DIFERENCIAÇÃO OSTEOGÊNICA DE CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS DE RATO CULTIVADAS EM
ARCABOUÇOS DE POLI
(HIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO), POLI (CAPROLACTONA) E SUAS
BENDAS
Ana A. Rodrigues1, Nilza A. Batista1, William D. Belangero1,Sônia M. Malmonge2 Suzan A. Casarin3, José Augusto M. Agnelli3, Arnaldo R. Santos Jr. 4
1 Laboratório de Biomateriais em Ortopedia, F.C.M., Unicamp, Campinas, (SP); 2 Centro de Engenharia e
Ciências Sociais Aplicadas, UFABC, Santo André, (SP); 3 Departamento de Engenharia de Materiais,
UFSCar, São Carlos, (SP); 4 Centro de Ciências Naturais e Humanas, UFABC, Santo André, (SP), Brasil.
arnaldo.santos@ufabc.edu.br
Resumo. Este estudo teve como objetivo avaliar arcabouços de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)
e poli (caprolactona) no potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do fêmur, tíbia e úmero ratos Wistar-Kyoto. Os parâmetros avaliados foram: morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV), a atividade das células pela análise citoquímica e diferenciação osteogênica por alizarina e atividade da enzima fosfatase alcalina. Os resultados obtidos por MEV mostrou MSCs bem aderidas aos substratos, mas em menor número. Estudo citoquímico mostrou células com uma elevada actividade metabólica. Um desenvolvimento de nódulos de matriz orgânica mineralizada na cultura MSC foi identificado por alizarina e diferenciação osteogénico foi confirmada por quantificação da actividade da fosfatase alcalina. Concluiu-se que os arcabouços diferentes utilizados não interferiu na diferenciação MSC ou no seu potencial osteogênico.
Palavras-chave: células-tronco mesenquimais, diferenciação osteogênica, biomaterias, poli(hydroxibutirato-co-hidroxivalerato), poli(caprolactona), cultura celular.
1. INTRODUÇÃO
A engenharia tecidual voltada para a regeneração tecidual tem sido uma abordagem interessante e com resultados promissores. O uso de células-tronco mesenquimais (MSCs) associadas a arcabouços tem sido usadas no reparo de diversos tecidos e órgãos. A eficácia da utilização vem sendo avaliada por estudos que buscam esclarecer os mecanismos de isolamento, manutenção das células in vitro, interação das células com os arcabouços e indução da diferenciação (Chamberlain et al. 2007).
O osso é um tecido que consiste de componentes orgânicos, predominantemente colágeno, e minerais, principalmente hidroxiapatita. Reconstrução de defeitos ósseos extensos ainda é um desafio clínico. Normalmente, são necessárias várias cirurgias para restaurar a estrutura e função do local lesado. O desenvolvimento de técnicas de engenharia tecidual tem trazido o uso de novos procedimentos para a restauração do osso. Materiais poliméricos podem servir como arcabouço para o crescimento celular, permitindo a penetração de vasos sanguíneos, e até mesmo exercer atividade morfogenética em alguns casos, quando estes são enriquecidos com hidroxiapatita, fatores de crescimento, proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) (An, 2000). Apesar destes resultados, novos estudos são necessários para identificar biomateriais que sirvam como substrato para o crescimento das células ósseas uma vez que não existe ainda um composto ideal que estimule a osteogênese in vitro.
Alguns polímeros biorreabsorvíveis utilizados para esse fim são os polihidroxialcanoatos, poliésteres produzidos por microorganismos. Esses compostos vêm sendo utilizados como matéria-prima para diversos dispositivos de aplicação biomédica e engenharia tecidual (Chen & Wu, 2005). Dentre os polihidroxialcanoatos, destacam-se o poli(hidroxibutirato) (PHB), o copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato (PHBV), o poli(4-hidroxibutirato) (P4HB), o copolímero de 3-hidroxibutirato e 3-hidroxihexanoato (PHBHHx) e poli(3-hidroxioctanoate) (PHO). Esses compostos têm sido usados no desenvolvimento de fios de sutura, dispositivos para guiar o reparo tecidual, implantes cardíacos, pinos ortopédicos, stents, túbulos para regeneração nervosa e membranas para regeneração de pele (Chen & Wu, 2005). O uso de blendas de PHBV com o poly(caprolactone) (PCL) é uma proposta nova na literatura e a avaliação biológica deste composto pode ser importante e de grande relevância no contexto da engenharia tecidual aplicada ao tratamento de defeitos osteocondrais.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Preparation of poly(hydroxybutirate-co-hydroxyvalerate), poly(caprolactone) and theirs bend scaffolds
Foram utilizados polímeros composto de poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHVB) com 12% de valerato e policaprolactona (PCL) tipo CAPA 6500 com massa molar reportada de 50.000 g/mol. Estes materiais foram fornecidos pelas empresas PHB Industrial S/A (lote FE133) e Solvay, respectivamente. Foram produzidos pelo Departamento de Processos Biotecnológicos, Faculdade de Engenharia Química, UNICAMP, blendas poliméricas com os polímeros PHBV associados à PCL (PHBV/PCL) nas seguintes concentrações: PHBV/PCL 75:25 e PHBV/PCL 50:50.
Cultura de células fibroblásticas
Usamos a linhagem celular Vero, estabelecida a partir do rim do macaco verde Africano (Cercopithecus aethiops), obtidas do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil. As células foram cultivadas em meio Ham F12 (Sigma) suplementado com 10% soro fetal bovino
(FBS, Nutricell) e 1% de penicilina/ a 5%.
A linhagem Vero é recomendado como padrão para estudos de citotoxicidade e para a célula-substrato interações com biomaterial (ISO 10993-5, 1992).
Isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais de medula óssea de ratos
As células estroco mesenquimais (MSCs) foram obtidas dos fémures, tíbias e úmero de ratos Wistar-Kyoto. A medula óssea foi precipitada e homogeneizado por uma solução de PBS/EDTA, filtrada e colocada em 15 ml de Ficoll-Hypaque ® e centrifugado a
300g durante 25 minutos. A fracção de células mononucleous foi recolhida e centrifugado durante 10 minutos a 200g, o sobrenadante foi eliminado e o precipitado foi homogeneizado em 10 ml de PBS/EDTA. A suspensão obtida foi lavada em três ciclos de centrifugação a 200g durante 10 minutos. As células foram colocadas em um meio DMEM com baixa concentração de glucose suplementado com 10% de FBS e 5% de CO2.
Microscopia eletrônica da varredura (MEV)
Para análise, 2 x 105 células/ml forma inoculadas nos diferentes materiais em meio Ham F-10 (Sigma) com 10% SFB (Nutricell). Após 24h, as amostras foram fixadas em Paraformaldeído 4% / Glutaraldeído 2.5% (Sigma) em tampão fosfato 0.1M em pH 7.2 por 2h, pós fixadas com OsO4 1% (Sigma) for 15 minutes a 4C. As amostras foram
desidratadas em serie crescente de etanol, levadas a ponto critico (Balzers CDT 030), recobertas com ouro em sputter (Balzers CDT 050) e observados em microscópio eletrônico de varredura JEOL 300.
Cytochemical analysis
As células foram fixadas em formaldeido 10% e coradas com azul de toluidina (AT) em pH 4,0 (Lison, 1960; Mello 1997).
Indução da diferenciação osteogênica
O MSCs foram inoculadas em placas de 24 poços e induzida a diferenciação osteogénica, de acordo com Neuhuber et al [2008]. Rapidamente, as MSCs foram incubadas com Após 48 horas, as amostras de material foram adicionados aos poços e do meio dsuplementado com 15% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, 100 nM de dexametasona, 50-ascorbato μM 2-fosfato e glicerol-fosfato10 mM. Após este período, as células foram testadas para a actividade fosfatase alcalina (utilizando kit Sigma Fast p-nitrophenyl phosphatase Tablets N1891) ou o desenvolvimento da matriz óssea mineralizada indicada pelo vermelho de alizarina (Gregory et al. 2004)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos chamou a atenção que sobre o PHBV as células não exibiram prolongamentos citoplasmáticos (Figura 1), vesículas e/ou microvilosidades em sua superfície. Previamente, estudamos o comportamento de células cultivadas sobre blendas de PHBV/PLLA, bem como os polímeros puros. Observamos que a proporção dos polímeros influencia drasticamente o padrão morfológico da célula. Porém, em todos os substratos que estudamos anteriormente, observamos células apresentavam uma morfologia mais condizente com o status secretor da células, ou seja, vesículas e/ou microvilosidades na superfície e, algumas vezes, elementos fibrosos que são condizentes com a secreção de matriz extracelular (Santos Jr et al., 2001, 2005). Não observamos isso nesse trabalho. Portanto, a forma de produção do arcabouço deve ter influenciado na resposta da célula. Das amostras que estudamos, as que apresentaram um padrão morfológico celular compatível com o esperado foram PHBV/PCL 50:50. Alem disso, em outros substratos que estudamos anteriormente, observamos que as células apresentavam vesículas e/ou microvilosidades na superfície e, algumas vezes, elementos fibrosos que são condizentes com a secreção de matriz extracelular (Santos Jr
et al., 2001, 2009; Lombello et al., 2002). O mesmo não foi observado neste trabalho
Figure 1: Microscopia eletrônica de varredura (MEV) das MSCs em condições experimentais: A) e B) de controle sobre lamínulas de vidro; C) PCL; D) PHBV/PCL (50:50); E) PHBV / PCL (75:25) e F) PHBV. Barra de aumento = 2.000x.
Figure 2: Citoquímica das MSCs em condições experimentais: A) e B) de controle sobre vidro lamela; C) PCL; D) PHBV/PCL (50:50); E) PHBV / PCL (75:25) e F) PHBV. Barra de aumento = 200x.
Control PCL 50:50 75:25 PHBV 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
*
Ab s o rb a n c e ( 4 0 4 n m ) Samples studiedFigura 3: Quantificação da atividade da fosfatase alcalina (ALP) das MSCs após 21 dias de diferenciação osteogênica.
Control PCL 50:50 75:25 PHBV 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Ab s o rb a n c e ( 4 0 5 n m ) Samples studied
Figura 4: Quantificação da matriz mineralizada de células MSC pelo método colorimétrico de extracção de alizarina (ARS).
MSCs são capazes de formar osteoblastos, condrócitos e adipócitos in vitro e in
vivo. Além da identificação de MSCs baseadas em suas características morfológicas ou
fenotípicas, a habilidade de culturas expandidas em formar todos os três tipos celulares citados é um dos poucos critérios funcionais disponíveis para identificar MSCs e distingui-las de célula já comprometidas em uma determinada rota de diferenciação, como pré-osteoblastos, pré-adipócitos ou pré-condrócitos. A observação feita em MEV e apresentada nesse trabalho mostra uma quantidade pequena de MSCs sobre os diferentes materiais. Esse resultado já era esperado, uma vez que as MSCs são células bem mais sensíveis e tem uma cinética de adesão e divisão celular bem mais lenta que as células fibroblásticas também utilizadas nesse mesmo estudo. Observamos poucas células sobre todos os materiais estudados. Pelo menos no que diz respeito a MEV, não observamos nenhum sinal que pudesse indicar um comportamento substancialmente mais diferenciado das MSCs sobre um dos biomateriais com 24 h de cultivo.
A análise citoquímica (Figura 2) não mostrou variações nas MSCs que cresceram por 24 h sobre os biomateriais. Com o uso do AT, observamos células com basofilia marcante, com núcleos ligeiramente metacromáticos e nucléolos evidentes, indicando atividade celular. O AT é um corante básico que forma ligações eletrostáticas com os radicais ácidos presentes nos tecidos. As estruturas ácidas dos tecidos coram-se em azul arroxeado com este método, pois AT se liga em grupos PO4-, SO4-, COO-, que
em pH 4,0 estão presentes em DNA, RNA e glicosaminoglicanos (Lison, 1960; Mello, 1997). Os dados citoquímicos apontam para a identificação de RNAr citoplasmático. Os resultados citoquímicos encontrados nesse trabalho estão de acordo com resultados previamente publicados do cultivo de células Vero sobre diferentes tipos de polímeros biorreabsorvíveis, como o PLLA, PHBV e blendas destes (Santos Jr et al., 2009), em polímeros naturais como o colágeno (Haas et al., 2001; Santos Jr et al., 2003) ou hidrogéis sintéticos como Poli HEMA (Lombello et al., 2000). Também são compatíveis com os dados apresentados para MSCs em PVA reforçados com nanotúbulos (Rodrigues et al., 2012).
Com a indução do processo de diferenciação, direcionamos as MSCs a adotarem o padrão osteogênico. Essas células passaram a produzir fosfatase alcalina (ALP), uma enzima normalmente relacionado ao processo de mineralização da matriz óssea orgânica (Figura 3). Embora exista uma certa controvérsia sobre a eficácia de se usar a ALP como um marcador da diferenciação da diferenciação osteogênica, está enzima é usada por muito grupos com tal finalidade (Moreira et al., 2004). Diante disso, para confirmarmos nosso resultado, utilizamos também a coloração do ARS que se fixa em sítios de mineralização (Gregory et al., 2004). Verificamos a produção da matriz mineralizada nas amostras estudadas. Os diferentes materiais estudados, PCL, PHBV e suas blendas, não interferiram nesse padrão comportamental (Figura 4).
Cultura de MSCs provenientes da medula óssea vendo sendo investigada quanto ao seu potencial osteogênico e condrogênico. Existem relatos mostrando as condições necessárias à diferenciação óssea das células tronco, assim como potencial osteogênico das células obtidas da medula óssea frente ao cultivo extensivo e a criopreservação. Esses trabalhos demonstram que as células tronco medulares podem ser cultivadas por mais de 35 passagens sem que ocorra perda em suas propriedades osteogênicas. Células tronco adultas da medula óssea cultivadas em materiais biocerâmicos e implantados subcutaneamente em animais de experimentação demonstraram a capacidade formação de tecido ósseo quanto colhidos após 4 semanas após a implantação (Goshima et al., 1989). Em algumas situações foi obtido também tecido cartilaginoso. Assim, o uso de materiais que guiem a diferenciação das células tronco no sentido de formar um tecido
específico passa a ser uma alternativa bastante interessante do ponto de vista clínico, considerando as necessidades dos pacientes e disponibilidade de células tronco medulares presentes no indivíduo adulto.
CONCLUSÕES
Nesse estudo, observamos que foi possível induzir e manter o padrão de diferenciação óssea nas MSCs. Os materiais estudados não interferiram nesse processo. Analisados em conjuntos, as informações que obtivemos sobre as MSCs indicam que em todos os casos estudados, as células assumiram e mantiveram o padrão de diferenciação ósseo. Concluímos que o PCL, PHBV e suas blendas não interferiram no desenvolvimento de MSC, bem como no potencial de diferenciação osteogênica.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a CAPES, CNPq, INCT-BIOFABRIS e ao Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS).
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OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF RAT BONE
MESENCHYMAL STEM CELLS CULTURED ON
POLY(HYDROXYBUTYRATE-CO-HYDROXYVALERATE),
POLY(CAPROLACTONE) AND THEIRS BEND SCAFFOLDS
Ana A. Rodrigues1, Nilza A. Batista1, William D. Belangero1,Sônia M. Malmonge2 Suzan A. Casarin3, José Augusto M. Agnelli3, Arnaldo R. Santos Jr. 4
1 Laboratório de Biomateriais em Ortopedia, F.C.M., Unicamp, Campinas, (SP); 2 Centro de Engenharia e
Ciências Sociais Aplicadas, UFABC, Santo André, (SP); 3 Departamento de Engenharia de Materiais,
UFSCar, São Carlos, (SP); 4 Centro de Ciências Naturais e Humanas, UFABC, Santo André, (SP), Brasil.
arnaldo.santos@ufabc.edu.br Abstract.
This study aimed at assessing of poly(hydroxybutirate-co-hydroxyvalerate), poly(caprolactone) and theirs blend scaffolds in the osteogenic differentiation potential of mesenchymal stem cells (MSC) obtained from bone marrow of the femur, tibias and humerus of Wistar-Kyoto rats. The following parameters were assessed: cell morphology by scanning electronic microscopy (SEM), cell activity by cytochemical analysis and osteogenic differentiation by alizarin red staining and activity of alkaline phosphatase enzyme. The results obtained by SEM showed MSCs well adhered to the substrata, but in smaller number. Cytochemical study showed cells with a high metabolic activity. A development of nodules of mineralized organic matrix in the MSC culture was identified by alizarin red staining and osteogenic differentiation was confirmed by quantification of the alkaline phosphatase activity. It was concluded that the different bend composition scaffolds did not interfere in the MSC differentiation or in its osteogenic potential. Keywords: mesenchymal stem cells, osteogenic differentiation, biomaterials, poly(hydroxybutirate-co-hydroxyvalerate), poly(caprolactone), cell culture.
