Identificação de bactérias ruminais via PCR - Multiplex utilizando DNA extraído diretamente do
líquido ruminal fresco e conservado em metanol
Acta Tecnológica
http://portaldeperiodicos.ifma.edu.br/
Ana Paula Del Vesco1, Stefania Caroline Claudino da Silva1, Adriana Bagatoli2, Eliane Gasparino1, Maria Amélia Menck
Soares2, Débora Marques Voltolini1, Álida Mariana dos Reis Buzzo1, Liegie Alher Marques1, Angélica de Souza Khatlab1
1Departamento de Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringá - Paraná, Brasil.
2Departamento de Genética da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Av. Min. Fernando Costa, 23890-000, Seropédica- Rio de Janeiro, Brasil.
RESUMO
O rumem contém várias espécies de bactérias habitando um sistema anaeróbico. Um método bastante utilizado na identificação de bactérias em diferentes ambientes é a amplificação do gene que codifica o 16S rRNA. Entretanto, para que seja possível o sucesso nas identificações e quantificações desses microrganismos, a extração do DNA total do líquido ruminal é uma etapa fundamental no processo; desta forma, o objetivo desse trabalho foi verificar a eficiência na identificação de bactérias do rúmen de bovinos utilizando DNA extraído diretamente do líquido ruminal fresco e conservado em metanol, e utilizando um sistema de amplificação multiplex. Foram avaliadas seis bactérias presentes no líquido ruminal de bovinos pelos métodos da PCR convencional e multiplex. O sistema de PCR convencional mostrou-se eficiente apresentando resultado positivo nas reações de amplificação para o DNA das bactérias estudadas. A mesma eficiência também foi observada utilizando o sistema multiplex. O armazenamento de líquido ruminal de bovinos no metanol mostrou-se eficiente, pois permitiu a extração e amplificação da região do DNA bacteriano, tanto pelo sistema de PCR convencional quanto pelo sistema multiplex.
Termos para indexação:extração, bovinos, PCR.
Identification of ruminal bacteria by PCR – Multiplex using DNA extracted directly from fresh ruminal fluid and stored in methanol.
ABSTRACT
The rumen contains several species of bacteria inhabiting an anaerobic system. One method widely used in identification of bacteria in different environments is the amplification of the gene encoding the 16S rRNA. However to succeed in the identification and quantification of these bacteria, the extraction of total DNA from rumen fluid is a fundamental step in the process; thus the aim of this study was to evaluate the efficiency in the identification of bacteria from the rumen bovine using DNA extracted directly from fresh rumen fluid and stored in methanol, using a multiplex amplification system. We evaluated six bacteria in bovine rumen fluid by conventional methods ofPCR and multiplex. The conventional PCR system was efficient presenting positive amplification reactions for DNA of the bacteria studied. The same efficiency was also observed using the multiplex. The storage ofbovine rumen fluid in methanol was efficient because it allowed the extraction and amplification of the region of bacterial DNA by both conventional PCR system and the multiplex.
INTRODUÇÃO
O rúmen contém várias espécies de bactérias, habitando um sistema anaeróbio com pH em torno da neutralidade proporcionado pelos tampões salivares de fluxo constante para o órgão. Um pH próximo da neutralidade facilita a manutenção de uma população microbiana diversificada, com grande capacidade fermentativa (LETTAT et al., 2010). Além das bactérias, o rúmen é habitado por protozoários, fungos anaeróbios e ainda bacteriófagos (KAMRA, 2005), entretanto, são as bactérias os microrganismos com maior atividade enzimática, apresentando mais de 20 espécies, com uma população entre 1.000.000.000 a 10.000.000.000 de células/g de conteúdo ruminal (TEIXEIRA, 1991).
Mudança na dieta, na idade do animal, no estado geral de saúde, no uso de antibióticos entre outros fatores, pode alterar a atividade fermentativa favorecendo um determinado tipo de microrganismo. O número e atividade predominante das bactérias ruminais nativas podem ser manipuladas, oferecendo vantagens seletivas às de interesse (WANAPAT, 2000).
Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com o objetivo de isolar e identificar linhagens bacterianas do rúmen de bovinos submetidos a diferentes condições ambientais (YU et al., 2010; GREBEN & SIGAMA, 2009; JOHNSON et al., 2009). Contudo, considerando que apenas uma pequena fração do total da diversidade microbiana no ecossistema natural do rúmen pode ser recuperada por métodos de cultura (AMANN et al, 1995), por não serem cultiváveis ou pela dificuldade de cultivo, faz-se necessário o uso de métodos mais refinados e acurados na identificação de bactérias ruminais. Um método bastante utilizado na identificação de bactérias em diferentes ambientes é a amplificação via PCR do gene que codifica o 16S rRNA (TAJIMA et al, 1999, GRIFITHS et al, 2000). O RNA ribossômico (rRNA) é fundamental nos processos celulares e sua codificação é feita pelo DNA ribossômico (rDNA). Os genes ribossomais apresentam regiões altamente conservadas entre as espécies, sendo utilizados em estudos de evolução (WOESE & FOX, 1977), mas apresentam também regiões variáveis e essas variações de nucleotídeos observadas entre as espécies podem ser utilizadas na identificação de diferentes microrganismos. A distinção de bactérias através de análise genética pode solucionar problemas apresentados pelas técnicas convencionais de taxonomia (SULLIVAN, 2000). Uma adaptação da PCR é a reação de PCR multiplex, esta permite que as reações de amplificação seja
menos laboriosas e mais rápidas, diversas sequências podem ser amplificadas simultaneamente em uma mesma reação, utilizando-se de mais de um par de primers. Para que a PCR multiplex atinja a máxima eficiência é necessário otimizar as condições da reação, as concentrações dos reagentes, a temperatura de anelamento, bem como uma combinação ótima entre esses fatores (MARKOULATOS et al., 2002). Essa técnica possui alta sensibilidade além de possibilitar amplificações múltiplas em uma única reação, o que a torna altamente desejável para fins práticos (WOLFFS et al., 2009).
Estudos utilizando a sequência do gene 16S rRNA tem sido desenvolvidos com bactérias do rúmen (TAJIMA et al., 1999, TAJIMA et al., 2000, WHITFORD at al., 1998) entretanto para que seja possível o sucesso nas identificações e quantificações desses microrganismos a extração do DNA total do líquido ruminal é etapa fundamental no processo, desta forma o objetivo desse trabalho foi verificar a eficiência na identificação de bactérias do rúmen de bovinos utilizando DNA extraído diretamente do líquido ruminal fresco e conservado em metanol,utilizandoumsistemamultiplex.
MATERIAL E MÉTODOS Matéria-prima
Foi coletado líquido ruminal de bovino da raça Holandesa e retirado uma alíquota de 15 mL do material ainda fresco a qual foi centrifugada a 10.000 rpm por 2 minutos. Logo após, o sobrenadante foi vertido e adicionou-se 50 mL de metanol. Em adicionou-seguida, a amostra foi armazenada em freezer a -20ºC.
A extração de DNA foi realizada segundo o protocolo proposto por Boom et al. (1990), para as amostras frescas (recém coletadas) e conservadas em metanol. Inicialmente 50 µL de líquido ruminal foram lavados em 200 µL de TE, em seguida, centrifugados a 8.000 rpm por 2 minutos. 20 µL da suspensão de bactérias foram retirados para a extração de DNA. Para lise celular foram utilizados 1.000 µl de tampão L6 (120g de Isoticianato, 100 mL de Tris HCl (0,1M e pH 6,4), 22 mL de EDTA (0,2M e pH 8,0) e 2,6 mL de Triton X100, juntamente com 20 µL de sílica e 20 µL de amostra. A amostra foi agitada em vórtex por 10 minutos e em seguida centrifugada a 14.000 rpm, por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado. O pellet de sílica foi lavado com 500 µL de tampão L2 (120g de Isoticianato, 100 mL de Tris HCl (0,1M e pH 6,4)), misturado em vórtex e centrifugado a 14.000 rpm, durante 30 segundos, a lavagem
lavagem com L2 foi realizada 2 vezes. Posteriormente foram realizadas duas lavagens com etanol 70% gelado. Para finalizar procedeu-se uma lavagem com acetona absoluta, no qual 1.000 µL de acetona gelada foram adicionadas a amostra, seguida de agitação vigorosa e centrifugação a 14.000 rpm, por 30 segundos, o sobrenadante foi descartado. A amostra foi deixada em 37°C durante 10 minutos para secagem da sílica. Em seguida foram adicionados 80 µL de água ultra-pura, agitou-se vigorosamente e deixou-se em banho-seco a 56°C, por 15 minutos. Logo após centrifugou-se as amostras a 14.000 rpm, por 2 minutos e recuperou-se 40 µL do sobrenadante.
Para a detecção das bacterias, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Streptococcus bovis, Prevotella ruminicola, Eubacterium ruminantium e
Anaerovibrio lipolytica foram utilizados primers proposto por Tajima et al. (2001) (Tabela 1). O volume total de reação foi de 15 µL, contendo concentrações variadas de MgCl2e Primers, (Tabela 2), o programa de amplificação
foi o mesmo para todos os primers, mudando apenas a temperatura de anelamento. As condições da PCR foram de uma etapa inicial a 95°C por 3 minutos, seguido de 35 ciclos, de 95°C por 30 segundos, anelamento por 30 segundos, variando a temperatura de anelamento de cada primer e extensão de 72°C por 30 segundos, seguido de uma extensão final de 72°C por 1 minuto.
As concentrações dos reagentes nas reações de PCR variaram para cada primer (Tabela 2), sendo que os primers de Fibrobacter succinogenes e Ruminococcus flavefaciens foram utilizados em sistema multiplex, e os
demais primers utilizados emsistemaPCRconvencional. Após as reações de amplificações as amostras foram visualizadas em gel de agarose 2% corado com Brometo de Etídeo.
RESULTADO E DISCUSSÃO
Os primers utilizados para amplificar uma região menos conservada do gene 16S rRNA nas bactérias
Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Streptococcus bovis, Prevotella ruminicola, Eubacterium ruminantium e Anaerovibrio lipolytica, se mostraram específicos para os estudos de identificação como encontrado por Tajima et al. (2001). O conjunto de primers produziu produtos de PCR de tamanho esperado para as bactérias em estudo, sendo respectivamente 445 pb para F. succinogenes, 835 pb para R. flavefaciens , 869 pb paraS. bovis, 485 pb para P. ruminicola, 681 pb para E. ruminantium e 597 pb para A. lipolytica.
As bactérias selecionadas para este estudo foram utilizadas para avaliar a eficiência na identificação de DNA bacteriano extraído de amostras de líquido ruminal fresco e conservado em metanol, utilizando um sistema de PCR multiplex. O sistema de PCR convencional mostrou-se eficiente apresentando resultado positivo nas reações de amplificação do DNA. A mesma eficiência também foi observada neste trabalho utilizando o sistema multiplex para as bactérias cujos fragmentos apresentavam tamanhos diferentes, e temperaturas de anelamento semelhantes (Figura 1).
Tabela2. Concentrações de reagentes utilizados nas reações de PCR, para cada primer utilizado.
Figura 1.Gel de agarose. Canaleta 1: Padrão de 100 pb. Canaleta 2 e 3: Multiplex Primer (Primer Fibrobacter succinogenes, 445 pb e Primer Ruminococcus flavefaciens, 835 pb). Canaleta 4 e 5: Primer Streptococcus bovis, 869 pb. Canaleta 6 e 7: Primer Prevotella ruminicola, 485 pb. Canaleta 8 e 9: Primer Eubacterium ruminantium, 671 pb. Canaleta 10 e 11: Primer Anaerovibrio lipolytica, 597 pb.
A maioria dos estudos de identificação de bactérias ruminal vem de estudos de culturas, o que muitas vezes dificulta sua correta identificação, uma vez que apenas uma pequena fração da diversidade microbiana ruminal pode ser identificada por métodos tradicionais (AMANN et al, 1995). O uso te técnicas moleculares baseada na amplificação do gene que codifica o RNA ribossômico (16S rRNA), tem confirmado que a população microbiana do rúmen pode estar sendo subestimada e a utilização do 16S rRNA pode ser uma ferramenta poderosa na classificação e identificação desses microrganismos (WEIDONG et al, 2007). O uso da técnica de PCR para análise das variações do gene 16S rRNA trouxe grande progresso a esses estudos, permitindo resultados com maior confiabilidade. A PCR multiplex para análise do gene 16S rRNA utilizada juntamente com o método tradicional de cultura, pode contribuir para o diagnostico rápido e preciso na identificação de bactérias (KIN et al., 2010).
CONCLUSÃO
O armazenamento de líquido ruminal de bactérias no metanol mostrou-se eficiente na conservação das bactérias, pois permitiu a extração e amplificação da região do DNA bacteriano tanto pelo sistema de PCR convencional quanto pelo sistema PCR multiplex. A amplificação via PCR do gene 16S rRNA foi capaz de identificar as bactérias ruminais.
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