AVALIAÇÃO DA FIBRA PA POR HS-SPME/GC-MS ATRAVÉS
DE PLANEJAMENTO FATORIAL PARA A DETERMINAÇÃO
DE VOLÁTEIS EM CAGAITAS
G.H. Bueno
1, S.E. Vries
2, L.S. Garcia
1, A.G. Souza
1, R. Augusti
3, J.O.F. Melo
11 - Departamento de Ciências Exatas e Biológicas – Universidade Federal de São João del Rei / CSL – Rodovia MG 424–Km 47 – CEP: 5701-970 – Sete Lagoas – MG – Brasil, Telefone: (31) 3697-2003 – email: (gubueno1@yahoo.com.br).
2 - E.E. Professor João Fernandino Júnior – Rua Goiás – 1696 – Boa Vista – CEP: 35700-085 – Sete Lagoas – MG – Brasil, Telefone: (31) 3771-7404.
3 – Departamento de Química – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Exatas – Av. Antônio Carlos – 6627 – CEP:31270-901 – Belo Horizonte – MG – Brasil, Telefone: (31) 3409-5000.
RESUMO – A cagaiteira (Eugenia dysenterica) produz fruto constituído por uma baga globosa-achatada, amarelo-pálida, de 2 a 3 cm de diâmetro, levemente ácida, pertencente ao Cerrado brasileiro. Esse trabalho tem como objetivo avaliar a eficiência da fibra poliacrilato (PA) de SPME para a extração dos compostos voláteis de cagaita e determinar as melhores condições de extração. Coletaram-se aleatoriamente frutos inteiros de uma matriz de Eugenia dysenterica no município de Sete Lagoas, situado no estado de Minas Gerais, na safra 2014. Para realizar as análises utilizou-se a microextração em fase sólida (SPME) no modo headspace e sistema GC-MS com um analisador do tipo íon-trap. Para a microextração foi utilizada a fibra polar PA (Poliacrilato). Na análise dos compostos voláteis da polpa de cagaita foram encontrados 20 compostos. As melhores condições para a extração foram baixa temperatura e tempos inferiores a 40 minutos.
ABSTRACT –The cagaiteira (Eugenia dysenterica) produces a fruit consisting of a rounded-flattened berry, pale yellow, 2 to 3 cm in diameter, slightly acidic, belonging to the Brazilian Cerrado. This study aims to evaluate the efficiency of polyacrylate fiber (PA) SPME for extraction of volatile compounds of cagaita and determine the best extraction conditions. Were collected randomly whole fruit of a Eugenia matrix dysenterica in the city of Sete Lagoas, located in the state of Minas Gerais, in the harvest 2014. To perform the analyzes was used the solid phase microextraction (SPME) and headspace GC system MS with ion-trap type analyzer. For microextraction was used polar fiber PA (polyacrylate). In the analysis of volatile compounds of cagaita pulp were found 20 compounds. The best conditions for the extraction were low temperature and times less than 40 minutes.
PALAVRAS-CHAVE: Eugenia dysenterica; headspace; SPME; Poliacrilato. KEYWORDS: Eugenia dysenterica; headspace; SPME; Polyacrylate.
1. INTRODUÇÃO
O Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, ocupando 21% do território nacional e é considerado a última fronteira agrícola do planeta (Borlaug, 2002). Além disso, apresenta rica
biodiversidade, possuindo cerca de 160 mil espécies de plantas, fungos e animais (Ratter, 1997). Sua flora riquíssima passou a ser conhecida recentemente, existindo cerca de 1000 espécies de árvores, 3000 espécies de ervas e arbustos e aproximadamente 500 trepadeiras. Nas últimas três décadas, o avanço da tecnologia e a maior disponibilidade de insumos agrícola facilitaram a devastação da vegetação nativa do Cerrado em aproximadamente 40% (Roesler et al. 2007).
Algumas espécies vegetais do Cerrado fornecem frutos de características sensoriais peculiares e elevados teores de vitaminas, sais minerais e açúcares, podendo assim constituir potenciais fontes de exploração econômica (Silva & Tassara 2003, Oliveira et al. 2012). Nesse contexto, insere-se a cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.), uma espécie frutífera subexplorada, aproveitada pela população local para uso alimentar e medicinal. Essa matriz produz um fruto amarelo, globoso e achatado, com polpa de sabor acidulado, sendo que estes pesam de 14g a 20g, possuem de 3cm a 4cm de comprimento, 3cm a 5cm de diâmetro e as sementes ocorrem de uma a três por fruto (Silva et al., 1994).
A Eugenia dysenterica produz um fruto que contém um teor de vitamina C significativo, quando comparado a outros frutos do Cerrado, além de contribuir significativamente para fornecer as necessidades diárias de vitamina C (em média 71,0%), vitamina A (em média de 7,5%) e folatos (em média de 7,9%). (Silva et al. 1994).
Dentre as características sensoriais peculiares da cagaita, encontra-se o aroma, que é um dos atributos de qualidade mais pesquisados devido às inúmeras sensações olfativas geradas pelas distintas moléculas dos frutos (Martins et al. 2010). O aroma típico da cagaita resulta da combinação de dezenas ou centenas de substâncias voláteis responsáveis do odor despedido pela fruta, tais como os ésteres, ácidos, cetonas, aldeídos, alcoóis e terpenos, que são utilizados em quantidades mínimas, para a formação dos aromas dos alimentos.
Para que possam ser feitas a separação e a identificação destes compostos, são utilizados instrumentos de cromatografia gasosa (CG) acoplado a espectrometria de massas (EM), sendo procedidas por uma operação de extração (Canuto et al. 2011). A técnica de SPME é constituída basicamente de duas etapas: extração dos voláteis pela fibra e transferência do material da fibra para o injetor de um cromatógrafo (Garruti et al. 2011).
A quantidade de analitos extraídos pela fibra pode ser afetada pelo tipo de revestimento utilizado, as condições de extração (temperatura e tempo), assim como a agitação da amostra. O tipo de revestimento da fibra é uma das principais características a escolher se deseja alcançar uma boa seletividade de analitos, pois de acordo com o revestimento da fibra, serão obtidos diferentes tipos de compostos químicos (Penalver et al. 1999).
A presença de variabilidade em Eugenia dysenterica para todos os caracteres de interesse, tanto os agronômicos, quanto para os de qualidade do fruto, proporciona ganhos nos programas de melhoramento. Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência da fibra poliacrilato (PA) de SPME para a extração dos compostos voláteis de cagaita e determinar as melhores condições de extração, para definir o perfil volátil característico da cagaita.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados frutos de cagateira obtidos no município de Sete Lagoas-MG. A coleta foi feita durante a safra de 2014, sendo os frutos selecionados quanto à maturidade (coloração amarela). Após a coleta, os frutos foram conduzidos para o Laboratório de Química da UFSJ/CSL, onde em seguida foram lavados para a eliminação das impurezas e armazenados em freezer a –18°C até o momento das análises.
Foi avaliada a fibra polar Poliacrilato (PA), 85 μm. Antes do uso da fibra, esta foi condicionada no cromatógrafo de acordo com os tempos e temperaturas recomendadas pelo fabricante. As análises foram realizadas por um cromatógrafo a gás Trace GC Ultra (Thermo Scientific, San Jose, CA) acoplado a espectrômetro de massas Polaris Q (Thermo Scientific, San Jose, CA) com analisador do tipo ion-trap, instalado no Laboratório de Espectrometria de Massas do Departamento de Química - UFMG.
Os frutos armazenados foram retirados do freezer e colocados em água corrente para seu fácil descongelamento. Posteriormente, foram separadas as sementes da polpa dos frutos de forma manual.
Para a extração dos compostos voláteis da cagaita foi utilizado o método de microextração em fase sólida no modo headspace (HS-SPME), onde se utilizou 2,0 g de polpa de cagaita, a qual foi colocada em frascos de headspace com capacidade de 20 mL, lacrados com lacre de alumínio e septo de borracha.
As condições investigadas foram: tempo de extração, temperatura de extração e agitação, com o objetivo de determinar as condições ideais para atingir o equilíbrio de partição dos analitos entre a amostra e a fibra no modo headspace, as quais originam maior recuperação dos compostos voláteis após a análise cromatográfica.
O tempo em que a amostra fica sob agitação numa temperatura determinada, sem a fibra ser exposta, é denominado “tempo de equilíbrio”. Após esse tempo, a fibra (PA) é introduzida no modo
headspace para a absorção dos analitos, e em seguida, exposta à fase gasosa, após o tempo de extração
foi inserida no injetor do cromatógrafo a 250°C, por 5 min de dessorção dos compostos voláteis capturados.
Os compostos voláteis extraídos da polpa de cagaita foram separados através de um sistema de cromatografia gasosa Thermo-Finnigan modelo Trace GC ultra-acoplado com detector de espectrometria de massas modelo Polaris Q equipado com injetor split/splitless, utilizado no modo
splitless. Foi utilizado como gás de arraste, o hélio, a um fluxo constante de 1mL min-1. A coluna
cromatográfica utilizada foi a coluna capilar TR-1MS (100% dimetilpolisiloxano; de 30 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 m de espessura do filme). As condições de analise cromatográficas foram: temperatura do injetor 250C, tempo de dessorção 5 min, temperatura da fonte de íons 200C, temperatura da interface 275C. O aquecimento da coluna foi com temperatura programada, iniciou-se a 40ºC permanecendo por 5 minutos e depois com uma taxa de aquecimento de 4,0ºC min-1 até 125ºC por 2 minutos e depois 15ºC min-1 até 245ºC, temperatura na
qual se manteve a isoterma por 5 minutos.
Os compostos voláteis foram identificados através da relação massa-carga (m/z) correspondente a cada pico gerado por o cromatograma de íons totais de cada amostra analisada, sendo comparados com os espectros de massa obtidos por ionização por impacto de elétrons (EI), o qual usa uma energia de 70 eV, com a faixa de varredura (full scan, de 50 a 650 m/z), assim comparados com os dados da biblioteca NIST (National Institute of Standards and Technology) do equipamento.
O índice RSI, que consiste em um fator numérico de comparação entre um composto desconhecido e compostos da biblioteca NIST, é usado na identificação dos compostos voláteis, sendo considerado um valor superior a 500.
O planejamento experimental empregado foi o fatorial (23)com três pontos centrais.
Utilizou-se o efeito das variáveis dependentes: tempo de extração (t), temperatura de extração (°C) e agitação (rpm) na extração dos compostos voláteis de cagaita. Para isto, foi utilizada a metodologia de superfície de resposta com a finalidade de verificar a influência de cada uma das variáveis na extração dos voláteis, assim como para determinar a condição ótima de extração. Para a realização do planejamento fatorial, utilizou-se o software STATISTICA na versão 10.0, assim como para as análises de superfície de resposta. Foi utilizado o número de compostos voláteis capturados por ensaio como resposta dos fatores avaliados.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo foram identificados 20 compostos voláteis presentes em frutos de cagaiteira (Eugenia dysenterica D. C.) através do método de microextração em fase sólida no modo
headspace (HS-SPME).
Os compostos voláteis isolados foram classificados em diferentes classes químicas: cetonas, álcoois, ésteres, fenóis, aldeídos, terpenos, ácidos carboxílicos e hidrocarbonetos. Desses compostos, aqueles que apresentavam menor polaridade foram identificados primeiro, em sequência foram observados os de maior polaridade. Isso ocorreu devido o fato da fibra poliacrilato (PA) ser polar.
Segundo Santos (2015) os compostos voláteis apresentam funções específicas nos vegetais, sendo responsáveis, principalmente, pela perpetuação da espécie, por meio do cheiro exalado, atraindo o dispersor ou polinizador específico da espécie. Não obstante, dentro da aceitação ou não aceitação pelo consumidor este, também, tem influência direta.
Dentre os compostos encontrados, os monoterpenos pertencem ao grupo mais abundante e potente de substâncias encontradas naturalmente em plantas; são nomeados de terpenóides e realizam atividades biológicas contra insetos. Os sesquiterpenos estão presentes em compostos voláteis de várias plantas, participando ativamente nos processos de interações entre planta-planta, planta-inseto e planta-patógeno, servindo de proteção contra ataques de predadores (Santos 2015).
A partir dos dados do planejamento experimental, foram gerados gráficos de Pareto para a fibra testada, os quais envolvem as variáveis independentes investigadas: tempo de extração (min), temperatura de extração (°C) e agitação (rpm), assim como a interação entre elas.
O gráfico de Pareto mostra na forma de barras horizontais a interação entre as variáveis, considerando um limite de confiança de 95%, representado pela linha vertical que secciona o gráfico. Pode-se observar que o gráfico de Pareto não foi significativo (Figura 1), pois as barras não ultrapassam a linha que representa p=0.05, pelo que as variáveis investigadas não tiveram influência para extração dos compostos voláteis.
Os valores negativos encontrados no gráfico de Pareto indicam maiores respostas em direção ao nível inferior da variável analisada, enquanto que os valores positivos indicam maiores respostas em direção ao nível máximo (Martendal et. al., 2007).
De acordo com o Diagrama de Pareto, conforme apresentado na Figura 1, pode-se observar que o tempo de extração e a temperatura de extração, influenciaram negativamente. Seu efeito negativo associa-se com o maior número de compostos voláteis extraídos, ou seja, quanto menor a temperatura e o tempo, maior será o número de compostos. A agitação não teve influência na extração dos compostos, ou seja, não foi significativo.
A interação dos fatores foi analisada através do gráfico de Superfície de Resposta, o qual é apresentado na Figura 2. Observa-se que o número de compostos voláteis aumenta à medida que a temperatura de extração e o tempo são mínimos. Constatou-se então, o tempo de extração como a principal condição para a extração dos compostos voláteis de cagaita, onde o número de compostos extraídos foi maior a 11, representado pela cor vermelha mais escura.
Figura 2 - superfície de resposta para os fatores mais significativos.
4. CONCLUSÃO
O uso das técnicas de SPME-HS e GC-MS mostrou-se eficiente para a extração dos compostos voláteis em frutos de cagaita.
A fibra PA avaliada permitiu extrair um total de 20 compostos voláteis.
Foram considerados os compostos pertencentes às classes dos terpenos, ácidos carboxílicos e ésteres, como principais constituintes do fruto de cagaita. O conhecimento do perfil de compostos voláteis de uma matriz alimentar auxilia na identificação de substâncias responsáveis pelo aroma do fruto. Isso contribuirá para a padronização na produção de derivados de cagaita, como geléias e sorvetes.
As melhores condições para a extração dos compostos voláteis através da fibra poliacrilato (PA) foram tempo de extração inferior a 40 minutos e temperatura inferior a 65ºC. Essas condições permitem agilidade na técnica de SPME-HS, uma vez que já são conhecidas as variáveis ótimas de extração.
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