UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
RAÍSSA DE PAULA MORO
Alterações na expressão de alg-1 modificam o miRNoma e a
sensibilidade a estressores oxidativos em Caenorhabditis elegans
CAMPINAS 2019
RAÍSSA DE PAULA MORO
Alterações na expressão de alg-1 modificam o miRNoma e a
sensibilidade a estressores oxidativos em Caenorhabditis elegans
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução
ESTE ARQUIVO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA RAÍSSA DE PAULA MORO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCELO ALVES DA SILVA MORI
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Alves da Silva Mori
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Alves da Silva Mori Prof. Dr. Murilo Vieira Geraldo
Profa. Dra. Fernanda Marques da Cunha
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Prof. Dr. Hugo Aguilaniu (Ecole Normale Supérieure de Lyon) e à Profa. Dra. Katlin Brauer Massirer (Universidade Estadual de Campinas), por gentilmente cederem materiais fundamentais para a execução dos experimentos desta dissertação.
Gostaríamos de agradecer aos Técnicos Administrativos em Educação do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas que contribuíram para o desenvolvimento desta dissertação, em especial à Dra. Elzira Elisabeth Saviani.
Gostaríamos de agradecer também ao MSc Silas Pinto da Silva, pela ajuda com o método de Sequenciamento de RNAs pequenos, e ao MSc Evandro Araújo de Souza, pela ajuda com a análise de ChIP-Sequencing.
Gostaríamos ainda de agradecer ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) sob o processo nº 134578/2016-3, e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) sob o processo nº 2016/15958-3, pela concessão da bolsa de mestrado.
Resumo
A expressão global de microRNAs (miRNAs) diminui durante o envelhecimento em diversos grupos filogenéticos, inclusive em Caenorhabditis elegans. Entretanto, a identidade do mecanismo envolvido nessa alteração e qual o seu efeito sobre fenótipos associados ao envelhecimento ainda não foram determinados de forma conclusiva. Existem evidências de que certos miRNAs regulam o tempo de vida de C. elegans, e a proteína argonauta ALG-1 é uma importante reguladora da biogênese e da função de miRNAs em C. elegans. Posto isso, nessa dissertação descrevemos e interpretamos resultados obtidos em experimentos delineados para analisar o mecanismo de regulação transcricional de alg-1 e sua função na resposta a estressores oxidativos e térmicos, e na longevidade de C. elegans. Avaliamos, ainda, o perfil de expressão de miRNAs em animais sob condições ou de superexpressão de alg-1 (ALG-1 O/E), ou de longevidade do glp-(ALG-1(e2(ALG-144). Observamos que há pelo menos 5 repressores da transcrição de alg-1, os quais estão relacionados com o envelhecimento biológico. O knockdown de alg-1 retarda o desenvolvimento do C. elegans, diminui o tempo de vida, promove sensibilidade ao arsenito de sódio (NaAsO2), e inibe a longevidade do glp-1(e2144). ALG-1 O/E, por sua vez, não altera seu tempo de vida em condições fisiológicas ou em estresse térmico moderado, porém aumenta a resistência do C. elegans aos estressores oxidativos NaAsO2 e metil viologênio, este de modo dependente do miRNA cel-miR-71. Também foi possível demonstrar que há alteração global na expressão de miRNAs em glp-1(e2144). Dos 11 miRNAs diferencialmente expressos entre glp-1(e2144) e ALG-1 O/E, 8 também tem seus níveis de expressão alterados no modelo de longevidade induzida por restrição dietética, o eat-2(ad1116). Esses resultados constituem indícios de que ALG-1 pode participar na regulação do envelhecimento saudável ao atuar na defesa a estressores oxidativos em situações fisiopatológicas, e que a via da biogênese de miRNAs é um fator limitante para esses efeitos.
Descritores: Envelhecimento. Estresse oxidativo. microRNAs. Longevidade. Proteína Argonaute-like gene 1.
Abstract
The overall expression of microRNAs (miRNAS) decreases throughout aging on different phylogenetic groups, including Caenorhabditis elegans. However, the exact identity of the mechanism involved in this reduction and its effects on phenotypes associated with aging have not yet been conclusively determined. There is evidence that certain miRNAs regulate C. elegans lifespan, and the ALG-1 argonaute protein is one of the major regulators of biogenesis and function of miRNAs in C. elegans. Therefore, this dissertation consists of the description and interpretation of results from experiments designed to characterize the mechanism of alg-1 transcriptional regulation and its function in the response to oxidative and thermal stress, and longevity of C. elegans, as well as to analyse the pattern of miRNA expression of worms under conditions of either alg-1 overexpression (ALG-1 O/E), or glp-1(e2144) longevity. We observed that there are at least 5 transcriptional repressors of alg-1, all of which have been associated with longevity phenotypes. alg-1 knockdown delays developmental time, decreases lifespan, enhances sensitivity to sodium arsenite (NaAsO2), and inhibits longevity of glp-1(e2144) C. elegans. ALG-1 O/E, in turn, does not change its lifespan under physiological conditions or moderate heat stress; still, it increases C. elegans resistance to the oxidative stressors NaAsO2 and methyl viologen, the latter in a cel-miR-71 dependent-manner. It has also been shown that there are changes in the global pattern of miRNA expression in glp-1(e2144). Of these, a subset of miRNAs maintains differential expression in ALG-1 O/E, as well as in eat-2(ad1116), a calorie-restricted model of longevity. The present findings are indicators that ALG-1 may participate in the regulation of healthspan by acting in the defense against oxidative stressors on pathophysiological situations, and that the miRNA biogenesis pathway is a limiting factor for these effects.
Keywords: Aging. Argonaute-like gene 1 protein, C. elegans. Longevity. microRNAs. Oxidative stress.
Sumário
1. Introdução ... 10
1.1. Epidemiologia e hallmarks do envelhecimento ... 10
1.2. Modelos animais do envelhecimento ... 14
1.3. RNAs não codificantes e a função regulatória de microRNAs (miRNAs) ... 17
1.4. A proteína argonauta ALG-1 ... 20
2. Objetivos ... 23
3. Material e Métodos... 24
3.1. Animais ... 24
3.2. Sincronização ... 25
3.3. RNA de interferência (RNAi) ... 25
3.4. Tempo de desenvolvimento ... 26
3.5. Tempo de vida ... 26
3.6. Resistência a estressores térmicos e oxidativos ... 27
3.6.1. Exposição a dicloreto hidratado de metil viologênio ... 27
3.6.2. Exposição a arsenito de sódio (NaAsO2) ... 27
3.6.3. Exposição a 5-hidroxi-1,4-naftoquinona ... 28
3.7. Microscopia de fluorescência ... 28
3.8. Reação em cadeia da polimerase convencional (PCR) ... 28
3.9. Transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) ... 29
3.9.1. Extração do RNA total ... 29
3.9.2. Transcrição reversa (RT) ... 30
3.9.3. PCR em tempo real (qPCR) ... 30
3.9.4. Quantificação relativa das amostras ... 31
3.10. Sequenciamento de RNAs pequenos ... 32
3.11. Identificação de possíveis reguladores da transcrição de alg-1 a partir de dados do modENCODE ... 32
3.12. Análise funcional de via de enriquecimento ... 33
4. Resultados e Discussão ... 34
4.1 Efeitos do knockdown de alg-1 no desenvolvimento, tempo de vida, e resistência a estressor oxidativo em C. elegans ... 34
4.2 ALG-1 é necessária para a longevidade de C. elegans e sua superexpressão altera o miRNoma ... 39
4.3 Superexpressão de alg-1 é insuficiente para aumentar o tempo de vida de C. elegans, porém o protege quando sob estressores oxidativos ... 46
4.4 Reguladores negativos da transcrição de alg-1 estão envolvidos em vias regulatórias da longevidade ... 52
5. Conclusões ... 56
Referências Bibliográficas ... 57
Apêndices ... 64
Apêndice 1. A. e B. Eletroforese em gel de agarose de n4115 ... 64
Apêndice 2. A. e B. Quantificação da fluorescência de alg-1p::alg-1::gfp em ALG-1::GFP e mir-71(n4115); ALG-1::GFP ... 65
Apêndice 3 - Resultados das replicatas experimentais dos ensaios de tempo de vida ... 66
Apêndice 4 - miRNAs diferencialmente expressos em glp-1(e2144) em comparação com WT, e ALG-1 O/E em comparação com ctrl ... 69
Anexos ... 74
Anexo 1 - Documento referente à Bioética e/ou Biossegurança ... 74
1. Introdução
1.1. Epidemiologia e hallmarks do envelhecimento
“Envelhecer nos dias de hoje, não é exceção, é regra” (KOMATSU, 1996). Com o fenômeno do envelhecimento populacional em processo de expansão, a incidência e a prevalência global de idosos aumenta num ritmo acelerado.
Esse fenômeno caracteriza-se pela combinação da queda na taxa de fecundidade e do aumento da expectativa de vida ao nascer. Quando combinados, esses fatores resultam na diminuição da população jovem, e aumento progressivo da proporção de idosos na população, os quais proporcionam a transição da estrutura etária.
Observam-se quedas abruptas nas taxas de fecundidade em todo o mundo. No Brasil, o número de crianças por mulher tem sido menor que a taxa de reposição, definida como o valor necessário e suficiente para manter o contingente populacional, e que está em torno de 2,1 para a América Latina. Entre 2045-2050, estima-se que 69% da população viverão em países cujas taxas de fecundidade estarão abaixo da de reposição (UN/DESA 2017)
Ademais, a expectativa de vida ao nascer da população tem aumentado nas últimas décadas. Entre 2000 e 2015, houve um crescimento de 5 anos na expectativa de vida ao nascer, e agora a média global situa-se em 71,4 anos (WHO, 2016).
Segundo o último censo da Organização das Nações Unidas, o número total de idosos, definidos como indivíduos com mais de 60 anos de idade, correspondia a 810 milhões de pessoas em 2012, 11,5% da população global. Em 2050, a estimativa é de que esse valor alcance 22%, num total de 2 bilhões de pessoas (UN/DESA, 2012).
A população idosa residente em países em desenvolvimento cresce muito mais rapidamente do que nos países desenvolvidos. Em 1980, países em desenvolvimento abrigavam 56% das pessoas com 60 anos ou mais, enquanto que em 2017, mais de 67% de todos os idosos moravam nos países em desenvolvimento (UN/DESA, 2017).
O Brasil segue esse processo de transição da estrutura etária. Projeções do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) relatam que até 2060 a população idosa no país irá compor 58,4 milhões de pessoas, passando a representar 26,7% do total de habitantes, um crescimento de 3,6 vezes no período entre 2013 e 2060 (IBGE, 2010).
Ainda, entre 1980 e 2016, a expectativa de vida ao nascer do brasileiro cresceu aproximadamente 13 anos, passando de 62,5 para 75,8 anos, e de 2004 a 2014, o grupo etário que mais cresceu na população brasileira foi o dos idosos longevos (IBGE, 2016).
Idosos longevos são indivíduos com mais de 80 anos de idade, e sua incidência é a que mais cresce entre todos os segmentos de idosos. Atualmente eles representam somente 1% da população global, mas devem alcançar a proporção de 4,1% em 2050 (UN/DESA, 2012).
O termo longevidade refere-se exclusivamente ao conceito de expectativa de vida, sendo o indivíduo longevo aquele que apresenta um tempo de vida maior que a média da população de um determinado espaço geográfico e tempo (MCDONALD; RUHE, 2011).
Diversos resultados indicam que há herdabilidade familiar da longevidade, como o trabalho publicado por Perls e colaboradores (1998), quando relataram que a probabilidade de sobrevivência até a faixa dos 80 aos 94 anos para irmãos de centenários é cerca de 4 vezes maior que a de irmãos de indivíduos que faleceram aos 73 anos.
Ademais, foi a partir de um estudo de coorte com gêmeos monozigóticos ou dizigóticos, nascidos na Dinamarca entre 1870 e 1900, que a hipótese de que
aproximadamente 25% do tempo de vida tem causa genética foi elaborada (HERSKIND et al., 1996).
Essas e outras evidências apontam que a longevidade é geneticamente regulada. Entretanto, ela também pode ser modulada por fatores estocásticos ambientais e metabólicos (MCDONALD; RUHE, 2011).
O envelhecimento é um processo marcado pela progressiva deterioração da função bioquímica e fisiológica do organismo, comprometendo a manutenção da homeostase metabólica (KIRKWOOD; AUSTAD, 2000). Em humanos, ele é acompanhado por um maior risco na incidência de doenças crônicas não-transmissíveis (DCNTs), como tumores, distúrbios metabólicos, doenças cardiovasculares e também neurodegenerativas, as quais estão entre as principais causas de morte no mundo.
Identificar intervenções capazes de retardar o envelhecimento e prevenir as DCNTs pode contribuir tanto para promover uma ainda maior longevidade, como para manter a qualidade de vida saudável (healthspan) à pessoa.
Tal resultado minimizaria, ainda, os gastos públicos com demandas por saúde, já que se estima que, do total de custos com saúde ao longo da vida de um indivíduo, 50% ocorre após seus 65 anos de idade (ALEMAYEHU; WARNER, 2004).
Para tanto, é necessário elucidar como se dá a regulação da longevidade, e o que determina os valores diferentes das taxas de envelhecimento entre indivíduos e/ou espécies.
Em 2013, o francês Guido Kromer, professor na Universidade Paris Descartes, propôs identificar marcadores celulares e bioquímicos do envelhecimento. Ele e um grupo de pesquisadores elaboraram 3 critérios para que se fossem reconhecidos marcadores do envelhecimento, os hallmarks of aging. O marcador deveria: (1) ser manifesto com o envelhecimento, (2) seu aumento deveria acelerar o processo, e (3) sua diminuição deveria retardá-lo.
Para tanto, revisitaram os resultados já encontrados na literatura científica até então, e propuseram a existência de 9 hallmarks of aging. São eles: (1) instabilidade genômica, (2) encurtamento de telômeros, (3) alterações epigenéticas, (4) perda de proteostase, (5) disfunção na função dos sensores celulares de nutrientes, (6) disfunção
mitocondrial, (7) senescência celular, (8) exaustão de células-tronco e (9) alterações da comunicação intercelular (LÓPEZ-OTÍN et al., 2013).
É interessante notar que cada um dos hallmarks está intimamente associado com a capacidade celular de responder adequadamente a estressores, sejam eles endógenos ou exógenos, a qual diminui com o envelhecimento (KENYON, 2010).
Por exemplo, um dos principais estresses endógenos é o resultado da perda de proteostase, a qual é proposta como marcador primário do envelhecimento (LÓPEZ-OTÍN et al., 2013). Ela é o resultado de disfunções no sistema de controle de qualidade proteica, e acarreta no estresse proteotóxico, caracterizado pelo acúmulo de proteínas mal formadas e eventual formação de agregados (CHITI et al., 2003; STEFANI; DOBSON, 2003). Alguns estudos têm demonstrado que diversas intervenções farmacológicas que inibem a perda gradual de proteostase são capazes de aumentar o tempo de vida (LABBADIA; MORIMOTO, 2014).
Há ainda o estresse advindo do acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS, em inglês Reactive Oxygen Species), geradas, dentre outros, por disfunções mitocondriais, outro hallmark do envelhecimento (LÓPEZ-OTÍN et al., 2013). ROS são formas reduzidas da molécula de oxigênio derivadas fisiologicamente do processo de respiração celular, sendo o ânion superóxido o mais comum deles. Entretanto, o desequilíbrio entre a superprodução de ROS e a diminuição das defesas antioxidantes
resulta no estresse oxidativo, o qual contribui com o efeito lesivo celular, acarretando
danos às membranas celulares, às organelas e ao conteúdo nuclear (efeito genotóxico), resultando em morte celular (GEMS; DOONAN, 2009).
Elevadas ou cumulativas concentrações de agentes pró-oxidantes, como NaAsO2 ou metil viologênio, já foram descritas como sendo deletérias, culminando na diminuição do tempo de vida (GEMS; DOONAN, 2009). Diversos estudos também têm demonstrado que a exposição prolongada de algumas espécies a altas temperaturas aumenta tanto a produção de ROS como o acúmulo de proteínas malformadas, induzindo, ainda, um acelerado envelhecimento (LABBADIA; MORIMOTO, 2014).
Variações modestas de temperatura estão associadas à healthspan inclusive em humanos, quando o Baltimore Longitudinal Study of Aging revelou que homens com
temperatura corporal mais baixa vivem significantemente mais do que os homens com temperatura corporal acima da mediana (ROTH et al., 2002).
1.2. Modelos animais do envelhecimento
O envelhecimento é um fenômeno praticamente universal, e com mecanismos de regulação que são bastante conservados evolutivamente (MITCHELL et al., 2015), apesar de grandes diferenças no tempo de vida entre os seres vivos. Logo, modelos animais são bastante utilizados para o estudo da fisiopatologia do envelhecimento humano.
Nos dias de hoje, há muitos modelos animais para o estudo da longevidade, todos eles exibindo um padrão semelhante de taxa de mortalidade, o qual cresce, em sua maioria, quasi-exponencialmente em função do tempo de vida (JONES et al., 2013). Entre os modelos animais mamíferos já descritos, encontram-se Mus musculus, Rattus novergicus, Macaca mulatta, Canis lupus familiaris e Felis catus.
As espécies domesticadas representam modelos interessantes para o estudo do envelhecimento, pois têm grande semelhança na incidência de DCNTs com o Homo sapiens. A doença renal crônica é a doença metabólica mais comum em Felis catus, sendo que a maioria dos afetados são idosos (> 12 anos) (REYNOLDS; LEFEBVRE, 2013). Canis lupus familiaris também desenvolvem várias DCNTs, e têm como grande vantagem o fato de apresentarem uma fisiopatologia bem caracterizada e bastante semelhante à humana (HOFFMAN et al., 2018).
Embora a espécie Macaca mulatta apresente a maior semelhança fisiopatológica com humanos, preocupações éticas e dificuldades logísticas restringem o uso desse modelo. O National Institute on Aging e a University of Wisconsin Madison são os centros de pesquisa berço dos 2 únicos estudos sendo realizados atualmente nessa espécie, que investiga o impacto positivo no tempo de vida da restrição dietética (MATTISON et al., 2017).
Em 1935, McCay e colaboradores, em seus experimentos, foram os primeiros a observar que a restrição dietética é capaz de prolongar o tempo de vida. Para tanto eles utilizaram Rattus novergicus, outro modelo que possibilita o estudo de algumas DCNTs, e mais comumente empregado em ensaios neurocognitivos (GALLAGHER; STOCKER; KOH, 2011).
É importante ressaltar que entre os mamíferos, o modelo animal mais utilizado é o Mus musculus, com prevalência do uso de populações inbreed, como o C57BL/6. A espécie traz a vantagem de apresentar uma anatomia semelhante a do humano (VANHOOREN; LIBERT, 2013).
Ele também é muito útil no estudo de intervenções e fármacos que têm potencial para aumentar o tempo de vida, além da possibilidade de se realizar manipulação genética. Desse modo, ao gerar linhagens knockout, pode-se estudar qual a influência dos genes para a longevidade. No entanto, esses animais podem apresentar várias diferenças em relação às DCNTs humanas, como uma susceptibilidade muito menor, por exemplo, de serem acometidos por alguns tumores ou doenças cardiovasculares (JACKSON LABORATORY, 2016).
Em contrapartida, em condições controladas de laboratório, a expectativa de vida ao nascer desses mamíferos é longa, partindo de 28 meses no Mus musculus chegando até 26 anos em Macaca mulatta, o que torna experimentos exploratórios bastante custosos e longos.
Além dos mamíferos descritos, existem modelos para o estudo da longevidade em Saccharomyces cerevisiae, na Drosophila melanogaster, e no nematoide de vida livre Caenoharbditis elegans (FONTANA; PARTRIDGE; LONGO, 2010).
Uma alternativa para o estudo mais generalizado de genes associados à longevidade é o uso do nematoide C. elegans. Diferentemente de estudos de senescência utilizando cultura celular, o C. elegans permite análise de um organismo multicelular completo, com tecidos e órgãos.
O C. elegans atinge em torno de 1 milímetro quando adulto e é majoritariamente hermafrodita, com apenas 0,1% de sua população constituída por
machos. Seu tempo de geração é de apenas 3 dias, e 1 único hermafrodita pode gerar mais de 200 nematoides. Em resumo, seu ciclo de vida consiste no estágio embrionário, 4 estágios larvais (L1, L2, L3, e L4) e a fase adulta. Adultos possuem 959 células somáticas, e sua autofecundação possibilita a propagação de uma progênie homozigota geneticamente idêntica.
A forma como o C. elegans envelhece é parecida com a de humanos. Semelhanças incluem o aumento da mortalidade e da formação de agregados proteicos, e ao mesmo tempo, a diminuição da fertilidade e da mobilidade com o tempo de vida (OLSEN; VANTIPALLI; LITHGOW, 2006). Ademais, quando mantidos em temperaturas superiores a sua fisiológica de 20°C (estresse térmico), há aceleração do envelhecimento biológico (BYERLY; CASSADA; RUSSELL, 1976).
Embora não apresente sistema circulatório, respiratório, ou órgãos mais complexos como rins, esse modelo animal tem como vantagens principais a grande facilidade de manipulação genética e o curto tempo de vida médio, que gira em torno de 20 dias. Alia-se a isso o fato de os animais possuírem células transparentes, as quais possibilitam o estudo de expressão proteica in vivo ao se utilizar marcadores fluorescentes.
Ademais, diferentes trabalhos mostraram que mutações gênicas que afetam
a longevidade em C. elegans têm efeitos conservados em mamíferos
(HOLZENBERGER et al., 2003; KENYON, 2010). Isto posto, 44% de todas suas sequências gênicas que codificam proteínas são correspondentes a transcritos no H. sapiens (LAI et al., 2000). Demonstrou-se, por exemplo, que tanto mutações no gene daf-16 de C. elegans quanto polimorfismos de seu ortólogo em humanos FOXO3A estão relacionados à alteração no tempo de vida e na expectativa de vida ao nascer, respectivamente (PANOWSKI; DILLIN, 2009; WILLCOX et al., 2008).
Esses resultados indicam a relevância do uso de C. elegans para a identificação de novas vias de sinalização evolutivamente conservadas na regulação no tempo de vida, o que torna possível a análise comparativa de seus efeitos e a busca de ferramentas para um envelhecimento humano saudável.
1.3. RNAs não codificantes e a função regulatória de microRNAs (miRNAs)
Em 2001, um consórcio envolvendo mais de 20 grupos de pesquisa publicou os primeiros resultados do “Human Genome Project”, cujo propósito inicial era realizar o primeiro sequenciamento de todo o genoma humano. Inesperadamente, constatou-se que somente 2% de todo genoma são capazes de serem traduzidos em proteínas (LANDER et al., 2001; VENTER et al., 2001). Uma interpretação simples para esse resultado, hipotetizada quando os resultados foram publicados, seria que os 98%
restantes do material genético não-codificante eram “lixos”, pois pareciam não ter
função.
Nos anos seguintes, novos estudos mostraram que regiões não-codificantes são fundamentais na regulação da expressão gênica (ELGAR; VAVOURI, 2008). Algumas dessas regiões são transcritas em ácidos ribonucleicos não-codificantes (ncRNAs).
ncRNAs são quaisquer moléculas funcionais de RNA que não são traduzidas em proteínas. RNAs transportadores, responsáveis pelo transporte de aminoácidos para o sítio da síntese proteica; e o RNA ribossomal, constituinte do ribossomo, são 2 dos tipos de ncRNAs. Outros tipos de ncRNAs, ainda, preservam a função de serem reguladores pós-transcricionais da expressão gênica, como as diversas moléculas de RNAs pequenos (BERNSTEIN; DENLI; HANNON, 2001)
Vários tipos de RNAs pequenos já foram identificados: miRNAs e siRNAs descobertos na década de 1990; e PIWI-interacting RNAs (piRNAs), já nos anos 2000, por exemplo (HOOGSTRATE et al., 2014).
miRNA é um RNA pequeno endógeno que contém aproximadamente 22 nucleotídeos. Quanto à nomenclatura, normalmente os miRNAs são nomeados pela identificação da espécie seguida do número do miRNA, de acordo com a ordem de sua descoberta. Assim, por exemplo, para denominar o miRNA 100 em H. sapiens, utiliza-se a nomenclatura hsa-miR-100.
miRNAs com sequência de nucleotídeos muito similares são geralmente distinguidos por uma letra adicional, por exemplo, hsa-mir-99a e hsa-mir-99b, os quais diferem em somente 4 nucleotídeos. Ademais, miRNAs com sequência nucleotídica madura idêntica podem advir de diferentes loci genômicos. Nesse caso, eles são usualmente distinguidos por outro número adicional no final da sequência, e.g., hsa-mir-103a-1 e hsa-mir-103a-2.
O reconhecimento do papel fisiológico de miRNAs data de sua própria descoberta pelos grupos liderados por Victor Ambros e Gary Ruvkun entre 1993 e 2000, quando foi constatado que 2 RNAs pequenos contendo 21 ou 22 nucleotídeos (lin-4 e let-7) eram capazes de interferir na tradução proteica e alterar o tempo de desenvolvimento do C. elegans (LEE; FEINBAUM; AMBROS, 1993; REINHART et al., 2000; WIGHTMAN; HA; RUVKUN, 1993).
Desde então, viu-se que esses e muitos outros miRNAs são evolutivamente conservados, e, só na espécie humana, foram descobertos mais de 2600 miRNAs (miRBase, v. 22). Há muitos exemplos de conservação entre C. elegans e mamíferos, inclusive o H. sapiens (IBÁÑEZ-VENTOSO; VORA; DRISCOLL, 2008), sugerindo que tais miRNAs participem de vias regulatórias vitais ao serem conservados em grupos filogeneticamente distintos.
Análises in silico predizem que cada miRNA pode regular a expressão de muitos RNA mensageiros (mRNAs), e que cada mRNA pode ser regulado por mais de 1 miRNA (MISKA et al., 2007). Acredita-se que mais de 60% dos genes codificadores de proteínas em humanos sofra regulação por miRNAs, evidenciando ainda mais sua importância na regulação da expressão gênica (BARTEL, 2009).
Nosso grupo e outros demonstraram que, em M. musculus e C. elegans, a síntese da maioria dos miRNAs diminui com o envelhecimento (IBÁÑEZ-VENTOSO et
al., 2006; MORI et al., 2012). Vários miRNAs e componentes da sua via de biogênese
têm sido implicados como reguladores da longevidade (SMITH-VIKOS; SLACK, 2012), e têm relevância em diversos processos biológicos que são hallmarks do envelhecimento, como na proliferação de células-tronco, e na senescência celular (CARAVIA et al., 2017).
Desregulações dos níveis de expressão de miRNAs estão correlacionadas
com a incidência de várias DCNTs (MORI, 2018).Alguns dos fatores que podem levar a
alterações na expressão de miRNAs são: (1) variações gênicas ou cromossômicas, (2) herança epigenética e (3) alterações no processo de biogênese de RNAs pequenos.
Sobre a biogênese, miRNAs maduros são formados a partir de transcritos primários de miRNAs (pri-miRNAs), os quais são sintetizados no núcleo por uma RNA polimerase II ou III e se apresentam em forma de hairpin (grampo). Ainda no núcleo, são clivados pelo complexo microprocessador DRSH-1/Drosha e PASH-1/DGCR8 ou por componentes da maquinaria de splicing que geram precursores de miRNAs (pre-miRNAs), contendo entre 60 e 70 nucleotídeos. Esses são exportados ao citoplasma pela XPO-1/Exportin-5, e ali reconhecidos pela DCR-1/DICER, uma RNAse do tipo III (BERNSTEIN; DENLI; HANNON, 2001).
DCR-1/DICER cliva os pre-miRNAs originando 1 molécula dupla-fita de miRNA. Uma das fitas, a passenger strand é geralmente degradada, enquanto a guide strand acoplar-se-á a proteínas argonautas do complexo silenciador induzido por RNA (RISC, em inglês RNA-induced silencing complex), formando o miRISC, que, em geral, reconhecem sequências complementares na região 3’-não traduzida (3’-UTR) de mRNAs e induzem a desestabilização e/ou inibição da tradução desses alvos.
1.4. A proteína argonauta ALG-1
ALG-1 é uma proteína citoplasmática de 112 kilodalton e foi primeiramente identificada como proteína essencial para a função de lin-4 e let-7 (GRISHOK et al., 2001). O gene que codifica a proteína ALG-1 (alg-1) está localizado no cromossomo sexual X, e possui 2 isoformas independentes. As isoformas de ALG-1 são expressas em vários tecidos e estruturas do C. elegans, como na camada muscular, na faringe, e na vulva (VASQUEZ-RIFO et al., 2012).
ALG-1 pertence à família das proteínas argonautas, as quais fazem parte do RISC, sendo responsáveis pelo fenômeno de silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) via ncRNAs. As argonautas são proteínas que apresentam 3 domínios característicos. Em sua região N-terminal, o domínio PAZ serve como sítio de ligação à região 3’ de RNAs pequenos, enquanto o domínio MID liga-se ao 5’. Já na região C-terminal há o domínio PIWI, que pode apresentar um sítio catalítico conservado (Asp-Asp-His/DDH) com atividade de endonuclease, sendo o responsável por clivar diretamente mRNAs alvos, inibindo sua tradução (SONG et al., 2003; YAN et al., 2003).
As argonautas foram subdivididas em 2 clados: Argonaute-like e Piwi-like, os quais se ligam a miRNAs ou piRNAs, respectivamente, para exercer o PTGS. Elas são altamente conservadas evolutivamente, sendo descritas em inúmeras espécies, como na D. melanogaster, em alguns peixes, como o Danio rerio, e em vários mamíferos.
Entre as proteínas Argonaute-like já identificadas em C. elegans, encontram-se, além de ALG-1, outras 2: ALG-2, que juntamente com ALG-1 é amplamente expressa e se associa à maioria dos miRNAs, e ALG-5, cuja expressão é restrita à linhagem germinativa e somente interage com um pequeno subgrupo de miRNAs (BROWN et al., 2017; VASQUEZ-RIFO et al., 2012). Há ainda um terceiro clado que contempla argonautas exclusivamente expressas em C. elegans, as WAGO (Worm Argonautes), tornando essa espécie a que mais abrange genes da família argonauta, 27 no total (HÖCK; MEISTER, 2008).
No mamífero H. sapiens, existem 4 proteínas Argonaute-like, sendo que uma das homólogas contém o mesmo sítio DDH-like de ALG-1, a proteína AGO2. Essa argonauta é encontrada em diversos tecidos e órgãos, entre os quais, no músculo esquelético, no rim, no fígado, no trato gastrointestinal, e nas glândulas tiroide, paratireoides e adrenal (UHLÉN et al., 2015).
O complexo de argonautas associadas pode desempenhar diferentes funções, que dependem dos tipos de ncRNAs com os quais interagem. Sendo do clado das Argonaute-like, ALG-1 liga-se a miRNAs maduros. Essa disposição permite que ALG-1 seja responsável pela estabilização do próprio miRNA, além de proteína efetora do PTGS.
No Reino Animalia, a interação entre o mRNA alvo e o miRISC ocorre primariamente devido à complementaridade parcial ou total entre o mRNA e os nucleotídeos 2 a 8, denominada região seed, do miRNA (BARTEL, 2009). Entretanto, recentemente foi demonstrado que há interações além do seed que podem determinar a especificidade do pareamento (BROUGHTON et al., 2016).
O PTGS mediado pelo miRISC pode ocorrer em cada uma das etapas da tradução. Na iniciação, por exemplo, a interação do miRISC com eIF6 (em inglês, eukaryotic Translation Initiation Factor 6) impede a formação do ribossomo 80S (CHENDRIMADA et al., 2007) em eucariotos, o qual é o competente para tradução do mRNA. Também há evidências de que a repressão ocorra durante o elongamento, uma vez que vários miRNAs copurificam com polirribossomos (KIM et al., 2004).
O knockout de alg-1 é suficiente para provocar desregulações globais do nível de expressão de miRNAs (ZINOVYEVA et al., 2014). Mutantes para alg-1 ainda apresentam aberrações fenotípicas, com diferentes graus de malformações no desenvolvimento embrionário, diminuição no número de oócitos, e menor tempo de vida (AALTO et al., 2018; VASQUEZ-RIFO et al., 2012).
Em seus experimentos com knockdown da expressão do gene alg-1, Grishok e colaboradores (2001) demonstraram que ALG-1 atua especificamente na via de miRNAs, ao observarem que a quantidade global de miRNAs está diminuída, mas que a de siRNAs não parece afetada.
Recentemente, o grupo liderado por Amy Pasquinelli (2018) evidenciou que os níveis de ALG-1 durante a fase adulta é rapidamente diminuído em C. elegans selvagens (WT). Entretanto, quando os mesmos WTs são submetidos a uma ainda maior redução da expressão do gene alg-1 a partir de L4, há diminuição no tempo de vida, indicando que a expressão residual de ALG-1 é necessária para manter o tempo de vida médio da espécie.
Além disso, um estudo publicado em 2017 revelou que ALG-1 é reguladora central do processo de biogênese de miRNAs. Métodos in silico identificaram regiões na própria 3’-UTR do mRNA de alg-1 que permitem o pareamento de vários miRNAs (INUKAI et al., 2017). Ensaios bioquímicos detectaram a associação de miRNAs específicos com a 3'-UTR de alg-1, em especial, o cel-miR-71. É interessante notar que animais mir-71 knockout para tem menor tempo de vida, e a perda desse miRNA ou de seus nucleotídeos alvo na 3'-UTR de alg-1 resultou em níveis aumentados de ALG-1, confirmando que alg-1 está sujeito à regulação pelo cel-miR-71 na fase adulta (INUKAI et al., 2017).
Tendo em vista a relevância de miRNAs na regulação pós-transcricional da expressão gênica e a função efetora das proteínas Argonaute-like nesse mecanismo; e as evidências na literatura que relacionam diminuição da biogênese de miRNAs com o envelhecimento bem como a modulação da sua expressão global por ALG-1 numa alça de autorregulação, o presente estudo propôs caracterizar a regulação da expressão de alg-1 no contexto do envelhecimento. Além de analisar a função da proteína em condições controle, de longevidade induzida, ou sob estresses ambientais (térmico e oxidativo), visamos identificar prováveis miRNAs que contribuem para o fenótipo de longevidade.
2. Objetivos
Visando avaliar a participação da via de miRNAs em fenótipos associados ao envelhecimento, tivemos como objetivo realizar experimentos numa tentativa de responder as seguintes perguntas:
1. ALG-1 é necessária para a longevidade de C. elegans?
2. Qual o efeito do knockdown de alg-1 no desenvolvimento de C.
elegans?
3. O knockdown de alg-1 tem efeito sob o tempo de vida e resistência
a estressores de C. elegans, se realizado só na fase adulta?
4. Caso haja modulação negativa no tempo de vida pelo knockdown
de alg-1, seriam esses efeitos os opostos da superexpressão de alg-1?
5. A superexpressão de alg-1 confere resistência a algum estressor,
seja ele oxidativo ou térmico?
6. Poderiam os efeitos da superexpressão de alg-1 serem atribuídos a
sua modulação por cel-miR-71?
7. Quais miRNAs têm sua expressão alterada na superexpressão de
alg-1 e/ou condições de longevidade?
3. Material e Métodos
3.1. AnimaisC. elegans foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center (CGC), centro da University of Minnesota, USA, ou gerados por cruzamento. Exceto quando mencionado diferentemente, eles foram acondicionados em incubadoras sob temperatura de 20 °C em placas de petri de 60x10 mm com meio semissólido
Nematode Growth Media (NGM) [1,7% Ágar, 1 mM CaCl2, 5 μg/ml colesterol, 25 mM
KH2PO4, 1 mM MgSO4, 0,3% NaCl, 0,25% peptona bacteriológica] acrescido de
estreptomicina 100 µg/ml e contendo uma camada de 500 µl em OD600=10 de sua fonte alimentar, a bactéria Escherichia coli OP50-1 (BRENNER, 1974), crescidas overnight em meio Luria Bertani [0,5% extrato de levedura, 1% NaCl, 1% triptona].
As linhagens utilizadas nesse trabalho foram, em ordem de linhagem, (genótipo), e descrição: CB4037 (glp1(e2141) III), CF1903 (glp1(e2144) III), e DG2389 (glp1(bn18) III), mutantes longevos que não desenvolvem linhagem germinativa a 25°C;
CT20, [alg-1p::GFP::alg-1 + rol-6(su1006)], superexpressão de alg-1 fusionada à GFP
apresentando o fenótipo roller; MAM44, (glp-1(e2144) III; [alg-1p::GFP::alg-1 + rol-6(su1006)]), superexpressão de alg-1 em background knockout de glp-1(e2144);
MAM131, (mir-71(n4115); [alg-1p::GFP::alg-1 + rol-6(su1006)]), superexpressão de
ALG-1 em background knockout de mir-71(n4115); MAM133, (mir-71(n4115); [sur-5p::luciferase::GFP + rol-6(su1006)]), linhagem knockout de mir-71(n4115) usada como controle para MAM131 ao conter vetor com o transgene GFP e apresentar fenótipo roller; MT12993, (mir-71(n4115) I); N2 Bristol, wild-type (WT); PE255, ([sur-5p::luciferase::GFP + rol-6(su1006)] X), linhagem usada como controle para CT20 ao conter vetor com o transgene GFP e apresentar o fenótipo roller.
Linhagens CT20, MAM131, MAM133 e PE255 foram outcrossed 4x com o
WT em uso, e congeladas em nitrogênio líquido (-196 oC). Novas alíquotas foram
3.2. Sincronização
Para que os ovos de C. elegans eclodam e suas larvas alcancem a fase adulta de forma sincrônica, o protocolo de sincronia de nematoides foi realizado de 2 maneiras. Quer seja por egg laying, ao alocar 20-40 hermafroditas gravídicas em placas de NGM e retirá-las após 1-3 h de deposição de ovos; quer seja por bleaching, conforme descrito em STIERNAGLE, 2006, ao acrescentar 500 µl de NaOH 5 M e 1 ml de solução 5% de NaClO em um tubo de 15 ml contendo hermafroditas gravídicas em 3,5 ml de H2O autoclavada. Após homogeneização em vórtex por 10 minutos (min) e centrifugação a 340 x g por 30 segundos (s), o precipitado resultante de ovos foi pipetado em placas de NGM. A estratégia de sincronização escolhida está descrita em cada experimento realizado.
3.3. RNA de interferência (RNAi)
Silenciamos a expressão gênica pela técnica de RNAi por ingestão de acordo com KAMATH et al., 2001. Em resumo, uma sequência complementar ao gene alvo é inserida no sítio múltiplo de clonagem (MCS) do plasmídeo L4440, que é então transformado em bactérias E. coli HT115(DE3). Induz-se a expressão do RNA dupla fita (dsRNA) com Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosidio (IPTG), ativador dos promotores T7 que flanqueiam o MCS. Foram oferecidas aos grupos controles cepas HT115(DE3) contendo dsRNA contra o gene da luciferase (ctrl RNAi), pois é um fragmento inespecífico sem complementaridade de bases com o genoma do C. elegans.
Além de suplementar o NGM com 12,5 μg/ml de tetraciclina e 50 μg/ml de
ampicilina, acrescentamos 1 mM de IPTG para induzir a expressão do dsRNA ao NGM. Quando utilizamos a cepa HT115(DE3) não transformada com o vetor de expressão L4440, não adicionamos ampicilina. As bactérias foram inoculadas em meio Luria
Utilizamos cepas construídas e disponibilizadas pelo Ahringer RNAi Library ou Vidal RNAi library.
Para os experimentos descritos em 3.4, os C. elegans foram mantidos sob RNAi desde o estágio embrionário. Para os demais experimentos, a interferência por RNA deu-se a partir do primeiro dia de adulto (d0), sendo os grupos mantidos em ctrl RNAi durante seu tempo de desenvolvimento.
3.4. Tempo de desenvolvimento
A sincronização foi realizada via egg laying por 1 h em placas de NGM
contendo 500 μl de E. coli HT115(DE3) transformada com vetor controle (pL4440 +
luciferase), ou com dsRNA contra alg-1. Após 60 h do desenvolvimento da progênie, as placas foram observadas a cada 1 h quanto ao aparecimento de adultos, vistos pela presença de ovos no útero, até o último C. elegans alcançar a fase adulta.
3.5. Tempo de vida
Cerca de 100 indivíduos sincronizados por bleaching foram monitorados diariamente com a utilização de um estereoscópio de luz. Durante o monitoramento, contamos o número de mortos, ou seja, os que não demonstraram bombeamento da faringe ou resposta motora ao toque com uma haste de platina. Os tempos de vida
foram realizados em placas de NGM, com 500 μl da cepa de E. coli de interesse, e
contendo 20 µg/ml de anfotericina B e 50 µg/ml de 5-fluor-2-deoxiuridina (FUdR), a 20 ou 25 °C, temperaturas fisiológicas para o C. elegans. As figuras mostram os resultados de uma replicata representativa. Resultados e análises estatísticas para todos os ensaios de tempo de vida estão no Apêndice 3.
3.6. Resistência a estressores térmicos e oxidativos
Para o estresse térmico, o método empregado foi semelhante a 3.5, exceto que mantivemos as placas de NGM contendo C. elegans sob RNAi contra o gene de interesse continuamente a 28 °C a partir de d0.
Para induzir estresse oxidativo em C. elegans, foram realizados ensaios com 3 agentes pró-oxidantes diferentes, que seguem:
3.6.1. Exposição a dicloreto hidratado de metil viologênio
C. elegans no estágio larval L4 foram distribuídos em placas de NGM com
500 μl de OP50-1, contendo 4 mM de dicloreto hidratado de metil viologênio
(Sigma-Aldrich) e 50 µg/ml de FUdR, mantidos a 20 °C, e monitorados diariamente quanto ao número de mortos.
3.6.2. Exposição a arsenito de sódio (NaAsO2)
C. elegans em d0 ou d3 da fase adulta foram distribuídos em uma placa de 96 poços contendo 100 μl de solução líquida M9, com concentrações de 0; 7,5 ou 10 mM de NaAsO2 (Sigma-Aldrich). Após 8 horas (h), o número de mortos foi quantificado. Os animais foram considerados mortos na ausência de bombeamento da faringe e/ou resposta a estímulo motor.
3.6.3. Exposição a 5-hidroxi-1,4-naftoquinona
O ensaio de estresse oxidativo via 5-hidroxi-1,4-naftoquinona (juglone, Sigma-Aldrich) foi realizado conforme descrito por SENCHUK; DUES; VAN RAAMSDONK, 2017. C. elegans em d0 foram distribuídos em placas de NGM contendo 0 ou 240 μM de juglone, e monitorados a cada 1 h quanto o número de mortos. Tanto a diluição do fármaco, como as placas foram feitas imediatamente antes da realização do experimento, as quais foram mantidas no escuro a 20 °C.
3.7. Microscopia de fluorescência
Para estudar a modulação in vivo da expressão de alg-1, utilizamos a técnica de microscopia de fluorescência. Linhagens de C. elegans contendo alg-1p::alg-1::gfp foram submetidas ao RNAi e transferidas em d3 para placas de 96 poços contendo 100 μl da solução M9 e imobilizados com 0,02% de NaN3.
A expressão proteica foi avaliada utilizando o Cytation™ 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments) com o uso de exposições semelhantes no software Gen5. A análise quantitativa do GFP das imagens foi feita no software ImageJ (National Institute of Health), considerando a média de fluorescência.
3.8. Reação em cadeia da polimerase convencional (PCR)
A reação de PCR foi realizada adicionando-se 12 μl de 2x Master Mix
(Promega), 0,25 μl de cada primer forward e reverse, um volume variável de DNA para manter a concentração final constante, mais H2O autoclavada completando um volume final de reação de 25 μl. A reação de PCR foi realizada em termociclador e, ao produto da reação, foi adicionado loading buffer, os quais foram resolvidos em eletroforese em gel de agarose a 1% (m/v) contendo tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) 1x corado com SYBR Safe, e revelados no ChemiDoc™ (Bio-Rad Laboratories). Os primers utilizados estão na Tabela 1.
3.9. Transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR)
3.9.1. Extração do RNA total
C. elegans foram transferidos para microtubos estéreis de 2 ml com a adição de 200 µl de Trizol (Thermo Fisher Scientific) e zirconium oxide beads (Thomas Scientific). Em seguida, as amostras foram congeladas em freezer a -80°C até a realização da extração do RNA total.
A extração de RNA total foi realizada pelo protocolo TRIzol (Thermo Fisher Scientific), com pequenas modificações. As amostras foram descongeladas, adicionadas de 300 µl de Trizol, homogeneizadas no Bullet Blender® Storm (Next Advance) e agitadas por 15 s após adição de 100 μl de clorofórmio. Em seguida, foram mantidas à temperatura ambiente por 10 min, e centrifugadas a 12.000 x g por 15 min a 4°C.
O sobrenadante resultante foi transferido para um microtubo estéril de 1,5 ml com 312 μl de isopropanol e 62 μl de acetato de sódio 3 M. Após serem mantidos a -20°C por pelo menos 20 min, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g por 10 min a 4°C.
O precipitado formado foi separado do sobrenadante e adicionado 500 μl de
etanol 75%. Após agitação por inversão, os microtubos foram à centrífuga a 7.500 x g por 5 min a 4°C. Essa etapa foi repetida 2x.
O sobrenadante formado foi descartado e o material precipitado foi seco em
temperatura ambiente. Posteriormente, 10 μl de H2O autoclavada foi adicionado ao
precipitado, e os microtubos incubados a 60°C por 10 min, para a ressuspensão e dissolução do RNA total.
As concentrações de RNA total de todas as amostras foram mensuradas por espectrofotometria no Nanodrop™ 2000c (Thermo Fisher Scientific), e a integridade analisada por eletroforese em gel de agarose a 1% (m/v) contendo tampão TAE
(Tris-Acetato-EDTA) 1x corado com SYBR Safe e revelado no ChemiDoc™(Bio-Rad Laboratories).
3.9.2. Transcrição reversa (RT)
A transcrição reversa foi feita segundo o protocolo do kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Thermo Fisher Scientific). Em suma, para cada reação foram adicionados 1 μl de primers randômicos, 1 μl de RT buffer, 0,4 μl de dNTP mix, 0,5 μl de transcriptase reversa e um volume variável de H2O autoclavada para manter a massa das amostras de RNA constante. Em seguida, a solução formada foi sequencialmente incubada a 25°C por 10 min, 37°C por 120 min, e 85°C por 5 min. Após diluição de 1:20, as amostras de cDNA resultantes foram armazenadas a -20°C até a utilização no qPCR.
3.9.3. PCR em tempo real (qPCR)
O cDNA resultante foi submetido ao PCR em tempo real em placas de 96 ou 364 poços, no qual utilizamos SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific), contendo em cada poço: 5 μl do cDNA das amostras, 3 μl 2x Syber Green, 0,25 μl de cada primer 100 μM forward ou reverse, e H2O autoclavada para completar um volume total de 10 μl.
Após alocar os microtubos a 95 °C por 5 min, realizamos o qPCR sob 40 ciclos de amplificação alternada, como se segue: desnaturação a 95 °C por 15 s, anelamento a 60 °C por 20 s, e extensão a 72 °C por 30 s. Ao final da ciclagem, foi realizada a etapa de obtenção da curva de melting, que consiste em uma etapa de 95 °C por 10 s, seguida por 1 ciclo, no qual as temperaturas variam de 65 °C a 95 °C por 5 s, com transição de 0,5 °C/s.
Controles negativos, substituindo o cDNA por H2O autoclavada, foram adicionados em cada reação realizada. Todas as amostras utilizadas na reação foram
analisadas em duplicata. A especificidade dos primers foi verificada pela curva de melting.
A detecção foi realizada no Sistema de Detecção de Sequências ABI 7000 (Thermo Fisher Scientific) para as reações feitas em placas com 96 poços, ou no CFX384 Touch™ Detection System (Bio-Rad Laboratories), para as reações feitas nas placas com 384 poços.
3.9.4. Quantificação relativa das amostras
A quantificação relativa foi determinada utilizando o método Delta-Delta Ct (∆∆Ct) (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Calculou-se inicialmente o threshold cycle (Ct) de cada amostra, subtraindo-os aos valores dos genes endógenos utilizados como controle (his-10 ou Y45F10.4), e usando um normalizador de interesse. Uma vez
determinado o ∆∆Ct, aplicou-se a fórmula 2−∆∆𝐶𝑡, que resultou no valor da expressão
gênica relativa. Os primers utilizados estão na Tabela 1.
Tabela 1 – Sequências de primers utilizados
Sequência (5’ 3’) Descrição
CGCGCTCGTTAATCATCTTGT qPCR para alg-1 forward GGATGAACCTGCACAGCTC qPCR para alg-1 reverse GCAATTCGTCGTCTCGC qPCR para his-10 forward GACTCCACGGGTTTCCT qPCR para his-10 reverse CGAGAACCCGCGAAATGTCGGA qPCR para Y45F10.4 forward CGGTTGCCAGGGAAGATGAGGC qPCR para Y45F10.4 reverse TCATTGGTGAAGTTGTTGCAACT Genotipagem (n4115) forward ATGGGTAGTGAGACGTCGGA Genotipagem (n4115) reverse 1 AGAGTGAGAAAGTGAGCGCG Genotipagem (n4115) reverse 2
3.10. Sequenciamento de RNAs pequenos
Os RNAs foram isolados de pools de C. elegans em d0, como no método 3.9.1. Amostras de 6 µg de RNA total foram enviadas para sequenciamento de RNAs no Centro de Genomas da ESALQ-USP, e enriquecidos para RNA pequenos usando o PureLink miRNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific), seguido por preparação da biblioteca de miRNA usando SOLID Total RNA-Seq Kit, e sequenciamento na plataforma SOLiD5500, de acordo com as recomendações do fabricante. Após o pré-processamento no software Fastx Tool Kit para retirar os adaptadores e selecionar dados com no mínimo 18 pares de base (bp), a análise foi realizada utilizando o software Bowtie2, com o genoma de referência ce10, fornecido pela UCSC. O mapeamento foi realizado utilizando miRNAs com alteração mínima de 2x na expressão, ou seja, genes com log2 fold change > 1 ou < -1 foram selecionados como
diferencialmente expressos, e diagramas de Venn foram feitos em
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/. Todos os miRNAs identificados estão no Apêndice 4.
3.11. Identificação de possíveis reguladores da transcrição de alg-1 a partir de dados do modENCODE
Acessamos a versão n° 33 do consórcio de ChIP-Sequencing modENCODE pelo site www.intermine.modencode.org/release-33/begin.do. Produtos gênicos foram considerados possíveis reguladores da transcrição de alg-1 caso houvesse um pico significante na região de até 2000 bp antes do início de seu códon iniciador (cromossomo X: 13947420..13949420). Essa característica é importante, pois a presença de picos indica ligação do possível regulador à região promotora de alg-1.
3.12. Análise funcional de via de enriquecimento
Os termos de ontologia do gene podem ser usados para descrever o processo biológico no qual os produtos desses genes estão implicados, sua função molecular e localização subcelular. A análise de enriquecimento a partir de Gene Ontology para os reguladores de transcrição de alg-1 foi realizada na versão 6.8 do DAVID Bioinformatics Resources.
3.13. Análise estatística
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. Para a determinação das diferenças estatísticas entre as curvas de tempo de vida, utilizamos o teste Log-rank (Mantel-Cox). Para os demais, as diferenças entre os valores médios foram analisadas por teste “t” de Student não pareado, ou ANOVA seguida do teste post-hoc adequado para cada experimento. As diferenças entre as médias foram consideradas significantes quando p < 0,05 e utilizamos o programa GraphPad Prism (Versão 5, Graph Pad Software).
4. Resultados e Discussão
4.1 Efeitos do knockdown de alg-1 no desenvolvimento, tempo de vida, e resistência a estressor oxidativo em C. elegansUma das técnicas para se obter informações sobre a função exercida por uma proteína é pelo knockdown ou knockout do gene que a codifica. Entre as primeiras, uma das técnicas mais amplamente utilizadas é o RNAi. De fato, 2 pesquisadores receberam o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 2006, pela descoberta da
técnica de RNAi empregando C. elegans (“The Nobel Prize in Physiology or Medicine
2006”).
Neles, podemos realizar RNAi pela alimentação, simplesmente ao expor os nematoides à cepa HT115(DE3) de E. coli transformada com o plasmídeo L4440, no qual uma sequência complementar ao gene alvo está inserida no MCS. O MCS é flanqueado por 2 promotores T7 antiparalelos responsáveis pela transcrição dos dsRNAs contra o gene de interesse, resultando em seu knockdown.
Primeiramente, então, buscamos validar se o RNAi induzia de fato o knockdown de alg-1. Por RT-qPCR, observamos que, após somente 3 dias de contato do WT com RNAi contra alg-1 em sua fase adulta, há uma diminuição consistente de 2x na expressão de seu mRNA (Figura 1, item A.). Por microscopia de fluorescência, confirmamos que o nível proteico de ALG-1::GFP decresce 60% nessas mesmas condições de RNAi contra alg-1 (Figura 1, item B.). Seguimos, então, empregando em C. elegans a técnica de RNAi contra alg-1 para avaliar sua função gênica.
Já é bem estabelecido na literatura que alguns miRNAs são essenciais para o correto desenvolvimento do C. elegans, sinalizando para a transição entre as fases larvais conseguintes (REINHART et al., 2000). Assim, como prova de conceito, avaliamos o tempo de desenvolvimento da linhagem WT após knockdown de alg-1. Como pode ser visto na Figura 2, há um atraso de 2h nessa situação.
O prejuízo no desenvolvimento poderia indiretamente prevenir a capacidade do RNAi contra alg-1 de prolongar o tempo de vida do nematoide, ou ainda induzir morte prematura. Assim, para avaliar se há modulação da taxa de envelhecimento por ALG-1, passamos a realizar o knockdown somente durante a fase adulta.
A. B.
Figura 1. A. Análise da expressão de mRNA de alg-1 por RT-qPCR relativo ao do controle endógeno his-10. C. elegans wild-type (WT) foram submetidos aos tratamentos com ctrl RNAi ou RNAi contra alg-1 a partir do primeiro
dia da fase adulta (d0) e tiveram o RNA extraído pelo método TRIzol no d3. RT-qPCR realizado utilizando o protocolo do SYBR Green Master Mix. *p < 0,05, teste ”t” de Student. Média e erro padrão apresentados. n=50 por condição, 3 replicatas. B. Quantificação da expressão de alg-1 através da fluorescência de alg-1p::alg-1::gfp em ALG-1::GFP. C. elegans foram distribuídos em d0 para placas de NGM com bactéria E. coli HT115(DE3) contendo ctrl RNAi ou RNAi contra os genes supracitados. Em d4, imagens de fluorescência foram obtidas no Cytation 5 e analisadas no software ImageJ. *p < 0,05, ANOVA de 1 via seguida de teste post-hoc de Dunnett. n=6-13, 3 replicatas.
Prosseguindo com o silenciamento da expressão de alg-1 somente durante a fase adulta no WT, observamos que o tempo de vida médio passou de 22 para 18 dias, uma redução de 18.2% (Figura 3, item A.), ou seja, alg-1 é importante para a manutenção do tempo de vida de C. elegans. Ainda, o tratamento do WT com RNAi contra dcr-1 somente durante a fase adulta, apesar de exibir diferença estatisticamente significante da mediana do tempo de vida em comparação com o WT, apresentou magnitude de diminuição de apenas 4,5% (Figura 3, item B.).
Figura 2. Tempo de desenvolvimento de WTs mantidos a 20°C sob condições ótimas e submetidos ao tratamento
com ctrl RNAi (linha contínua) ou RNAi contra alg-1 (linha tracejada) a partir de L1. *p < 0,05, Log-rank (Mantel-Cox), n=89-257, 4 replicatas.
DCR-1 é uma das enzimas da via de biogênese miRNAs, porém ela também participa da síntese de outros RNAs pequenos, como siRNAs (BERNSTEIN; DENLI; HANNON, 2001). Esse resultado parece indicar que a alteração do tempo de vida é devida majoritariamente à diminuição da biogênese de miRNAs, e não de outros RNAs pequenos. Ainda, pode-se especular que a perda de outras espécies de RNAs pequenos em adultos poderia ser benéfico.
Figura 3. A. e B. Curvas de sobrevivência de WTs mantidos a 20°C sob condições ótimas, Linhagens
foram mantidas em ctrl RNAi desde o estágio embrionário, e distribuídas aos tratamentos com os RNAis indicados a partir de d0, na presença de FUdR, mostrando menores tempos de vida em alg-1 e dcr-1 RNAi. *p < 0,05, Log-rank (Mantel-Cox). n=78-128, 3 replicatas.
A exposição prolongada a estressores pode desregular a capacidade do organismo de desenvolver respostas compensatórias, acelerar o envelhecimento biológico, e reduzir seu tempo de vida. Demonstrou-se que NaAsO2 provoca estresse oxidativo através da geração de ROS em C. elegans (SAHU et al., 2013). Quando
testamos a resistência da linhagem WT a 7,5 ou 10 mM de NaAsO2, observamos que
ela se torna aproximadamente 30% mais sensível quando em knockdown de alg-1 (Figura 4).
Figura 4. Resistência ao estresse oxidativo por NaAsO2 foi avaliada em d3, ao se mensurar a sobrevivência de
WTs após 8h de incubação com 7,5 mM ou 10 mM de NaAsO2 em meio M9. Linhagens foram mantidas em
HT115(DE3) com ctrl RNAi desde o estágio embrionário, e distribuídas aos grupos controle (ctrl RNAi) ou RNAi contra alg-1 a partir de d0, na presença de FUdR. Média e erro padrão apresentados. *p < 0,05, ANOVA de 2 vias seguida de teste post-hoc de Bonferroni. n=32-44, 4 replicatas.
4.2 ALG-1 é necessária para a longevidade de C. elegans e sua superexpressão altera o miRNoma
Nosso próximo passo foi avaliar se intervenções que sabidamente aumentam o tempo de vida apresentam maior expressão de alg-1. Para tanto, escolhemos como modelo animais glp-1(e2144), os quais não desenvolvem linhagem germinativa e, por isso, são longevos (HSIN; KENYON, 1999). Observamos, durante a fase adulta, que glp-1(e2144) apresenta uma tendência de ter maior expressão gênica relativa de alg-1 já no d0, a qual se concretiza diferente em todos os demais dias avaliados (Figura 5, item B.). O gene Y45F10D.4 foi escolhido como controle endógeno porque parece manter seu nível de expressão constante ao longo do tempo (ZHANG et al., 2012).
Ainda, analisamos a expressão proteica de ALG-1, comparando as linhagens WT e glp-1(e2144), mas que também apresentam um transgene com alg-1 fusionada à GFP (ALG-1::GFP), sob o comando de seu próprio promotor endógeno. Interessantemente, observarmos um aumento na expressão de alg-1 em glp-1(e2144); ALG-1::GFP (Figura 5 item A.; DE-SOUZA, dados não publicados), o que sugere que há uma associação entre a maior longevidade desses mutantes e a quantidade de ALG-1 expressa nos tecidos somáticos.
Essas observações sugerem que há uma correlação positiva entre a expressão de alg-1 e o maior tempo de vida. É possível que um aumento em sua expressão gênica, ainda em jovens adultos, e principalmente em tecidos somáticos, possa induzir fenótipos que se associam à longevidade.
Para analisar, então, se o knockdown de alg-1 não somente diminui o tempo de vida de WTs, mas também seria suficiente para prevenir a longevidade induzida pela ausência da linhagem germinativa dos glp-1(e2144), prosseguimos realizando experimentos com o knockdown de alg-1 em glp-1(e2144).
Figura 5. A. Expressão de alg-1p::alg-1::gfp nos backgrounds WT versus glp-1(e2141) visualizada por
microscopia de fluorescência. Micrografias foram capturadas com o filtro FITC/GFP e objetiva de 4x. B. Análise da expressão de mRNA de alg-1 por RT-qPCR relativo ao controle endógeno Y45F10D.4 nos dias d0, d3, d5 e d10 da fase adulta de C. elegans WT ou glp-1(e2144), que tiveram o RNA extraído pelo método TRIzol. RT-qPCR realizado utilizando o protocolo do SYBR Green Master Mix. *p < 0,05, ANOVA de 2 vias seguida de teste
post-hoc de Bonferroni. Média e erro padrão apresentados. 3-5 replicatas. B.
A.
ALG-1::GFP glp-1(e2144); ALG-1::GFP
Primeiramente, reproduzimos a premissa de que há aumento no tempo de vida de glp-1(e2144) em relação ao WT, quando alimentada tanto em E. coli OP50-1, como na cepa HT115(DE3) contendo o ctrl RNAi. Quando mantidos a 25°C, glp-1(e2144) viveu, respectivamente, entre 20% e 33% a mais que o WT (Figura 6, itens A. e B.).
O primeiro trabalho que descreveu geneticamente que a ausência de um sistema reprodutivo funcional aumenta o tempo de vida em C. elegans, lançando mão dos mesmos animais glp-1(e2144), observou um aumento de ~50% (ARANTES-OLIVIERA et al., 2002). Entretanto, essa magnitude é variável, e diversos trabalhos mais recentes apontam uma média aproximada de ~30% de aumento no tempo de vida (RATNAPPAN et al., 2014), cuja magnitude é semelhante ao observado.
Nesse contexto, o RNAi contra alg-1 preveniu a longevidade do glp-1(e2144), que passou a ter o tempo de vida semelhante ao do WT em condições de RNAi contra alg-1 (Figura 7).
B.
Figura 6. Curvas de sobrevivência de WT ou glp-1(e2144) avaliados a 25°C sob condições ótimas, na presença
de FUdR. Linhagens foram mantidas em OP50-1 em A., e em HT115(DE3) com ctrl RNAi em B.. *p < 0,05, confirmando maior tempo de vida em glp-1(e2144), Log-rank (Mantel-Cox). n=80-146, 2-3 replicatas.
Esses dados são condizentes com a hipótese de que o aumento na expressão de alg-1 é necessário para o fenótipo de longevidade no glp-1(e2144), devido a uma maior capacidade de manter, ou até mesmo aumentar, os níveis globais de miRNAs ao longo do envelhecimento.
Surpreendentemente, porém, identificamos outros 2 alelos mutantes de glp-1 que foram incapazes de aumentar o tempo de vida em nossos experimentos: glp-1(bn18) e glp-1(e2141) (Figura 8, itens A. e B.). Esses resultados foram reprodutíveis e repetidos em diferentes momentos de nossos testes, porém são inconsistentes com a literatura, já que ambos foram previamente descritos de forma extensiva como longevos (EWALD et al., 2015; WOLFF et al., 2006).
Figura 7. Curvas de sobrevivência de WT ou glp-1(e2144) mantidos a 25°C em ctrl RNAi sob condições ótimas,
e distribuídos aos tratamentos ctrl RNAi ou RNAi contra alg-1 a partir de d0, na presença de FUdR, mostrando menores tempos de vida em ambas as linhagens quando em RNAi contra alg-1. *p < 0,05, Log-rank (Mantel-Cox). n=97-145, 2 replicatas.
Novas análises poderão auxiliar-nos a elaborar uma alternativa na explicação para esse achado, e solucionar a aparente contradição com os resultados já descritos na literatura.
Como dito anteriormente, vários estudos têm implicado diversos miRNAs como reguladores do tempo de vida em C. elegans (BOEHM; SLACK, 2005). Ainda, já foi visto aumento de alguns miRNAs em glp-1(e2144) (SHEN et al., 2012). Como alg-1 tem um papel na longevidade induzida pela ausência da linhagem germinativa (Figura 7), objetivamo-nos mapear de forma mais abrangente os padrões de expressão de miRNAs, numa tentativa de identificar miRNAs específicos que medeiam os efeitos da longevidade nesse modelo.
Para tanto, nós buscamos determinar se há intersecção de miRNAs diferencialmente expressos pelo método de sequenciamento de RNAs pequenos, usando os grupos amostrais glp-1(e2144) e ALG-1 O/E; este, um modelo de superexpressão de alg-1.
B.
Figura 8. A. e B. Curvas de sobrevivência de WT, glp-1(e2141) ou glp-1(bn18) avaliados a 25°C sob condições
ótimas, na presença de FUdR. p > 0,05, Log-rank (Mantel-Cox). n=92-139, 3-4 replicatas.
A análise de sequenciamento de nova geração de RNAs pequenos enriquecidos para miRNAs revelou que, dos 437 miRNAs atualmente anotados em C. elegans, 269 foram detectados. Desses, 94 estão diferencialmente expressos entre glp-1(e2144) e WT, um total aproximado de 22% de seu miRNoma, sendo 72 aumentados e 22 diminuídos (Figura 9, itens A. e B.). Esse resultado revela que há uma extensiva alteração nos níveis globais de miRNAs nesse modelo de longevidade.
Por sua vez, 40 miRNAs estão diferencialmente expressos, sendo 36 aumentados e 4 diminuídos, em ALG-1 O/E (Figura 9, itens A. e B.). Desses, 11 miRNAs são modulados de maneira semelhante entre os 2 grupos amostrais testados.
Os miRNAs diferencialmente expressos identificados em ambos os grupos são: miR-45-5p, miR-47-5p, miR-87-3p, miR-87-5p, miR-229-5p, miR-230-3p, miR-230-5p, miR-235-3p, miR-259-3p, miR-357-3p e cel-miR-789-5p (Figura 9, item C.).
Para tentar priorizar ainda mais a seleção de miRNAs que, ao terem sua expressão aumentada teria efeito causal no aumento do tempo de vida, hipotetizamos que miRNAs diferencialmente expressos em distintos modelos de longevidade apresentariam uma maior probabilidade de terem função pró-longeva.
Assim, buscamos a intersecção de nossos resultados com o de outro modelo longevo, o eat-2(ad1116). Ele é utilizado como um modelo de restrição dietética, a qual aumenta o tempo de vida em diversos grupos filogenéticos, inclusive em C. elegans (LAKOWSKI; HEKIMI, 1998).
