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Mapeamento genético de regiões cromossômicas associadas a massa óssea em pares de irmãs adolescentes

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Academic year: 2017

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UNIVERSIDADE

CATÓLICA DE

BRASÍLIA

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

STRICTO SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA

Doutorado

MAPEAMENTO GENÉTICO DE REGIÕES CROMOSSÔMICAS ASSOCIADAS A MASSA ÓSSEA EM PARES DE IRMÃS ADOLESCENTES

Autor: Rômulo Maia Carlos Fonseca Orientadora: Prof. Dra. Nanci Maria de França Co-orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira

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RÔMULO MAIA CARLOS FONSECA

MAPEAMENTO GENÉTICO DE REGIÕES CROMOSSÔMICAS ASSOCIADAS A MASSA ÓSSEA EM PARES DE IRMÃS ADOLESCENTES

Orientadora: Profª. Drª. Nanci M. França

Co-orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira

BRASÍLIA 2010

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Agradecimentos

Essa tese é o resultado de um trabalho multidisciplinar, o qual só foi possível ser realizada graças à ajuda de diversas pessoas. Portanto, tenho muito o que agradecer a muita gente e peço que me perdoem caso eu esqueça de alguém. Então vamos começar a agradecer:

Aos meus pais, Edmilson e Cicera, meus irmãos, Rafael e Renan, cunhada e sobrinhas, Catarina, Bia e Gabi e a minha namorada Barbara, por terem me ajudado durante todo o processo, além de me darem muita força quando foi necessário. Não só pela força ou o apoio moral, mas também, pela ajuda de ir comigo para as coletas e para os laboratórios, pelo simples prazer de ajudar.

Aos meus dois Orientadores, Profª Drª Nanci e Prof Dr Rinaldo, que são muito mais do que orientadores, pois participaram ativamente de todo o processo, seja ajudando nas coletas realizadas nas escolas ou acompanhando durante um simples procedimento de preparação de DNA para ser amplificado. Além disso, quando eu sumia das vistas de um, era porque estava sobre a vigilância do outro e vice-versa. Mesmo assim ambos continuaram me dando todo o suporte para continuar desenvolvendo a pesquisa.

A CAPES e ao CNPq, pois sem o apoio financeiro recebido de ambos, essa pesquisa não poderia ser realizada no padrão de qualidade que foi.

Aos amigos do grupo de Estudo em Escolares, Tug, Leo, Cido, Cintia, Juliana, Valéria e Isabela, pela ajuda direta e indireta nas coletas.

Aos amigos do laboratório de Biotecnologia, Rodrigo, Breno, Túlio, Erika, Paula, Tailce e Marcela, por terem me ensinado desde a extração do DNA do sangue à genotipagem no seqüenciador. Em especial a Paula, pois foi quem desenvolveu os protocolos para realizar o multiplex na PCR e as análises dos genótipos no programa Genemapper.

As alunas do curso de enfermagem, Lidia, Luana, Yasmim, Helena e Kamila que participaram realizando as coletas sanguíneas das voluntárias nas escolas e a direção do curso por essas indicações valiosas.

A todos os funcionários do HUCB pela recepção tão cordial e pela ajuda na realização da densitometria, coletas sanguíneas e análises laboratoriais. São eles: Lima, Vilany, Janete, José, Patrícia, Fernanda, Rosangela, Ivonete, Amélia, Mara, Rodrigo, Vanessa, Dr Barros.

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de seqüenciamento e biotecnologia André, Willian Ida e Prof Ms Alessandra por terem me ajudado em todas as análises laboratoriais e armazenamento das amostras.

Aos Diretores, coordenadores e professores de todas as escolas visitadas, pelo acolhimento e auxilio na realização da pesquisa.

Aos Professores, amigos e funcionários do programa por terem me ajudado na construção e no amadurecimento quanto aluno, pesquisador e professor.

Aos amigos do Jota, Rubio, Bim, Ricardo, Rogério, André, Cecília, Fernanda, Angélica e Shalana, por ouvirem as minhas explicações e idéias sobre a pesquisa inúmeras vezes e mesmo assim me ajudavam a descontrair e relaxar, para que eu acabasse explicando outras tantas.

E principalmente, eu agradeço a DEUS por ter colocado todas essas pessoas maravilhosas no meu caminho, pois eu não seria nada sem a participação delas.

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Se você estudar a ciência por bastante tempo, com seriedade e mergulhar profundamente, e no final não se sentir meio louco, é porque não entendeu nada!

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Prefácio

Essa tese é baseada nos seguintes artigos, numerados em algarismos romanos: Artigo I

Fonseca RMC, Pereira RW, França NM. Valores referenciados de massa óssea para adolescentes brasileiras. Jornal de Pediatria. Submetido e em revisão.

Artigo II

Fonseca RMC, Pereira RW, França NM. Bone mineral density in Brazilian female adolescents: Associated to physical traits and life style factors. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. Submetido e em revisão.

Artigo III

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RESUMO

Objetivos: a) Fornecer valores de referência de densidade mineral óssea (DMO) e conteúdo mineral ósseo (CMO) por idade e estagio de maturação sexual em adolescentes brasileiras com idades entre 10 e 20 anos, e identificar a curva de ganho de DMO; b) Identificar as características físicas e os fatores do estilo de vida relacionados a DMO das adolescentes; e c) Replicar os estudos de ligação entre o cromossomo 1q e 11q e a DMO em pares de irmãs adolescentes.

Métodos: A amostra desse estudo foi composta por 161 pares de irmãs – sendo que 7 foram compostos por trios - (n=329) com idades entre 10 e 20 anos e 57 mães. Características físicas (peso corporal, estatura, índice de massa corporal, estágio de maturação sexual, a raça, pigmentação cutânea) e fatores do estilo de vida (consumo diário de cálcio, nível de atividade física e nível socioeconômico). A densidade e o conteúdo mineral ósseo e a densidade mineral óssea aparente (DMOA) do corpo inteiro, da coluna lombar e do colo do fêmur foram avaliados pela densitometria óssea. O DNA foi extraído de uma amostra sanguínea e os cromossomos 1q (9 microssatélites) e 11q (8 microssatélites) foram amplificados e genotipados. Os dados foram analisados por meio de análise de variância One-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey, correlação de Pearson e regressões múltiplas stepwise (p0,05). Os resíduos da regressão foram utilizados nas análises de ligação genética, como variáveis co-ajustadas.

Resultados: A massa óssea das adolescentes aumentou significativamente no período dos 10 aos 14 anos de idade. Além disso, a densidade mineral óssea da coluna lombar e do colo do fêmur das adolescentes pós-púberes teve um aumento de aproximadamente 58% e 31%, respectivamente, quando comparadas com as suas correspondentes no estagio pré-púbere. O peso corporal foi o principal preditor da massa óssea das adolescentes e teve os maiores valores de associação com a DMO do corpo inteiro, coluna lombar e colo do fêmur (r=0,75 p<0,01; r=0,65 p<0,01; r=0,64 p<0,01; respectivamente). O peso corporal, estágio puberal, idade, consumo de cálcio, nível socioeconômico e nível de atividade física explicaram de 48 a 68 % na variação da DMO. Os maiores valores de LOD encontrados em nosso estudo foram nas análises da DMOA da coluna lombar das irmãs. Os valores encontrados foram: 1.32 (p<0.006), 2.61 (p<0.0002) e 2.44 (p<0.0004) nos marcadores D1S218, D1S2640 e D1S2623, respectivamente. Nenhuma associação significativa foi encontrada entre a DMO/DMOA da coluna lombar e colo do fêmur e o cromossomo 11q. Somente a DMO do corpo inteiro teve valores de LOD score maiores do que 1,0 nos marcadores D11S4191 e D11S937 do cromossomo 11q.

Conclusão: a) A curva de aquisição da massa óssea para as adolescentes brasileiras ocorreu no período dos 10 aos 14 anos de idade, sendo que o ganho de massa óssea do colo do fêmur estabilizou-se primeiro. As garotas pós-púberes tiveram valores de DMO significativamente maiores que as púberes e o mesmo aconteceu entre as púberes e pré-púberes. b) A DMO de todos os sítios ósseos tende a aumentar conforme o aumento do peso corporal, estatura, IMC, idade e estágio puberal. Características físicas podem contribuir mais para a DMO do que os fatores do estilo de vida, embora a contribuição do estilo de vida para a DMO seja pequena, ela pode ser muito importante para otimizar o ganho de DMO. c) Nossos resultados não puderam replicar os estudos de ligação entre a DMO e os cromossomos 1q e 11q, mas forneceram evidências de ligação entre a DMO volumétrica da coluna lombar e o microssatélite D1S2640 em pares de irmãs adolescentes.

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ABSTRACT

Purpose: a) to provide normative data for bone mineral density and content from Brazilian female adolescents aged 10-20-y-o. b) to identify physical traits and life style factors related to bone mass in a large sample of Brazilian female adolescents. c) to replicate linkage studies to chromosome 1q and 11q for bone mineral density in Brazilian sister adolescents.

Methods: We evaluated 161 sister pairs (n=329) aged 10-20 years-old and 57 of their mothers in this study. Physical traits and life style factors were collected as covariates for lumbar spine (LS), femoral neck (FN) and total body (TB) BMD and bone mineral apparent density (BMAD). An one-way ANOVA with Tukey post-hoc, Pearson’s correlation and Stepwise multiple regression were used. We selected 9 microsatellite markers in chromosome 1q region (spanning nearly 33cM) and 8 in chromosome 11q region (spanning nearly 34cM) to perform linkage analysis.

Results: Girls’ bone mass had a significant increase during 10-14-y-o. Besides, post-pubertal girls had lumbar spine and femoral neck bone mineral density 58 and 31%, respectively, higher than pre-pubertal ones. Body weight had the highest associated values to total body, lumbar spine and femoral neck BMD (r=0,75 p<0.01; r=0.65 p<0.01; r=0.64 p<0.01; respectively) and was the main predictor for all sites analyzed. Body weight, pubertal stage, age, calcium intake, SES, and physical activity level explained around 48-68% for BMD variation in female adolescents. And the highest LOD score values obtained from our data were in sister pairs LS BMAD analysis. Their values were: 1.32 (p<0.006), 2.61 (p<0.0002) and 2.44 (p<0.0004) in D1S218, D1S2640 and D1S2623 markers, respectively. No significant LOD score was found with LS and FN BMD/BMAD in chromosome 11q region. Only TB BMD showed significant linkage higher than 1.0 for chromosome 11q region in the markers D11S4191 and D11S937.

Conclusion: a) the ‘tempo” of bone mass acquisition in our sample was during 10 to 14 years old. Post-pubertal girls had bone mineral density higher than pubertal girls, and it also happened between pubertal and pre-pubertal ones. b) BMD at all sites tends to increase as body weight, height, BMI, age and pubertal stage increase. Physical traits have a greater contribution to BMD than life style factors, however life styles factor can be very important to optimize BMD gain. c) Our results could not replicate previous results reported in 1q and 11q chromosome regions, but they provided suggestive linkage for LS BMAD at D1S2640 marker in adolescent sister pairs.

(10)

Sumário

RESUMO ... vii 

ABSTRACT ... viii 

1.  Introdução ... 11 

1.1.  Objetivos ... 13 

1.2.  Objetivos específicos: ... 13 

2.  Revisão da literatura ... 14 

2.1.  Adaptação óssea ... 14 

2.2.  Pico de massa óssea ... 14 

2.3.  Influência da etnia na massa óssea ... 15 

2.4.  Relação entre estilo de vida e DMO ... 16 

2.5.  Métodos de mensuração da DMO ... 17 

2.6.  Estudos de ligação genética e DMO ... 18 

3.  Metodologia ... 22 

3.1.  Amostra ... 22 

3.2.  Antropometria e maturação sexual ... 22 

3.3.  Autodenominação de cor de pele ... 22 

3.4.  Mensuração do índice de melanina ... 23 

3.5.  Questionários ... 23 

3.6.  Densidade mineral óssea, Conteúdo mineral ósseo e Densidade Mineral óssea aparente (DMO / CMO / DMOA) ... 23 

3.7.  Amostras de DNA e genotipagem dos microssatélites ... 23 

3.8.  Análise estatística ... 26 

4.  Resultados ... 28 

5.  Discussão ... 37 

6.  Conclusões do estudo ... 42 

7.  Limitações de estudo ... 43 

8.  Referências ... 44 

9.  Anexos ... 51 

9.1.  Anexo I ... 51 

9.2.  Anexo II ... 54 

9.3.  Anexo III ... 55 

9.4.  Anexo IV ... 56 

9.5.  Anexo V ... 57 

9.6.  Anexo VI ... 58 

9.7.  Anexo VII ... 59 

9.8.  Anexo VIII ... 60 

9.9.  Anexo IX ... 77 

(11)

1. Introdução

A Osteoporose é um distúrbio osteometabólico caracterizado pela diminuição da densidade mineral óssea (DMO), com deterioração da microarquitetura óssea, levando a um aumento da fragilidade esquelética e do risco de fraturas (1). Somente no ano de 2009, o SUS (Sistema Único de Saúde) gastou quase R$ 81 milhões com o tratamento de fraturas em pessoas idosas (2). Para poder diagnosticar a osteoporose, o exame de referência é a densitometria óssea da coluna lombar e do fêmur proximal (colo femoral e/ou fêmur total). Apesar de ser uma doença comumente relacionada a pessoas idosas, aproximadamente 60% do risco de desenvolver a osteoporose pode ser explicado pela aquisição de massa óssea durante a infância e a adolescência (3).

Entretanto, o período do pico de ganho de DMO varia de acordo com a população estudada. Por exemplo: O pico de aquisição de massa óssea ocorreu aos 13 de idade para garotas canadenses, aproximadamente um ano após o pico de crescimento em estatura (PHV) (4). Para adolescentes americanas, o platô de aumento da DMO foi atingido aos 14 anos para a medida do quadril inteiro e aos 15 anos para a medida da coluna lombar (3). Porém, o ganho em DMO na coluna lombar e no colo do fêmur foi significativo somente até os 14 anos de idade para garotas suíças, dois anos após a idade da menarca (5). Esses estudos possuem em comum, o fato de que foram realizados em garotas de origem européia e mesmo assim, a idade do pico de ganho de DMO foi diferente. Além da idade, os estágios de maturação sexual são responsáveis por grandes diferenças nos valores de DMO entre as adolescentes. Esse fato foi verificado em adolescentes libanesas (6), holandesas (7) e australianas (8).

No Brasil, somente nessa ultima década os estudos avaliando a DMO de adolescentes começaram a se tornar mais frequentes, porém a quantidade de publicações ainda é muito modesta se comparada com os estudos realizados no exterior. Entre esses estudos, dois se propuseram a avaliar o desenvolvimento da DMO em adolescentes brasileiros, mas o primeiro (9), que tinha uma amostra significativa de ambos os sexos, foi conduzido somente com crianças e adolescentes até os 14 anos de idade, enquanto que o segundo (10) foi realizado com uma pequena amostra de 61 adolescentes do sexo masculino com idades entre 10 e 19 anos. Portanto, ao realizar o nosso estudo, nos deparamos com a falta de valores de referência da DMO de adolescentes brasileiras e uma lacuna na literatura cientifica brasileira sobre o ‘tempo’ de ganho de DMO das adolescentes.

(12)

possuíam valores de DMO maiores do que os de ascendência européia ou asiática (3, 11, 12). Porém, isso ainda foi pouco estudado na população brasileira que possui características distintas das outras porque foi originada da recente miscigenação entre Europeus, Africanos e Ameríndios (13).

O estilo de vida também está associado à DMO e estudos realizados com adolescentes brasileiras já identificaram que a aptidão física (14) e o esporte praticado (15) podem exercer influências significativas na DMO. Além disso, melhorias nos hábitos alimentares podem resultar em ganhos de DMO para as adolescentes (16). O nível socioeconômico também pode influenciar a DMO, pois ele influencia diretamente o nível de atividade física e o consumo alimentar (17, 18). Entretanto, o conjunto desses fatores ainda não foram avaliados em adolescentes brasileiras.

Embora a maioria desses fatores mencionados possam ser modificados para otimizar o ganho de DMO, existem outros que ainda são pouco estudados na população de adolescentes, que são os fatores genéticos. Estudos realizados com pais e filhos (19) e com gêmeos (20) demonstraram que a hereditariedade é responsável por uma variação de 60 a 80% na determinação da massa óssea. Apesar de a genética ser determinante para a aquisição da DMO, o(s) gene(s) responsável pela regulação da DMO ainda não foi encontrado. Isso se deve, principalmente, as características complexas da fisiologia do ganho de massa óssea que podem envolver a interação de um ou mais genes além dos fatores ambientais (21). Além disso, evidências mostram que os genes que regulam a DMO podem atuar de forma especifica por sexo, idade e sitio ósseo (22), o que dificulta a replicação de estudos em populações com histórias genéticas distintas.

(13)

Embora existam outras regiões cromossômicas que possam regular a variação da DMO, esses estudos, conduzidos em mulheres pré-menopausa, sugerem que essas duas regiões (1q e 11q) podem conter genes relacionados a formação ou manutenção óssea. Além disso, vários genes-candidatos estão localizados nessas duas regiões como: o gene da osteocalcina (BGLAP) e do receptor de interleucina-6 (IL-6R) na região do cromossomo 1q e dois conhecidos genes associados a variação da DMO: o gene do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LPR5) e o regulador imune 1 (TCIRG1), no cromossomo 11q. Portanto, a replicação desses estudos de análise de ligação em pares de irmãs adolescentes poderiam confirmar a existência de genes associados a formação óssea nessas duas regiões cromossômicas.

1.1. Objetivos

O principal objetivo da tese foi investigar a associação entre as regiões cromossômicas 1q21-23 e 11q12-13 com a DMO do colo do fêmur, da coluna lombar e do corpo inteiro em irmãs consanguíneas com idades entre 10 e 20 anos.

1.2. Objetivos específicos:

A. Fornecer valores de referência de DMO e CMO por idade e estagio puberal em jovens brasileiras com idades entre 10 e 20 anos. E identificar a curva de ganho de DMO (artigo I).

B. Identificar as características físicas e os fatores do estilo de vida relacionados à DMO das adolescentes (artigo II).

(14)

2. Revisão da literatura

2.1. Adaptação óssea

Frost (28) desenvolveu a teoria do mechanostat, para descrever a relação entre a intensidade da tensão no osso e a adaptação desse osso ao estímulo. Quando a atividade estiver abaixo dos valores fisiológicos mínimos de tensão, ocorre a perda da massa óssea. Dentro da zona de carga fisiológica, o osso é mantido; os ganhos ocorrerão somente quando a intensidade de carga for aumentada. Em resposta a cargas extremas, um novo osso desorganizado pode ser produzido.

Snow-Harter e Marcus (29) relataram um mecanismo bem parecido. Segundo esses dois autores, a hipertrofia óssea ocorre quando o estresse é aplicado em níveis maiores do que os níveis normais, ou seja, quando a atividade osteoblástica (Osteoblasto – unidade de formação óssea) excede a atividade osteoclástica (Osteoclasto – unidade de reabsorção óssea). Os osteoclastos removem o material danificado para que os osteoblastos possam depositar tecido e mineral onde o estresse foi imposto.

Os mesmos autores relatam que todas as forças impostas ao osso produzem tensão de alguma magnitude, e essas forças criam estresses dentro do osso que podem estimular uma remodelação interna, externa ou ambas, e levar a uma possível mudança na densidade óssea.

Em outras palavras, Vieira (30) diz que o processo de remodelação óssea se desenvolve com base em dois processos antagônicos, mas acoplados: a formação e a reabsorção. O seu acoplamento permite a renovação e remodelação óssea e é mantido a longo prazo por um complexo sistema de controle que inclui hormônios, fatores físicos e fatores humorais locais.

Além desses fatores, também existe o efeito piezoelétrico, que é a transformação de energia mecânica em energia elétrica. Ele acontece durante a contração muscular. Essa energia é transmitida dos músculos para o osso, pelos tendões, provocando um aumento na atividade dos osteoblastos e aumentando a incorporação do cálcio no osso, tendo como resultado a hipertrofia das trabéculas ósseas e, conseqüentemente, o aumento da densidade óssea (31).

2.2. Pico de massa óssea

(15)

Segundo Kemper (34), o PMO ocorre pelo final da segunda década de vida, porém pelo menos 90% de toda a massa óssea são adquiridos no final da adolescência (21). Snow-Harter e Marcus (29) mencionam que observações feitas em laboratório mostram que, após os 17 anos, não foi encontrada nenhuma mudança significativa na densidade óssea de mulheres.

Segundo Theintz et al. (5), o aumento na massa óssea é diferente para ambos os sexos, havendo um maior crescimento durante as idades de 11 a 14 anos para garotas e 13 a 17 para garotos, o que corrobora com os achados de Bailey et al. (4) e de Bachrach et al. (3).

Em um estudo com crianças e adolescentes brasileiros, Fonseca et al. (9) encontraram valores médios de DMO de 0.984 g/cm2 e 1.017 g/cm2, nos adolescentes de 14 anos, correspondendo a 81% e 85% da densidade óssea esperada para brasileiros caucasianos, homens e mulheres, com idades entre 35 e 40 anos, respectivamente.

Esse crescimento ósseo não ocorre de maneira uniforme em todo o esqueleto, havendo diferenças entre o esqueleto apendicular e o axial. Segundo Bass et al. (35), antes da puberdade, o desenvolvimento do esqueleto apendicular é mais rápido do que o axial, invertendo-se a situação no início da puberdade.

2.3. Influência da etnia na massa óssea

Bachrach et al. (3), em um estudo longitudinal com crianças e adolescentes de diferentes etnias (caucasianos, negros, hispânicos e asiáticos) e idades entre 9 e 25 anos, encontraram uma superioridade significativa na DMO de negros, quando comparada a DMO de não-negros, para ambos os sexos. Entre os não-negros, poucas diferenças foram encontradas nos valores de DMO.

Em outro estudo relacionando a diferença étnica, Ettinger et al. (36) encontraram valores de DMO maiores em negros do que em brancos, todos com idades entre 25 e 36 anos. Esta superioridade foi encontrada, mesmo após o ajuste de covariantes antropométricas, estilo de vida e fatores bioquímicos. Sendo que na DMO dos vários sítios ósseos, a diferença encontrada foi de 4,5 a 16,1% maior dos homens negros em relação aos brancos e de 1,2 a 7,3% maior nas mulheres negras em relação às brancas.

(16)

2.4. Relação entre estilo de vida e DMO

O estilo de vida é o conjunto de ações habituais que refletem as atitudes, os valores e as oportunidades na vida das pessoas (37). Existem fatores positivos e negativos no estilo de vida que podem afetar a saúde a curto ou longo prazo, como: a atividade física, a nutrição, o stress, os relacionamentos e o comportamento preventivo (37).

A relação entre a atividade física e a DMO tem sido muito estudada nas últimas décadas. A demonstração da interação entre a atividade física e a massa óssea é a perda substancial do osso, devido a uma imobilização prolongada, sendo que pacientes imobilizados podem perder 40% da massa óssea original em 1 ano (38).

Estudos têm comparado a DMO de atletas com não-atletas (33), de atletas de diferentes esportes (39) e de praticantes de atividade física com não praticantes (40). Há também estudos em que ocorre intervenção com exercícios na população (41). A maioria deles demonstra que a DMO dos mais ativos é maior do que a dos menos ativos. Ao comparar a DMO de atletas de diferentes esportes, Andreoli et al. (39) relataram que todos os grupos de atletas têm maior DMO do que o grupo controle e que os atletas de judô possuem valores de DMO mais altos que os outros atletas. Isso sugere que atividades com grandes cargas mecânicas parecem resultar em uma maior massa óssea do que atividades onde o peso do corpo é pouco usado.

O consumo alimentar também pode influenciar diretamente a DMO, pois aproximadamente 99% do cálcio corporal está depositado no esqueleto e deficiências na ingestão e absorção desse mineral podem comprometer a saúde óssea (34). O consumo diário de cálcio deve ser de 1300 mg/dia durante a adolescência (42), porém estudos realizados com adolescentes (43-45) têm demonstrado que o consumo diário de cálcio está muito abaixo do que é recomendado, e isso pode refletir diretamente no ganho de massa óssea.

Embora a atividade física seja um importante preditor da DMO, como foi mencionado acima, a suplementação de cálcio parece influenciar diferentemente cada sitio ósseo. Pois, a suplementação de cálcio foi mais efetiva na DMO do corpo inteiro e da coluna lombar de adolescentes (19, 46, 47).

(17)

2.5. Métodos de mensuração da DMO

Inicialmente, a avaliação da massa óssea e as suas mudanças com a idade eram conduzidas usando-se cadáveres e análises morfológicas de radiografias (29).

Porém, na atualidade, alguns métodos não invasivos têm sido aplicados para determinação da massa óssea. Dentre eles, existem a simples e a dupla absortometria de fótons (SPA e DPA), a absortometria de raios-X de dupla energia (DXA) e a tomografia quantitativa computadorizada (QCT).

Segundo o American College (51), as duas técnicas mais comuns de avaliação da massa óssea são a DXA, que fornece uma densidade regional em g / cm2, e a QCT, que fornece uma densidade volumétrica em mg / cm3.

Segundo Janz (33), a QCT pode ser usada para fornecer a medida verdadeira da densidade volumétrica. Porém, quando comparada à DXA, o equipamento é mais caro, tem uma menor disponibilidade e expõe os indivíduos a uma maior dose de radiação. Devido a essa exposição a radiações mais altas, a QCT não é usada em pesquisas pediátricas.

Existem algumas variáveis que podem tornar a avaliação do DXA imprecisa para indivíduos em fase de crescimento, como massa corporal, estatura e maturação sexual. Porém, quando são controladas essas variáveis, diminui-se a limitação da DXA (32).

Para uma melhor compreensão, Katzman et al. (52) e Carter et al. (53) utilizaram o exemplo de dois cubos com a mesma densidade volumétrica real (D=1). O primeiro cubo tem 2 cm de cada lado e, então, tem um volume de 8 cm3 , um total de conteúdo mineral de 8g e uma área de 4 cm2 . Embora D=1, a medida da DMO produz um valor de 8  4 = 2 g/cm2 . O segundo cubo tem 3 cm de cada lado. O valor total do volume é de 27 cm3, e o conteúdo mineral é de 27g. Entretanto, sua área é de 9 cm2 , então sua DMO= 27 9 = 3 g/cm2 . Dessa forma, mesmo os dois cubos tendo a mesma densidade volumétrica, o segundo cubo é maior que o primeiro. De forma inerente, a DXA superestima a DMO de pessoas altas e subestima a DMO de pessoas mais baixas. Porém, esses autores propuseram fórmulas para diminuir o erro de avaliação da DXA para indivíduos em fase de crescimento. Mesmo assim, a DMO fornecida pela DXA tem sido a característica fenotípica mais utilizada nos estudos que buscam a compreensão dos efeitos da genética sobre a massa óssea, principalmente pela menor exposição do individuo a radiação.

(18)

Outro método para avaliar o tecido ósseo é a utilização dos marcadores bioquímicos. Segundo Vieira (30), os marcadores bioquímicos podem ser definidos como substâncias que retratam a formação ou a reabsorção do tecido ósseo. Como a formação é dependente da ação dos osteoblastos, os marcadores de formação, na realidade, avaliam produtos decorrentes destas células, o mesmo ocorrendo para os marcadores de reabsorção.

2.6. Estudos de ligação genética e DMO

O DNA se transforma em vida a partir do momento em que o gene com as informações da proteína que se deseja produzir é transcrito para o RNA mensageiro. Por sua vez, o RNA mensageiro levará essas informações para os ribossomos onde elas serão traduzidas. A cada três bases lidas, um aminoácido correspondente será trazido pelo RNA transportador, até que essa sequencia de aminoácidos formem uma proteína (55). A partir desse processo, algumas doenças ósseas monogênicas, como a osteopetrose, foram identificadas com grande sucesso. Porém, até os dias atuais, nenhum polimorfismo de nenhum gene(s) pôde ser responsável pela osteoporose, apesar de todos os esforços realizados (56).

Nas últimas duas décadas, diversas estratégias têm sido aplicadas para elucidar a influência genética na DMO, como o mapeamento por ligação genética, associações com gene-candidato, estudos de associações no genoma inteiro e mais recentemente, tem sido proposto a aplicação de seqüenciamento genômico em larga escala (57). A tabela 1 apresenta um resumo com os principais locos associados à DMO.

A probabilidade de um loco estar ligado a um fenótipo pode ser expresso pelo LOD score. O LOD score é um logaritmo de probabilidades em que os alelos compartilhados entre os pares de irmãos ou familiares podem estar ligados ou não ao fenótipo analisado (58). Os pares de irmãs podem compartilhar 0, 1 ou 2 alelos idênticos por descendência (IBD) no loco de interesse, portanto, as análises de características quantitativas partem do principio da correlação existente entre a magnitude das diferenças fenotípicas e o número de alelos compartilhados por IBD (59).

(19)

Neste sentido, Koller et al. (23) encontraram associações significativas entre a DMO e as regiões cromossômicas 1q21-23 (LOD score = 3,86) e 11q12-13 (LOD score = 1,85). Esse estudo foi realizado com 595 pares de irmãs, sendo que 464 irmãs eram brancas e 131 eram negras, com idades entre 20 e 45 anos. Essa faixa etária corresponde ao período, no qual ocorre o final da aquisição óssea máxima, pois o pico de massa óssea se dá por volta da terceira década de vida (34).

Por ter encontrado um alto e significativo LOD score entre o cromossomo 1q21-23 e a DMO, o mesmo grupo de pesquisadores replicou o estudo com uma amostra independente de 254 pares de irmãs, na mesma faixa etária, e assim, a junção do total de participantes dos dois estudos confirmou a associação dessa região cromossômica com a densidade mineral óssea (24).

Em outro grande estudo realizado com 715 famílias (3658 participantes) em oito centros de referências de pesquisas em osteoporose na Europa, Ralston et al. (22) encontraram uma associação significativa (LOD score =1,11) entre o cromossomo 1q21 e a DMO no grupo feminino com faixa etária menor que 50 anos. Essa é a mesma região cromossômica mencionada por Koller et al. (23). Segundo os autores somando-se os LOD scores de ambos estudos o valor fica acima de 5,0, o que dá suporte a hipótese que exista um importante gene nessa região que regule o pico de massa óssea em mulheres.

Além desses estudos, Karasik et al., (61) utilizaram a análise de componentes principais para identificar associações de regiões cromossômicas com a DMO em cada gênero e também encontraram o locus 1q21 associado à DMO (LOD score >2,0).

Outra região cromossômica relacionada a DMO que também apresentou discordância na literatura foi o lócus 11q12-13. Koller et al. (26) encontraram um LOD score de 2,79 entre esse locos e a DMO do colo do fêmur, porém na replicação desse estudo o valor LOD caiu para 1,85. Embora o LOD score tenha diminuído entre um estudo e outro, diferentes estudos sugerem que essa região cromossômica realmente possue um ou mais genes candidatos que expliquem a variação da DMO.

Em estudo com modelo animal, Havill et al, (62) realizaram uma pesquisa com babuínos e encontraram um LOD score > 3,0 entre a DMO do antebraço e uma região cromossômica sintênica idêntica a região 11q12-13 em humanos.

(20)

que as ligações dos dados com os marcadores genéticos utilizados confirmam a hipótese de que essa região possua um gene que influencie a DMO do colo do fêmur.

(21)

Tabela 1. Regiões cromossômicas que apresentam ligação com as variações na DMO.

Locos Sigla (gene) Referência

1q21.23 BMND2 Koller et al., 2000

5q33.35 - Koller et al., 2000

5q31-q33 SPARC Bradshaw et al., 2003

6p11.12 - Koller et al., 2000

11q12.13 - Koller et al., 2000

11q12.13 - Koller et al., 1998

6q21.3 - Ota et al., 2000

11q12.13 - Carn et al., 2002

1p36.2 e 1p36.3 BMND3 Devoto et al., 2001

1q21 TUFT1 Karasik et al., 2004

20q13 BMP7 Ralston et al., 2005

18p11 - Ralston et al., 2005

Xq27 BMND4 Shen et al., 2004

11q23 BMND5 Shen et al., 2004

17q22 - Xu et al., 2004

8q24.3 TNFRSF11B Karasik et al., 2004

3p21 CCR1 Wilson et al., 2003

1p36 ALPL Wilson et al., 2003

12q23 IGF1 Karasik et al., 2003

12q13.11 VDR

---6q25.1 ESR1 Styrkarsdottir et al., 2008

17q21.33 COL1A1

---7q22.1 COL1A2 Spotila et al., 1992

9p24 VLDLR Sakai et al., 1994

9q13-q21 OSTF1 Reddy et al., 1998

6p24-p23 BMP6 Cheng et al., 2003

11q13.4 LRP5 Hey et al., 1998

9q21.3 e Xp21.3 - van Asselt et al. 2004

11q12-13 HBM Johnson et al., 1997

CTR Froes, et al., 2002

No cromossomo 1 - Econs et al., 2004

Nos cromossomos 14 e 15 - Peacock et al., 2004

No cromossomo 1 - Cheung & Huang, 2006

(22)

3. Metodologia 3.1. Amostra

A população desse estudo foi constituída por uma amostra de 171 pares de irmãs (n=349) com idades entre 10 e 20 anos, estudantes da Rede de Ensino Pública de Brasília - Distrito Federal. Todas as irmãs poderiam participar, para aquelas que tinham mais de uma irmã, portanto entre os 171 pares de irmãs da amostra, 7 foram compostos por trios. Para facilitar a compreensão e a discussão dos resultados encontrados, cada trio foi classificado como um par. Além disso, todas as mães também foram convidadas a participar da pesquisa e 75 concordaram. Os critérios de inclusão adotados na seleção da amostra foram: não possuir doença crônico-degenerativa; não ter histórico de doenças ou fazer uso de medicamentos que afetem o desenvolvimento ósseo e não ter imobilizado algum segmento corporal durante longo período no ano anterior a pesquisa. Aplicando esses critérios, 161 pares de irmãs (n=329) e 57 mães foram mantidas nas análises.

Todas as participantes responderam perguntas sobre o consumo de cigarros e bebidas alcoólicas e também, se faziam uso de algum contraceptivo oral. Todas as participantes e os responsáveis (para aquelas com idade inferior a 18 anos) preencheram e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes de dar inicio a qualquer procedimento. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Católica de Brasília (CEP/UCB Nº 078/2006), de acordo com a Resolução 196/96.

Esse estudo recebeu apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (processo Nº: MCT/CNPq - 02/2006 – Universal - 475438/2006-0) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

3.2. Antropometria e maturação sexual

O peso corporal e estatura foram avaliados por equipamentos padronizados. O Índice de massa corporal (IMC) foi obtido pela fórmula: massa corporal (Kg) ÷ altura2 (m). O nível de maturação sexual foi determinado pela auto-avaliação de pelos pubianos conforme descrito por Tanner (65). As adolescentes foram classificadas em pré-púbere (Tanner I), púbere (Tanner II e III) e pós-púbere (Tanner IV e V).

3.3. Autodenominação de cor de pele

(23)

3.4. Mensuração do índice de melanina

Além disso, a pigmentação cutânea foi mensurada por um refratômetro de mão. Esse aparelho emite dois feixes de luz, um de cor azul e outro verde e mede a quantidade de luz refletida, apontando assim, valores numéricos para a pigmentação cutânea.

3.5. Questionários

O nível de atividade física foi mensurado pela versão curta, em português, do Questionário Internacional de Atividade Física (IPAQ), validado no Brasil por Matsudo et al (66). A estimativa do consumo diário de cálcio foi baseada no recordatório alimentar de um dia. Para a análise do consumo de cálcio, foi utilizado o software nutricional Dietpro versão 5.1i.

Foi utilizado o Critério de Classificação Econômica Brasil da Associação Brasileira de Empresas de Estatística (ABEP, 2003 – www.abep.org) para identificar as classes socioeconômicas das participantes. Esse questionário é baseado na posse de itens domésticos e cômodos da casa, e no grau de instrução do chefe da família. A quantidade de itens corresponde a uma pontuação e o somatório dos pontos classifica as pessoas em A (classe mais alta – Renda mensal ≥ R$ 4.648), B (Renda mensal ≥ R$1.669), C (Renda mensal ≥ R$927), D (Renda mensal ≥ R$424) e E (Renda mensal ≥ R$207).

3.6. Densidade mineral óssea, Conteúdo mineral ósseo e Densidade Mineral óssea aparente (DMO / CMO / DMOA)

A DMO e o CMO da coluna lombar, do colo do fêmur e do corpo inteiro foram mensurados por um aparelho de absortometria de Raios X de dupla energia (DXA), da marca Lunar, modelo DPX-IQ (Software versão 4.7e). Como o DXA pode superestimar a DMO em crianças e adolescentes com grande estatura e tamanho ósseo, e subestimar naquelas com baixa estatura e tamanho ósseo (67), nós também utilizamos a densidade mineral óssea aparente (DMOA). Os cálculos da DMOA já foram previamente descritos (52, 53) e a DMOA da coluna lombar foi derivada da fórmula CMO ÷ (área)1.5; a DMOA do colo do fêmur foi proveniente da expressão CMO ÷ (área)² e a DMOA do corpo inteiro do CMO ÷ (estatura). O coeficiente de variação da DMO e do CMO de todos os sítios ósseos encontrada em nosso laboratório situou-se entre 0,7% e 2,4% (14). A calibração do aparelho é realizada diariamente e todos os exames foram analisados pelo mesmo técnico.

(24)

De cada voluntária foi colhido um volume inicial de 2 a 5 mL de sangue em tubo vacutainer estéril. As amostras coletadas foram submetidas à extração de DNA genômico dos leucócitos do sangue periférico com pequenas modificações do método salting out (68).

A extração foi realizada nos seguintes passos: primeiramente, a amostra sanguínea de cada indivíduo foi “lavada” em água mili-Q (água ultra pura), por três vezes, para eliminação das impurezas mais densas presentes no sangue. Após a homogeneização do sangue, um volume inicial de 375µL foi depositado em um microtubo de 2,0 mL, acrescentando-se ao material um volume de 1000µL de água mili-Q. O material foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos, em seguida o sobrenadante foi descartado mantendo-se apenas o pellet condensado no fundo do microtubo, ao qual foi adicionado mais um volume de 375µL de sangue, obtendo-se um volume total utilizado de 750µL de sangue, juntamente com 1000µL de água mili-Q. O material foi centrifugado, novamente a 5000 rpm por 5 minutos, para a condensação do pellet e posterior descarte do sobrenadante. Por fim, na terceira “lavagem”, adicionou-se ao pellet um volume de 1000µL de água mili-Q, que foi centrifugado a 5000 rpm por mais 5 minutos, seguido do descarte do sobrenadante.

As membranas celulares foram rompidas por meio da adição do Tampão A, composto por sacarose a 0,32 M, Tris H-CL pH 7,6 a 10 mM, MgCl2 a 5 mM e detergente não iônico Triton X 100 (1%). Diretamente ao pellet foi adicionado um volume inicial de 750µL de Tampão A, em seguida o material foi rapidamente vortexado e centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e este procedimento repetido, sendo o material centrifugado a 5000 rpm por 15 minutos, novamente, descartando-se o sobrenadante.

As proteínas celulares e histonas ligadas ao DNA foram removidas através da adição do Tampão B, composto de 25 mM de EDTA pH 8,0 e 75 mM de NaCl a 6M, 50µL de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) a 10% e 5,5µL de proteinase K (10 mg/mL). O pellet foi suspenso em 500µL de Tampão B, os tubos foram então incubados a 55ºC durante uma hora (60 minutos), ou 37ºC overnight, para a ação da enzima. Em seguida foi adicionado ao material 140µL de NaCl saturado (6M), os tubos foram agitados vigorosamente por 15 segundos, para precipitação de impurezas protéicas ainda presentes na amostra.

(25)

a evaporação total do etanol, em cerca de 20 minutos, o pellet foi suspenso em 100-200µL de TE (Tris-EDTA). Os tubos foram incubados a 37ºC durante uma hora para a eluição e estocagem do DNA.

O DNA extraído foi quantificado em gel de agarose 1,0% corado com brometo de etídio (1 mg/mL). Padrões de concentrações conhecidas (10ng, 20ng, 50ng e 100ng) do DNA do fago lambda (λ) foram utilizados para a comparação da quantidade aproximada de DNA presente na amostra, e visualizado em luz ultravioleta (UV). Após a quantificação, as amostras de DNA foram diluídas para a concentração de 10 ng/mL. Em seguida o material diluído foi amplificado pelo método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Um total de 17 microssatélites foram genotipados nos cromossomos 1q (D1S2635, D1S484, D1S2844, D1S2878, D1S196, D1S452, D1S218, D1S2640 e D1S2623) e 11q (D11S935, D11S4102, D11S905, D11S1313, D11S4191, D11S987, D11S1314 e D11S937). Foram selecionados os marcadores que delimitavam as áreas com os maiores valores de LOD dos estudos de ligação previamente reportados (23, 24). Os microssatélites selecionados foram oriundos do ABI PRISM® Linkage Mapping Sets Version 2.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA); a ordem e a posição física deles foram obtidas do Marshfield map. Os marcadores possuíam uma distância média entre eles de 3,6 e 4,2 centimorgans (cM), respectivamente, para o cromossomo 1q e 11q. Esses marcadores possuem uma heterozigosidade média na população de 78%.

Duas reações multiplex de reação em cadeia de polimerase (PCR) foram realizadas para amplificar, respectivamente, os microssatélites dos cromossomos 1q e 11q. A amplificação do DNA via PCR foi realizada em um volume final de 12,5µL, contendo de 10 a 20 ng do DNA molde; 0,1 µM cada iniciador (direto e reverso); 0,25 µM de dNTP mix (ATGC); 2,5 µM de MgCL2; 0,24 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA); 1 unidade (U) de Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen); 1 X de Tampão Platinum Taq (Invitrogen) e H2O Milli-Q estéril qsp.

O ciclo de temperaturas ideal para o sucesso da amplificação foi baseado nas condições de termociclagem do programa de PCR “touchdown”, de acordo com o seguinte programa: 11 minutos de desnaturação a 95ºC, 20 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1’, anelamento a 62ºC por 1’ com decaimento de -0,5ºC a cada ciclo e extensão a 72ºC por 1’ segundos; em seguida, 10 ciclos de 1’ de desnaturação a 95ºC, anelamento a 58ºC por 1’ e extensão a 72ºC por 1’ e, por fim, 45’ de extensão final a 72ºC, mantendo 4ºC por 5’. A maquina utilizada foi o termociclador PE GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).

(26)

partir de comparação com uma escala de seqüenciamento controle do DNA (lader DNA) em um gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta. A detecção dos fragmentos amplificados e marcados com fluoróforos que se encontram acoplados aos oligonucleotídeos ocorreu em seqüenciador automático ABI3100.

A eletroforese foi realizada no seqüenciador automático de DNA ABI PRISM® 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) com 1,0 µL do amplicon final, 8,85 µL de formamida Hi-Di e 0,15 µL de Liz500 Size Standard (Applied Biosystems). Os parâmetros utilizados para a corrida foram: GS500(-250)LIZ, IDI_analyses_fragment_POP6_36, em 1800 segundos por injeção. A designação alélica foi feita através da análise dos resultados no programa GeneMaper ® Software Version 4.0.

3.8. Análise estatística

Primeiramente, as variáveis foram analisadas de forma descritiva por meio de médias e desvios-padrão. A normalidade foi verificada por meio de Skewness e Kurtosis. As variáveis que estavam positivamente enviesadas foram corrigidas pela raiz quadrada dela mesma (√x) antes de serem utilizadas nas análises seguintes. Os valores de referência dos parâmetros ósseos foram classificados e apresentados por idade e maturação sexual. Uma análise de variância One-way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey foi utilizada para verificar os efeitos da idade e da maturação sexual nas variáveis analisadas. A análise de variância foi realizada primeiramente com todas as adolescentes, mas como a amostra foi composta por pares de irmãs os resultados poderiam estar enviesados ou tendenciosos. Para tanto, foi realizada uma nova análise com somente uma adolescente de cada par, foi escolhida a mais nova, e verificou-se que os resultados e o comportamento da curva de ganho da DMO foram semelhantes aos obtidos nas análises com o grupo todo.

O coeficiente de correlação de Pearson (r) foi utilizado para verificar a existência de correlações entre as características físicas, o estilo de vida e a DMO da coluna lombar, colo do fêmur e do corpo inteiro. Um modelo de regressão múltipla Stepwise foi utilizado com a DMO/DMOA da coluna lombar, colo do fêmur e corpo inteiro como variáveis independentes e o peso corporal, estatura, estágio puberal, idade, cor de pele auto-declarada, pigmentação cutânea, nível de atividade física, consumo de cálcio, posição socioeconômica e uso de contraceptivo oral foram usados para identificar os fatores preditivos da DMO. Como o IMC é estabelecido pelo peso corporal e estatura, ele não foi utilizado nas análises para evitar a colinearidade. A análise dos dados foi realizada no pacote estatístico SPSS for Windows, versão 16. O nível de significância adotado foi p0,05.

(27)
(28)

4. Resultados

As características principais de todas as participantes encontram-se na tabela 2. Nenhuma das garotas fumava e somente quatro responderam que consumiam bebidas alcoólicas semanalmente. Além disso, 23 garotas reportaram o uso de contraceptivo oral, porém os parâmetros ósseos delas eram similares aos das outras garotas. A média da idade da menarca foi de 12,2 ± 1,28 (média ± desvio-padrão) e corresponde a 262 meninas avaliadas, pois a primeira menstruação ainda não havia ocorrido para 67 delas.

Tabela 2. Características gerais das participantes (média ± desvio padrão)

Garotas Mães (n=329) (n=57)

Idade (anos) 14,8 ± 2,5 41,4 ± 4,67

Peso Corporal (Kg) 50,4 ± 10,0 64,4 ± 11,8

Estatura (cm) 158,1 ± 7,9 157,8 ± 5,76

IMC (Kg/m2) 20 ± 3,28 25,9 ± 4,83

Pigmentação cutânea 37,9 ± 4,8 37,7 ± 6,03

DMO corpo inteiro (g/cm2) 1,086 ± 0,105 1,205 ± 0,085

DMO coluna lombar (g/cm2) 1,015 ± 0,176 1,244 ± 0,177

DMO colo do fêmur (g/cm2) 1,019 ± 0,150 1,083 ± 0,158

DMOA Corpo Inteiro (g/cm3) 13,24 ± 2,43 -

DMOA Coluna Lombar (g/cm3) 0,150 ± 0,020 -

DMOA Colo do fêmur (g/cm3) 0,346 ± 0,078 -

Consumo de Calcio (mg/day) 446,8 ± 306,6 408,5 ± 252,1

Estágio puberal -

I 32 (9,7%) -

II 25 (7,6%) -

III 49 (14,9%) -

IV 86 (26,1%) -

V 137 (41,6%) -

Nível socioeconômico

A (≥ R$ 4.648) 16 (4,9%) 4 (7%)

B (≥ R$ 1.669) 136 (41,3%) 23 (40,4%)

C (≥ R$ 927) 145 (44,1%) 23 (40,4%)

D (≥ R$ 424) 32 (9,7%) 7 (12,3%)

Nivel de Atividade Fisica

Baixa (< 600 MET- min/semana) 118 (35,9%) 15 (26,3%) Moderada(≥ 600 MET- min/semana) 129 (39,2%) 10 (17,5%)

Alta (≥ 3000 MET- min/semana) 82 (24,9%) 32 (56,1%)

Raça auto-declarada

Branca 108 (32,8%) 25 (43,9%)

Preta 24 (7,3%) 3 (5,3%)

Parda 185 (56,2%) 25 (43,9%)

Amarela 5 (1,5%) 2 (3,5%)

Amerindia 7 (2,1%) 2 (3,5%)

DMO: Densidade mineral óssea; DMOA: Densidade mineral óssea aparente.

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estatura tiveram um crescimento significativo entre os 10 e 13 anos de idade, enquanto que o IMC só apresentou diferença entre os 10 e 12 anos. Os valores do consumo diário de cálcio estavam enviesados e após serem corrigidos não apresentaram nenhuma diferença significativa quando comparados entre as idades.

Tabela 3 – Características antropométricas e consumo de cálcio das adolescentes por faixa etária (média±desvio padrão)

Idade (anos) N (329) Peso Corporal (Kg)

Estatura (cm) IMC (Kg/m2) Calcio diário† (mg)

10 15 34,5±10,5* 140,2±7,9* 17,2±3,3* 415,3±335,8

11 27 41,7±8,7* 150,8±7,2* 18,2±3,2* 488,8±262,4

12 30 45,9±10,3* 153,9±6,3* 19,2±3,2 623,3±363,3

13 32 48,9±8,3 158,8±7,4 19,3±2,7 502,9±317,1

14 38 52,1±9,1 159,2±6,5 20,4±3,1 395,6±287,2

15 51 53,7±9,3 160,4±5,3 20,8±3,3 417,7±240,0

16 41 54,3±9,4 161,1±5,5 21,0±3,8 407,4±268,6

17 51 53,0±6,9 161,5±5,8 20,3±2,4 435,2±387,3

18 21 52,9±6,0 160,9±5,8 20,4±2,0 344,2±236,8

19 12 53,5±9,4 161,2±7,6 20,6±3,9 499,4±293,8

20 11 54,4±8,9 159,0±4,4 21,5±3,4 392,2±229,5

* Diferença significativa em relação às outras idades (p0,05) † Valores não corrigidos do consumo diário de cálcio

(30)

Tabela 4 – Valores da densidade e do conteúdo mineral ósseo das adolescentes por faixa etária (média±desvio padrão)

Idade (anos)

N (329)

DMO Coluna (g/cm2)

CMO Coluna (g)

DMO Colo Femur (g/cm2)

CMO Colo Femur (g)

10 15 0,657±0,173* 21,47±8,83* 0,796±0,122* 1,99±0,62*

11 27 0,792±0,121* 30,62±8,39* 0,867±0,112* 2,40±0,68*

12 30 0,883±0,141* 35,47±9,44* 0,928±0,128* 2,86±0,72

13 32 0,988±0,134* 43,95±8,68* 0,983±0,135 2,80±0,80

14 38 1,047±0,099 49,05±8,22 1,074±0,129 3,28±0,98

15 51 1,073±0,112 51,38±8,77 1,074±0,131 3,67±0,90

16 41 1,107±0,129 54,08±8,78 1,079±0,122 3,36±0,89

17 51 1,088±0,113 52,57±8,89 1,064±0,123 3,45±1,08

18 21 1,107±0,143 53,90±10,48 1,085±0,132 3,37±0,79

19 12 1,135±0,161 56,31±9,53 1,028±0,135 3,36±1,06

20 11 1,135±0,085 53,77±8,43 1,042±0,117 2,93±0,69

DMO: Densidade mineral óssea; CMO: Conteúdo mineral ósseo * Diferença significativa em relação as outras idades (p0,05)

Tabela 5 – Valores da densidade e do conteúdo mineral ósseo das adolescentes por estágio maturacional (média±desvio padrão).

Estágio maturacional

N (329)

DMO Coluna (g/cm2)

CMO Coluna (g)

DMO Colo Femur (g/cm2)

CMO Colo Femur (g)

Tanner Ia 32 0,690±0,142 23,2±7,1 0,806±0,115 2,19±0,68

Tanner IIb 25 0,970±0,143 43,5±10,7 1,014±0,144 3,04±0,90

Tanner IIIb 49 0,946±0,150 41,6±11,8 0,978±0,146 2,80±0,78

Tanner IVc 86 1,074±0,127 50,7±8,9 1,063±0,137 3,35±1,08

Tanner Vc 137 1,089±0,118 52,4±8,9 1,059±0,120 3,42±0,87

(31)

Figura 1 – Variações do aumento da densidade mineral óssea da coluna lombar por idade

(32)

Figura 3 – Variações do aumento da densidade mineral óssea da coluna lombar pelo estágio de maturação sexual.

(33)

A DMO das adolescentes tende a aumentar conforme o aumento do peso corporal, estatura, IMC, idade e estágio puberal. Já os fatores do estilo de vida estavam fracamente correlacionados com a DMO das adolescentes (tabela 6).

Tabela 6. Matriz de correlação entre as características físicas, fatores de estilo de vida e parâmetros ósseos das adolescentes.

DMO Corpo

Inteiro

DMO Coluna Lombar

DMO Colo do Fêmur

Idade (anos) 0,58** 0,63** 0,43**

Peso Corporal (Kg) 0,75** 0,65** 0,64**

Estatura (cm) 0,53** 0,57** 0,47**

IMC (Kg/m2) 0,64** 0,49** 0,54**

Estágio puberal 0,59** 0,62** 0,44**

Raça auto-declarada 0,00 0,00 0,00

Pigmentação cutânea -0,17** -0,21** -0,10

Consumo de cálcio (mg/day) -0,05 -0,01 0,01

Nivel Socioeconomico 0,10 0,09 0,14*

Nivel de Atividade Fisica 0,12* 0,09 0,12*

DMO: Densidade mineral óssea (g/cm²) * p<0.05; ** p<0.01

O peso corporal, estágio puberal, idade, consumo de cálcio, nível socioeconômico e nível de atividade física explicaram de 48 a 68 % da variação da DMO das adolescentes (tabela 7). As análises de regressão demonstraram que a raça e a pigmentação cutânea não foram fatores explicativos da DMO das adolescentes. A distribuição da DMO do corpo inteiro, coluna lombar e colo do fêmur vs. o peso corporal estão apresentados na figura 5. Tabela 7. Coeficiente Beta e o R²* acumulativo, derivados dos modelos de regressão múltipla.

DMO Corpo

Inteiro

DMO Coluna Lombar

DMO Colo do Fêmur

R²*() R²*() R²*()

Peso corporal 55,6 (0,557) 41,7 (0,407) 41,1 (0,560)

Idade 8,8 (0,242) 15,6 (0,325) 3,1 (0,218)

Estágio Puberal 2,5 (0,193) 3,9 (0,250) -

Nivel Socioeconomico 1,1 (-0,100) 0,5 (-0,073) 2,3 (-0,148)

Consumo de cálcio - 0,8 (0,089) 0,9 (0,095)

Nivel de Atividade Fisica 0,8 (0,099) 0,4 (0,070) 0,6 (0,089)

ΣR²(%) 68,8 62,7 48

(34)

Figura 5 – DMO do corpo inteiro (Total Body - A), coluna lombar (Lumbar Spine - B) e colo do fêmur (Femoral neck - C) vs. Peso corporal (Body weight).

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Lumbar Spine 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

166 175 181 192 198

Chromosome 1 position (cM)

LO D s cor e D1 S 263 5 D1 S 4 8 4 D1 S 284 4 D1 S 287 8 D1 S 1 9 6 D1 S 4 5 2 D1 S 2 1 8 D1 S 264 0 D1 S 262 3

All participants BMD Sib-pairs BMD Sib-pairs BMAD Total Body 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

46 52 60 74

Chromosome 11 Position (cM)

L

O

D

sco

re

D11S935 D11S4102 D11S905 D11S1313 D11S4191 D11S987 D11S1314 D11S937

All participants BMD Sib-pairs BMD Sib-pairs BMAD

(37)

5. Discussão

Primeiramente, como caracterização da amostra, foi observado um crescimento físico significativo das adolescentes no período dos 10 aos 13 anos de idade. Bergmann et al. (71) também encontraram um crescimento significativo durante esse período em estudantes do Rio Grande do Sul. Os valores médios de estatura e peso corporal da nossa amostra são similares aos encontrados em escolares de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (72, 73) e ligeiramente superiores, até os 14 anos de idade, aos de adolescentes de Pernambuco e Sergipe (74) (artigo I). A estratificação por raças encontrada em nossa amostra está de acordo com o que é esperado para a população de Brasília (Censo IBGE, 2000; http://www.ibge.gov.br), com aproximadamente 88% da amostra classificada como branca ou parda (artigo I-III).

A DMO do colo do fêmur e da coluna lombar aumentou significativamente no período dos 10 aos 14 anos de idade, sendo que o ganho da DMO do colo do fêmur se estabilizou um ano antes quando comparado com curva da DMO da coluna lombar. Além disso, também foi observado que o aumento da DMO estabilizou-se um ano após o pico de crescimento físico e dois anos após a menarca (12,2 anos) (artigo I). Apesar de ser um estudo transversal, nossos resultados são semelhantes aos que foram reportados por estudos longitudinais. O pico do ganho de massa óssea ocorreu aos 13 de idade para garotas canadenses, aproximadamente um ano após o pico de velocidade em estatura (4). Para adolescentes americanas, o platô de aumento da DMO foi atingido aos 14 anos para a medida do quadril inteiro e aos 15 anos para a medida da coluna lombar (3). Entretanto, o ganho da DMO da coluna lombar e de colo do fêmur foi significativo somente até os 14 anos de idade para garotas suíças, dois anos após a idade da menarca (5). Com base nos períodos de maior ganho da massa mineral ósseo reportado pelos estudos, podemos sugerir que os resultados do presente estudo possam ser considerados como a curva de aquisição de massa óssea para adolescentes brasileiras. E sugerir que comportamentos saudáveis adotados e ou implementados (enquanto estilo de vida) durante esse período poderão representar a otimização do acúmulo mineral ósseo durante o surto de crescimento adolescente.

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maior aumento na DMO da coluna lombar entre as adolescentes pré e pós-púberes, sendo esse aumento superior a 60%. Esse fato também pôde ser observado quando comparamos os valores de DMO da coluna lombar e do colo do fêmur entre as adolescentes pós-púberes e os valores esperados para mulheres adultas brasileiras no pico de massa óssea. Se considerarmos os valores de 1,200 (g/cm²) e 0,965 (g/cm²) (75) como sendo os valores da DMO da coluna lombar e do colo do fêmur no pico de massa óssea, então as adolescentes pós-púberes já atingiram aproximadamente 90 e 109% do que é esperado para a DMO da coluna lombar e do colo do fêmur, respectivamente. Outros estudos também encontraram um percentual de aquisição de 90 a 100% do pico de massa óssea ao final da adolescência(4, 5).

O peso corporal foi o principal fator explicativo da massa óssea das adolescentes (artigo II). Outros estudos também encontraram associações entre o peso corporal e a DMO de garotas (9, 14, 76, 77) e adultas jovens(78-80). Além disso, essa influência pôde ser claramente demonstrada na figura 5, pois a DMO de todos os sítios analisados aumenta conforme o aumento do peso corporal (artigo II). O aumento do peso implica no aumento da carga que o esqueleto tem que suportar e conforme a teoria do “mechanostat” de Frost (28), o ganho de massa óssea ocorre quando a intensidade da carga sobre o osso é aumentada. A idade foi o segundo preditor da DMO, seguida pelo estágio puberal. Juntos, esses dois componentes puderam adicionar quase 20% no modelo de regressão da DMO da coluna lombar, mas somente a idade foi importante para a DMO do colo do fêmur (artigo II). Os efeitos da idade e do estagio puberal na DMO já foram previamente discutidos e observados (artigo I), porém nessa nova análise (artigo II), podemos identificar que ambos têm uma parcela de contribuição considerável para a DMO e que precisam ser observados nos estudos que avaliam a DMO de adolescentes.

(39)

A população brasileira tem a particularidade de ser geneticamente heterogênea(13), resultado da miscigenação entre europeus, africanos e índios, e mesmo alguns indivíduos que foram classificados como pretos, a partir de características fenotípicas como cor da pele, tipo e cor de cabelo, e formato de nariz e boca, apresentaram origem ancestral européia, enquanto que, outros classificados como brancos tiveram a ancestralidade genética africana (83). Embora a miscigenação dos brasileiros dificulte o entendimento das influências étnicas sobre a DMO, ela pode ser bastante proveitosa para estudos de ligação genética, pois estudos com populações miscigenadas e não-européias são muito importantes para entender fenótipos complexos como a variação da DMO(84).

Os fatores do estilo de vida podem contribuir com até 40% para variação da DMO, já que de 60-80% é devido a hereditariedade (19, 20). O Nível socioeconômico, consumo diário de cálcio e nível de atividade física são fatores relacionados ao estilo de vida que podem influenciar a variação da DMO das adolescentes. Esses três componentes puderam explicar até 4,4% da variação da DMO em nossa amostra (artigo II). O nível socioeconômico foi associado a DMO em crianças do Reino Unido (48), da África do Sul (49), da Índia (50) e adolescentes do Líbano (6). Em nosso estudo ele foi um fator explicativo para todos os sítios ósseos e isso pode ser uma conseqüência da relação positiva com o crescimento (48) e ser mais evidente durante a puberdade (49).

(40)

Após identificar todos os fatores relacionados a DMO das adolescentes, os resíduos da regressão foram utilizados como variáveis ajustadas nas análises de ligação genética. Os resultados encontrados sugerem mais evidências de ligação entre o cromossomo 1q e a DMO da coluna lombar (artigo III). Embora nenhuma das análises tenha atingido valores de LOD maiores do que 1, os maiores valores de associação encontrados estavam bem próximos e justamente nos microssatélites previamente reportados. Koller et al. (23) encontraram valores de LOD score de 3,86 no marcador D1S484 para a DMO da coluna lombar em pares de irmãs caucasianas e afro-americanas com idades entre 20 e 50 anos. Indícios de ligação entre esse mesmo microssatélite e a DMO da coluna lombar também foram reportados por Ralston et al (22) (LOD=1,11) em mulheres < 50 anos de idade. Porém, Econs et al. (24) replicaram a primeira análise do grupo (23) com um grupo expandido de 938 mulheres brancas pré-menopausa e encontraram um LOD score de 4,3 na posição 181cM do Marshfield Map, que é aproximadamente 1cM de distancia do microssatélite D1S196. Esse estudo foi replicado por Cheung et al. (25) em mulheres chinesas pré-menopausa (LOD=2,36). Nós não conseguimos replicar esses estudos em nossa amostra, embora os valores de LOD score encontrados estivessem bem próximos de 1,0.

Entretanto, quando a estimativa da densidade volumétrica do osso foi empregada em nossas análises, nós observamos o maior valor de LOD encontrado em nosso estudo (LOD=2.61, p<0.0002) entre a DMOA da coluna lombar e o marcador D1S2640 (artigo III). Alguns estudos encontraram associações entre DMO volumétrica do colo do fêmur e a porção distal do cromossomo 1 em ratos (87-89). Essa região é homóloga a região do 1q21-43 em humanos (90). Como a DMOA do colo do fêmur também apresentou valores de LOD > 1,0 para esses mesmos marcadores, isso sugere que essa região possa abrigar um gene(s) relacionado a formação volumétrica do osso. Um possível gene-candidato é o Gene Lim Homeobox 4 (LHX4), que está relacionado com a deficiência hormonal pituitária-4 (CPHD4) (OMIM #262700). Polimorfismos no LHX4 podem acarretar em deficiências no hormônio de crescimento (DHS), redução hormonal e atraso na maturação óssea(91). Esse gene não pode explicar a variação da DMOA sozinho, mas pode ter uma influência indireta como demonstrado em um aumento significativo de DMOA após 3 anos de tratamento com hormônio do crescimento em crianças com DHS (92). Porém isso tem que ser confirmado em estudos futuros.

(41)
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6. Conclusões do estudo

 A curva de aquisição da massa óssea para as adolescentes brasileiras ocorreu no período dos 10 aos 14 anos de idade, sendo que o ganho de massa óssea do colo do fêmur estabilizou-se primeiro.

 As garotas pós-púberes tiveram valores de DMO significativamente maiores que as púberes e o mesmo aconteceu entre as púberes e pré-púberes. A DMO da coluna lombar e do colo do fêmur das adolescentes pós-púberes teve um aumento de aproximadamente 58% e 31%, respectivamente, quando comparadas com as suas correspondentes pré-púberes.

 A DMO de todos os sítios ósseos tende a aumentar conforme o aumento do peso corporal, estatura, IMC, idade e estágio puberal. O peso corporal, estágio puberal, idade, consumo de cálcio, nível socioeconômico e nível de atividade física explicaram de 48 a 68 % da variação da DMO das adolescentes.

 Características físicas podem contribuir mais para a DMO do que os fatores do estilo de vida, e o peso corporal é o principal preditor da DMO durante a adolescência. Embora a contribuição do estilo de vida para a DMO seja pequena, ela pode ser muito importante para otimizar o ganho de DMO e conseqüentemente, reduzir o risco de osteoporose.

 O consumo diário de cálcio pelas adolescentes está muito abaixo do recomendado e medidas interventivas devem ser realizadas para aumentar o consumo de alimentos ricos em cálcio por essa população.

 Nossos resultados não puderam replicar os estudos de ligação entre a DMO e os cromossomos 1q e 11q, mas eles forneceram evidências de ligação entre a DMO volumétrica da coluna lombar e o microssatélite D1S2640 em pares de irmãs adolescentes.

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7. Limitações de estudo

Nosso estudo teve algumas limitações que precisam ser mencionadas.

1. Por ser um estudo transversal, os valores de DMO e CMO foram comparados entre pessoas diferentes e podem não representar a variabilidade no ganho de massa óssea das adolescentes brasileiras, sendo necessário um acompanhamento longitudinal para estabelecer a taxa de incremento real durante o estirão de crescimento.

2. O uso de marcadores genéticos de ancestralidade é o mais recomendado para características fenotípicas que podem ser influenciadas pela raça na DMO da população brasileira (13) e isso não foi realizado em nosso estudo.

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8. Referências

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Imagem

Tabela 1. Regiões cromossômicas que apresentam ligação com as variações na DMO.
Tabela 3 – Características antropométricas e consumo de cálcio das adolescentes por faixa  etária (média±desvio padrão)
Tabela 4 – Valores da densidade e do conteúdo mineral ósseo das adolescentes por faixa  etária (média±desvio padrão)
Figura 1 – Variações do aumento da densidade mineral óssea da coluna lombar por idade
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