio.
Às adoráveis pessoas do Laboratório de Anatomia Vegetal (de antes e de agora), Ton, Carol, Deni, Elimar, Ilse, Bárbara, Debora, Marta, Davi, Beth, Laís, Edilaine, Aninha, Emília, Marília, Thaís e Aline pela prazerosa convivência, pelas melhores festas e por todo auxílio, os quais contribuíram diretamente para o desenvolvimento desse estudo.
Ao técnico do Laboratório de Anatomia Vegetal, Sr. Sebastião “Tião” Militão Junior pelo suporte técnico e auxílio na preparação de reagentes.
À Prof.ª Dra. Makeli Garibotti Lusa, colaboradora e querida amiga, por todo apreço, pelas discussões enriquecedoras, pelos valiosos ensinamentos a respeito de anatomia vegetal e das reações histoquímicas e pelo grande auxílio na realização dos cortes manuais.
À Gleicyanne (Emma) pela amizade, pelas conversas, pelo ombro amigo e por tudo que passamos juntos, até mesmo pelos choros (e quantos choros!). A melhor parceira para uma primeira viagem de avião e uma das pessoas mais amáveis que eu já conheci. – “’Shantay you stay’” forever in my heart... ♡”
Ao Rhaniel (Mel C) pelas risadas, pelo companheirismo, por toda paciência e pelas sugestões dadas para a montagem das pranchas. Muito obrigado também pelas indicações de músicas sertanejas, as quais prometo ouvir um dia e por me mostrar que pessoas góticas também sabem amar.
À Mariana (Victoria) por todos os conselhos, pela confiança transmitida e por todo o apoio. Eu tenho profunda admiração pela mulher decidida e madura que você é e sou muito
grato por ter alguém próximo a mim com essas qualidades. Obrigado querida amiga, companheira na produção de desenhos anatômicos e manicure nas horas vagas. P.S.: Desculpe-me por não ter respeitado os moDesculpe-mentos de silêncio.
Ao Edimar (Geri) por todas as explicações a respeito de anatomia vegetal, pelos inúmeros auxílios, tanto no dia-a-dia do laboratório quanto durante o processo de qualificação e por toda diversão que tivemos juntos. Faltam-me palavras para dizer todas as coisas fantásticas que você me proporcionou e o quão bom é ter uma pessoa maravilhosa como você em minha vida! “Não há ninguém igual a você. Você me dá nos nervos, mas eu sei que a vida seria chata sem você...” e são por essas e outras que essa amizade deu tão certo. – “’Shantay you stay’” forever in my heart too... ♡”
À Giovanna pelo companheirismo, carinho, autenticidade e amizade. Muito obrigado pelas inúmeras risadas com seus incríveis comentários e, obviamente, pela companhia no ônibus em todas as turnês.
À Jasmim e à Anninha pela amizade, paciência e disponibilidade para me auxiliar no desenvolvimento das análises estatísticas e na construção dos gráficos de variância.
Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) por toda a infraestrutura e por disponibilizar suas dependências para a realização de parte desse trabalho.
À equipe do Departamento de Química Orgânica e Farmacêutica (DQOF), Layany, Carol, Sinésio, Matheus, Gaby, Rebeca, Marili e Adilson pelo constante aprendizado, pela troca de experiência, por todo o suporte e pela amizade.
À Adriana pela paciência, por todos os ensinamentos a respeito das técnicas cromatográfica e, acima de tudo, pela amizade sincera. Muitíssimo obrigado por todo o auxílio e também pelos puxões de orelha! Você é uma profissional incrível e uma pessoa magnífica.
Às Prof.ª Dra. Ana Paula Caetano, Prof.ª Dra. Cíntia Alessandra Matiucci Pereira, Prof.ª Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya, Prof.ª Dra. Letícia Silva Souto e Prof.ª Dra. Ana Lúcia Tasca Góis Ruiz pelas sugestões e correções nos exames de qualificação e pré-banca. A todos os meus queridos professores pelo conhecimento proporcionado e por contribuírem para o meu crescimento, tanto pessoal quanto profissional.
Ao Eric pela amizade e pelo auxílio na elaboração do résumé.
À Prof.ª Dra. Julie Henriette Antoinette Dutilh por todas as colaborações científicas, pela prazerosa amizade e pelo auxílio na revisão do abstract.
À Vanessa por todo o apoio e suporte durante a minha ingressão no mestrado. Ao Alexandre pela colaboração e realização das análises cromatográficas em CLUE-EM.
A todos os meus amigos, tanto os próximos como os distantes, pelo incentivo constante. Ao Guilherme e ao André (Thank God I found you...) por toda dedicação, ajuda e incentivo no meu processo de mudança. Ao Hiago pelos bons momentos que partilhamos juntos e por ser “a Monica da minha Rachel”. “Welcome to the real world. It sucks. You are gonna love it.”
Ao “meu luar” e ao “meu amor” pelos pequenos momentos de felicidade proporcionados durante esse meio tempo.
Aos meus pais e demais familiares por toda a compreensão, amor, dedicação, confiança e incentivo incondicional. Ao meu avô Olívio, à minha avó Maria e à minha tia Amélia (in memoriam) pelas extraordinárias pessoas que foram em vida terrena e que, com toda certeza, torceriam pelo meu sucesso.
Ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (FAEPEX), pela concessão da bolsa de estudo.
A todas as outras pessoas que não foram mencionadas, mas que colaboraram de alguma forma na realização desse sonho, os meus mais sinceros agradecimentos. Obrigado por estarem ao meu lado, por me verem crescer e por deixarem que os outros soubessem que vocês acreditam no que eu ainda serei.
“Eles podem dizer o que quiserem dizer, tentar me deixar triste, mas eu não permitirei que ninguém consiga colocar nuvens sobre mim. E eles podem tentar muito fazer com que eu sinta que não significo nada, mas eu me recuso a duvidar no que acredito ou perder a fé nos
meus sonhos. Porque há uma luz em mim que brilha forte, eles podem tentar, mas eles não podem tirar isso de mim.”
Mariah Carey – Can't take that away (Mariah's theme)
“Eu costumava conhecer uma garota que tinha um sonho, a cabeça cheia de ambição, seu coração cheio de dor. Andando pelo mesmo caminho, vendo os mesmos rostos, desejando que ela pudesse trocar de lugar. Talvez eu pudesse voar para longe, ela diria, mesmo que o tempo
tenha seguido, eu ainda me sinto igual. E eu quero ser feliz. E eu quero encontrar meu caminho. E eu quero correr livre. E eu quero voar para longe.”
Rebecca Ferguson – Run free
“Mantenha a fé, não deixe ninguém lhe mudar. Você tem que saber quando é a hora de ir e tirar seus sonhos do chão. Então mantenha a fé, porque é só uma questão de tempo até que sua autoconfiança prevaleça. Acredite em você, não importa o quanto vai custar. Você pode
ser um vencedor, mas você precisa manter a fé. [...] Mas até esse dia chegar, eu te peço, mantenha a fé!”
RESUMO
Espécies de Justicia L. são empregadas com fins analgésico e anti-inflamatório, propriedades essas relacionadas aos flavonoides e outras substâncias fenólicas. Alterações morfoanatômicas e químicas podem ocorrer em virtude dos fatores bióticos e abióticos, naturalmente presentes no ambiente de cultivo. Essas alterações podem ser refletidas em mudanças no teor de metabólitos secundários de espécies medicinais, quesito fundamental para a produção de medicamentos fitoterápicos. Desse modo, esse estudo pretendeu avaliar a influência das condições de cultivo (estufa e campo) em parâmetros morfoanatômicos e químicos dos órgãos aéreos de três espécies de Justicia de interesse econômico. As espécies selecionadas foram Justicia brandegeeana Wassh. & L. B. Sm., Justicia gendarussa Burm. f. e Justicia pectoralis Jacq. Os resultados morfológicos mostraram que as plantas cultivadas em campo apresentaram melhor desenvolvimento, enquanto que as de estufa sofreram estiolamento. Através dos resultados anatômicos, observou-se grande semelhança nas estruturas das três espécies. As plantas cultivadas em estufa apresentaram maior área foliar e redução na espessura do mesofilo. Já as mudas que foram cultivadas no campo mostraram maior espessura da cutícula e do mesofilo, além de aumento na espessura da parede das células do tecido colenquimático do caule e do pecíolo. As espécies cultivadas no campo também tiveram aumento na densidade estomática. Entretanto, o cultivo não influenciou na densidade dos tricomas. Por meio das análises químicas realizadas evidenciou-se semelhança entre a composição química de J. gendarussa e de J. pectoralis com os dados descritos na literatura. Todavia, os trabalhos não mencionam a presença de cumarina em J. gendarussa, dado observado no presente estudo. O perfil químico de J. brandegeeana apresentou o indicativo da presença de terpenos e glicosídeos saponínicos por CCD e de rutina, ácido cafeico, quercetina e cumarina por CLUE-EM mostrando a evidente relação química entre J. brandegeeana (espécie ornamental) com as demais espécies medicinais utilizadas no estudo. O cultivo em estufa causou o aumento na concentração de alguns compostos em J. brandegeeana e em J. pectoralis. Análises espectrométricas revelaram aumento no conteúdo total de fenóis e de flavonoides e na atividade antioxidante frente ao radical livre DPPH nos extratos das plantas cultivadas no campo. Dentre as três espécies, J. pectoralis foi a que apresentou as maiores concentrações desses compostos e, por conseguinte, a maior atividade antioxidante. Isso mostrou que, embora o teor das substâncias quantificadas tenha sido maior no cultivo em estufa, o cultivo em campo ativou outras rotas metabólicas uma vez que os teores de fenóis e de flavonoides totais foram maiores nesse ambiente. Desse modo, as formas de cultivo as quais as espécies foram submetidas causaram alterações anatômicas e no teor de algumas substâncias. Para um melhor rendimento das substâncias quantificadas em J. brandegeeana e J. pectoralis, recomenda-se o cultivo em estufa. Entretanto, para um maior rendimento de fenóis totais, flavonoides totais e da atividade antioxidante do extrato, aconselha-se o cultivo das três espécies em campo.
ABSTRACT
Species of Justicia L. are employed for analgesic and anti-inflammatory purposes, properties related to flavonoids and other phenolic substances. Morphoanatomical and chemical changes can occur due to biotic and abiotic factors, naturally present in the growing environment. These changes may be reflected in variations on the content of secondary metabolites of medicinal species, a fundamental issue for the production of phytotherapics. In this way, this study aimed to evaluate the influence of growing conditions (greenhouse and field) on morphological and chemical parameters of the aerial organs of three species of Justicia of economic interest. The species selected were Justicia brandegeeana Wassh. & L. B. Sm., Justicia gendarussa Burm. f. and Justicia pectoralis Jacq. The morphological results showed that the plants cultivated in the field presented better development, while the greenhouse plants showed effects of shading. Through the anatomical results, great similarity was observed in the structures of the three species. The plants grown in greenhouse had a larger leaf area and a reduction in mesophyll thickness. However, the seedlings that were cultivated in the field showed greater thickness of the cuticle and the mesophyll, as well as an increase in the wall thickness of the cells of the stem and petiole. The species cultivated in the field also had an increase in stomatal density. However, the cultivation did not influence the density of the trichomes. The chemical composition of J. gendarussa and J. pectoralis was similar to that reported in the literature. Conversely, the studies do not mention the presence of coumarin in J. gendarussa, as observed in the present study. The chemical profile of J. brandegeeana presented the indicative of the presence of terpenes and saponinic glycosides by TLC and rutin, caffeic acid, quercetin and coumarin by UPLC-MS showing the evident chemical relationship between J. brandegeeana (ornamental species) and the other medicinal species used in the study. Greenhouse cultivation caused an increase in the concentration of some compounds in J. brandegeeana and J. pectoralis. Spectrometric analyzes revealed an increase in the total contents of phenols and flavonoids and antioxidant activity against the DPPH free radical of the extracts of the plants cultivated in the field. Among the three species, J. pectoralis presented the highest concentrations of these compounds and, consequently, the highest antioxidant activity. This showed that although the content of the quantified substances was higher in greenhouse cultivation, field cultivation activated other metabolic routes since the total contents of phenols and flavonoids were higher in this environment. Thus, the forms of cultivation to which the species were subjected caused anatomical changes and the content of some substances. For a better yield of quantified substances in J. brandegeeana and J. pectoralis, greenhouse cultivation is recommended. However, for a higher yield of total phenols, total flavonoids and antioxidant activity of the extract, it is advisable to cultivate the three species in the field. Keywords: Foliar diagnosis. Cultivation. Coumarin. Flavonoids.
RÉSUMÉ
Espèces du Justicia L. sont utilisées à des fins analgésiques et anti-inflammatoires, ces propriétés sont donc liées aux flavonoïdes et d’autres substances phénoliques. Les changements morpho-anatomiques et chimiques peuvent survenir en raison de facteurs biotiques et abiotiques, naturellement présents dans les zones de culture. Ces modifications peuvent être reflétées en changements sur le teneur de métabolites secondaire d’espèces médicinales, condition fondamentale pour la production de médicaments phytothérapiques. Ainsi, cette étude vise à évaluer l'influence des conditions de culture (serre et champ) sur des paramètres morpho-anatomiques et chimiques des organes aériens de trois espèces de Justicia d'intérêt économique. Les espèces sélectionnées pour cette étude furent Justicia brandegeeana Wassh. & L. B. Sm., Justicia gendarussa Burm. f. et Justicia pectoralis Jacq. Les résultats ont démontré que les plantes cultivées dans les champs avaient présenté un meilleur développement, alors que les plantes de serre ont étiolé. Par des résultats anatomiques, on a pu remarquer beaucoup de similarités dans les structures des trois espèces. Les plantes cultivées dans la serre ont présenté une plus grande superficie foliaire et réduction de l'épaisseur du mésophile. Cependant, les boutures qui ont été cultivées dans les champs, à leur tour, ont montré une plus grande épaisseur de la cuticule et du mésophile, et aussi l’augmentation de l'épaisseur dans la paroi cellulaire de la tige et du pétiole. Les espèces cultivées dans les champs ont également augmenté la densité stomatique. Toutefois, la culture n'a pas influencé la densité des trichomes. La composition chimique des espèces J. gendarussa et J. pectoralis était similaire aux données décrites dans la littérature. En contrepartie, les études ne mentionnent pas la présence de coumarine dans le J. gendarussa, donnée observée dans cette étude. Le profil chimique de la J. brandegeeana ont révélé l'indicatif de la présence de terpénoïdes et glycosides saponines par CCM et de rutine, acide caféique, quercitrine et coumarine par CLHP-SM montrant la relation chimique évidente entre J. brandegeeana (espèce ornemental) avec d'autres espèces médicinales du genre Justicia. La culture en serre a provoqué une augmentation de la concentration de certains composés chez J. brandegeeana et J. pectoralis. L’analyse spectrométrique a révélé une augmentation de la teneur totale en phénols et des flavonoïdes et de l'activité antioxydante contre le DPPH radical libre dans les extraits de plantes cultivées en plein champ. Parmi les trois espèces, J. pectoralis présentait les plus fortes concentrations de ces composés et, par conséquent, activité antioxydante la plus élevée. On a trouvé que bien que la teneur en substances quantifiées était plus élevée dans la culture en serre, la culture en plein champ et plein soleil activait d'autres voies métaboliques puisque les teneurs en phénol et en flavonoïdes totaux étaient plus élevées dans cet environnement. De cette façon, les formes de culture auxquelles les espèces étaient soumises ont provoqué des changements anatomiques et de la teneur de certaines substances. Pour un meilleur rendement en substances quantifiées chez J. brandegeeana et J. pectoralis, une culture en serre est recommandée. Cependant, pour un rendement plus élevé en phénols totaux, en flavonoïdes totaux et en activité antioxydante de l'extrait, il est conseillé de cultiver les trois espèces en plein soleil.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Sequência das atividades envolvidas no desenvolvimento de medicamentos
fitoterápicos ... 26
Figura 2. Principais fatores que podem levar a alterações morfoanatômicas e influenciar no acúmulo de metabólitos nas plantas ... 32
Figura 3. Localização das regiões em que a família Acanthaceae está presente ... 41
Figura 4. Distribuição de espécies do gênero Justicia por domínio fitogeográfico ... 42
Figura 5. Justicia brandegeeana Wassh. & L. B. Sm. ... 43
Figura 6. Justicia gendarussa Burm. f. ... 44
Figura 7. Justicia pectoralis Jacq. ... 46
Figura 8. Esquema das etapas para inclusão de material vegetal em historesina ... 53
Figura 9. Esquema das etapas de obtenção do extrato metanólico e das análises cromatográficas realizadas (CCD, CLUE-EM e CG-EM) ... 57
Figura 10. Esquema das etapas para a análise das substâncias fenólicas totais nos extratos metanólicos ... 60
Figura 11. Esquema das etapas para a análise dos flavonoides totais nos extratos metanólicos ... 61
Figura 12. Esquema das etapas para a análise da atividade antioxidante nos extratos metanólicos ... 62
Figura 13. Variação média do índice pluviométrico no período de setembro de 2015 a fevereiro de 2017 ... 64
Figura 14. Variação média da temperatura no período de setembro de 2015 a fevereiro de 2017 ... 65
Figura 15. Aspecto geral de indivíduos e folhas de três espécies de Justicia após 17 meses de cultivo nos ambientes de estufa e campo ... 66
Figura 16. Eletromicrografias de varredura do caule de espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo)... 68
Figura 17. Secções do caule de espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 69
Figura 18. Secções do pecíolo de espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 73
Figura 19. Eletromicrografias de varredura da face adaxial do limbo de espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 78 Figura 20. Eletromicrografias de varredura da face abaxial do limbo de espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 79 Figura 21. Secções do limbo de espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 80 Figura 22. Anexos epidérmicos do limbo de espécies de Justicia ... 81 Figura 23. Área foliar das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 83 Figura 24. Área foliar específica das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo)... 84 Figura 25. Espessura média da cutícula na face adaxial das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 85 Figura 26. Espessura média da cutícula na face abaxial das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 85 Figura 27. Espessura média da epiderme na face adaxial das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 86 Figura 28. Espessura média da epiderme na face abaxial das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 86 Figura 29. Espessura média do parênquima paliçádico das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 87 Figura 30. Espessura média do parênquima lacunoso das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 88 Figura 31. Densidade estomática das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo)... 89 Figura 32. Densidade de tricomas glandulares das folhas de Justicia a partir da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 89 Figura 33. Reações histoquímicas no limbo de espécies de Justicia cultivadas em estufa ... 92 Figura 34. Variação na intensidade das reações histoquímicas no limbo de espécies de Justicia em vista da forma de cultivo utilizada (estufa e campo) ... 94 Figura 35. Análise para o indicativo da presença de terpenos por cromatografia em camada delgada em espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 96
Figura 36. Análise para o indicativo da presença de cumarinas por cromatografia em camada delgada em espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 97 Figura 37. Análise comparativa entre o extrato metanólico de espécies de Justicia frente ao padrão de cumarina por cromatografia em camada delgada ... 98 Figura 38. Cromatograma CG-EM ampliado do extrato metanólico de J. pectoralis ... 98 Figura 39. Espectro de massas da cumarina presente no extrato metanólico de J. pectoralis 99 Figura 40. Análise para a presença de substâncias de maior polaridade por cromatografia em camada delgada em espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... ... 99 Figura 41. Análise comparativa entre o extrato metanólico de J. brandegeeana frente aos padrões analíticos por cromatografia em camada delgada ... 100 Figura 42. Análise comparativa entre o extrato metanólico de J. gendarussa frente aos padrões analíticos por cromatografia em camada delgada... 101 Figura 43. Análise comparativa entre o extrato metanólico de J. pectoralis frente aos padrões analíticos por cromatografia em camada delgada... 101 Figura 44. Cromatograma CLUE-EM dos padrões analíticos em modo positivo ou negativo de ionização ... 103 Figura 45. Quantificação das substâncias das folhas de J. brandegeeana por CLUE-EM ... 106 Figura 46. Quantificação das substâncias das folhas de J. gendarussa por CLUE-EM ... 107 Figura 47. Quantificação das substâncias das folhas de J. pectoralis por CLUE-EM ... 108 Figura 48. Teor de fenóis totais e de flavonoides totais das folhas de espécies de Justicia em vista da forma de cultivo aplicada (estufa e campo) ... 109 Figura 49. Análise qualitativa da atividade antioxidante por cromatografia em camada delgada em espécies de Justicia por meio da redução do radical DPPH em vista da forma de cultivo aplicada (estufa e campo) ... 110 Figura 50. Análise quantitativa da atividade antioxidante dos extratos de Justicia por meio da redução do radical DPPH em vista da forma de cultivo aplicada (estufa e campo) ... 111 Figura 51. Análise qualitativa para a presença de alcaloides em espécies de Justicia em vista da forma de cultivo aplicada (estufa e campo) ... 113 Figura 52. Análise para a presença de glicosídeos saponínicos por cromatografia em camada delgada em espécies de Justicia sob diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 114
Figura 53. Análise qualitativa de espuma em espécies de Justicia em vista da forma de cultivo aplicada (estufa e campo) ... 114 Figura 54. Formação do complexo flavonoide-alumínio ... 121 Figura 55. Princípio da atividade de captação de radicais pelo DPPH ... 122
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Efeitos de diferentes fontes de radiação na fisiologia vegetal ... 39 Tabela 2. Resumo sobre as formas de uso e aplicações de J. pectoralis ... 46 Tabela 3. Relação entre a idade e a posologia indicada para a utilização do infuso de J. pectoralis ... 47 Tabela 4. Relação da distribuição das amostras de Justicia nos ambientes de cultivo em estufa e campo ... 50 Tabela 5. Região de coleta das amostras de caule e folha usadas nas análises morfoanatômicas qualitativas ... 52 Tabela 6. Gradiente para avaliação cromatográfica em CLUE-EM ... 58 Tabela 7. Resumo das diferenças encontradas no caule de espécies de Justicia em vista da forma de cultivo aplicado (estufa e campo)... 71 Tabela 8. Resumo das diferenças encontradas no pecíolo de espécies de Justicia em vista da forma de cultivo aplicado (estufa e campo)... 75 Tabela 9. Resumo das diferenças encontradas no limbo de espécies de Justicia em vista da forma de cultivo aplicado (estufa e campo)... 82 Tabela 10. Análise (valor de t, graus de liberdade e valor de p) da área foliar, área foliar específica, espessura das estruturas foliares, densidade estomática e de tricomas glandulares de espécies de Justicia submetidas à diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 90 Tabela 11. Localização e intensidade das reações histoquímicas para o limbo de espécies de Justicia em diferentes ambientes de cultivo (estufa e campo) ... 95 Tabela 12. Compostos usados como padrão de identificação, razão massa/carga (m/z), modo de ionização (EM) e faixa de tempo de retenção (tR) ... 102
Tabela 13. Resumo das substâncias encontradas nas espécies de Justicia através das diferentes técnicas cromatográficas empregadas ... 104 Tabela 14. Análise (valor de t, graus de liberdade e valor de p) da quantificação individual das substâncias, fenóis totais, flavonoides totais e atividade antioxidante do extrato metanólico de espécies de Justicia submetidas à diferentes formas de cultivo (estufa e campo) ... 112
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aa Atividade antioxidante
ABS Absorção
ACa Ácido cafeico
ACl Ácido clorogênico
AF Área foliar
AFE Área foliar específica
Al Alumínio
AlCl3 Cloreto de alumínio
B Boro
BEH Ethylene bridged hybrid
BHT Butil-hidroxi-tolueno
C Campo
C Cumarina
Ca Cálcio
CCD Cromatografia em camada delgada
Cd Cádmio
CEASA Centrais de Abastecimento de Campinas
CEPAGRI Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura
CG-EM Cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas
CLUE-EM Cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massas
cm Centímetros
cm² Centímetros quadrados
cm²/g Centímetros quadrados por grama
CO2 Dióxido de carbono
COX Cicloxigenase
COX-2 Cicloxigenase-isoforma 2
CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
D Diidrocumarina
DNA Deoxyribonucleic acid
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
E Estufa
EAG Equivalente em ácido gálico
ED50 Effective dose 50%
EM Espectro de massas
ESALQ Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
ESI Electrospray ionization
ERO Espécie reativa de oxigênio
FCA Freund complete adjuvant
FN– κB Fator nuclear kappa B
g Grama
gl Graus de liberdade
g/mol Grama por mol
h Horas
He Hélio
HIV Human immunodeficiency virus
HPO42- Fosfato ácido
H2PO4- Fosfato diácido
H2O Água
H2SO4 Ácido sulfúrico
IB Instituto de Biologia
IC50 Inhibitory concentration 50%
IL–6 Interleucina-6
iNOS Inducible nitric oxide synthase
JbC Justicia brandegeeana cultivada em campo JbE Justicia brandegeeana cultivada em estufa JgC Justicia gendarussa cultivada em campo JgE Justicia gendarussa cultivada em estufa JpC Justicia pectoralis cultivada em campo JpE Justicia pectoralis cultivada em estufa
kV Quilovolt
LPS Lipopolissacarídeo
m Metros
M Molar
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MeOH Metanol
mg/kg Miligrama por quilograma
mg/mL Miligrama por mililitro
min. Minutos
mL Mililitro
mL/min. Mililitro por minuto
MM Massa molecular
mM Milimolar
mm Milímetros
mm² Milímetros quadrados
mmol/L Milimol por litro
mRNA Ribonucleic acid messenger
m/v Massa por volume
m/z Razão massa carga
NaCl Cloreto de sódio
Na2CO3 Carbonato de sódio
NIST National Institute of Standards and Technology
nm Nanômetro
NP Ácido difenilbórico 2-amino etil éster
P Fósforo Pb Chumbo pH Potencial hidrogeniônico Pm Ponto misto Q Quercetina R Rutina R² Coeficiente de determinação
RENISUS Relação nacional de plantas medicinais de interesse ao Sistema Único de Saúde
Rf Retention factor
rpm Rotação por minuto
sp. Espécie
SUS Sistema Único de Saúde
T. máx. Temperatura máxima
T. min. Temperatura mínima
TPM Tensão pré-menstrual
TQD Triple quadrupole mass spectrometer
tR Tempo de retenção
U Umbeliferona
UEC Herbário da Universidade Estadual de Campinas
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
UV Ultravioleta
UV-B Ultravioleta do tipo B
V Volt
Vf Volume final
v/v Volume por volume
v/v/v Volume por volume por volume
v/v/v/v Volume por volume por volume por volume
Zn Zinco
ºC Graus Celsius
ºC/min. Graus Celsius por minuto
1O2 Oxigênio singleto [ ] Concentração λ Lambda 5–LOX 5-lipoxigenase µm Micrômetro µL Microlitro
µg/mL Micrograma por mililitros
SUMÁRIO RESUMO ... 10 ABSTRACT ... 11 RÉSUMÉ ... 12 LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... 13 LISTA DE TABELAS ... 17 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 18 1. INTRODUÇÃO ... 26 2. REFERENCIAL TEÓRICO ... 29 2.1 Plantas medicinais: conhecimento e utilização ... 29 2.2 Influência das diferentes condições ambientais no cultivo de espécies medicinais (estrutura foliar e composição química) ... 31 2.2.1 Fatores bióticos ... 32 2.2.1.1 Micro-organismos ... 32 2.2.1.2 Fatores antropogênicos ... 33 2.2.2 Fatores abióticos... 34 2.2.2.1 Disponibilidade de água ... 34 2.2.2.2 Salinidade ... 35 2.2.2.3 Composição do solo ... 36 2.2.2.4 Temperatura... 37 2.2.2.4.1 Altas temperaturas (30–40 ºC) ... 37 2.2.2.4.2 Baixas temperaturas (1–10 ºC) ... 38 2.2.2.5 Luminosidade ... 38 2.2.2.6 Efeitos da altitude ... 40 2.3 Família Acanthaceae ... 40 2.3.1 Gênero Justicia L. ... 41
2.3.1.1 Justicia brandegeeana Wassh. & L. B. Sm. ... 42 2.3.1.2 Justicia gendarussa Burm. f. ... 43 2.3.1.3 Justicia pectoralis Jacq. ... 45 3. OBJETIVO ... 49 3.1 Objetivo geral ... 49 3.2 Objetivos específicos ... 49 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 50 4.1 Material vegetal, parâmetros climáticos e condições de cultivo ... 50 4.2 Análises morfoanatômicas qualitativas ... 51 4.2.1 Microscopia de luz ... 51 4.2.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 53 4.2.3 Reações histoquímicas ... 54 4.3 Análises morfoanatômicas quantitativas ... 54 4.3.1 Área foliar (AF) e área foliar específica (AFE) ... 54 4.3.2 Espessura das estruturas foliares ... 55 4.3.3 Densidade estomática e de tricomas ... 55 4.4 Análises químicas ... 56 4.4.1 Produção dos extratos ... 56 4.4.2 Análises cromatográficas ... 56 4.4.2.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) ... 56 4.4.2.2 Cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLUE-EM)... 58 4.4.2.3 Cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (GC-EM) ... 59 4.4.3 Estimativa do teor de substâncias fenólicas totais ... 59 4.4.4 Estimativa do teor de flavonoides totais ... 60 4.4.5 Estimativa da atividade antioxidante ... 61
4.4.5.1 Análise qualitativa da atividade antioxidante ... 61 4.4.5.2 Análise quantitativa da atividade antioxidante ... 62 4.4.6 Avaliação da presença de alcaloides ... 63 4.4.7 Avaliação da presença de saponinas ... 63 5. RESULTADOS ... 64 5.1 Variação pluviométrica e da temperatura ... 64 5.2 Desenvolvimento das espécies ... 65 5.3 Análises anatômicas (microscopia de luz e MEV) ... 67 5.3.1 Caule ... 67 5.3.2 Pecíolo ... 72 5.3.3 Limbo ... 76 5.4 Análise da área foliar, área foliar específica, espessura das estruturas foliares e densidade de estômatos e tricomas ... 83 5.5 Testes histoquímicos ... 91 5.6 Avaliação da composição química dos extratos por análises cromatográficas (CCD, CLUE-EM e CG-EM) ... 96 5.7 Quantificação individual das substâncias, fenóis totais, flavonoides totais e atividade antioxidante dos extratos ... 106 5.8 Avaliação da presença de alcaloides ... 113 5.9 Avaliação da presença de saponinas ... 113 6. DISCUSSÃO ... 115 6.1 Área foliar, área foliar específica, espessura das estruturas foliares e densidade de estômatos e tricomas ... 115 6.2 Aspectos anatômicos ... 117 6.3 Aspectos químicos quantitativos ... 119 6.4 Reações histoquímicas e aspectos químicos qualitativos ... 123 7. CONCLUSÃO ... 126
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 128 APÊNDICE A ... 147 APÊNDICE B ... 165 APÊNDICE C ... 177 APÊNDICE D ... 179 ANEXO A ... 183 ANEXO B ... 184
1. INTRODUÇÃO
Entende-se como planta medicinal toda a espécie que apresenta propriedades farmacológicas e que auxilia no processo de cura e/ou na prevenção de doenças (CZELUSNIAK et al., 2012). Essas espécies têm sido utilizadas há milhares de anos, sendo um dos primeiros recursos empregados pelo homem na cura das enfermidades (OLIVEIRA; ARAUJO, 2007). As plantas medicinais podem ser facilmente encontradas em quintais residenciais e são amplamente comercializadas em mercados e feiras (ZANK; ÁVILA; HANAZAKI, 2016), revelando seu valor econômico que acaba despertando interesse e estimula a constante busca por novas substâncias terapêuticas (GARCEZ et al., 2016).
Espécies de Justicia L. são muito utilizadas na medicina popular para o tratamento de diversas patologias como depressão, anemia, epilepsia, infecção renal e enxaqueca (CORRÊA; ALCÂNTARA, 2012). Dentre essas espécies, Justicia gendarussa Burm. f. e Justicia pectoralis Jacq. têm grande emprego, principalmente nas regiões Norte e Nordeste do Brasil, sendo geralmente utilizadas na forma de decoto ou infusão (OLIVEIRA et al., 2000). As cumarinas, principal constituinte de J. pectoralis, apresentaram efeitos benéficos para o tratamento de doenças do trato respiratório (LEAL et al., 2000), enquanto que os flavonoides presentes em J. gendarussa parecem ser os responsáveis pelos efeitos positivos no tratamento de artrite e de outros processos inflamatórios (JOTHIMANIVANNAN; KUMAR; SUBRAMANIAN, 2010).
O processo de desenvolvimento de um medicamento fitoterápico passa por várias etapas (Figura 1), as quais são essenciais para produção de um medicamento de qualidade e com boa eficácia. Embora essas etapas não ocorram de forma linear, elas compreendem o levantamento e a correta seleção da espécie vegetal, o desenvolvimento adequado das formas de cultivo, a quantificação dos princípios ativos e a avaliação dos testes clínicos in vitro e in vivo (ARNOUS; SANTOS; BEINNER, 2005).
Figura 1. Sequência das atividades envolvidas no desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos
A qualidade de uma planta medicinal é determinada pela quantidade de princípios ativos que ela produz (BRASIL, 2006). Dessa maneira, procedimentos inadequados durante o cultivo, coleta e armazenamento dessas espécies acabam refletindo diretamente no teor dessas moléculas (PIMENTA et al., 2009). Conforme ressaltado por França e colaboradores (2008), uma falha nos processos de colheita e secagem podem gerar produtos de degradação na matéria-prima vegetal, causando a perda parcial ou total dos ativos. Situações como essa causam subdosagem durante o tratamento, ou seja, a dosagem do medicamento fica abaixo da concentração adequada para a produção do efeito (BARA et al., 2006), agravando o quadro clínico do usuário. Outra condição é sobre o armazenamento da matéria-prima que, se feito de maneira incorreta, pode causar a diminuição dos princípios ativos além de contaminações de origem fúngica e bacteriana (ROCHA; SOARES; CORRÊA, 2004). Essas situações acometem a qualidade do produto, podendo gerar um quadro de intoxicação.
Além disso, o teor dos princípios ativos também pode ser influenciado pela condição de cultivo em que a planta é submetida. Fatores bióticos (ataque de patógenos, ação humana, etc.) e abióticos (luminosidade, disponibilidade hídrica, estado nutricional, temperatura, altitude, etc.) podem acarretar no aumento ou na diminuição dessas substâncias (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Esses fatores também são responsáveis por originar alterações na fisiologia, morfologia e anatomia das espécies (MILANEZE-GUTIERRE; MELLO; DELAPORTE, 2003), evidenciando o processo de adaptação proporcionado pela plasticidade destes organismos.
O conhecimento a respeito das possíveis modificações morfoanatômicas causadas pelo ambiente de cultivo são importantes para a produção de fitofármacos, visto que muitas dessas estruturas armazenam as substâncias de interesse farmacológico. Um exemplo é o desenvolvimento dos tricomas glandulares, apêndice epidérmico que ocorre em diversos órgãos vegetais e que atua como sítio de biossíntese e armazenamento dos óleos essenciais (TAIZ; ZEIGER, 2013). Nesse contexto, Pegoraro e colaboradores (2011) constataram que as folhas de Mentha × gracilis Sole (hortelã) crescidas sob maior disponibilidade de luz tiveram maior densidade de tricomas glandulares comparado com as plantas cultivadas em ambientes sombreados. Quanto as análises químicas, Pegoraro e colaboradores (2010) verificaram que a adubação e a alta intensidade luminosa influenciaram positivamente no rendimento de óleo essencial das folhas de Mentha × piperita L. var. piperita (hortelã-pimenta) e que o mentol foi o componente majoritário.
Considerando esses aspectos, o presente trabalho objetivou avaliar a influência das condições de cultivo (estufa e campo) em parâmetros morfoanatômicos e químicos dos órgãos
aéreos de três espécies de Justicia L. (Justicia brandegeeana Wassh. & L. B. Sm., Justicia gendarussa Burm. f. e Justicia pectoralis Jacq.) de interesse econômico.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Plantas medicinais: conhecimento e utilização
A difusão do conhecimento popular à respeito da utilização de plantas medicinais ocorre principalmente de forma oral (ROSSATO; CHAVES, 2012). Esse tipo de transmissão promove a utilização e o cultivo dessas espécies (PIRES et al., 2016), além de estimular o interesse do meio científico na busca por informações a respeito das propriedades terapêuticas dessas espécies (FERRO, 2008). Com o avanço dos estudos, algumas das moléculas descobertas serviram como base para a produção de fármacos que atualmente são amplamente utilizados na clínica. Alguns exemplos são a emetina (anti-helmíntico), a vincristina (quimioterápico) e a colchicina (anti-inflamatório) (FOGLIO et al., 2006).
Com o passar dos anos, o uso de produtos de origem natural vem conquistando cada vez mais espaço. De acordo com Dell’ Antonio e colaboradores (2015), o predomínio do uso da fitoterapia é estimado em torno de 50% da população francesa, australiana e alemã e de 42%–69% da população norte-americana. A maioria dos produtos utilizados por essas populações atuam no combate da insônia/ansiedade (Matricaria recutita L.), resfriado (Allium sativum L.), enxaqueca (Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip.; Petasites hybridus (L.) G. Gaertn., B. Mey. & Scherb.), entre outros (FALZON; BALABANOVA, 2017).
O aumento no consumo de fitoterápicos pode ser relacionado ao receio que os usuários têm sobre as intoxicações provocadas pelos produtos farmacêuticos sintéticos, originadas em virtude da sua má administração (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008). Em vista disso, ocorre uma grande procura na substituição dessa forma de tratamento por outras práticas (integrativas e alternativas), como o uso de plantas medicinais (CZELUSNIAK et al., 2012). Porém, essa situação está diretamente vinculada à falsa concepção de que o uso de plantas medicinais é “natural” e de que “se ela não fizer bem, mal não irá fazer”, o que contribui para o aumento no número de mortes por intoxicação medicamentosa (NUNES; MACIEL, 2016).
O uso de plantas medicinais no Brasil também é impulsionado por outros fatores como os elevados custos dos medicamentos industrializados, as dificuldades enfrentadas pela população no serviço de saúde e pela tendência das pessoas a buscarem terapias alternativas (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008). De acordo com Ekor (2014), as populações de países menos desenvolvidos (aproximadamente 70% da população mundial) utilizam produtos fitoterápicos como fonte primária para o tratamento das enfermidades. Os principais motivos
para esse uso decorrem da ausência de alternativas terapêuticas e do uso tradicional de ervas medicinais por essas populações (VEIGA JUNIOR, 2008; EKOR, 2014).
Outro fator que desempenha importante papel no consumo de medicamentos é a propaganda. A influência da propaganda na aquisição de medicamentos é observada principalmente com os fitoterápicos (LEAL; TELLIS, 2015), visto que esses medicamentos são na sua maioria de venda livre e não necessitam de prescrição médica (VERNIZI; SILVA, 2016). Desse modo, é necessária uma maior atenção a respeito da forma com que as informações sobre os medicamentos fitoterápicos é vinculada nas propagandas, uma vez que muitas delas são feitas de maneira errônea (MARQUES et al., 2016). Vários dos anúncios não contém sequer advertências sobre o uso desses produtos, o que torna-se preocupante uma vez que boa parte dos consumidores são idosos (OLIVEIRA; SANTOS, 2016). De acordo com o estudo de Ângelo e Ribeiro (2014), os principais medicamentos fitoterápicos utilizados pelos idosos são carqueja (hipoglicemiante), ginkgo (vasodilatador), espinheira-santa (gastroprotetor), calêndula (anti-inflamatória) e guaraná (analgésico).
Além da correta promoção dos fitoterápicos, o controle de qualidade também é um importante fator na cadeia produtiva desses produtos. Diversas etapas são necessárias para a qualidade dos produtos fitoterápicos, considerando-se desde o cultivo das espécies medicinais até o produto acabado (GIL, 2007). Entre essas etapas, a correta identificação botânica e a disponibilidade de informações a respeito da morfologia e anatomia dessas espécies são fatores que afetam diretamente a qualidade e, consequentemente, a eficácia dos fitoterápicos (SILVA; SANTOS; RABELO, 2010).
Em relação à necessidade da correta identificação botânica das espécies, pode-se citar como exemplo o boldo. A espécie Peumus boldus Molina, originária do Chile, contém alcaloides (especificamente boldina) que promovem o aumento de secreção biliar no intestino. No Brasil, diversas espécies sem ação farmacológica comprovada são conhecidas e comercializadas como boldo, como é o caso do “falso-boldo” (Plectranthus barbatus Andr.) (FUCK et al., 2005). Os relatos etnofarmacológicos mencionam o uso da infusão das folhas de P. barbatus para interrupção da gravidez (ALMEIDA; LEMONICA, 2000). Segundo Almeida e Lemonica (2000), essa propriedade foi observada em fetos de ratos albinos que receberam a administração diária de 880 mg/kg do extrato hidroalcoólico de P. barbatus.
Intoxicações causadas por plantas medicinais também ocorrem, diversas vezes, em vista da falta de conhecimento a respeito das condições de cultivo dessas espécies (NICOLETTI et al., 2007). O desenvolvimento de estudos sobre os efeitos causados pelo cultivo é de grande importância, uma vez que essa etapa influencia diretamente na concentração dos metabólitos
secundários no vegetal (FURLAN, 1996). Técnicas inapropriadas no cultivo de espécies medicinais podem causar um risco à saúde já que mudanças no teor desses metabólitos alteram o efeito farmacológico do produto acabado (GIL, 2007) ocasionando situações de subdosagem ou superdosagem (dosagem excessiva de um medicamento).
2.2 Influência das diferentes condições ambientais no cultivo de espécies medicinais (estrutura foliar e composição química)
As características morfoanatômicas de uma espécie, além de determinadas geneticamente, são o reflexo das condições ambientais a que a planta está exposta (RODRIGUES et al., 2014). A plasticidade dos órgãos, principalmente das folhas, revela os processos adaptativos desenvolvidos pelo organismo vegetal para sobreviver à essas situações (TAIZ; ZEIGER, 2013). Segundo Reeve e Sherman (1993), a adaptação pode ser definida como um fenótipo estabelecido que apresenta êxito reprodutivo sob as diferentes variações (bióticas e abióticas) dentro de um determinado ambiente.
O processo de adaptação é causado por uma gama de fatores que induzem não somente à mudanças morfológicas e anatômicas (KOFIDIS; BOSABALIDIS; MOUSTAKAS, 2003), mas também fisiológicas e na produção de metabólitos (primários e secundários) (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Esses fatores podem ser classificados em dois tipos; os bióticos, que compreendem as ações dos micro-organismos (em sua maioria patógenos), animais (herbivoria) e de origem antropogênica e os abióticos, que incluem por exemplo a disponibilidade de água e de luz, a composição do solo (nutrientes e sais minerais) e as variações de temperatura (Figura 2) (LARCHER, 2000).
Figura 2. Principais fatores que podem levar a alterações morfoanatômicas e influenciar no acúmulo de
metabólitos nas plantas (Fonte: GOBBO-NETO; LOPES, 2007)
A seguir serão apresentadas situações em que algumas espécies medicinais apresentaram alterações morfoanatômicas e químicas em vista da atuação dos fatores bióticos e abióticos durante seu cultivo.
2.2.1 Fatores bióticos
Esse tipo de situação ocorre como resultado dos danos causados nas plantas por outros organismos vivos compreendendo as ações do homem, de animais e de micro-organismos (bactérias, vírus, fungos, parasitas, nematoides, etc.) (LARCHER, 2000). As plantas não possuem um sistema de defesa como os animais, mas mostram resistência contra esses fatores através da produção de metabólitos secundários (VERMA; SHUKLA, 2015).
2.2.1.1 Micro-organismos
Diferente dos micro-organismos endofíticos que não geram, aparentemente, nenhum tipo de dano ao seu hospedeiro, os micro-organismos fitopatogênicos são prejudiciais às plantas e podem ser desencadeadores de doenças (AZEVEDO, 1998). Danos causados por esses patógenos podem ter influência tanto na expressão do metabolismo secundário (GOBBO-NETO; LOPES, 2007) quanto na anatomia e morfologia das plantas.
O enrolamento das folhas é uma resposta comum das plantas à deficiência hídrica, entretanto, há relatos da atuação de micro-organismos como sendo a causa desse tipo de adaptação (KADIOGLU et al., 2012). Nesse contexto, Gazel e Önelge (2003) observaram que mudas de Vitis vinifera L. (uva) infectadas com vírus apresentaram, além do enrolamento das folhas, o surgimento de manchas e clorose (amarelecimento dos tecidos clorofilados).
Esse tipo de infecção também pode estimular a produção de substâncias que atuam na redução ou inibição do ataque desses agentes. A resposta à essa condição pode acontecer no órgão atacado (resposta local) ou em órgãos distantes da região atacada e que não estão sendo afetados (resposta sistêmica) (HEIL; BOSTOCK, 2002). A respeito disso, Wojakowska e colaboradores (2013) mencionam que o teor de fenóis das folhas de Lupinus angustifolius L. (tremoceiro-azul) aumentaram em decorrência da infecção fúngica causada por Colletotrichum lupini.
2.2.1.2 Fatores antropogênicos
Define-se como causa antropogênica aquela onde há a falta ou excesso de atividades humanas, as quais resultam em impactos ambientais (TAIZ; ZEIGER, 2013). A extensão em que as funções vitais das plantas são afetadas pelos poluentes, diariamente produzidos pelo homem, dependem de diversos fatores como as condições climáticas, a forma de crescimento e a idade da planta. Mais especificamente em relação aos poluentes, alguns fatores devem ser levados em conta como a sua propriedade química, concentração e a duração de exposição da planta a ele (LARCHER, 2000).
Metais pesados como o chumbo (Pb) são amplamente utilizados no meio industrial (indústria de tintas, corantes, cosméticos, etc.) (DASCANIO et al., 2016) e podem induzir a alterações no organismo vegetal quando presentes no ambiente de cultivo. Essas alterações incluem reduções nas células do mesofilo e na produção de clorofilas causando, consequentemente, reduções no processo fotossintético (RIBEIRO et al., 2015), o que acarreta na diminuição do crescimento e desenvolvimento das plantas (STIBOROVÁ; DITRICHOVÁ; BREZINOVÁ, 1987). Nesse aspecto, Kosobrukhov, Knyazeva e Mudrik (2004), ao analisar o cultivo de Plantago major L. (tanchagem) em solo com diferentes concentrações de Pb, notaram que o aumento da concentração de Pb foi proporcional à intensidade de danos causados nas plantas. Algumas características observadas foram a diminuição significativa no crescimento das plantas, a baixa produção de cloroplastos e o aumento na quantidade de estômatos em ambas as faces da folha.
Além do Pb, outro metal utilizado em grande escala pela indústria é o cádmio (Cd). Empregado geralmente para a fabricação de pilhas e baterias, o aumento no uso industrial desse elemento acabou contribuindo para o aumento da sua contaminação ambiental (GUIMARÃES et al., 2008). A exposição de plantas a quantidades excessivas de Cd resulta em diminuição da capacidade de absorção de nutrientes e acúmulo desse elemento pelas raízes (KAN et al., 2016), além de interferir na produção dos metabólitos secundários. Por exemplo, análises fitoquímicas com Hypoxis hemerocallidea Fisch. & C.A. Mey (estrela-amarela) mostraram diminuição no teor de hipoxósido à exposição de Cd e Al e quantidades significativamente elevadas de fenóis totais e de flavonoides totais no tratamento moderado com Cd (5 mg/L) por seis semanas (OKEM et al., 2015).
2.2.2 Fatores abióticos
Durante seu desenvolvimento, as plantas interagem com o ambiente circundante, estando constantemente em contato com diferentes componentes abióticos como a luminosidade, a disponibilidade de água e as variações de sais minerais, nutrientes e temperatura. As plantas requerem estes componentes na quantidade apropriada para o seu crescimento e sobrevivência (LARCHER, 2000). Entretanto, uma maior ou menor quantidade desses componentes abióticos pode levar à alterações morfoanatômicas e à variação na produção ou acúmulo dos metabólitos secundários nas plantas (VERMA; SHUKLA, 2015).
2.2.2.1 Disponibilidade de água
O excesso, ou a falta, de água pode afetar drasticamente o desempenho das funções normais do organismo vegetal. Em casos de redução do potencial hídrico nota-se, por exemplo, a diminuição do crescimento da planta e a limitação da expansão do limbo (SHAO et al., 2008). Por outro lado, um excesso na disponibilidade de água causa a restrição de gases e de nutrientes minerais ocasionando a redução do diâmetro do metaxilema e do protoxilema (MARYAM; NASREEN, 2012).
As respostas plásticas evidenciam os mecanismos desenvolvidos pelas espécies como forma de adaptação e sobrevivência às variações hídricas. Estratégias a fim de reduzir a transpiração (BOSABALIDIS; KOFIDIS, 2002), por exemplo, podem ser observadas no estudo desenvolvido por Chartzoulakis e colaboradores (2002). Os autores verificaram que o cultivo de duas variedades de Persea americana Mill. (abacate) (“Fuerte” e “Hass”) sob moderada
disponibilidade de água resultaram em diminuição significativa na espessura do mesofilo, bem como na espessura total do limbo. Também foi observado que a variedade “Fuerte” apresentou maior densidade celular do colênquima quando comparada às amostras que foram irrigadas normalmente. Como consequência, a quantidade de espaços intercelulares das folhas submetidas à moderada oferta hídrica foi menor do que as irrigadas normalmente. Esses resultados foram semelhantes aos encontrados por Ciordia e colaboradores (2012) em Castanea sativa Mill. (castanheira).
Esse tipo de alteração na estrutura foliar também pode promover o acúmulo de determinadas substâncias no mesofilo como mucilagem e outros metabólitos secundários (BOSABALIDIS; KOFIDIS, 2002) como visto por Zobayed, Afreen e Kozai (2007) em Hypericum brasiliense Choisy (erva-de-São-João). A escassez de água proporcionou um aumento na quantidade de quercetina, rutina e hiperforina e uma diminuição na concentração de hipericina e pseudo-hipericina (ZOBAYED; AFREEN; KOZAI, 2007).
2.2.2.2 Salinidade
Os habitats salinos são definidos pelo excessivo conteúdo de sais prontamente solúveis e são encontrados, geralmente, nas proximidades da costa marinha e em estuários, onde as águas salgada e doce se misturam em decorrência das marés (LARCHER, 2000). Plantas desenvolvidas em ambientes com alta concentração de íons cloreto e sódio têm dificuldade na absorção de certos nutrientes, o que acarreta em prejuízos ao metabolismo (WILLADINO; CAMARA, 2010). Minerais como nitrato, potássio e cálcio têm sua absorção reduzida em solos com altas concentrações de cloreto de sódio (NaCl) (LARCHER, 2000). Dessa forma, a compartimentação de sais dentro das células (MUNNS; TERMAAT, 1986 apud FARIAS et al., 2009) é um quesito importante, uma vez que esse fenômeno leva a modificações nos processos fisiológicos, bioquímicos e nutricionais das plantas (TAIZ; ZEIGER, 2013).
A alta concentração de sais no ambiente de cultivo também gera alterações na morfologia e anatomia das plantas com redução no crescimento, na área foliar e no diâmetro do caule (SILVA et al., 2008). Resultados semelhantes à esses foram observados em mudas de Mentha aquatica L. (hortelã-da-água) (HADDADI; HASSANPOUR; NIKNAM, 2016). Os autores verificaram que a salinidade (especificamente na concentração de 150 mM de NaCl) reduziu significativamente os parâmetros de crescimento, conteúdo relativo de água e de proteínas em M. aquatica. O estudo anatômico da raiz também revelou a presença de uma
camada adicional de endoderme e a redução no tamanho dos vasos do xilema na concentração de 100 mM de NaCl.
O desequilíbrio iônico e osmótico causado pela salinidade pode estimular a produção de óleos essenciais (RAMAKRISHNA; RAVISHANKAR, 2011) em decorrência do aumento de tricomas glandulares nas plantas (OPITZ; KUNERT; GERSHENZON, 2008). Essa situação já foi observada em algumas espécies como Matricaria recutita (camomila), Satureja hortensis L. (segurelha-dos-jardins) e Salvia officinalis L. (sálvia) (SAID-AL AHL; OMER, 2011).
2.2.2.3 Composição do solo
Os elementos minerais presentes no solo são absorvidos pelas plantas de acordo com as suas necessidades durante o desenvolvimento. Esses elementos podem ser classificados como macronutrientes e micronutrientes. Os macronutrientes são absorvidos em maiores quantidades e estão presentes em moléculas essenciais que desempenham função estrutural. São exemplos elementos como nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre. Já os micronutrientes são absorvidos em quantidades menores e apresentam função reguladora nas plantas atuando, por exemplo, na sinalização de auxinas (Zn) e na estruturação da parede celular (B, Ca). São classificados como micronutrientes elementos como boro, cloro, cobre, ferro, manganês, níquel, molibdênio e zinco (FAÇANHA; CANELLAS; DOBBSS, 2008). Dentre os macronutrientes, o fósforo (P) assume grande importância no metabolismo das plantas, pois auxilia em diversos processos fisiológicos como na transferência de energia da célula, na respiração e na fotossíntese. Além disso, o P se faz presente na composição de estruturas importantes para o desenvolvimento do organismo vegetal como coenzimas, fosfoproteínas, fosfolipídios de membrana e ácidos nucléicos de genes e cromossomos (GRANT et al., 2001). A maior parte do P é absorvido na forma de fosfato (H2PO4- e HPO42-) e reduções
nas concentrações desse elemento provocam injúrias na planta com diminuição do crescimento e alteração da coloração das folhas, por exemplo (TAVARES, 2008). A respeito disso, Santos e colaboradores (2015) analisaram o cultivo de Typha domingensis Pers. (taboa) durante 60 dias com soluções em diferentes concentrações de P (0; 0,20; 0,40; 0,60 e 0,80 mM). O estudo revelou que o maior crescimento das mudas, assim como de alguns parâmetros fisiológicos (taxa fotossintética, condutância estomática e taxas transpiratórias) foram proporcionais ao aumento da concentração de P da solução nutritiva.
Além da concentração de P proveniente do solo, outro quesito importante no cultivo de plantas medicinais diz respeito ao uso de fertilizantes organominerais. De acordo com Costa e colaboradores (2008), a produção de biomassa e de metabólitos secundários varia em decorrência do adubo utilizado e da espécie que está sendo cultivada. Sobre os efeitos da nutrição na produção de metabólitos secundários, Azizi e Dias (2004) notaram que a utilização de fertilizantes à base de nitrogênio e fósforo afetaram positivamente a produção de flavonoides no cultivo de Hypericum perforatum L. (erva-de-São-João).
2.2.2.4 Temperatura
A temperatura é um fator importante para a sobrevivência dos seres vivos, exercendo grande influência em todas as atividades fisiológicas por controlar as taxas das reações metabólicas nas células. Especialmente para os vegetais, as adaptações às alterações para esse tipo de situação devem ser rápidas e eficientes para garantir sua sobrevivência (BROWSE; XIN, 2001).
A temperatura, assim como a luz solar, modifica a velocidade das reações químicas e da atividade enzimática (OLIARI et al., 2010). O calor e o frio são estados termodinâmicos caracterizados pela alta ou baixa energia cinética das moléculas (LARCHER, 2000) e são responsáveis, de acordo com a frequência e a duração dos períodos, pelo aparecimento de lesões nas plantas (SZYMANSKA et al., 2017). Embora um dos efeitos comuns às altas e baixas temperaturas esteja relacionado aos danos causados por espécies reativas de oxigênio (ERO) à membrana celular (LIU; HUANG, 2000), as modificações provocadas na composição química e nos parâmetros morfoanatômicos são distintas.
2.2.2.4.1 Altas temperaturas (30–40 ºC)
Fatores fisiológicos como inibição da fotossíntese, limitação no acúmulo de carboidratos e danos nas membranas celulares induzem à morte celular e são verificados em espécies cultivadas em altas temperaturas (LIU; HUANG, 2000). Chabot e Chabot (1977) observaram o crescimento de Fragaria vesca L. (morango) em diferentes níveis de temperatura (dia/noite ºC = 10/2; 20/10; 30/20 e 40/30). Os autores constataram que, de acordo com as variáveis analisadas, a principal alteração encontrada nas folhas foi a diminuição da espessura e, por conseguinte, do peso foliar específico no tratamento de 40/30 ºC.
O cultivo em altas temperaturas também influenciou a produção de metabólitos secundários em Panax quinquefolius L. (ginseng). De acordo com Jochum, Mudge e Thomas (2007), análises das raízes revelaram aumento no teor de ginsenosídeos nessas condições.
2.2.2.4.2 Baixas temperaturas (1–10 ºC)
Espécies submetidas à baixas temperaturas são afetadas principalmente pela diminuição na velocidade das reações químicas. Essa condição fisiológica promove redução na absorção de nutrientes, na quantidade de energia disponível e na disponibilidade de água, provocando diminuição no crescimento da planta (LARCHER, 2000). Comparadas com as folhas de F. vesca coletadas no verão, as baixas temperaturas do inverno influenciaram o surgimento de folhas menores, com maior produção de tricomas não-glandulares e maior número de camadas de parênquima paliçádico. Folhas menores são mecanicamente mais resistentes e isso pode ser uma vantagem para a sobrevivência dessas espécies ao repetido processo de congelamento e descongelamento durante o inverno (ASTRÖM et al., 2015).
As baixas temperaturas também são responsáveis por influenciar nos níveis de metabólitos secundários das espécies (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Análises do óleo essencial de Teucrium polium L. (pólio) mostraram um rendimento significativamente maior nas folhas cultivadas durante o inverno comparado ao rendimento das folhas cultivadas no verão (LIANOPOULOU et al., 2014). Resultados semelhantes a esses foram vistos no óleo essencial de Hyptis marrubioides Epl. (hortelã-do-campo) (BOTREL et al., 2010). A partir desses resultados, nota-se que as baixas temperaturas ambientais, bem como a ocorrência de eventuais processos de congelamento, levaram as plantas a desenvolver estratégias mecânicas e químicas como forma de adaptação às condições de cultivo empregadas (LIANOPOULOU et al., 2014).
2.2.2.5 Luminosidade
As plantas são dependentes de todo o espectro luminoso (Tabela 1). Esse, por sua vez, é responsável por influenciar de maneira conspícua a estrutura foliar. Assim, a folha é dotada de grande plasticidade fenotípica, o que significa que é capaz de adaptar-se a determinadas condições de luz no ambiente (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Tabela 1. Efeitos de diferentes fontes de radiação na fisiologia vegetal
Tipos de radiação Comprimento de onda (nm) Efeitos sobre o vegetal
Raio X 0,1–24 Prejudiciais
Ultravioleta 120–400 Prejudiciais em doses altas;
importantes para várias sínteses
Violeta-azul 4000–4900 Fototropismo e fotomorfismo
Verde-vermelho 4900–7600 Assimilação de CO2
Infravermelho 7600–3×106 Aquecimento (aumento de
temperatura)
(Adaptado de: OLIVEIRA; AKISUE; AKISUE, 1998)
O aumento da intensidade luminosa geralmente proporciona aumento na espessura da cutícula, alongamento ou adição de células do parênquima paliçádico e redução no tamanho da folha. Já nas folhas desenvolvidas sob baixa intensidade luminosa o oposto dessas situações pode ser observado, embora tal padrão possa variar ligeiramente entre as espécies (CASTRO et al., 2007; PEGORARO et al., 2011).
Esse tipo de alteração morfoanatômica pode ser observado em Ocimum gratissimum L. (alfavaca-cravo) (FERNANDES et al., 2013), Bauhinia forficata Link (pata-de-vaca) (ATROCH et al., 2001), Passiflora sp. (maracujá) (BARP et al., 2006; FREITAS et al., 2012), e Melissa officinalis L. (erva-cidreira) (BRANT et al., 2011).
O acúmulo de metabólitos secundários depende de fatores que estimulem o crescimento da planta como temperatura, disponibilidade de luz e suprimento de nutrientes. Todavia, situações com excesso ou ausência de uma dessas variáveis afeta as vias metabólicas responsáveis pela produção dessas moléculas (SELMAR; KLEINWÄCHTER, 2013). Essas constatações foram feitas por Spring e Bienert (1987) quanto a produção de lactonas sesquiterpênicas em Helianthus annuus L. (girassol). O teor das lactonas foi influenciado pela luminosidade, sendo que o aumento na concentração dessa substância era proporcional à quantidade de luz disponibilizada. Já em Atropa belladonna L. (dedaleira), Datura stramonium L. (figueira-do-diabo) e Cinchona ledgeriana (Howard) Bern. Moens ex Trimen (quina), uma exposição total à luz solar levou a um maior conteúdo de alcaloides quando comparado às espécies que foram cultivadas sob sombreamento (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
