EFEITO
DO
TAMPONAMENTO
NA
REATIVIDADE
DE
SOLUÇÕES
FLUORETADAS
COM
A
DENTINA
COM
LESÃO
DE
CÁRIE
Piracicaba 2016
EMANUELLE DAYANA VIEIRA DANTAS
Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
EMANUELLE DAYANA VIEIRA DANTAS
EFEITO
DO
TAMPONAMENTO
NA
REATIVIDADE
DE
SOLUÇÕES
FLUORETADAS
COM
A
DENTINA
COM
LESÃO
DE
CÁRIE
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Odontologia, na Área de Cariologia.
Orientadora: Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Emanuelle Dayana Vieira Dantas
e orientada pelo Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury.
Piracicaba 2016
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Jacinto e Sônia, pelo amor incondicional e pelo esforço em tornar possível cada um dos meus sonhos. Obrigada por sempre acreditarem em mim! Todas as minhas conquistas sempre serão dedicadas a vocês...
Aos meus irmãos, Emanuell e Ellyommany, pela amizade e pela certeza de saber que sempre poderei contar com vocês.
Ao meu sobrinho, Emanuell Júnior, por me fazer conhecer uma nova forma de amor e por encher nossa família de alegria.
A Igor, meu amor e melhor amigo, pelo apoio, paciência, generosidade, e por tantas outras razões que não caberiam aqui em palavras, mas que foram essenciais ao longo desta jornada. Meu maior incentivador e minha força motriz!
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Campinas, na figura de seu Magnífico Reitor Prof. Dr. José Tadeu Jorge.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora dos Cursos de Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas.
Ao Prof. Dr. Marcelo de Castro Meneghim, coordenador do Curso de Pós-graduação em Odontologia, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de Doutorado nos períodos de abril/2012 a julho/2013, e de julho de 2015 a julho de 2016, respectivamente.
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, minha orientadora e mestre, pelos ensinamentos, conselhos, disponibilidade e por tudo o que ela certamente acrescentou à minha formação ao longo desse período. Minha sincera gratidão.
Ao Prof. Dr. Jaime Aparecido Cury, por todos os ensinamentos, discussões científicas e o tempo dedicado à minha formação. Exemplo de mestre e paixão pela pesquisa e docência.
À Profa. Dra. Livia Maria Andaló Tenuta, pelos ensinamentos e conselhos. Admiro sua competência, seu caráter e sua inquietude em busca de conhecimento. Sem dúvida, uma fonte de inspiração.
À Profa. Dra. Altair Antonina Del Bel Cury, pelos ensinamentos, conselhos e disponibilidade.
Ao Prof. Dr. Kenio Costa Lima meu ex-professor de graduação, orientador durante o mestrado, minha referência de mestre e exemplo de paixão pela pesquisa e docência. Agradeço pelas oportunidades, pelo apoio e amizade construída ao longo destes anos.
Aos Profs. Drs. Jaime Aparecido Cury, Livia Maria Andaló Tenuta, e Antônio Pedro Ricomini Filho pelas valorosas considerações feitas durante o exame de qualificação.
Aos Srs. Waldomiro Viera Filho e Alfredo José da Silva, técnicos do Laboratório de Bioquímica, por toda ajuda e disponibilidade, e pela grata convivência durante todo esse tempo.
Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Odontologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, em especial àqueles da Área de Cariologia, pelo companheirismo. À Juliana Nunes Botelho, Martinna de Mendonça e Bertolini e Samilly Evangelista de Souza pela amizade cultivada e grande ajuda sempre.
Às amigas Brunna Moreira, Luciana Jácome e Mércia Cunha, amigas desde a graduação, que foram minha família nesta cidade, agradeço a amizade e o apoio essenciais.
Aos meus amigos em Natal que mesmo à distância sempre me deram o apoio necessário e compreenderam minha ausência. Em especial, à Mariana Ottoni, Saziane de Sá, Silvana Nobre, Juliana Costa, Virgínia Vasconcelos e Lavínia Vasconcelos que sempre se fizeram presente, nos momentos que mais precisei.
À Universidade Potiguar, na pessoa de sua coordenadora do Curso de Odontologia, Maria Alice Fuscella que desde o primeiro momento, me apoiou e possibilitou que eu ingressasse como docente na referida universidade, ainda em fase de conclusão deste curso de Doutorado. Minha profunda gratidão.
Aos alunos que ao longo destes dois últimos anos, permitiram-me concretizar meu maior sonho: a docência!
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e participaram da minha vida durante esta pós-graduação.
RESUMO
A reatividade do fluoreto com o esmalte com lesão de cárie é potencializada pelo tamponamento da solução de reação, mas não é conhecido se o mesmo ocorreria com a dentina e se o efeito dose-resposta em relação à concentração de fluoreto seria mantido diante do tamponamento. Assim, objetivou-se avaliar o efeito do tamponamento na reatividade de soluções fluoretadas (SF) com a dentina, com lesão de cárie artificialmente induzida. Foram conduzidos dois experimentos in vitro, nos quais foram utilizados blocos de dentina radicular bovina. A lesão de cárie foi induzida pela imersão dos blocos (4x4x2 mm) em solução desmineralizante e, em seguida, os blocos foram selecionados e aleatoriamente distribuídos nos respectivos grupos de tratamento (n=12). O primeiro experimento avaliou o efeito do tamponamento de SF, com diferentes pH, na reatividade do fluoreto com a dentina com lesão de cárie, a partir de um delineamento fatorial 2 x 4, cujos fatores sob avaliação foram tamponamento em 2 níveis (com ou sem tampão histidina) e o pH das SF (226 µg F/mL) em 4 níveis (5,0; 5,5; 6,0 e 6,5). O segundo experimento avaliou o efeito do tamponamento na reatividade de SF, com diferentes concentrações de fluoreto, com a dentina com lesão de cárie, e envolveu um delineamento fatorial 2 x 4, sendo o tamponamento em 2 níveis (com ou sem tampão histidina) e a concentração de fluoreto em 4 níveis (113, 226, 452 e 904 µg F/mL). Nos 2 experimentos, os controles foram água purificada e histidina 0,1 M, e a reação dos blocos dentais com as soluções de tratamento ocorreu sob agitação, por 10 min. Em cada experimento, o pH das soluções foi determinado antes e após a reação, sendo o ΔpH (pHfinal-pHinicial) analisado pelos testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney e as concentrações (µg F/cm2) de fluoreto fracamente (“CaF2”) e firmemente ligado (FA) formados foram analisadas por ANOVA two-way. O nível de significância foi 5%. No experimento I, observou-se efeito significativo do tamponamento, mas não do pH ou da interação tampão x pH. O tamponamento aumentou significativamente as concentrações de “CaF2” (p<0,001) e FA (p=0,02) formados na dentina. No segundo experimento, os maiores valores de ΔpH foram observados para grupos sem tampão, porém tal diferença só foi significativa entre os grupos SF 113 e 904 µg F/mL. Houve efeito significativo do tamponamento (p<0,001) e da concentração de fluoreto (p<0,001), levando ao aumento das concentrações de “CaF2” e FA na dentina. A interação destes dois fatores foi significativa para “CaF2” (p<0,001). Assim, conclui-se que a presença de histidina nas soluções aumentou a reatividade do fluoreto com a dentina com lesão de cárie, independente do pH das soluções, e o efeito dose-resposta em relação à concentração de fluoreto e sua reatividade com a dentina com lesão de cárie foi mantido mesmo diante da presença da histidina nas soluções fluoretadas.
ABSTRACT
The reactivity of fluoride to enamel with carious lesion is enhanced by buffering the reaction solution, but it is not known whether the same would happen with dentine and whether the dose-response effect in relation to the fluoride concentration would be maintained against the buffering. Thus, the objective was to evaluate the effect of buffering on reactivity of fluoridated solutions (FS) with dentine with artificially induced carious lesion. Two in vitro experiments were conducted, using bovine root dentine blocks. The caries lesion was induced by immersion of the blocks (4x4x2 mm) in demineralizing solutions and then the blocks were selected and randomly distributed in the respective treatment groups (n=12). The first experiment evaluated the effect of buffering FS, at different pH, on fluoride reactivity with dentine with caries lesion, using a 2 x 4 factorial design, whose factors under evaluation were buffering at 2 levels (with or without histidine buffer) and the pH of FS (226 mg F/mL) at 4 levels (5.0; 5.5; 6.0 and 6.5). The second experiment evaluated the effect of buffering on reactivity of FS, with different concentrations of fluoride, with dentine with caries lesions and involved a 2 x 4 factorial design, buffering at 2 levels (with or without histidine buffer) and fluoride concentration at 4 levels (113, 226, 452 and 904 mg F/mL). In both experiments, the controls were purified water and 0.1 M histidine, and the reaction of dental blocks with the treatment solutions was performed under agitation for 10 min. In each experiment, the pH of the solutions was determined before and after the reaction, and the ΔpH (pHfinal-pHinitial) was analyzed by Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests and the concentrations (µg F/cm2) of loosely bound fluoride ("CaF2") and firmly bound fluoride (FA) formed were analyzed by two-way ANOVA. The level of significance was 5%. In experiment I, a significant effect of buffering was observed, but there was no effect of the pH or pH x buffering interaction. Buffering significantly increased the concentrations of "CaF2" (p<0.001) and FA (p=0.02) formed in dentine. In the second experiment, the greatest ΔpH values were observed for groups without buffer, but this difference was only significant between the SF 113 and 904 µg F/mL groups. There was a significant buffering effect (p<0.001) and the fluoride concentration (p<0.001), leading to increasing concentrations of "CaF2" and FA in dentine. The interaction of these two factors was significant for "CaF2" (p <0.001). Thus, it can be concluded that the presence of histidine in the solutions increased fluoride reactivity with dentine with caries lesion independent of pH solutions and the dose-response effect in relation to fluoride concentration and its reactivity with dentine with caries lesion was maintained even in the presence of histidine in fluoridated solutions.
Lista de Ilustrações
Quadro 1 - Grupos experimentais e respectivas soluções de tratamento, referentes ao Experimento I.
29
Quadro 2. Grupos experimentais e respectivas soluções de tratamento, referentes ao Experimento II
30
Gráfico 1. Média da concentração (μg F/cm²) de fluoreto fracamente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas (226 µg F/mL),
em diferentes pH, na presença ou não de tampão. 35
Gráfico 2. Média da concentração (μg F/cm²) de fluoreto firmemente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas (226 µg F/mL), em diferentes pH, na presença ou não de tampão.
36
Gráfico 3. Média da concentração (μg F/cm²) de fluoreto fracamente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas, em diferentes
concentrações (µg F/mL), na presença ou não de tampão. 39
Gráfico 4. Média dos valores da concentração (μg F/cm²) de fluoreto firmemente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas, em
diferentes concentrações (µg F/mL), na presença ou não de tampão. 40
... . ...
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Valores de pH inicial e média (±dp; n=12) dos valores de pH ao final das reações dos blocos de dentina com as soluções de tratamento, referentes ao
experimento I. ...
33
Tabela 2 - Valores de ΔpH (mediana/quartis 25 e 75) das soluções de tratamento referentes aos grupos sem e com tampão (n=12), referentes ao experimento I.
34
Tabela 3. Valores de pH inicial e média (±dp; n=12) dos valores de pH ao final das reações dos blocos de dentina com as soluções de tratamento, referentes ao experimento II.
37
Tabela 4 - Tabela 4. Valores de ΔpH (mediana/quartis 25 e 75) e significância estatística de cada grupo de tratamento (n=12), referentes ao experimento II.
38
Tabela 5 - Tabela 5 – Concentração de fluoreto (µg F/mL) nas soluções de tratamento, referentes ao experimento I.
53
Tabela 6 - Concentração de fluoreto (µg F/mL) nas soluções de tratamento, referentes ao experimento II.
54
Tabela 7 - Significância estatística da ANOVA two-way, respectivas fontes de variação e significâncias estatísticas, referentes à formação de fluoreto fracamente ligado sobre a dentina com lesão de cárie artificial.
55
Tabela 8 - Média (±dp) da concentração (μg F/cm²) de fluoreto fracamente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas (226 µg F/mL), em diferentes pH, na presença ou não de tampão
55
Tabela 9 - Significância estatística da ANOVA two-way, respectivas fontes de variação e significâncias estatísticas, na formação de fluoreto firmemente ligado sobre a dentina com lesão de cárie artificial.
56
Tabela 10 - Média (±dp) da concentração (μg F/cm²) de fluoreto firmemente ligado (n=12) formado na dentina exposta a soluções fluoretadas (226 µg F/mL), em diferentes pH, na presença ou não de tampão.
56
Tabela 11 - Significância estatística da ANOVA two-way, respectivas fontes de variação e significâncias estatísticas, na formação de fluoreto fracamente ligado sobre a dentina com lesão de cárie artificial.
57
Tabela 12 - Média (±dp) da concentração (μg F/cm²) de fluoreto fracamente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas, em diferentes concentrações (µg F/mL), na presença ou não de tampão.
57
Tabela 13 - Significância estatística da ANOVA two-way, respectivas fontes de variação, e significâncias estatísticas, na formação de fluoreto firmemente ligado sobre
a dentina com lesão de cárie artificial. 58
Tabela 14- Média (±dp) dos valores transformados da concentração (μg F/cm²) de F firmemente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas, em diferentes concentrações (µg F/mL), na presença ou não de tampão.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 16
2.1 Atual cenário da cárie dentária ... 16
2.2 Uso de soluções fluoretadas no controle da cárie dentária ... 18
2.3 Reatividade de soluções fluoretadas com o esmalte dental ... 21
3 PROPOSIÇÃO ... 25
4 MATERIAL E MÉTODOS 26
4.1 Delineamento Experimental ... 26
4.2 Obtenção dos blocos dentais ... 26
4.3 Seleção dos blocos dentais ... 28
4.4 Indução de lesão de cárie artificial nos blocos de dentina ... 28
4.5 Preparo das soluções de tratamento 29
4.5.1 Experimento I - Efeito do tamponamento de soluções fluoretadas, em diferentes pH, na reatividade do F com dentina bovina com lesão cariosa artificial 29 4.5.2 Experimento II - Efeito do tamponamento sobre a reatividade de soluções fluoretadas, com diferentes concentrações de F, com a dentina com lesão cariosa artificial 30 4.6 Reatividade das soluções de tratamento com os blocos dentais 30
4.7 Determinação do pH das soluções de tratamento após reação com os blocos dentais 31 4.8 Determinação do fluoreto fracamente ligado 31
4.9 Determinação de fluoreto firmemente ligado 31
4.10 Análise estatística ... 31
5 RESULTADOS ... 33
5.1 Experimento I - Efeito do tamponamento de soluções fluoretadas, em diferentes pH, na reatividade do F com dentina bovina com lesão de cárie artificial ... 33 5.1.1 pH das soluções ... 33
5.1.3 Determinação da concentração de fluoreto firmemente ligado ... 35 5.2 Experimento II - Efeito do tamponamento de soluções fluoretadas, sob diferentes concentrações de F, na reatividade do F com a dentina bovina com lesão de cárie artificial ...
37
5.2.1 pH das soluções ... 37 5.2.2 Determinação da concentração de fluoreto fracamente ligado ... 38 5.2.3 Determinação da concentração de fluoreto firmemente ligado ...
... 39 6 DISCUSSÃO 41 7 CONCLUSÃO ... 44 REFERÊNCIAS ... 45 APÊNDICES
Apêndice 1 - Dosagem da concentração de fluoreto nas soluções de tratamento 53
1 INTRODUÇÃO
Há clara evidência na literatura sobre a efetividade do fluoreto no controle da cárie dental, reduzindo a desmineralização e ativando a remineralização dos tecidos duros dentais (ten Cate, 1999). Em acréscimo, o significativo declínio na prevalência de cárie dental observado nas últimas décadas, quer em países desenvolvidos (Bratthall, 1996) ou em desenvolvimento (Narvai et al., 1999; Brasil, 2010), tem sido atribuído ao uso difundido do fluoreto pelas populações ao redor do mundo.
Entretanto, a despeito da significativa redução da prevalência e incidência da cárie dental, esta doença ainda se manifesta e o faz de maneira desigual (Brasil, 2010; Kämppi et al., 2013). Os dentes atingidos pela doença se concentram numa menor proporção de indivíduos, fenômeno descrito como polarização e que reflete as disparidades socioeconômicas das populações (Narvai et al., 2006). Em acréscimo, se levado em consideração o aumento da prevalência e incidência de lesões de cárie radicular em idosos, fato relacionado à maior expectativa de vida e, consequentemente, ao maior número de dentes e superfícies de dentina radicular expostas na cavidade oral desses indivíduos (Anusavice, 2002; Griffin et al., 2004; Curzon e Preston, 2004; Rihs et al., 2005; Du et al., 2009), pode-se concluir que a adoção de medidas preventivas e de controle da cárie, dirigidas aos grupos mais vulneráveis da população (Mascarenhas, 2016), permanece um desafio.
Desta forma, estratégias têm sido propostas a fim de aumentar a biodisponibilidade do fluoreto nos fluidos bucais, o que poderia resultar em aumento da proteção dos indivíduos que se apresentam sob maior risco ou atividade da doença. Embora tenham como objetivo comum o aumento do efeito anticárie dos produtos fluoretados, tais estratégias são pautadas em diferentes mecanismos, seja pelo aumento da frequência de exposição ao fluoreto (Marinho et al., 2003a; Souza et al., 2010; Songsiripradubboon et al., 2014; Nóbrega et al., 2016), pelo uso de dentifrícios de alta concentração de fluoreto (Srinivasan et al., 2014; Yeung, 2014; Ekstrand, 2016) ou pela associação de meios fluoretados adicionalmente àqueles usualmente utilizados (Souza et al., 2010; Vale et al., 2011; Songsiripradubboon et al., 2014).
As soluções fluoretadas para bochecho são uma boa indicação de fonte adicional de fluoreto para indivíduos de alto risco e/ou de alta atividade de cárie (Weyant et al., 2013). Há evidência da efetividade das soluções fluoretadas na redução da incidência de cárie em crianças e adolescentes (Marinho et al., 2003b) e seu mecanismo de ação é atribuído ao aumento da biodisponibilidade de fluoreto na saliva e no fluido do biofilme, após o bochecho (Serra e Cury,
1992), e ainda à formação de reservatórios minerais, na forma de fluoreto firmemente ligado aos tecidos duros dentais (Tabchoury et al., 2005), também chamado fluorapatita (FA) e na forma de fluoreto fracamente ligado, como o mineral tipo fluoreto de cálcio (“CaF2”) sobre o esmalte/dentina (Chow e Takagi, 1991; van Strijp et al., 1999). A formação de ambos os minerais contribuiria para a diminuição da desmineralização e ativação da remineralização, diante e após um desafio cariogênico, respectivamente (Takagi et al., 2000; Songsiripradubboon et al., 2014)
A reatividade do fluoreto com o esmalte com lesão de cárie artificial pode ser aumentada na presença do conservante metilparabeno, conforme relatado por Tabchoury et al. (2005) e Arthur et al. (2007), que avaliaram a reatividade a partir da formação de FA no esmalte. Como o metilparabeno apresenta ação tamponante, tal efeito foi melhor estudado (Vieira Júnior, 2010) e verificou-se que o tamponamento de uma solução fluoretada, contendo 226 ppm de fluoreto, com tampão histidina, aumentou significativamente a reatividade do fluoreto com o esmalte dental bovino com lesão de cárie artificial, diante da maior formação de “CaF2” e FA, sendo este efeito mais significativo em pH 5,0. Nesta faixa de pH, a hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2), principal constituinte do esmalte, sofre dissolução e os íons fosfato (PO4)-3 e hidroxila (OH-) liberados combinam-se com prótons (H+) do meio, resultando assim no aumento do pH da solução ao longo da reação e, por conseguinte, na diminuição da reatividade do fluoreto (Arthur et al., 2007), que é dependente do pH. Logo, a ação do tampão em manter o pH da solução estável, durante a reação, culminaria no aumento da reatividade das soluções fluoretadas (Vieira Júnior, 2010).
Diante do exposto acima, seria importante avaliar se o efeito do tamponamento das soluções fluoretadas também ocorreria frente à dentina com lesão de cárie artificialmente induzida, e ainda, se o aumento da reatividade do fluoreto presente nas soluções fluoretadas, quando tamponadas, apresentaria um efeito dose-resposta em relação a diferentes concentrações de fluoreto. A maior reatividade das soluções fluoretadas poderia contribuir na melhoria do efeito anticárie desses produtos, sendo de grande relevância, principalmente, na prevenção e no controle da cárie radicular.
2 REVISÃO DA LITERATURA
Com o intuito de tornar a revisão da literatura mais objetiva, essa foi dividida didaticamente em três tópicos. O primeiro versou a respeito do atual cenário da cárie dentária, o segundo discorreu sobre o papel das soluções fluoretadas no controle da cárie dentária e por fim, o terceiro abordou a reatividade de soluções fluoretadas com o esmalte dental.
2.1 Atual cenário da cárie dentária
A cárie dental é uma doença de progressão lenta e localizada, cujas lesões são decorrentes da desmineralização dos tecidos duros dentais, pela ação de ácidos produzidos por bactérias presentes no biofilme dentário, a partir da fermentação de carboidratos oriundos da dieta (Marsh, 1999; Bowen, 2002; Cury et al., 2003). Trata-se, portanto, de uma doença biofilme e açúcar-dependente (Fejerskov, 2004), onde o acúmulo do biofilme dentário é o fator necessário, sem o qual a doença não se manifesta, e o consumo de carboidratos fermentáveis, o fator determinante principal da doença (Tenuta e Cury, 2010).
Neste contexto, Moynihan e Kelly (2014), em uma revisão sistemática, ressaltam a importância de recomendar-se a limitação do consumo de carboidratos, o qual deve ser menor do que 5% do consumo energético diário (E), para que um indivíduo possa obter benefícios no controle da cárie dentária ao longo da vida. Tal publicação teve como objetivo pautar, em evidência científica, a atualização das recomendações vigentes da Organização Mundial de Saúde (OMS), concernentes a esse assunto, as quais ainda sugeriam um consumo de carboidratos-livres menor do que 10% do E, para que a população pudesse de fato, obter benefícios no controle da cárie dentária (Sheiham e James, 2014). A despeito de tais esforços para limitar o consumo de carboidratos da população, para prevenção da cárie dentária (Moynihan e Kelly, 2014), a diminuição nos índices de prevalência e incidência desse agravo tem sido explicada pelo uso de fluoreto pelas populações ao redor do mundo (ten Cate, 2013).
Tal constatação ressalta a importância dos demais fatores etiológicos implicados na rede de causalidade da cárie dentária, que não apenas o consumo de açúcares, como o fluoreto - fator determinante positivo (Tenuta e Cury, 2010). O mecanismo de ação do fluoreto no controle da cárie dental está pautado na sua efetividade em reduzir a desmineralização e ativar a remineralização dos tecidos duros dentais (ten Cate, 1999). Dessa maneira, o declínio da prevalência e severidade da cárie dentária observado nas últimas décadas, não apenas em países desenvolvidos (Bratthall, 1996; Clarkson, 2000), mas também naqueles em desenvolvimento, como o Brasil (Brasil, 2010), pode ser explicado, principalmente, pela larga exposição dos
indivíduos aos fluoretos (ten Cate, 2013), além do maior acesso a serviços de atenção à saúde bucal e melhoria de condições socioeconômicas (Bönecker et al., 2002; Narvai et al., 2006).
Entretanto, embora os índices de cárie tenham diminuído, principalmente entre crianças e jovens, estudos mais recentes demonstram que esse agravo à saúde bucal ainda é importante não só na infância e adolescência, mas também, nos demais ciclos de vida (Bagramian et al., 2009), o que pode ser comprovado, quando adultos e idosos são avaliados em relação à ocorrência da cárie dentária, na medida em que o aumento da prevalência e da severidade da doença tem sido correlacionado com o aumento da idade dos indivíduos (Luan et al., 2000; Edman et al., 2016)
Adicionalmente, tem sido relatado o aumento na prevalência de cárie radicular, em consequência à manutenção de um maior número de elementos dentários na cavidade bucal de adultos e idosos (Anusavice, 2002; Griffin et al., 2004; Rihs et al., 2005; Ekstrand, 2016). A ocorrência de cárie radicular é mais frequentemente associada às sequelas da doença periodontal, que aumentam a probabilidade de que superfícies radiculares sejam expostas ao meio bucal, em consequência da recessão gengival, o que culmina no aumento do risco de desenvolvimento e progressão da cárie nesses grupos etários (Curzon e Preston, 2004; Rihs et al., 2005; Du et al., 2009).
Nesse sentido, a cárie radicular constitui-se em importante agravo à saúde bucal da população idosa dentada (Anusavice, 2002; Heijnsbroek et al., 2007) e apresenta prevalência em torno de 44 (Matthews et al., 2012) a 50% (Zimmer, 2001; Du et al., 2009). De acordo com Gregory e Hyde (2015), esse agravo é uma das maiores causas de perda dentária em idosos, o que compromete a qualidade de vida desses indivíduos. Tais achados ressaltam a importância de que esse grupo populacional é tão suscetível ao desenvolvimento de novas lesões de cárie, quanto adolescentes e crianças, e que devem ser incluídos em programas preventivos e terapêuticos, em relação à cárie dentária (Banting et al., 1980; Thomson, 2004; Heijnsbroek et al., 2007).
Assim, vivencia-se atualmente a existência de dois cenários paralelos, um de clara redução da experiência de cárie nas populações ao redor do mundo, e outro, no qual há manutenção e até mesmo aumento da severidade da doença em grupos específicos de indivíduos – ditos de maior risco, a saber: indivíduos com baixo status socioeconômico, crianças e idosos (ten Cate, 2013; Edman et al., 2016; Mascarenhas, 2016). Logo, ratifica-se o conhecimento de que a rede de causalidade que encerra a cárie dentária envolve, além de aspectos biológicos, fatores socioeconômicos e comportamentais, os quais explicariam as diferentes formas de acometimento da doença, nas diferentes populações (Narvai et al., 2006). Dessa forma, o que
se observa atualmente é um novo padrão de ocorrência da doença, descrito a partir do fenômeno de polarização da cárie dental, caracterizado, de forma sucinta, pela concentração de níveis elevados da doença e suas necessidades de tratamento em uma menor parcela da população, geralmente, sob privação social e econômica (Narvai et al., 2006; Carvalho et al., 2011; ten Cate, 2013).
Ainda, a discussão acerca da polarização da cárie lança luz sobre outro debate: a necessidade de se propor para essa parcela da população, mais vulnerável ao desenvolvimento e progressão da doença, estratégias de utilização de fluoretos através de meios adicionais aos usualmente recomendados (van Strijp et al., 1999; Weyante et al., 2013; Songsiripradubboon et al., 2014).
2.2 Uso de soluções fluoretadas no controle da cárie dentária
Dentre os meios de utilização de fluoreto, há clara evidência a respeito da eficácia das soluções fluoretadas sobre a diminuição da incidência de cárie dentária (Marinho et al., 2003b). As soluções para bochecho, com fluoreto em sua composição, foram apontadas como responsáveis pela redução, em cerca de 26%, da experiência de cárie em crianças, que fizeram uso regular e supervisionado desse meio de utilização de fluoreto (Marinho et al., 2003b). Segundo recomendações da ADA (American Dental Association), suportadas cientificamente e ainda, pautadas no balanço entre benefício e potencial risco de meios fluoretados individuais (auto uso e uso profissional), ratifica-se o benefício anticárie das soluções fluoretadas (0,05% ou 0,2% NaF) para indivíduos entre 6 e 18 anos de idade, sob risco à cárie, bem como, para prevenir cárie radicular entre adultos e idosos (Weyant et al., 2013).
As soluções para bochecho que contêm fluoreto em sua composição são classificadas como meios fluoretados individuais, de auto uso, e são indicadas a partir da detecção de uma condição de alto risco e/ou de alta atividade de cárie (Tenuta e Cury, 2010; Rugg-Gunn e Banoczy, 2013). Embora as principais evidências recaiam sobre a utilização diária ou semanal, nas concentrações de 0,05% NaF (225 ppm F), ou 0,2% NaF (900 ppm F), respectivamente (Marinho et al., 2003b), outros compostos fluoretados podem ser encontrados na composição dos produtos para bochecho como fluoreto de amina e de estanho, bem como outras concentrações e frequências de uso (Rugg-Gunn e Banoczy, 2013).
Os resultados de alguns estudos que avaliaram o efeito da associação de dentifrício e bochecho fluoretados muitas vezes são conflitantes (Marinho et al., 2004). Ringelberg et al. (1979) apontaram a diminuição da incidência de cárie em indivíduos, que fizeram uso de soluções contendo fluoreto, diariamente, por 60 dias, em adição ao uso de dentifrício
fluoretados. Contrariamente, Blinkhorn et al. (1983) não observaram nenhum efeito adicional do uso diário de bochecho fluoretado, sobre a incidência de cárie de um grupo de 751 crianças, o mesmo achado foi obtido por Axelsson et al. (1987), em um estudo clínico, conduzido por 3 anos. Nesse último estudo, não houve diferença entre o grupo que fez uso de solução contendo 0,05% NaF e o grupo controle, que usou uma solução placebo, em relação à incidência de lesões de cárie proximal.
De maneira geral, diferenças no delineamento experimental dos diferentes estudos, como o momento em que foi realizado o bochecho da solução fluoretada (imediatamente após a escovação, ou horas depois); a frequência (diária ou semanal); tipo de composto fluoretado, podem explicar a incoerência dos resultados obtidos (van Strijp et al., 1999; Songsiripradubbon et al., 2014). O mais aceito hoje é que se a prevalência de cárie da população em estudo é baixa, o benefício adicional decorrente do uso de soluções fluoretadas pode não ser observado (van Strijp et al., 1999). Dito de outra forma, as soluções fluoretadas devem ser indicadas de acordo com o risco ou atividade de cárie (Weyant et al., 2013), visto que o benefício anticárie advindo de sua combinação a outros meios, como dentifrícios fluoretados, é modesto (Marinho et al., 2004), se comparado ao uso do dentifrício isoladamente, em indivíduos de baixo risco à cárie (Tenuta e Cury, 2010).
Entretanto, há situações nas quais a combinação desses meios se justifica, como por exemplo, no caso de pacientes portadores de aparelhos ortodônticos fixos. Tais dispositivos sabidamente aumentam o risco de desenvolvimento da cárie dental, visto que favorecem o acúmulo de biofilme sobre as superfícies dentais, e simultaneamente, dificultam a higienização bucal por parte do paciente (Marinho et al., 2004; Benson et al., 2004). Adicionalmente, tem sido sugerido que essa combinação de meios fluoretados, dentifrícios e soluções, seria também importante para o controle da progressão de lesões de cárie radicular (Fure et al., 1998; Weyant et al., 2013; ten Cate, 2013). No entanto, a despeito da ampla evidência de que meios contendo fluoreto são eficazes no controle da cárie em esmalte, pouco é conhecido acerca da eficácia do fluoreto na redução da desmineralização do tecido dentinário.
Sabe-se que o mineral da dentina é mais solúvel do que o do esmalte, o que torna a dentina mais susceptível à desmineralização(Hoppenbrouwers et al., 1986). Em acréscimo, a dentina difere do esmalte por ter cristais menores, com maior conteúdo de carbonato e consideravelmente maior volume de componentes orgânicos (Nyvad e Fejerskov, 1982; ten Cate et al., 1998). Logo, devido a diferenças entre suas propriedades, é provável que esses tecidos dentais apresentem respostas distintas à ação do fluoreto, durante episódios de desafio cariogênico.
Nesse contexto, resultados obtidos a partir de um estudo in situ(Kusano et al., 2011) sugerem que o fluoreto disponível no dentifrício (1100 ppm F; NaF/SiO2) apresenta um efeito mais pronunciado na redução da perda mineral em esmalte, do que em dentina. De fato, dados de outro estudo in situ corroboram essa hipótese, na medida em que mostram que a combinação de aplicação tópica profissional de flúor (flúor fosfato acidulado em gel, 1,23% F) e de uso de dentifrício fluoretado (1100 ppm F) não apresenta efeito adicional na diminuição da perda mineral em esmalte(Paes Leme et al., 2004), diferentemente do que ocorre para a dentina, para a qual, a combinação destes tratamentos apresenta efeito protetor adicional(Vale et al., 2011).
Embora não seja possível afirmar, diante dos resultados apresentados pelos estudos citados acima, pode ser levantada a hipótese de que concentrações maiores, do que aquelas usualmente requeridas para o esmalte, sejam necessárias para que o fluoreto exerça diminuição efetiva da desmineralização da dentina radicular, o que também tem sido apontado por estudos clínicos (Ekstrand et al., 2013; Srinivasan et al., 2014). Logo, a associação de soluções fluoretadas e dentifrícios estaria bem indicada na prevenção e controle da cárie radicular. De maneira geral, as soluções fluoretadas são indicadas como meio adicional de fluoreto, para aqueles indivíduos com alto risco ao desenvolvimento da cárie, e principalmente para aqueles já doentes, cuja detecção de lesões de cárie, em franca atividade, denuncia que a escovação com dentifrício fluoretado, per se, não tem sido suficiente para controlar a doença em tais indivíduos (Rugg-Gunn e Banoczy, 2013; Marinho et al., 2003b).
O efeito anticárie das soluções para bochecho pode ser explicado por meio de dois mecanismos. Um deles consiste no aumento da concentração de fluoreto na saliva e no fluido do biofilme, acima dos níveis basais, por cerca de 1 a 2 h após o bochecho (Serra e Cury, 1992). A concentração de fluoreto presente na cavidade bucal, decorrente de um bochecho fluoretado é cerca de duas vezes mais alta, do que aquela encontrada 1 a 2 h após escovação com dentifrício fluoretados (Zero et al., 1992).
O segundo mecanismo baseia-se na formação de reservatórios minerais, principalmente, na forma de “CaF2” e fluorapatita (Ögaard et al., 1983). A deposição de um mineral “tipo fluoreto de cálcio” (“CaF2”) sobre a superfície dos tecidos duros dentais é decorrente da interação físico-química entre o fluoreto, presente na solução, em concentração superior a 100 ppm F, e os tecidos dentários (Ögaard et al., 1983; Chow e Takagi, 1991). O “CaF2” formado irá atuar como reservatório de fluoreto, liberando este íon para o meio em decorrência de sua solubilização, oportunamente, diante de um desafio cariogênico (Saxegaard e Rølla, 1989). Em relação à formação de fluorapatita decorrente da utilização de meios fluoretados, essa tem sido considerada modesta, visto que o principal mecanismo envolvido na
formação desse tipo reservatório é resultado dos ciclos de desmineralização/remineralização que ocorrem no meio bucal, na presença do fluoreto (Saxegaard e Rølla, 1989). Entretanto, devido à incorporação de FA concentrar-se superficialmente, diante de sua menor solubilidade, em relação à hidroxiapatita, poderia contribuir para a diminuição da desmineralização dos tecidos dentais, durante um desafio cariogênico (Saxegaard e Rølla, 1989).
Em seu trabalho, van Strijp e colaboradores (1999) avaliaram o efeito in situ da associação de uma solução fluoretada (250 ppm F - fluoreto de amina/fluoreto de sódio) e dentifrício fluoretado (1.250 ppm F – fluoreto de amina), sobre a formação de depósitos de fluoreto no esmalte e dentina com lesão de cárie, e concluíram que o uso da solução fluoretada (2x/dia) aumentou significativamente a quantidade de F fracamente (“CaF2”) e firmemente ligado (fluorapatita – FA). Os resultados deste estudo indicam que um enxaguatório fluoretado usado em combinação com um dentifrício fluoretado pode ter um efeito benéfico na proteção do esmalte e dentina contra a cárie dental.
Os mecanismos de ação responsáveis pela eficácia das soluções fluoretadas podem sofrer influência de fatores como: frequência de utilização da solução (Songsiripradubboon et al., 2014), tipo de composto fluoretado (Laheij et al., 2010), concentração (Ögaard et al., 1983) e pH da solução (Gonzáles-Cabezas et al., 2012).
2.3 Reatividade de soluções fluoretadas com o esmalte dental
Em seu trabalho, ten Cate (1999) propôs que a otimização da utilização de fluoreto na prevenção e controle da cárie poderia ser pautada no desenvolvimento de meios fluoretados especialmente produzidos com o objetivo de aumentar a retenção do fluoreto no meio bucal por prolongados períodos de tempo. Nesse sentido, a avaliação da influência de fatores como o pH, composição e concentração dos meios fluoretados comercializados é de suma importância, já que a presença de determinados componentes presentes na formulação de soluções fluoretadas, bem como o próprio pH do produto (Friberger, 1975; Delbem e Cury, 2002), podem alterar a reatividade do fluoreto com os tecidos dentários, e, consequentemente, aumentar ou mesmo comprometer a eficácia anticárie.
Barkvoll e colaboradores (1988) relataram a incompatibilidade físico-química entre o digluconato de clorexidina e o monofluorofosfato de sódio (MFP), devido à formação de um sal insolúvel após reação entre os dois compostos, resultando na menor reatividade do MFP com o esmalte. Outro componente, que pode estar presente na composição de alguns produtos fluoretados como detergente, o lauril sulfato de sódio, também parece ser capaz de reduzir a
reatividade do fluoreto, embora o mecanismo pelo qual essa diminuição ocorra não é conhecido (Barkvoll, 1991; Franco e Cury, 1994).
Por outro lado, Tabchoury e colaboradores (2005) avaliaram a qualidade de enxaguatórios contendo NaF 0,05% preparados em farmácias de manipulação. De forma inesperada, três produtos mostraram-se mais reativos com o esmalte dental desmineralizado do que o controle positivo (solução de NaF 0,05% preparada no laboratório sem qualquer outro reagente). Análises realizadas nestes 3 produtos sugeriram que a maior reatividade poderia ser devido à presença de metilparabeno, um conservante, na sua composição.
Posteriormente, outro estudo (Arthur et al., 2007) avaliou diretamente o efeito de conservantes presentes em enxaguatórios bucais na reatividade do fluoreto com o esmalte dental. Para tal, blocos de esmalte bovino, hígidos ou com lesão artificial de cárie, foram seccionados longitudinalmente. Uma metade de cada bloco foi mantida como controle e a outra reagiu, durante 10 min, com solução de NaF 0,05% contendo ou não metilparabeno 0,2%, propilparabeno 0,02% ou benzoato 0,35%. A reatividade do fluoreto com esmalte hígido não foi afetada pelos conservantes, mas a reatividade da solução de NaF 0,05% com o esmalte com lesão artificial de cárie foi significativamente aumentada na presença do metilparabeno.
Com base no trabalho anteriormente citado, Tramontino e colaboradores (2010) avaliaram se o metilparabeno e o propilparabeno aumentariam a incorporação de fluoreto pelo esmalte dental desmineralizado. Assim, foi delineado um ensaio in vitro, no qual blocos de esmalte com lesão de cárie foram expostos aos seguintes tratamentos: solução fluoretada (200 ppm F - controle); solução fluoretada + metilparabeno 13 mM; solução fluoretada + propilparabeno 13 mM em propilenoglicol 35% e solução fluoretada + propilenoglicol 35%. Todas as soluções foram tamponadas com cacodilato 0,01 M e o pH ajustado para 6,27. Os grupos de tratamento contendo ambos parabenos e o grupo controle não apresentaram diferença significativa em relação à formação de FA, entretanto, todos diferiram estatisticamente do grupo contendo propilenoglicol, o qual mostrou a menor concentração de FA formada. Assim, os autores concluíram que metilparabeno e propilparabeno, presentes em uma solução tamponada com pH em torno de 6,27, não foram capazes de aumentar a reatividade das soluções fluoretadas, e que os resultados anteriormente reportados por Tabchoury e colaboradores (2005) e Arthur e colaboradores (2007) poderiam ser explicados pelo efeito do pH das soluções (5,6) e não somente pela ação de conservantes utilizados na sua formulação.
É bem estabelecido que o pH desempenha papel fundamental na reatividade do fluoreto com o esmalte dental (Frieberger, 1975; Larsen, 1990; Delbem e Cury, 2002). A diminuição do pH de soluções fluoretadas de 7 para 5,5 é capaz de aumentar, em 4 vezes, a
reatividade do fluoreto com o substrato dental (Saxegaard e Rolla, 1988). Entretanto, embora esteja claro que a diminuição do pH da solução fluoretada aumente a reatividade do fluoreto com o esmalte (Saxegaard e Rolla, 1988), durante a reação da solução fluoretada com o substrato dental pode haver uma alteração no pH final da solução, na medida em que os íons fosfato e hidroxilas, que compõem a hidroxiapatita, reagem com os íons H+ livres na solução (Arthur et al., 2007). Logo, como o pH reflete a concentração de íons H+, a reação citada anteriormente culminaria no aumento do pH da solução e consequentemente, na diminuição da reatividade do fluoreto com o substrato dental ao longo da reação (Arthur et al., 2007).
Neste contexto, Vieira Júnior (2010) avaliou a reatividade do fluoreto presente em soluções fluoretadas tamponadas ou não com histidina e em diferentes pH com o esmalte dental com lesão de cárie artificial, baseado na hipótese de que se o fluoreto estiver presente em uma solução tamponada, o aumento do pH ao longo da reação seria menor, devido à ação do tampão em manter estável o pH da solução. Assim, a manutenção do pH em valores mais baixos durante toda a reação poderia resultar no aumento da reatividade do fluoreto com o esmalte dental. Nesse estudo, blocos de esmalte bovino foram submetidos aos seguintes tratamentos: soluções de NaF 0,05% pH 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5 tamponadas com histidina 0,1 M ou com pH ajustado, mas sem tamponamento. Como controle foi usada solução de histidina 0,1 M sem ajuste do pH (pH=3,92). Os grupos experimentais, cujas soluções de tratamento foram tamponadas, apresentaram concentrações de “CaF2” e FA estatisticamente maiores do que os respectivos grupos sem o tampão, independentemente do pH inicial da solução. A maior concentração de “CaF2” foi observada no grupo com NaF 0,05%, pH 5,0, com tampão, diferindo significativamente das demais soluções tamponadas. Os resultados de tal estudo sugerem que o tamponamento de soluções fluoretadas com baixo pH pode aumentar sua reatividade com o esmalte com lesão de cárie (Vieira Júnior, 2010).
Adicionalmente, pode ser citado ainda o estudo in vitro de Gonzáles-Cabezas e colaboradores (2012), que teve como objetivo comparar o efeito de soluções fluoretadas (NaF 2%) sob diferentes pH, na reatividade do esmalte apresentando diferentes perfis de lesões subsuperficiais, bem como a remineralização dessas. Os autores relataram que soluções contendo fluoreto em alta concentração são mais efetivas em promover remineralização e incorporação de fluoreto em lesões subsuperficiais de esmalte, quando sob pH ácido, e adicionalmente, tal efeito parece ser mais pronunciado em lesões em estágios iniciais, em comparação com aquelas com desmineralização mais avançada.
Diante do exposto seria relevante avaliar o efeito do tamponamento de soluções fluoretadas frente à dentina, o que ainda não foi testado e que seria importante para o controle
da cárie radicular, agravo de prevalência crescente em adultos e idosos. Assim, justifica-se a realização deste trabalho tendo em vista que a maior reatividade das soluções fluoretadas, decorrente do seu tamponamento, poderia resultar em um maior efeito anticárie desse meio fluoretados.
3 PROPOSIÇÃO
Avaliar o efeito do tamponamento de soluções fluoretadas na sua reatividade com a dentina com lesão de cárie em função do pH da solução e o efeito dose-resposta em relação à concentração de fluoreto.
4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Delineamento Experimental
Dois ensaios in vitro, independentes entre si, foram realizados. Blocos dentais de dentina radicular bovina (4x4x2 mm) pré-selecionados, inicialmente quanto à dureza de superfície e, após a indução da lesão de cárie artificial, quanto à porcentagem de perda de dureza de superfície (%PDS), foram utilizados. A lesão de cárie artificial foi induzida pela imersão dos blocos dentais em solução desmineralizante, contendo tampão acetato 0,05 M (pH 5,0), 1,4 mM Ca, 0,91 mM Pi e 0,06 μg F/mL. Após a seleção, os blocos foram aleatoriamente distribuídos nos respectivos grupos de tratamentos. O primeiro estudo avaliou o efeito do tamponamento de soluções fluoretadas, em diferentes pH, na reatividade do fluoreto com a dentina com lesão de cárie artificial, a partir de um delineamento fatorial 2 x 4, cujos fatores sob avaliação foram o tamponamento, em 2 níveis (com ou sem tampão histidina), e o pH das soluções fluoretadas (226 µg F/mL) em 4 níveis (5,0; 5,5; 6,0 e 6,5) (n=12/grupo). O segundo estudo avaliou o efeito do tamponamento na reatividade de soluções fluoretadas, com diferentes concentrações de fluoreto com a dentina com lesão de cárie artificialmente induzida, e envolveu um delineamento fatorial 2 x 4, cujos fatores sob avaliação foram o tamponamento, em 2 níveis (com ou sem o tampão histidina), e a concentração de F nas soluções fluoretadas em 4 níveis (113, 226, 452 e 904 µg F/mL) (n=12/grupo). Em ambos os experimentos, os controles utilizados foram água purificada e solução de histidina 0,1 M, sem ajuste de pH. No experimento II, as soluções variaram apenas em relação à concentração de F, apresentando todas o mesmo pH, o qual foi ajustado para 5,5, a partir dos resultados do primeiro estudo. Nos 2 ensaios, a reação dos blocos dentais com as respectivas soluções foi realizada sob agitação, durante 10 min. Ao final de cada experimento, os blocos dentais foram analisados quanto ao efeito dos tratamentos sobre a reatividade do fluoreto, por meio da determinação da concentração de fluoreto fracamente e firmemente ligado à dentina. Adicionalmente, o pH das soluções foi mensurado após sua reação com os blocos dentais. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente de forma independente (α = 5%).
4.2 Obtenção dos blocos dentais
Conforme mencionado anteriormente, os experimentos I e II foram realizados de forma independente. Entretanto, devido à semelhança metodológica entre os experimentos, optou-se por descrevê-los conjuntamente, a partir deste tópico, ressaltando-se suas diferenças, quando necessário.
Foram utilizados incisivos bovinos hígidos e, antes de qualquer procedimento experimental, tais elementos dentais foram mantidos em solução de formol 2%, por um período mínimo de 30 dias, para desinfecção (White, 1987). Para obtenção dos blocos dentais de dentina, foi utilizada cortadeira elétrica (Buehler – Isomet), bem como discos diamantados de dupla face (Buehler Diamond Wafering Blade nº 11-4243 da série 15 HC). Os dentes foram fixados em placas de acrílico com auxílio de cera pegajosa e levados à cortadeira elétrica para que fossem seccionados na porção cervical, separando a porção coronária da radicular.
Usando 2 discos diamantados posicionados paralelamente e separados por um espaçador de acrílico com 4 mm de espessura, foram obtidos blocos dentais a partir do corte das raízes dentais, no sentido mésio-distal. Os fragmentos de dentina foram correspondentes ao primeiro terço da raiz. Estas fatias foram novamente fixadas a placas de acrílico e seccionadas no sentido mésio-distal para obtenção de blocos dentais medindo 4 x 4 x 2 mm. Os cortes foram sempre feitos sob refrigeração (água purificada) para evitar trincas.
A altura dos blocos foi ajustada para 2 mm, utilizando-se lixa de granulação 320 (Carbimet® Paper Discs – nº 30-5108-320 Buehler®) e politriz APL-4 Arotec®, verificando-se a espessura do bloco com paquímetro digital. Para tal, a superfície vestibular do bloco foi fixada com cera pegajosa sobre um disco de resina acrílica pré-fabricado, para que a superfície oposta pudesse ser ajustada/planificada. Em seguida, os blocos foram lavados em ultrassom (T7, Thornton®) com água purificada, para remoção das partículas de lixa. Os blocos dentais foram removidos do respectivo disco de resina, e novamente fixados, desta vez com superfície vestibular do bloco voltada para cima, para que esta fosse planificada, lixada e polida. A planificação foi iniciada a partir da lixa de granulação 600 e, posteriormente, foi utilizada lixa de granulação 1200 por 2 min, para que se procedesse o polimento das superfícies dos blocos dentais. A cada mudança de granulação das lixas, os blocos foram colocados em ultrassom para remoção dos resíduos da lixa anteriormente utilizada. Ao final, os blocos de dentina foram imersos em uma solução detergente, visando remoção completa dos resíduos da lixa. O polimento foi realizado com panos auto-adesivos, previamente banhados com suspensão contendo partículas de diamante 1 µm, por 2 min. Em seguida, os blocos foram imersos em uma solução detergente (Ultramet®) diluída na proporção de 20:1 em água purificada, por 2 min.
Os blocos de dentina obtidos foram armazenados em geladeira em potes devidamente vedados e cobertos com papel toalha umedecido com água purificada, para evitar o ressecamento da superfície e a ocorrência de rachaduras.
4.3 Seleção dos blocos dentais
Previamente à determinação da dureza de superfície, os blocos foram mantidos à temperatura ambiente para secagem, durante30 min (Vale et al., 2011). A seguir, a dureza de superfície dos blocos foi determinada, utilizando–se o microdurômetro Future Tech modelo FM – 7 acoplado a um software FM – ARS e penetrador tipo Knoop, com carga de 5 g por 5 s (Hara et al., 2003).Foram realizadas 3 endentações, distantes 100 µm entre si, na região central dos blocos dentais e os critérios de seleção foram baseados na média e desvio padrão de dureza de cada bloco. Foram excluídos, de cada experimento, blocos dentais que apresentaram desvio padrão maior que 10% de sua média individual (variabilidade intra-blocos) e aqueles que apresentaram sua média individual de dureza maior ou menor do que 10% da média de dureza calculada para todos os blocos inicialmente obtidos (variabilidade entre blocos). Em relação ao Experimento I, a média de dureza de superfície dos blocos selecionados para indução de cárie foi 33,9 (± 2,1), e 36,2 (± 2,1) para os blocos do Experimento II.
4.4 Indução de lesão de cárie artificial nos blocos de dentina
Cada bloco dental, previamente selecionado, teve a área da superfície vestibular medida, e com exceção dessa, que foi exposta à solução desmineralizante, teve as demais faces isoladas com cera do tipo utilidade. Anteriormente à imersão dos blocos de dentina na solução desmineralizante, esses foram tratados com saliva artificial (1,5 mM Ca, 0,9 mM P, 150 mM KCl e 0,1 M de tampão Tris, pH 7,0) durante 24 h, a 37°C, sem agitação. Tal tratamento teve o objetivo de minimizar a variabilidade dos blocos com relação ao desenvolvimento da lesão de cárie (Hara et al., 2003). Posteriormente, os blocos foram imersos na solução desmineralizante, 50% saturada em relação à dentina bovina, contendo tampão acetato 0,05 M (pH 5,0), 1,4 mM Ca, 0,91 mM Pi e 0,06 μg F/mL (2 mL de solução/mm2 de área do bloco), durante 16 h a 37°C, sem agitação (Nóbrega et al., 2016).
Após a indução das lesões de cárie, uma nova linha de três endentações, distante 100 µm da primeira, foi realizada para mensuração da dureza de superfície dos blocos foi feita, de acordo com a descrição do item 4.3. Posteriormente, foi calculada a porcentagem de perda de dureza de superfície (%PDS) para cada bloco, de acordo com a fórmula:
%PDS = microdureza inicial – microdureza após a lesão induzida x 100 microdureza inicial
Então, foram excluídos, de cada experimento, os blocos dentais que apresentaram desvio padrão maior ou menor do que 10% de sua média de %PDS individual (variabilidade intra-blocos) e aqueles que apresentaram sua média individual maior ou menor do que 10% da média de %PDS calculada para todos os blocos inicialmente obtidos (variabilidade entre blocos). Em relação ao Experimento I, a média de %PDS dos blocos selecionados foi 63,2 (±3,8), e 65,5 (± 3,1) para os blocos selecionados para o Experimento II.
4.5 Preparo das soluções de tratamento
4.5.1 Experimento I – Efeito do tamponamento de soluções fluoretadas, em diferentes pH, na reatividade do F com dentina bovina com lesão cariosa artificial
As soluções foram preparadas com água purificada e apresentaram a mesma concentração de fluoreto (226 µg F/mL), diferindo entre si com relação ao valor do pH (5,0; 5,5; 6,0 e 6,5) e à presença ou não do tampão histidina 0,1 M. Foram utilizadas como controle água purificada e solução de histidina 0,1 M, sem ajuste do pH (Vieira Júnior, 2010). O ajuste do pH das soluções foi realizado com o auxílio de um eletrodo de pH e peagômetro calibrado com soluções de pH 4,0 e 7,0, a partir da adição de soluções de HCl ou NaOH. Após o preparo das soluções, alíquotas das mesmas foram diluídas e misturadas com TISAB II (tampão acetato 1 M, pH 5,0, contendo NaCl 1 M e CTDA 0,4%) para a determinação da concentração de fluoreto, em triplicata e utilizando eletrodo íon-específico ORION 96-06 e analisador de íons EA 940, previamente calibrados. A determinação da concentração de fluoreto foi realizada anteriormente à utilização das soluções (Apêndice 1, Tabela 5). O Quadro 1 mostra as soluções que foram preparadas para os respectivos grupos de tratamento.
Quadro 1. Grupos experimentais e respectivas soluções de tratamento, referentes ao experimento I
GRUPOS DE TRATAMENTO SOLUÇÕES DE TRATAMENTO
Controle água água purificada
Controle histidina histidina 0,1 M
SF pH 5,0 226 µg F/mL, pH 5,0 SF + tampão pH 5,0 226 µg F/mL e histidina 0,1 M, pH 5,0 SF pH 5,5 226 µg F/mL, pH 5,5 SF + tampão pH 5,5 226 µg F/mL e histidina 0,1 M, pH 5,5 SF pH 6,0 226 µg F/mL, pH 6,0 SF + tampão pH 6,0 226 µg F/mL e histidina 0,1 M, pH 6,0 SF pH 6,5 226 µg F/mL, pH 6,5 SF + tampão pH 6,5 226 µg F/mL e histidina 0,1 M, pH 6,5
4.5.2 Experimento II - Efeito do tamponamento sobre a reatividade de soluções fluoretadas, com diferentes concentrações de F, com a dentina com lesão cariosa artificial
As soluções foram preparadas com diferentes concentrações de fluoreto (113, 226, 452 e 904 µg F/mL) e foram tamponadas ou não com histidina 0,1 M. Todas as soluções foram preparadas com água purificada e o pH foi ajustado para 5,5, exceto as soluções dos grupos controle (água purificada e histidina 0,1 M), que não tiveram o pH ajustado, apenas aferido antes e depois da reação com os blocos dentais. O pH 5,5 foi definido, após análise dos resultados do experimento I. A determinação da concentração de fluoreto foi realizada em triplicata, utilizando eletrodo íon-específico ORION 96-06 e analisador de íons EA 940, previamente calibrado, anteriormente à utilização das soluções (Apêndice 1, Tabela 6). O Quadro 2 mostra as soluções que foram preparadas para os respectivos grupos de tratamento.
Quadro 2. Grupos experimentais e respectivas soluções de tratamento, referentes ao experimento II.
GRUPOS DE TRATAMENTO SOLUÇÕES DE TRATAMENTO
Controle água água purificada
Controle histidina histidina 0,1 M
SF 113 µg F/mL 113 µg F/mL* SF 113 µg F/mL + tampão 113 µg F/mL e histidina 0,1 M* SF 226 µg F/mL 226 µg F/mL* SF 226 µg F/mL + tampão 226 µg F/mL e histidina 0,1 M* SF 452 µg F/mL 452 µg F/mL* SF 452 µg F/mL + tampão 452 µg F/mL e histidina 0,1 M* SF 904 µg F/mL 904 µg F/mL* SF 904 µg F/mL + tampão 904 µg F/mL e histidina 0,1 M*
*O valor do pH foi ajustado para 5,5.
4.6 Reatividade das soluções de tratamento com os blocos dentais
Cada bloco de dentina com lesão de cárie artificial foi individualmente transferido para tubos contendo as soluções de tratamentos, na proporção de 2 mL de solução por mm2 da superfície exposta do bloco dental, e mantidos sob agitação (100 rpm), em temperatura ambiente, por 10 min (Tabchoury et al., 2005). Decorrido esse tempo, os blocos foram removidos da solução, lavados com água purificada e armazenados a 4ºC em ambiente úmido.
4.7 Determinação do pH das soluções de tratamento após reação com os blocos dentais Após a remoção dos blocos de dentina dos respectivos tubos, o pH das soluções de tratamento foi determinado, utilizando-se eletrodo de pH e peagômetro calibrado com soluções padrões de pH 4,0 e 7,0. A variação do pH foi calculada e expressa sob a forma de ΔpH (ΔpH = pH final – pH inicial).
4.8 Determinação do fluoreto fracamente ligado
Em seguida, os blocos de dentina foram imersos individualmente em 0,5 mL de solução de KOH 1 M a temperatura ambiente e mantidos sob agitação (100 rpm em mesa agitadora), por 24 h (Caslavska et al., 1975). Transcorrido esse tempo, a solução foi neutralizada com 0,5 mL de TISAB II contendo HCl 1 M e analisada com eletrodo específico para íon flúor acoplado a analisador de íons, previamente calibrado. O fluoreto fracamente ligado formado e extraído dos blocos de dentina foi expresso em µg F/cm².
4.9 Determinação de fluoreto firmemente ligado
Duas camadas de dentina foram removidas sequencialmente, por extração ácida, de cada bloco dental. Para remoção da primeira camada, cada bloco foi imerso em 0,25 mL de HCl 0,5 M, durante 15 s, sob agitação; em seguida, foram adicionados 0,25 mL de tampão TISAB II, contendo 20 g de NaOH/L. O bloco foi então removido do tubo e a concentração de fluoreto presente na solução remanescente foi analisada por meio de eletrodo íon-específico, acoplado a um potenciômetro. A espessura média da primeira camada removida foi 9,9 µm (± 1,9), para os blocos do Experimento I, e 9,4 µm (± 2,1), para os blocos do Experimento II. A remoção da segunda camada foi realizada, repetindo-se os procedimentos anteriormente citados. A espessura média da segunda camada removida foi de 7,1 µm (± 1,2), para os blocos do Experimento I, e 6,9 µm (± 1,2), para os blocos do Experimento II. A concentração total de fluoreto firmemente ligado formado (FA total) foi calculada a partir do somatório das médias das concentrações de fluoreto firmemente ligado obtidas em cada uma das camadas extraídas, e expressa em µg F/cm2 (Tabchoury et al., 2005).
4.10 Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos I e II foram analisados de forma independente, assim, a análise estatística realizada para cada um dos experimentos será descrita separadamente.
Para o experimento I, os resultados obtidos foram inicialmente avaliados quanto à normalidade e homogeneidade de suas variâncias. Assim, os dados referentes ao ΔpH foram analisados estatisticamente pelos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, pois não apresentaram distribuição normal. Os dados referentes às concentrações de fluoreto fracamente e firmemente ligado foram avaliados por ANOVA two-way, em esquema fatorial 4 x 2 +1 (pH x tampão + controles), seguida do teste de Bonferroni, considerando como fatores o tamponamento, em dois níveis (com e sem histidina), e o pH, em quatro níveis (5,0; 5,5; 6,0; e 6,5). A comparação entre os grupos de tratamento e os grupos controles foi realizada pelo teste de Dunnett.
Os resultados obtidos no experimento II também foram avaliados quanto à normalidade e homogeneidade de suas variâncias. De maneira semelhante, os dados referentes ao ΔpH foram analisados estatisticamente, utilizando-se os testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, pois não apresentaram distribuição normal. Os dados referentes às concentrações de fluoreto fracamente e firmemente ligado foram avaliados por ANOVA two-way, em esquema fatorial 4 x 2 +1 (pH x tampão + controles), seguida do teste de Bonferroni, considerando como fatores o tamponamento, em dois níveis (com e sem histidina), e a concentração de fluoreto nas soluções, em quatro níveis (113, 226, 452 e 904 µg F/mL). A comparação entre os grupos de tratamento e os grupos controles foi realizada pelo teste de Dunnett. Em relação aos dados de FA total, após análise exploratória, os dados foram transformados em raiz cúbica, para atender aos pressupostos da análise de variância. Análise de regressão foi realizada entre a concentração de fluoreto nas soluções e as respectivas concentrações de “CaF2”e FA formadas sobre a dentina
com lesão de cárie.
O nível de significância utilizado para todos os testes, nos 2 experimentos, foi de 5%. Os dados foram analisados no programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versão 21.0.
5 RESULTADOS
5.1 Experimento I - Efeito do tamponamento de soluções fluoretadas, em diferentes pH, na reatividade do F com dentina bovina com lesão de cárie artificial.
5.1.1 pH das soluções
A tabela 1 apresenta o pH inicial e a média e o desvio-padrão dos valores de pH final das respectivas soluções de tratamento após reação com os blocos de dentina.
Tabela 1. Valores de pH inicial e média (±dp; n=12) dos valores de pH ao final das reações dos blocos de dentina com as soluções de tratamento, referentes ao experimento I.
Grupos de Tratamento pH inicial pH final
Controle água 5,72 5,92 ± 0,04 Controle histidina 3,92 3,96 ± 0,05 SF pH 5,0 5,00 5,09 ± 0,03 SF + tampão pH 5,0 5,01 5,01 ± 0,02 SF pH 5,5 5,52 5,61 ± 0,04 SF + tampão pH 5,5 5,50 5,53 ± 0,02 SF pH 6,0 6,00 6,09 ± 0,03 SF + tampão pH 6,0 6,01 6,04 ± 0,01 SF pH 6,5 6,50 6,64 ± 0,03 SF + tampão pH 6,5 6,51 6,52 ± 0,04
SF: soluções fluoretadas contendo 226 µg F/mL. Tampão histidina 0,1 M.
Ao se avaliar os valores de pH apresentados na Tabela 1, pode ser observado que o aumento do pH das soluções, após a reação com os blocos dentais, foi numericamente mais pronunciado para os grupos cuja solução fluoretada não foi tamponada e para o grupo controle água. Os dados referentes à variação de pH estão apresentados na Tabela 2, que mostra a mediana dos valores de ΔpH e respectivos quartis 25 (Q25) e 75 (Q75), para cada grupo de tratamento.
Tabela 2. Valores de ΔpH (mediana/quartis 25 e 75) das soluções de tratamento referentes aos grupos sem e com tampão (n=12), referentes ao experimento I.
Grupos Sem tampão Com tampão
SF pH 5,0 0,09 (0,08/0,11) *Aa 0,00 (-0,02/0,01)*Ba SF pH 5,5 0,10 (0,09/0,12) *Aa 0,04 ( 0,02/0,06) Bb SF pH 6,0 0,09 (0,08/0,10) *Aa 0,02 ( 0,02/0,04) Bb SF pH 6,5 0,16 (0,13/0,17) *Ab 0,00 (-0,02/0,06) Bab SF: soluções fluoretadas contendo 226 µg F/mL.
Medianas seguidas de letras distintas (maiúsculas na horizontal e minúsculas na vertical) diferem estatisticamente entre si (p<0,05).
Todos os grupos diferiram estatisticamente em relação ao grupo controle água (ΔpH = 0,21; 0,18/0,23). *Grupos que diferiram estatisticamente do grupo controle histidina (ΔpH = 0,03; 0,02/0,06).
De acordo com a Tabela 2, independente do pH inicial das soluções de tratamento, após a reação com os blocos de dentina, houve menor variação de pH nos grupos com tampão (p<0,001). Nos grupos sem tampão, a maior variação de pH ocorreu no grupo SF pH 6,5, o qual diferiu estatisticamente dos demais (p<0,05). Nos grupos com tampão, embora a menor variação tenha ocorrido no grupo SF tampão pH 5,0, este não diferiu estatisticamente do SF tampão pH 6,5 (p>0,05), o qual, por sua vez, não diferiu dos demais grupos com tampão (p>0,05).
5.1.2 Determinação da concentração de fluoreto fracamente ligado
Os resultados obtidos após análise estatística (Apêndice 2, Tabela 7) apontam que apenas a presença do tampão foi significativa (p<0,001) para explicar a diferença encontrada entre os grupos experimentais, não havendo, portanto, efeito significativo do pH das soluções (p>0,05). Adicionalmente, não foi detectado o efeito da interação entre o tampão e o pH. Segundo o modelo utilizado para esta análise, os fatores tamponamento e pH foram capazes de explicar em quase 60% a formação de fluoreto fracamente ligado, nas condições experimentais testadas. O gráfico 1 apresenta as concentrações de fluoreto fracamente ligado formado sobre a dentina com lesão de cárie artificial, para cada grupo de tratamento.
Gráfico 1. Média da concentração (μg F/cm²) de fluoreto fracamente ligado (n=12) formado sobre a dentina exposta a soluções fluoretadas (226 µg F/mL), em diferentes pH, na presença ou não de tampão.
Letras maiúsculas distintas indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre os grupos com e sem tampão, independente do pH. Letras minúsculas distintas apontam diferença estatística (p<0,05) entre os grupos de diferentes pH, em cada tipo de solução, tamponada ou não.
Barras indicam desvio-padrão.
Todos os grupos diferiram estatisticamente em relação aos grupos controles água (0,26 ± 0,08 μg F/cm²) e histidina (0,45 ± 0,12 μg F/cm²), os quais não diferiram entre si.
De acordo com o Gráfico 1, o tamponamento das soluções fluoretadas provocou aumento significativo das concentrações de fluoreto fracamente ligado sobre a dentina, independentemente do pH avaliado.
5.1.3 Determinação da concentração de fluoreto firmemente ligado
Os resultados referentes à concentração de fluoreto firmemente ligado formado na primeira e na segunda camada de dentina removida foram somados e expressos como FA total (µg F/cm2), o que pode ser visto no Gráfico 2.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 SF pH 5,0 SF pH 5,5 SF pH 6,0 SF pH 6,5 "C aF 2 " (µg F /c m 2) Tratamentos
Sem tampão Com tampão
A B A B A B A B a a a a a a a a
