Efeitos do Tratamento com LASSBio 596 na Mecânica e Histologia Pulmonares de Camundongos Injetados com Microcistina-LR

Efeitos do Tratamento com LASSBio 596 na

Mecânica e Histologia Pulmonares de

Camundongos Injetados com Microcistina-LR

Walter Zin

Laboratório de Fisiologia da Respiração

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Introdução

Cianobactérias

ƒ Microrganismos procariontes, fotossintetizantes, com organização bioquímica e celular semelhante às bactérias.

ƒ Distribuição geográfica ampla,

ƒ Habitats com maior ocorrência são os ecossistemas de água doce, mares e águas salobras. Nesses ambientes, quando surgem condições favoráveis, pode-se verificar a intensa floração de cianobactérias.

ƒ A eutrofização favorece o crescimento e muitas vezes apresenta-se como espessa camada de células na superfície do corpo d`água (fenômeno observado em vários países)

Introdução

Lagoa de Jacarepaguá (RJ) O Globo – 13/08/01

Matilda Bay, Swan-Canning Estuary, Austrália.

ƒ Preocupação quanto ao surgimento de florações → cianobactérias são produtoras de toxinas e a sua liberação na água representa um risco para a saúde pública.

ƒ No Brasil, grande parte das cepas de cianobactérias isoladas de corpos d` água mostro-se produtora de toxinas.

Introdução

Sant` Anna, 2000; Carmichael, 1997; Chorus & Bartram, 1999

Toxinas dermatotoxinas neurotoxinas hepatotoxinas microcistinas nodularina alcalóide cilindrospermopsina

Microcistinas (MCYST)

ƒ Cianotoxinas mais freqüentemente encontradas nos ambientes aquáticos.

ƒ Apresentam mais de 70 variedades diferindo na natureza dos seus dois L -aminoácidos.

ƒ No fígado, inibem as proteínas fosfatases 1 e 2A dos hepatócitos, podendo levar a morte ou intoxicação crônica, inclusive promovendo tumores hepáticos.

ƒ Estimulam macrófagos peritoneais a produzir TNF-α e IL-1, sugerindo que macrófagos hepáticos respondam às MCYST produzindo mediadores inflamatórios.

ƒ A DL50 para camundongos injetados i.p. varia de 50 a 1200 μg/kg

e a DL50 oral apresenta valores de 50 a 170 vezes mais altos que a

DL50 i.p.

Introdução

Introdução

ƒ A exposição às toxinas pode ocorrer pelas vias oral e intravenosa,

além da inalatória. Fitzgeorge et al. (1994) observaram necrose extensiva dos epitélios olfatório e respiratório de camundongos que receberam MCYST-LR intranasal.

Desenho esquemático da

molécula de microcistina-LR. Os dois L-aminoácidos variáveis estão destacados

Introdução

ƒ Essa toxina pode alcançar o pulmão, e sua distribuição após administração oral e intratraqueal já foi descrita.

ƒ O primeiro caso confirmado de morte humana por intoxicação por MCYST ocorreu em Caruaru (1996).

ƒ No entanto, existem poucos trabalhos analisando os efeitos terapêuticos contra a MCYST no pulmão.

LASSBio 596

ƒ Híbrido da talidomida modificada e do sildenafil, que inibe as PDE4, PDE5 e o TNF-α: tem um perfil antiinflamatório e imunomodulador.

Objetivo

9

Avaliar o potencial terapêutico de LASSBio 596

sobre o processo inflamatório pulmonar agudo

causado pela exposição à

MCYST-LR, em

Materiais e Métodos

27 camundongos Swiss, machos,

normais, adultos, pesando entre

23 a 34 g

salina

salina

Materiais e Métodos

ƒ Após 8 horas os animais serão sedados (diazepam, 1 mg i.p.), anestesiados (pentobarbital sódico, 20 mg/kg i.p.), paralisados (brometo de pancurônio, 0,4 mg/kg, i.v.), e ventilados mecanicamente (FR = 100 irpm, V_T = 0,2 mL e V’ = 1 mL/s )

ƒ O tórax será aberto e será aplicada uma pressão positiva ao final da expiração de 2 cmH₂O

ƒ O fluxo aéreo e a pressão transpulmonar serão medidos e o volume calculado por integração do sinal de fluxo.

ƒ Todas as variáveis serão acondicionadas, amplificadas e os sinais de fluxo e pressão traqueal serão passados por filtros com freqüência de corte em 100 Hz, convertidos análago-digitalmente e armazenados em um computador. Todos os dados serão coletados usando o software LABDAT.

ƒ Os parâmetros da mecânica pulmonar serão avaliados pelo “Método de Oclusão ao Final da Inspiração”.

Materiais e Métodos

Método de oclusão ao final da inspiração. De cima para baixo: Fluxo, Volume e Pressão Transpulmonar (PL). Oclusões da via aérea ao final da inspiração foram realizadas. Após 5 s, a via aérea foi liberada. V, volume; PL, pressão transpulmonar.

ΔP1,L ΔP2,L 1,25 0 -1,25 0,25 0,0 P L ( cm H 2 O ) Pel,L Pmax,L Pi,L ΔP1 ΔP2 1,25 0 -1,25 0,25 0,0 PL (cmH 2 O) Pel Pmax Pi

ƒ Ao final do experimento o pulmão esquerdo será removido na CRF, rapidamente congelado em nitrogênio líquido e fixado com solução Carnoy a -70°C por 24 h

ƒ As lâminas contendo os cortes pulmonares serão coradas com HE

ƒ Em seguida a porcentagem de colapso alveolar, células polimorfo, mononucleares e tecido pulmonar será contada e determinada pela técnica de contagem de pontos

ƒ Análise de MCYST será feita por ELISA (detectar somente MCYST livre).

Materiais e Métodos

Análise Estatística

ƒ Os parâmetros serão comparados utilizando one-way ANOVA seguido do teste Tukey

ƒ Os parâmetros de celularidade e morfometria serão submetidos à transformada arcoseno, sendo, então, analisados por análise de variância one-way ANOVA, seguida de teste de Tukey.

ƒ Nível de significância → p < 0,05

ƒ A análise estatística será feita com o SigmaStat 3.1 statistical software package (Jandel Corporation, San Rafael, CA)

Resultados

Elastância estática (Est) e componente elástico da viscoelasticidade (ΔE) do pulmão nos grupos controle (C), injetado com MCYST-LR (T) e injetado com MCYST-LR e tratado com LASBio596 (L). Valores são médias+SEM. *Significativamente diferente dos grupos C e L (p<0.05). Est cmH 2O/mL 0 10 20 30 40 50 C T L ΔE

*

Resultados

Pressão resistiva (ΔP1), viscoelática/inomogênea (ΔP2) e total (ΔPtot) do pulmão nos grupos controle (C), injetado com MCYST-LR (T) e injetado com MCYST-LR e tratado com LASBio596 (L). Valores são média +SEM. *Significativamente diferente dos grupos C e L (p<0,05). cmH 2O 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 C T L ΔP2 ΔPTot ΔP1

*

*

*

Resultados

Celularidade

Porcentagem de células polimorfonucleares (PMN), mononucleares (MN) e totais em relação ao total de pontos de tecido, dos grupos controle (C), injetado com MCYST-LR (T) e injetado com MCYST-LR e tratado com LASBio596 (L). Valores são média ±SEM de 10 campos/animal (7-11 animais/ grupo). *Significativamente diferente do grupo C (p<0.05).

32.6 ± 2.2 67.4 ± 2.2 * L 61.4 ± 1.2 *,# 38.6 ± 1.2 *,# T 27.3 ± 1.3 72.7 ± 1.3 C Áreas Colapsadas (%) Áreas Normais (%)

Resultados

Morfometria

Fração de áreas normais e colapsadas no parênquima pulmonar dos grupos controle (C), injetado com MCYST-LR (T) e injetado com MCYST-LR e tratado com LASBio596 (L). Valores são média ±SEM de 10 campos/animal (7-11 animais/ grupo).

*Significativamente diferente do grupo C; # _{significativamente diferente de L (p<0.05).}

Conclusão

ƒ A administração intraperitoneal de cianobactéria contendo MCYST-LR provoca resposta inflamatória aguda, com conseqüente prejuízo da mecânica e histologia pulmonares, que foram parcialmente revertidas pelo tratamento com LASSBio 596.