FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA
PRISCILA RAMOS DE OLIVEIRA
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE AS RESPOSTAS DA
AORTA À ANGIOTENSINA II EM RATOS NORMOTENSOS E
HIPERTENSOS 2R1C
MARÍLIA
2017
Priscila Ramos de Oliveira
Efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em ”Saúde e Envelhecimento” da Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Saúde e Envelhecimento.
Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies.
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia de Souza Rossignoli.
Marília 2017
Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília
Oliveira, Priscila Ramos de.
Efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C / Priscila Ramos de Oliveira. - - Marília, 2017.
53 f.
Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies.
Coorientadora: Profa. Dra. Patrícia de S. Rossignoli. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.
1. Angiotensina II. 2. Aorta. 3. Hipertensão. 4. Endotélio. 5. Exercício. 6. Óxido nítrico. 7. Superóxidos. O48e
Priscila Ramos de Oliveira
Estudo dos efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento” da Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Saúde e Envelhecimento.
Banca examinadora:
_________________________________________ Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies
Faculdade de Medicina de Marília
_________________________________________ Prof. Dr. Carlos Alberto Lazarini
Faculdade de Medicina de Marília
_________________________________________ Profa. Dra. Maricelma da Silva Soares de Souza Universidade de Marília
A Jeová Deus, Ao meu marido Cido, A minha filhinha Rayssa.
AGRADECIMENTOS
A Jeová Deus, por me dar o discernimento necessário para cumprir esta fase tão importante da minha vida.
Ao meu marido e filha, por serem minha razão para tudo e obrigada por compreenderem quão importante foi e sempre será para mim, esta jornada que estou findando.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Agnaldo, por ter me proporcionado este desafio, pela confiança e pelo conhecimento que venho adquirindo.
A minha co-orientadora, Profa. Dra. Patrícia de Souza Rossignoli, que me proporcionou um grande crescimento, sempre com muito profissionalismo, dedicação e paciência.
Aos meus amigos:
Priscilla, que é uma luz na minha vida, estando sempre ao meu lado de todas as formas; Alisson, que sempre me ajudou prontamente e pacientemente;
Gabriela, que me inspira e me ajuda com seu conhecimento e carinho.
“O amor é paciente, o amor é bondoso. Não inveja, não se vangloria, não procura seus interesses, não guarda rancor. O amor não se alegra com a injustiça, mas se alegra com a verdade.” (1 Coríntios 13:4-6)
RESUMO
O presente trabalho objetivou estudar os efeitos do exercício agudo e do treinamento sobre os mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à angiotensina II (Ang II), em animais submetidos ao modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip (2R1C). Logo, foi proposto o estudo funcional das respostas de aortas torácicas à Ang II, nitroprussiato de sódio e solução despolarizante em ratos machos Wistar normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C), sedentários e treinados, estudados no repouso e após exercício agudo. Os desafios com Ang II foram feitos na ausência e na presença de PD 123.319 (inibidor seletivo do receptor AT2), L-NAME (inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase) indometacina
(inibidor não seletivo da cicloxigenase) e tiron (sequestrante de radicais livres). Algumas preparações foram estudadas após remoção endotelial. Paralelamente, realizaram-se análises bioquímicas para avaliação da peroxidação lipídica (FOX) e capacidade antioxidante do plasma (FRAP). Observou-se que o treinamento atenuou as respostas da aorta à Ang II em animais SHAM. Esta redução de resposta deixou de existir após a remoção endotelial e tratamento com PD 123.319, L-NAME, indometacina e tiron. A exposição ao exercício agudo atenuou a sensibilidade da aorta à Ang II em animais 2R1C, atenuação não mais observada após remoção endotelial e tratamento com PD 123.319 e L-NAME. No entanto, na presença de indometacina, a magnitude de resposta à Ang II foi reduzida para todos os grupos experimentais. Adicionalmente, na presença de tiron, houve atenuação da resposta à Ang II em animais expostos ao treinamento e ao exercício agudo. Curiosamente, o inverso ocorreu com os animais treinados que foram re-expostos ao exercício. Não houve diferença no padrão de resposta das aortas após desafio com nitroprussiato e solução despolarizante, tanto em animais SHAM quanto 2R1C, sedentários e treinados, expostos ou não ao exercício agudo. O treinamento e/ou o exercício agudo também não alteraram as concentrações plasmáticas de FOX e FRAP nos animais SHAM e 2R1C. O presente estudo demonstra que, em animais SHAM, as respostas da aorta à Ang II são moduladas, em animais expostos ao treinamento, por óxido nítrico de origem endotelial, liberado em consequência da ativação de receptores AT2. Nos animais 2R1C, este mecanismo endotelial modulador é suprimido pela elevada
concentração tecidual de ânion superóxido que leva a um estado de estresse oxidativo.
Palavras-chave: Angiotensina II. Aorta. Hipertensão. Endotélio. Exercício. Óxido Nítrico. Superóxidos.
ABSTRACT
The present work aimed to study the effects of acute exercise and training on the local mechanisms that modulate the aorta responses to angiotensin II (Ang II), in animals submitted to the two kidney, one clip (2K1C) renovascular hypertension model. Therefore, the functional study of the thoracic aorta responses to Ang II, sodium nitroprusside and depolarizing solution were proposed in normotensive (SHAM) and hypertensive (2K1C) male Wistar rats, sedentary and trained, studied at rest and after acute exercise. The challenges with Ang II were made in the absence and presence of PD 123.319 (selective AT2 receptor
inhibitor), L-NAME (nonselective inhibitor of nitric oxide synthase) indomethacin (non-selective cyclooxygenase inhibitor) and tiron (free radical scavenger). Some preparations were studied after endothelial removal. At the same time, biochemical analyzes were performed to evaluate lipid peroxidation (FOX) and plasma antioxidant capacity (FRAP). The training attenuated the responses of the aorta to Ang II in SHAM animals. This reduction in response ceased to exist after endothelial removal and treatment with PD 123.319, L-NAME, indomethacin and tiron. Exposure to acute exercise attenuated the sensitivity of the aorta to Ang II in 2K1C animals, attenuation no longer observed after endothelial removal and treatment with PD 123.319 and L-NAME. However, in the presence of indomethacin, the magnitude of response to Ang II was reduced for all experimental groups. Additionally, in the presence of tiron, there was attenuation of response to Ang II in animals exposed to training and acute exercise. Interestingly, the inverse occurred with trained animals that were re-exposed to exercise. There was no difference in the response pattern of the aortas after challenge with nitroprusside and depolarizing solution, both in SHAM and 2K1C animals, sedentary and trained, exposed or not to acute exercise. Training and/or acute exercise also did not alter the plasma concentrations of FOX and FRAP in SHAM and 2K1C animals. The present study demonstrates that in SHAM animals, the responses of the aorta to Ang II are modulated, in animals exposed to training, by nitric oxide of endothelial origin, released as a consequence of the activation of AT2 receptors. In 2K1C animals, this modulating endothelial
mechanism is suppressed by the high tissue concentration of superoxide anion leading to a state of oxidative stress.
Keywords: Angiotensin II. Aorta. Hypertension. Endothelium. Exercise. Nitric Oxide. Superoxide.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma do protocolo experimental...22
Figura 2 - Massas corporais obtidas de animais SHAM e 2R1C...26
Figura 3 - Massas úmidas cardíacas obtidas em animais SHAM e 2R1C...26
Figura 4 - Desempenho em esteira dos animais SHAM e 2R1C...27
Figura 5 - Valores de pressão arterial sistólica de ratos SHAM e 2R1C...27
Figura 6 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta intactas e deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença PD 123.319 10-6M, L-NAME 10-4M ou indometacina 10-5M, provenientes de animais SHAM...29
Figura 7 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta intactas e deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M, L-NAME 10-4M ou indometacina 10-5M, provenientes de animais 2R1C...31
Figura 8 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta intactas tratadas com tiron 10-4M, provenientes de animais SHAM e 2R1C...33
Figura 9 - Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio obtidas em preparações de aorta intactas provenientes de animais SHAM e 2R1C...34
Figura 10 - Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio obtidas em preparações de aorta deendotelizadas provenientes de animais SHAM e 2R1C...35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas e
deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M, L-NAME 10-4M ou indometacina 10-5M, provenientes de animais SHAM...30
Tabela 2 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas e
deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M, L-NAME 10-4M ou indometacina 10-5M, provenientes de animais 2R1C...32
Tabela 3 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas na
presença de Tiron 10-4M, provenientes de animais SHAM e 2R1C...33
Tabela 4 - Valores plasmáticos (µM/L) das análises bioquímicas do balanço redox (FOX e FRAP) em animais SHAM e 2R1C...34
Tabela 5 - Valores de pEC50 para nitroprussiato de sódio e cloreto de potássio, determinados
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACh Acetilcolina
AMPc Adenosina-3’,5’-monofosfato cíclico
Ang II Angiotensina II
ANOVA Análise de Variância
Basal Aferição da pressão arterial sistólica antes da cirurgia BHT
CaCl2
HidroxiTolueno Butilado Cloreto de Cálcio
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
COX Ciclo-oxigenase
CO2 Gás Carbônico
ECA Enzima Conversora de Angiotensina
EC50 Concentração molar do agonista responsável por 50% do efeito máximo
EET Ácido epóxi-eicosatrienóico
Emax Endo -
Efeito desencadeado pela concentração supra máxima do agonista Deendotelização
eNOS Óxido Nítrico Sintase endotelial
E.P.M. Erro Padrão da Média
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FAMEMA Faculdade de Medicina de Marília FeCl3.6H2O Cloreto Férrico hexahidratado
Fe2+ Íon Ferroso
Fe3+ Íon Férrico
Final Aferição da pressão arterial sistólica quatro semanas após a cirurgia FOX Complexo Fe3+ - Xilenol Laranja
FRAP Poder Antioxidante de Redução do Ferro
GMPc Monofosfato de Guanosina cíclico
HAS Hipertensão Arterial Sistêmica
HCl Ácido Clorídrico
H2SO4 Ácido Sulfúrico
KCl Cloreto de Potássio
KH2PO4 Fosfato de Potássio
LOX Lipo-oxigenase
L-NAME N-nitro-L-arginina-metil-ester
M Molar
mg/dia Miligrama por dia
mg/kg Miligrama por quilo
MgSO4.7H2O Sulfato de Magnésio heptahidratado
mL Mililitro
mmHg Milímetro de mercúrio
mM Milimolar
min. Minuto
mol/L Molar
NaCl Cloreto de Sódio
NADPH Fosfato de Dinucleotídeo de Adenina e Nicotinamida
NaHCO3 Bicarbonato de Sódio
Nm Nanômetro
nM Nanomolar
NO Óxido Nítrico
NOR Noradrenalina
NOS Óxido Nítrico Sintase
ONOO- Peroxinitrito O2 Gás Oxigênio O2- Ânion Superóxido P Probabilidade de significância PA PAS Pressão Arterial
Pressão Arterial Sistólica
PD 123.319 Bloqueador de receptor AT2 da Angiotensina II
pEC50 Negativo do logarítmo da EC50
pH Escala para medida do potencial Hidrogeniônico PGI2
PGH2
Prostaciclina Prostaglandina H2
RPM Rotações Por Minuto
SE Sedentário Exercício
SNS SOD
Sistema Nervoso Autônomo Simpático Superóxido Dismutase
SR Sedentário Repouso
SRAA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona
TE Treinado Exercício
TPTZ 2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine
TR Treinado Repouso
V/V Volume por volume
μL Microlitro
Μmol Micromol
2K1C Hypertensive by renovascular hypertension model 2 Kidney – 1 Clip 2R1C Hipertenso pelo modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 14
1.1 Controle do tônus vascular ... 14
1.2 Exercício físico e mecanismos que controlam o tônus vascular ... 17
1.3 Hipertensão arterial e controle do tônus vascular ... 18
1.3.1 Exercício e controle do tônus vascular na hipertensão ... 19
2 OBJETIVOS ... 20
2.1 Geral ... 20
2.2 Específicos ... 20
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 21
3.1 Delineamento Experimental ... 21
3.2 Protocolo de distribuição dos animais nos grupo experimentais ... 21
3.3 Protocolo de exercício/treinamento ... 22
3.4 Modelo de hipertensão 2R1C ... 22
3.5 Medida da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda (“tail cuff”) ... 23
3.6 Eutanásia dos animais e coleta de material ... 23
3.7 Estudo funcional de reatividade vascular ... 23
3.8 Quantificação da peroxidação lipídica ... 25
3.9 Avaliação da capacidade antioxidante do plasma ... 25
3.10 Análise Estatística ... 25
4 RESULTADOS ... 26
4.1 Massas corporais e cardíacas ... 26
4.2 Desempenho em esteira... 27
4.3 Pressão Arterial Sistólica ... 27
4.4 Reatividade vascular à angiotensina II ... 28
4.5 Análises bioquímicas ... 33
4.6 Reatividade vascular ao nitroprussiato de sódio e à solução despolarizante de cloreto de potássio... ... .34
5 DISCUSSÃO ... 36
6 CONCLUSÃO ... 41
REFERÊNCIAS ... 42
14
1 INTRODUÇÃO
O envelhecimento é um fator de risco para doenças cardiovasculares, que constituem a principal causa de morbimortalidade na sociedade moderna. Mundialmente as doenças cardiovasculares são responsáveis por cerca de 30 % de todas as mortes, sendo que a hipertensão arterial sistêmica (HAS) é a mais comum. Cabe ressaltar que a incidência destas doenças cardiovasculares tende a aumentar drasticamente nos próximos anos. Neste sentido, torna-se necessário um maior aprofundamento acerca dos mecanismos fisiopatológicos relacionados à HAS, bem como a identificação de possíveis estratégias, tanto medicamentosas quanto não medicamentosas, que podem ser empregadas para o tratamento desta doença.1,2
1.1 Controle do tônus vascular
A pressão arterial (PA) é produto do débito cardíaco pela resistência total periférica e, dessa forma, modificações nos mecanismos que regulam o tônus vascular estão envolvidas na gênese e/ou manutenção da HAS. O tônus vascular é controlado primeiramente pela ação do sistema nervoso autônomo simpático (SNS). Já está bem estabelecido que as terminações nervosas do SNS liberam noradrenalina (NOR) e esta, atuando sobre os adrenoceptores presentes na musculatura lisa vascular (predominantemente os α1-adrenoceptores) leva à
vasoconstrição.3 Em paralelo, a noradrenalina atua em receptores presentes no endotélio vascular, sobretudo nos α2 e β2-adrenoceptores, levando à liberação de mediadores endoteliais
que acabam por modular a vasoconstrição mediada pela estimulação dos α1-adrenoceptores
presentes na musculatura lisa vascular.4 Com efeito, isto indica que as ações do SNS sobre os vasos precisam ser moduladas pelo endotélio vascular a fim de que a homeostasia circulatória seja mantida.
O endotélio reveste todo o vaso, sendo considerado um extenso tecido endócrino. Diversos autores pontuam que o endotélio vascular exerce a função de sensor de alterações do fluxo sanguíneo e é um importante modulador do tônus vascular.5,6,7,8 A modulação endotelial sobre o tônus vascular fisiológico se dá através da produção equilibrada de substâncias tanto vasodilatadoras quanto vasoconstritoras.9,10 Dentre as substâncias vasodilatadoras liberadas pelo endotélio, destaca-se o óxido nítrico (NO), uma molécula muito pequena, extremamente lipossolúvel e instável. Sua síntese acontece através de uma família de enzimas denominadas óxido nítrico sintase (NOS), sendo que a isoforma endotelial (eNOS) é talvez a principal produtora de NO em condições fisiológicas. A eNOS está constitutivamente presente no endotélio vascular e é ativada pelo aumento da concentração intracelular de cálcio, que se dá pela ação de mediadores endógenos como a angiotensina II (Ang II) ou por estímulos físicos
15
como o cisalhamento exercido pelo fluxo sanguíneo sobre a superfície endotelial.7,11,12 A eNOS produz pequenas quantidades de NO, que difunde-se para a musculatura lisa vascular e interage com o grupo heme da guanilato ciclase solúvel.13 Como resultado, há formação do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), cuja função é diminuir o nível intracelular de íon cálcio. Assim, haverá ativação da proteína quinase e consequente abertura dos canais de íon potássio, ocasionando o relaxamento da musculatura lisa.14
No endotélio vascular ocorre também a produção de prostanóides. A produção destes prostanóides se dá através de uma via bioquímica que tem início pela ativação da enzima fosfolipase A2, responsável pela produção de ácido araquidônico a partir de fosfolípideos de
membrana. O ácido araquidônico presente no citoplasma é substrato tanto para as enzimas ciclo-oxigenases (COX) quanto para as lipo-oxigenases (LOX).15 A ação da prostaciclina (PGI2), considerada um importante mediador vasodilatador endotelial, se dá pela ativação de
receptores P. A ativação destes receptores, que são acoplados à proteína G, leva à ativação da enzima adenilato ciclase e à consequente elevação das concentrações intracelulares de adenosina-3’,5’-monofosfato cíclico (AMPc) que, por sua vez, ativa a proteína quinase A para promover a vasodilatação.9,16,17 Cabe ressaltar, por fim, que a PGI2 não é o único prostanóide
vasodilatador.15
O endotélio vascular também libera prostanóides vasoconstritores, tais como a prostaglandina H2 (PGH2).6 A ação da PGH2 se dá através da ativação do receptor TP
acoplado à proteína G, que ativa a fosfolipase C levando à síntese de diacilglicerol e inositoltrifosfato, ativando a proteína quinase, que ocasiona o aumento intracelular de íons cálcio e consequentemente vasoconstrição.17,18,19 Mesmo a PGI2, considerada um prostanóide
vasodilatador, pode apresentar ações vasoconstritoras sobre alguns leitos vasculares em determinadas situações fisiopatológicas.20 Cabe ressaltar, por fim, que outras substâncias de origem endotelial, além do NO e dos prostanóides, podem exercer papel decisivo no controle do tônus vascular.16,21
Paralelamente ao SNS, o controle do tônus vascular também envolve a ação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA). Nesse sistema, destaca-se como um dos principais efetores a Ang II, um potente peptídeo vasoconstritor. A Ang II é formada por meio da clivagem enzimática da angiotensina I, que se dá principalmente pela ação da enzima conversora de angiotensina (ECA). Vale ressaltar que as ações vasculares da Ang II também devem ser moduladas pelos mecanismos endoteliais mencionados anteriormente, a fim de que a homeostasia circulatória seja garantida.22
16
As ações cardiovasculares da Ang II se dão pela ativação tanto dos receptores AT1
quanto AT2, que geralmente resulta em efeitos opostos. Esta ação simultânea da Ang II em
AT1 e AT2 favorece a homeostasia circulatória.22-27 Por meio da ativação do receptor AT1, a
Ang II promove a vasoconstrição, indução do aumento da contratilidade e hipertrofia cardíaca, aumento da atividade simpática e da secreção de aldosterona e vasopressina, entre outros efeitos.9
A ativação dos receptores AT1 também leva à expressão/ativação da enzima fosfato de
dinucleotídeo de adenina e nicotinamida (NADPH) oxidase no endotélio vascular, considerada a principal geradora de espécies reativas de oxigênio, sendo a Ang II um potente ativador deste complexo. Ao ativar o receptor AT1, utiliza vias sinalizadoras intracelulares e
estimula a expressão de genes responsáveis pela ativação deste complexo, que culmina com a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente o ânion superóxido (O2-),
responsável por 70% dos efeitos deletérios da Ang II. O O2- pode atuar como um agente
redutor e, ao doar elétron ao NO, contribui para a formação de peroxinitrito (ONOO-). Por sua vez, esta sequência de eventos ativa fatores de transcrição nuclear, levando à expressão de genes pró-inflamatórios e consequente remodelamento vascular, causando dano tecidual por estresse oxidativo.6,28,29
O estresse oxidativo ocasionado indiretamente pela Ang II causa diminuição da biodisponibilidade de NO endotelial, além de vasoconstrição induzida pelo próprio O2- e das
consequências deletérias do ONOO-. Com isso, são reforçadas a vasoconstrição, a inflamação vascular e o remodelamento celular, desencadeados diretamente pela Ang II.30 A perda da integridade vascular expõe as células da musculatura lisa vascular à ação de substâncias vasoconstritoras que estimulam a proliferação celular, causando hiperplasia e hipertrofia da célula muscular lisa, além de disfunção endotelial, um marcador precoce das doenças cardiovasculares.6,31 Dessa forma, a Ang II participa tanto da homeostasia circulatória quanto de processos fisiopatológicos como a HAS e danos cardiovasculares relacionados a esta doença.9,16,23
Por outro lado, tem sido demonstrado que as ações da Ang II em receptores AT2 se
contrapõem aos efeitos vasoconstritores mediados pelos receptores AT1,22,32-34 levando à
atenuação da inflamação, fibrose e apoptose, além de promover ações vasodilatadoras em diversos leitos vasculares.35 Verificou-se em artérias renais e mesentéricas de ratos que estas ações vasodilatadores mediadas por AT2 envolvem liberação de bradicinina e/ou NO, com
consequente aumento de GMPc nas células musculares.22,24-27 A ativação deste receptor também pode ter ação vasodilatadora direta devido a ação do citocromo P450 sobre o ácido
17
araquidônico com consequente formação do ácido epóxi-eicosatrienóico (EET), fenômeno observado em arteríolas eferentes de coelhos.8
1.2 Exercício físico e mecanismos que controlam o tônus vascular
Durante o exercício físico, ocorre um importante aumento da demanda metabólica, sobretudo na musculatura cardíaca e na musculatura esquelética em atividade.36,37 Com isso, ocorre um aumento no fluxo sanguíneo para o coração, diafragma e musculatura esquelética envolvida na locomoção à custa de uma diminuição de fluxo para pele, estômago, intestinos, pâncreas, fígado, rins, baço e musculatura esquelética em repouso.38,39 Estas modificações circulatórias, que recebem a denominação genérica de "redistribuição circulatória", podem influenciar ou ser influenciadas pelos diversos mecanismos reguladores do tônus vascular. Para uma compreensão mais aprofundada destes processos é necessário considerar que a redistribuição circulatória acarreta um aumento do cisalhamento exercido pelo fluxo sanguíneo sobre a camada endotelial das artérias.40 Com isso, pode ocorrer um aumento da expressão de eNOS e uma maior produção endotelial de NO41-44 e/ou prostanóides.45,46 Neste sentido, tanto o exercício agudo47 quanto o treinamento48-52 parecem aumentar a liberação endotelial de NO que, por sua vez, modula o tônus em diversos leitos vasculares. De fato, já foi demonstrado que NO e prostanóides atenuam a vasoconstrição induzida pela estimulação α-adrenérgica em território vascular da musculatura esquelética humana envolvida no exercício.53 Curiosamente, estas adaptações endoteliais relacionadas ocorrem sobretudo em territórios vasculares de regiões recrutadas durante o exercício.48 Dessa forma, é cabível afirmar que a ação destes mecanismos vasomotores pode dirigir o fluxo sanguíneo para os leitos vasculares envolvidos no suprimento de demandas metabólicas teciduais que foram elevadas pelo exercício.
Adaptações promovidas pelo exercício sobre os mecanismos locais que regulam o tônus vascular já foram descritas em diversos estudos anteriores. Estas adaptações geralmente melhoram a função endotelial e favorecem a homeostasia circulatória.54-56 Cabe ressaltar, no entanto, que os efeitos do exercício físico não se dão apenas sobre as ações cardiovasculares do SNS. Evidências prévias sugerem que as ações do SRAA sobre o sistema cardiovascular também podem ser influenciadas pelo exercício.57 De fato, exposições repetidas ao exercício podem levar à modificações nos mecanismos locais de controle do tônus vascular e, como consequência, influenciar a capacidade de resposta de diversos leitos vasculares à Ang II. De fato, foi demonstrado que ratos submetidos a exposições repetidas ao exercício de natação, apresentaram redução na capacidade de resposta das aortas e das artérias mesentéricas à Ang
18
II.58 Além disso, em animais submetidos ao exercício, prostanóides vasodilatadores passam a cooperar com o NO para manter reduzidas as respostas à Ang II em veia femoral59 e em veia mesentérica60 de ratos. O treinamento também reduz os níveis plasmáticos de Ang II61 e diminui a vasoconstrição mediada por este peptídeo em aorta de ratos.62
1.3 Hipertensão arterial e controle do tônus vascular
Modificações no funcionamento endotelial, acompanhadas ou não de alterações nas células musculares lisas ou da matriz extracelular dos diferentes vasos que integram o sistema cardiovascular podem levar à HAS e/ou contribuir para a sua manutenção. Isto porque estas modificações, que geralmente envolvem aumento da produção de O2-, fatores de crescimento
e moléculas de adesão, favorecem o aumento do tônus vascular e, mas tardiamente, as alterações estruturais dos vasos sanguíneos.10,28,34,63 Para que se possa melhor compreender a HAS, estes mecanismos de controle vascular também devem ser adequadamente compreendidos. Neste sentido, é indispensável o emprego de modelos experimentais que simulam a HAS dos seres humanos. Existem diferentes modelos experimentais de hipertensão, que reproduzem com algum grau de confiabilidade as diversas etiopatogenias da HAS humana.64 Dentre estes, o modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip (2R1C) é o que mais se assemelha à hipertensão renovascular humana.65 Este modelo de hipertensão é causado pela estenose da artéria renal através da implantação de um clip de prata.66 Como resultado da diminuição do fluxo renal, ocorre liberação de renina na corrente sanguínea levando à formação de Ang II pela ativação do SRAA. Assim, na hipertensão 2R1C, ocorre uma intensa ativação do SRAA que culmina com a elevação dos níveis circulantes de Ang II.67,68
Na fase aguda da hipertensão 2R1C, entre 4-5 semanas de estenose, os níveis circulantes de Ang II são altos, predominando sua função endócrina. Porém, a partir da 6ª semana de indução, os níveis plasmáticos de Ang II são atenuados, e por este motivo suas ações autócrina e parácrina passam a ser predominantes.66 Devido a sua ação endócrina, a Ang II aumenta a PA mediante aumento da retenção de sódio e água pela aldosterona e também aumenta a atividade simpática. E com a ativação do SRAA há hipertrofia das células musculares lisas e remodelamento vascular.69 Neste modelo, a Ang II também ativa o complexo enzimático NADPH oxidase, com consequente formação de EROs e aumento do estresse oxidativo.68,70 Como já foi apresentado, esta concentração de EROs no endotélio reduz a biodisponibilidade de NO e atenua a vasodilatação dependente do endotélio.71,72 A presença de EROs também pode regular a expressão/atividade das fosfolipases A2 e,
19
consequentemente, a produção de prostanóides.73 Esta disfunção endotelial desencadeada pela hipertensão 2R1C foi observada tanto nas artérias de condutância como aorta72 e artéria caudal,74 quanto em artérias de resistência, como a artéria coronária.75
1.3.1 Exercício e controle do tônus vascular na hipertensão
A literatura é abundante em estudos que mostram adaptações cardiovasculares promovidas pelo exercício em animais normotensos. Todavia, existem poucos estudos que analisam os efeitos vasculares do exercício na hipertensão 2R1C. Estes poucos estudos, no entanto, demonstram que o exercício agudo promove benefícios cardiovasculares nos animais 2R1C.25,76 Tem sido descrito que o treinamento aumenta o vasorrelaxamento dos anéis de aorta torácica, além de atenuar a rigidez arterial decorrente da hipertensão renovascular em ratos 2R1C, devido à melhora na capacidade de relaxamento vascular em consequência de uma maior atividade dos canais de potássio.77 O treinamento também reverte à disfunção endotelial causada pela hipertensão 2R1C e, por conta disso, atenua a resposta vasoconstritora à fenilefrina, em aorta de ratos 2R1C.70
Com base nesta revisão é possível afirmar que o exercício agudo e o treinamento promovem adaptações benéficas ao sistema cardiovascular dos animais 2R1C. Existem evidências de que a função endotelial e o balanço redox podem ser melhorados pelo exercício agudo nos animais 2R1C.76 Contudo, esta mesma revisão de literatura também sugere que o controle do tônus vascular envolve diversos mecanismos locais que podem modular de forma distinta as ações do SNS e do SRAA. Assim, se por um lado existem evidências de que o treinamento promove modificações vasculares que levam a uma atenuação das ações vasoconstritoras da fenilefrina, por outro, pouco se sabe a respeito de seus efeitos sobre as ações vasculares da Ang II. Neste sentido, o presente estudo preenche uma importante lacuna de conhecimento na medida em que aprofunda a compreensão dos efeitos do exercício sobre os mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C.
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2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudar as respostas da aorta torácica à Ang II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C na fase aguda, bem como os efeitos do exercício agudo e do treinamento sobre estas respostas.
2.2 Específicos
2.2.1 Investigar a participação dos mecanismos moduladores endoteliais relacionados ao NO e aos prostanóides, bem como o envolvimento dos receptores AT2, em eventuais
modificações de respostas à Ang II induzidas pelo exercício agudo e/ou treinamento em aorta de animais normotensos e hipertensos 2R1C.
2.2.2 Verificar se alterações no balanço redox podem estar envolvidas em eventuais modificações de respostas à Ang II induzidas pelo exercício agudo e/ou treinamento em aorta de animais normotensos e hipertensos 2R1C.
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3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Delineamento Experimental
Foram utilizados 123 ratos machos Wistar, com 8 semanas de idade, provenientes do biotério central da Faculdade de Medicina de Marília (Famema). Durante todo o período de experimento, os animais permaneceram no biotério de apoio, ligado ao laboratório de Farmacologia. Esses animais foram mantidos em gaiolas coletivas (4 animais/caixa), submetidos à dieta (APÊNDICE A) e água ad libitum em ambiente com temperatura controlada (23-25°C) e ciclo claro-escuro de 12 h. Para evitar discrepância no peso, o crescimento dos animais foi monitorado de forma que, tanto os sedentários quanto os submetidos ao exercício agudo ou treinamento, pesassem entre 400 e 450 g no dia do estudo funcional das respostas vasomotoras. Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) com o número de protocolo 300/14.
3.2 Protocolo de distribuição dos animais nos grupos experimentais
A distribuição dos animais nos grupos experimentais foi realizada levando em consideração a capacidade de exercício inata de cada animal, utilizando a estratégia proposta por Melo, Martinho e Michelini.78 Brevemente, ratos de 8 semanas de idade foram treinados diariamente (sessões de 10 minutos) para andar em esteira (Movement Technology LX 170) com velocidade de 0,3 a 0,5 Km/h, sem inclinação. Ao final deste período, no 10° dia, estes animais foram submetidos a um teste de esforço para a capacidade individual de corrida na esteira. Neste teste os animais foram colocados em esteira com velocidade de 0,3 Km/h. Em seguida, a cada 3 minutos, a velocidade da esteira foi aumentada em 0,3 Km/h até que o animal apresentasse sinais de exaustão (parar de correr mesmo quando estimulados por leve pressão na cauda). Para cada animal, foi registrado o tempo que este conseguiu correr até a exaustão na escala de acréscimo de velocidade acima mencionada (capacidade máxima de exercício). Ao final do teste de esforço, os animais foram distribuídos nos grupos, de acordo com a capacidade máxima de exercício de cada um. Assim, os animais foram alocados em quatro grupos: dois sedentários, estudados no repouso (grupo sedentário repouso – SR) e imediatamente após uma sessão de exercício (grupo sedentário exercício – SE) e dois treinados, estudados em repouso (grupo treinado repouso – TR) e imediatamente após uma sessão de exercício (grupo treinado exercício – TE). Com base no teste de esforço, calculou-se também a velocidade média de cada grupo, utilizada para o treinamento. A calculou-sessão de exercício, no dia eutanásia, a qual o grupo SE foi submetido durou 15 minutos (tempo de exercício previsto para o primeiro dia de treinamento) e a sessão de exercício do grupo TE
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durou 60 min., com velocidade de 60% da capacidade máxima de exercício média de cada um dos grupos.
Figura 1: Fluxograma do protocolo experimental
3.3 Protocolo de exercício/treinamento
Foi utilizada a metodologia de treinamento descrita em Melo, Martinho e Michelini,78 segundo a qual o grupo a ser treinado iniciou o programa de treinamento físico a uma velocidade da esteira correspondente a 60% da média das velocidades máximas obtida pelos animais pertencentes a este grupo no teste de esforço. Este programa de treinamento consistiu em sessões diárias de exercício (1 hora), 5 dias/semana durante 10 semanas. Nas 3 primeiras semanas, o tempo de exercício foi progressivamente aumentado de 20 minutos para 1 hora/dia, em esteira não inclinada (APÊNDICE B).
Na sexta semana de treinamento, o teste de esforço foi repetido e a velocidade da esteira foi ajustada de acordo com o ganho do grupo em termos de desempenho. O desempenho dos animais neste teste de esforço também serviu para indicar indiretamente a efetividade do protocolo de treinamento utilizado. O peso dos animais também foi monitorado no decorrer do treinamento. Por fim, a massa úmida do coração foi verificada no dia da eutanásia (ao final das 10 semanas de treinamento).
3.4 Modelo de hipertensão 2R1C
A hipertensão renovascular 2R1C foi induzida em ratos por meio do modelo descrito por Goldblatt et al.,66 com algumas adaptações, sendo que a cirurgia para a colocação do clip foi realizada no decorrer do período de treinamento – 4 semanas antes do sacrifício dos animais para os experimentos (APÊNDICE C). Para tanto, os ratos foram anestesiados com Tribromoetanol (Sigma; 250 mg/kg, por via intraperitoneal) para depois serem submetidos a uma laparotomia na linha média. Em seguida, a artéria renal esquerda foi isolada e, nesta, se
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implantou um grampo de prata (clip) de 0,25 mm de diâmetro. Os animais normotensos (SHAM) foram submetidos à laparotomia, porém sem a colocação do clip na artéria renal. No pós-operatório, a analgesia foi feita com Dipirona Sódica (Farmace; 100 mg/dia, por 2 dias, via subcutânea) e o antimicrobiano utilizado foi o Enrofloxacino (Bayer; 0,01 mg/dia, por 2 dias, via subcutânea). Após a cirurgia, os animais permaneceram em gaiolas isoladas por 4 dias. Neste período, os animais pertencentes aos grupos destinados ao treinamento (TR e TE) foram poupados do exercício.
3.5 Medida da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda (“tail cuff”) A pressão arterial sistólica (PAS) foi aferida por pletismografia de cauda. Para isso, os ratos foram aquecidos a uma temperatura média de 40°C por 20 min., para a dilatação da artéria caudal. Em seguida, os animais foram cuidadosamente acondicionados em um contensor apropriado ao seu tamanho, e seu campo visual foi reduzido com o auxílio de uma toalha vermelha, proporcionando assim um ambiente de estresse controlado.79 Na cauda de cada animal, foi colocado um manguito acoplado a um sensor de fluxo para o registro das pressões sistólicas com auxílio de um Powerlab 8/30 data acquisition system® (Australia ADInstruments). As aferições de pressão foram realizadas antes da cirurgia (Basal) e quatro semanas após a cirurgia (Final), sempre no período da manhã. Foram considerados hipertensos (2R1C) os animais que obtiveram um aumento maior que 20 mmHg na aferição de PAS final em relação à PAS basal. Cabe ressaltar que os animais que não atingiram esse aumento da PAS foram excluídos do estudo.
3.6 Eutanásia dos animais e coleta de material
Os animais foram eutanasiados em câmara de gás carbônico (CO2), em uma
concentração aproximada de 40% de CO280, e imediatamente exsanguinados através da
punção da veia cava com auxílio de agulha/seringa heparinizada. O sangue obtido neste procedimento foi centrifugado para a coleta do plasma, que foi congelado para posterior análises bioquímicas, conforme o método preconiza. Paralelamente, após toracotomia, a aorta torácica destes animais foi cuidadosamente dessecada e removida para um béquer contendo solução de Krebs-Henseleit (APÊNDICE D).
3.7 Estudo funcional de reatividade vascular
Segmentos da aorta torácica foram transferidos para uma placa de Petri recoberta com parafina e solução de Krebs-Henseleit, e sob lupa foram separados dos tecidos adjacentes e
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seccionados em anéis de 2-3 mm. Estes anéis foram montados entre 2 ganchos de metal inseridos no lúmen. Em seguida, essas preparações foram colocadas em cubas para estudo de órgão isolado com capacidade para 2 mL, em solução de Krebs-Henseleit, pH 7,4, gaseificada com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) e aquecida a 37°C. Nestas cubas, um dos
ganchos foi fixado no fundo e o outro, no transdutor isométrico de força para a detecção de modificações do tônus vascular. Modificações de tônus vascular foram registradas em Powerlab 8/30 data acquisition system® (Australia ADInstruments) (APÊNDICE E). As preparações permaneceram em repouso durante 60 minutos, sob uma tensão basal de 1,5 g para estabilização. Neste período, a solução nutritiva foi substituída a cada 20 minutos.
A integridade do endotélio das preparações foi avaliada funcionalmente. Para isso, preparações pré-contraídas com NOR 10-5 M, no platô da resposta, foram desafiadas com acetilcolina (ACh) 10-4 M. O relaxamento igual ou superior a 80% da contração inicial foi considerado indicativo de integridade endotelial. Algumas preparações tiveram o endotélio removido mecanicamente (preparações deendotelizadas) antes da montagem nas cubas de órgão isolado. Neste caso, a ausência de relaxamento induzido por ACh 10-4 M foi indicativa da efetividade de remoção endotelial.
Para o estudo da reatividade vascular, as preparações foram desafiadas cumulativamente com Ang II (Sigma; 10-11 - 10-6 Mol/L), solução despolarizante de cloreto de potássio (Sigma; 4,7x10-3 – 12x10-3 M, compensado pela redução do sódio em solução) e nitroprussiato de sódio (Sigma; 10-9 – 10-4 Mol/L). Os desafios com Ang II foram feitos na ausência e na presença de PD 123.319 (Sigma; 10-6 M; inibidor seletivo do receptor AT2),
N-nitro-L-arginina-metil-ester (Sigma; L-NAME 10-4 M; inibidor não seletivo da NOS), indometacina (Sigma; 10-5 M; inibidor não seletivo da COX) e tiron (Sigma;10-4 M; sequestrante de radicais livres). Todos estes inibidores foram administrados diretamente ao banho 20 minutos antes do início dos desafios, e as respostas vasomotoras produzidas foram expressas graficamente como curvas concentração-resposta. A partir destas curvas concentração-resposta, foram obtidos o pEC50, que consiste no negativo do logarítmo da
concentração molar do agonista responsável por 50% do efeito máximo (EC50) e o Emax, que
consiste no efeito desencadeado pela concentração supra máxima do agonista. Para o cálculo da EC50, os valores determinados nos registros foram normalizados pela máxima resposta
(maior valor da curva). Em seguida, fez-se o cálculo da EC50 por regressão não linear através
25
3.8 Quantificação da peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica, que indica o grau de estresse oxidativo do meio biológico, foi estimada pela análise do consumo do Complexo Fe3+ - xilenol laranja (FOX), segundo a técnica descrita originalmente por Jiang e Cols.81 e adaptada para plasma e soro por Arab e Steghens.82 Este método se baseia na oxidação do íon ferroso (Fe2+) a íon férrico (Fe3+) na presença de hidroperóxidos lipídicos e formação de complexos de Fe3+ com o xilenol laranja, gerando uma cor característica, a qual pode ser medida espectrofotometricamente.
Para a determinação do grau de estresse oxidativo no plasma, amostras de sangue foram colhidas em seringas heparinizadas e posteriormente centrifugadas a 3000 RPM/5min./4°C. Em seguida, 20 μL do plasma coletado foram acrescidos a 180 μL do reagente de trabalho (metanol absoluto 81%; xylenol orange 100 μmol; ácido sulfúrico - H2SO4 25 mM; hidroxi tolueno butilado - BHT 40 mM; sulfato ferroso 250 μmol). Por fim,
procedeu-se a leitura das absorbâncias a 560 ηm, em paralelo a uma curva padrão de peróxido de hidrogênio (8,8 M), por meio de um espectrofotômetro.
3.9 Avaliação da capacidade antioxidante do plasma
Esta avaliação foi feita pelo método do FRAP (poder antioxidante de redução do ferro). Para isso foram preparadas três soluções: A (tampão acetato: 300 mM, pH 3,6 e ácido clorídrico - HCl 40 mM), B (2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine - TPTZ - 10 mM) e C (cloreto férrico hexahidratado - FeCl3.6H2O - 20 mM), formando o reagente de trabalho A+ B + C na
proporção 10:1:1 (V/V). O sangue dos animais foi coletado em seringa heparinizada e posteriormente centrifugado a 2500 RPM/10 min./4° C. Em seguida, 0,8 mL do plasma obtido foram adicionados a uma mistura de água deionizada (2,4mL) com o reagente de trabalho (0,25mL). Depois, esta solução foi colocada em microplaca e as absorbâncias foram lidas a 593 nm, em paralelo a uma curva padrão de sulfato ferroso, por meio de um espectrofotômetro.83
3.10 Análise Estatística
Os dados obtidos foram expressos pela média ± erro padrão da média (E.P.M.). A análise estatística dos resultados foi realizada por análise de variância (ANOVA) de duas vias (treinamento e exposição ao exercício) e ANOVA de medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Diferenças nos valores de p<0,05 foram consideradas estatisticamente significativas. Para realização dos testes estatísticos foram utilizados os programas Prisma® e SPSS®.
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4 RESULTADOS
4.1 Massas corporais e cardíacas
Os dados obtidos mostram que nem os diferentes protocolos de exercício aos quais os animais foram expostos, tampouco a elevação da PAS induzida pelo modelo de hipertensão utilizado, causaram modificações significativas de massa corporal (Figuras 2A e 2B). As massas úmidas cardíacas também não foram significativamente diferentes entre os grupos estudados (Figuras 3A e 3B).
Figura 2 - Massas corporais obtidas em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente), determinadas durante o protocolo de treinamento. Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
Figura 3 - Massas úmidas cardíacas obtidas em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente), determinadas no dia da eutanásia. Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 300 350 400 450 500 SR (1 4 ) SE (1 5 ) T R (1 4 ) T E (1 6 ) SH AM
A
Se ma n a s d e Pro to co lo M a s s a s C o r p o r a is ( g ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 SR (1 6 ) SE (1 6 ) T R (1 6 ) T E (1 6 ) 2R 1CB
Se ma n a s d e Pro to co lo M a s s a s C o r p o r a is ( g ) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 S R (1 4 ) S E (1 5 ) T R (1 4 ) T E (1 6 ) S H AM A 1 0 ° S e m a n a d e P ro to c o lo M a s s a s Ú m id a s C a r d ía c a s ( g ) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 S R (1 6 ) S E (1 6 ) T R (1 6 ) T E (1 6 ) 2R 1C B 1 0 ° S e m a n a d e P ro to co lo M a s s a s Ú m id a s C a r d ía c a s ( g )27
4.2 Desempenho em esteira
Os dados obtidos demonstram que, após 6 semanas de treinamento, os animais pertencentes aos grupos treinados (TR e TE) apresentam um desempenho na corrida em esteira significativamente maior em relação aos animais que nunca foram expostos a treinamento (SR). Esta melhora no desempenho foi observada tanto nos animais SHAM (Figura 4A) quanto nos animais 2R1C (Figura 4B).
Figura 4 – Desempenho em esteira dos animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente), determinado antes de iniciar o protocolo (Inicial) e na 6ª semana de protocolo (Final). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). *indica diferença significativa (p<0,001) em relação aos valores basais do mesmo grupo (ANOVA de medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
4.3 Pressão arterial sistólica
Os resultados obtidos mostram que o procedimento cirúrgico para o acesso à artéria renal esquerda, por si, não eleva significativamente a PAS em nenhum dos grupos estudados (Figura 5A).
Figura 5 - Valores de pressão arterial sistólica obtidos em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente), determinados na 5ª semana de protocolo de exercício (Basal - uma semana antes da cirurgia) e na 10ª semana de protocolo de exercício (Final - quatro semanas após a cirurgia), Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,001) em relação aos valores basais do mesmo grupo (ANOVA de medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
Inicial Final 0 5 10 15 20 25 S R (1 4 ) S E (1 5 ) T R ( 1 4 ) T E (1 6 ) * * S HAM A T e s te d e E s fo rç o ( m in u to s ) Inicial Final 0 5 10 15 20 25 S R (1 6 ) S E (1 6 ) T R (1 6 ) T E (1 6 ) 2R 1C * * B T e s te d e E s fo rç o ( m in u to s ) Basal Final 50 100 150 200 250 S R (1 4 ) S E (1 5 ) T R (1 4 ) T E (1 6 ) S H AM A P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a (m m H g ) Basal Final 50 100 150 200 250 S R (1 6 ) S E (1 6 ) T R (1 6 ) T E (1 6 ) 2R 1C B * * * * P re s s ã o A rt e ri a l S is tó li c a (m m H g )
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Por outro lado, quatro semanas após a implantação do clip na artéria renal esquerda, houve um significativo aumento da PAS nos animais pertencentes a todos os grupos experimentais (Figura 5B).
4.4 Reatividade vascular à Angiotensina II
O treinamento, seguido ou não de exposição ao exercício agudo, atenuou as respostas da aorta à Ang II em animais SHAM, levando a uma redução significativa dos valores de Emax, sem contudo modificar significativamente os valores de pEC50. Observou-se também
que a exposição ao exercício agudo não modificou significativamente os perfis de resposta à Ang II nas aortas dos animais sedentários (Figura 6A; Tabela 1). Esta redução significativa de Emax para Ang II, que foi observada nas preparações obtidas de animais treinados, re-expostos ou não ao exercício, deixou de existir após a remoção endotelial. Com efeito, os valores de Emax para Ang II, assim como os valores de pEC50, obtidos nestas preparações,
não diferiram significativamente daqueles obtidos nas preparações de animais sedentários (Figura 6B; Tabela 1). Reduções de Emax para Ang II, induzidas pelo treinamento, também não foram observadas em preparações intactas na presença do PD123.319, tampouco foram observadas alteração nos valores de pEC50 (Figura 6C; Tabela 1). Por conta disso, não mais se
constatou aquela atenuação de resposta induzida pelo treinamento que havia sido observada em preparações não tratadas (Figura 6A). Fato semelhante foi observado quando as preparações intactas foram estudadas na presença de L-NAME. Nestas condições, preparações obtidas dos animais submetidos ao treinamento mostraram um padrão de resposta à Ang II semelhante aos demais. Desta forma, não foram observadas diferenças significativas de Emax ou pEC50 para Ang II entre os diferentes grupos de animais estudados (Figuras 6D;
Tabela 1). Por fim, na presença de indometacina, as respostas à Ang II foram reduzidas nos animais sedentários. Com isso, não se observou redução de Emax para Ang II induzida pelo treinamento, semelhante àquela que havia sido observada em preparações não tratadas (Figura 6E). Nesta condição também não foram observados valores diferentes de pEC50 para Ang II
entre os diferentes grupos de animais estudados (Tabela 1).
Quando animais 2R1C sedentários foram expostos ao exercício agudo, observou-se um deslocamento da curva concentração-resposta à Ang II, com redução significativa do pEC50. Estas preparações também mostraram redução de Emax, porém não estatisticamente
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Figura 6 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas (A) e deendotelizadas (Endo -) na presença de salina (B), bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M (C), L-NAME 10-4M (D) ou indometacina 10-5M, provenientes de animais SHAM sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (09) SE (09) TR (07) TE (06) SHAM (SALINA) *
A
* Angiotensina II Log [mol/L]T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (09) SE (10) TR (10) TE (09)
SHAM (SALINA Endo -)
B
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (08) SE (07) TR (09) TE (05) SHAM (PD 123.319)
C
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (07) SE (08) TR (10) TE (07) SHAM (L-NAM E)
D
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (07) SE (09) TE (10) TR (07)
SHAM (INDOM ETACINA)
E
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g )
30
Tabela 1 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas provenientes de
animais SHAM pEC50 SR SE TR TE Salina Intactas 8,30 ± 0,05 (09) 8,09 ± 0,16 (08) 8,34 ± 0,09 (07) 8,39 ± 0,07 (07) Deendotelizadas 7,81 ± 0,12 (08) 7,76 ± 0,15 (10) 8,13 ± 0,08 (08) 8,19 ± 0,12 (09) PD 123.319 (10-6 M) Intactas 8.96 ± 0,23 (07) 8,46 ± 0,12 (09) 8,33 ± 0,09 (09) 8,42 ± 0,21 (05) L-NAME (10-4M) Intactas 7,95 ± 0,06 (07) 8,05 ± 0,12 (08) 8,00 ± 0,09 (10) 7,96 ± 0,18 (07) Indometacina (10-5 M) Intactas 7,92 ± 0,10 (07) 8,03 ± 0,06 (09) 8,04 ± 0,13 (10) 8,22 ± 0,07 (07)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
Em contrapartida, o treinamento, seguido ou não de re-exposição ao exercício, não promoveu modificações significativas no padrão de resposta à Ang II nestas preparações obtidas de animais 2R1C (Figura 7A; Tabela 2).
Após a remoção endotelial, contudo, as respostas à Ang II não apresentaram diferenças acentuadas entre grupos experimentais estudados. Com efeito, os valores de Emax e pEC50 também não diferiram significativamente entre grupos (Figura 7B; Tabela 2). Na
presença PD123.319 também não foram observadas modificações no padrão de resposta das preparações à Ang II, em consequência do exercício agudo e/ou do treinamento (Figura 7C; Tabela 2). A presença do L-NAME elevou muito discretamente as respostas à Ang II em preparações obtidas de animais 2R1C, pertencentes aos diferentes grupos experimentais estudados (Figura 7D). Estas elevações de resposta à Ang II, embora discretas, resultaram na supressão da redução do pEC50 que havia sido observada em preparações obtidas de animais
sedentário-exercício tratadas apenas com salina (Tabela 2). Por fim, a magnitude de resposta à Ang II foi reduzida nas preparações provenientes de todos os grupos experimentais, quando tratadas com indometacina (Figura 7E). Estas reduções, contudo, não evidenciaram qualquer diferença significativa de Emax ou pEC50 entre os grupos experimentais(Tabela 2).
31
Figura 7 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas (A) e deendotelizadas (Endo -) na presença de em salina (B), bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M (C), L-NAME 10-4M (D) ou indometacina 10-5M, provenientes de animais 2R1C sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (12) SE (11) TR (10) TE (11) 2R1C (SALINA)
A
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (13) SE (09) TR (09) TE (12) 2R1C (SALINA Endo -)
B
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (08) SE (07) TR (08) TE (08) 2R1C (PD 123.319)
C
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 TR (07) TE (10) SR (09) SE (09) 2R1C (L-NAM E)
D
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (10) SE (07) TR (09) TE (08) 2R1C (NDOM ETACINA)
E
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n sã o ( g )
32
Tabela 2 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas provenientes de
animais 2R1C pEC50 SR SE TR TE Salina intactas 8,30 ± 0,08 (12) 7,87 ± 0,08* (11) 8,37 ± 0,10 (10) 8,25 ± 0,07 (11) deendotelizadas 8,00 ± 0,06 (13) 8,06 ± 0,08 (09) 7,96 ± 0,13 (09) 8,18 ± 0,18 (12) PD 123.319 (10-6 M) intactas 8.30 ± 0,19 (08) 8,43 ± 0,19 (07) 8,43 ± 0,13 (08) 8,17 ± 0,20 (08) L-NAME (10-4M) intactas 8,12 ± 0,05 (10) 8,06 ± 0,05 (10) 8,18 ± 0,09 (07) 8,12 ± 0,04 (10) Indometacina (10-5 M) intactas 8,21 ± 0,07 (10) 7,90 ± 0,16 (08) 8,20 ± 0,03 (09) 8,24 ± 0,07 (08)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
Preparações obtidas de animais SHAM, quando estudadas na presença do tiron, não mostraram diferenças evidentes no padrão de resposta à Ang II entre grupos. Com efeito, não se observou diferenças significativas de Emaxou pEC50 entre os diferentes grupos estudados,
nestas condições (Figura 8A; Tabela 3). Quando foram estudadas preparações obtidas dos animais 2R1C, na presença de tiron, observou-se que o treinamento físico, por si, atenuou as respostas das aortas destes animais à Ang II. Por conta disso, observou-se uma redução significativa nos valores de Emax para Ang II nas preparações destes animais treinados em relação aos sedentários, ambos estudados no repouso. Adicionalmente, a exposição dos animais 2R1C sedentários ao exercício agudo resultou em uma diminuição das respostas de suas aortas à Ang II, em relação aos animais sedentários que permaneceram no repouso, e observou-se um deslocamento da curva concentração-resposta à Ang II, com redução significativa do pEC50. Curiosamente, o inverso ocorreu com os animais treinados que foram
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Figura 8 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas tratadas com tiron 10-4M, provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
Tabela 3 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas
provenientes de animais SHAM e 2R1C
pEC50 SHAM SR SE TR TE Tiron 10-4M intactas 8,15 ± 0,09 (08) 8,27 ± 0,12 (07) 8,09 ± 0,08 (07) 8,51 ± 0,29 (08) 2R1C Tiron 10-4M intactas 8,98 ± 0,27 (07) 7,78 ± 0,08* (07) 8,49 ± 0,02 (09) 8,55 ± 0,04 (08)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,05) em relação aos animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
4.5 Análises bioquímicas
O treinamento e/ou o exercício agudo não alteraram as concentrações plasmáticas de FOX e FRAP nos animais SHAM e 2R1C (Tabela 4).
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SR (08) SE (07) TR (07) TE (08) SHAM (TIRON)
A
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n s ã o ( g ) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 SE (07) TR (09) TE (08) SR (07) 2R1C (TIRON)
B
*
*
Angiotensina II Log [mol/L]
T e n s ã o ( g )
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Tabela 4 – Valores plasmáticos (µM/L) das análises bioquímicas do balanço redox (FOX e FRAP) em animais SHAM e 2R1C
SR SE TR TE SHAM FOX 569,17 ± 72,75 (14) 629,19 ± 92,90 (15) 538,86 ± 68,45 (14) 573,58 ± 67,18 (16) FRAP 1,20 ± 0,07 (16) 1,25 ± 0,09 (16) 1,30 ± 0,09 (16) 1,43 ± 0,08 (16) 2R1C FOX 440,78 ± 52,93 (14) 430,34 ± 50,46 (15) 399,88 ± 33,06 (14) 351,69 ± 25,49 (16) FRAP 1,07 ± 0,06 (16) 1,23 ± 0,13 (16) 1,08 ± 0,08 (16) 1,08 ± 0,08 (16)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
4.6 Reatividade vascular ao nitroprussiato de sódio e à solução despolarizante de cloreto de potássio
Nos animais SHAM e 2R1C, o treinamento e a exposição ao exercício agudo não alteraram os valores de Emaxe pD2 das curvas concentração-resposta para nitroprussiato de
sódio, em anéis de aorta pré-contraídos com NOR 10-4M (Figuras 9A e 9B; Tabela 5).
Figura 9 – Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio obtidas em preparações de aortas intactas provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 SR (08) SE (08) TR (07) TE (07) SHAM (SALINA)
A
Nitroprussiato de sódio Log [mol/L]
T e n s ã o ( g ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 SR (08) SE (09) TR (06) TE (06) 2R1C (SALINA)
B
Nitroprussiato de sódio Log [mol/L]
T e n s ã o ( g )
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Da mesma forma, não houve diferença no padrão de resposta da aorta à solução despolarizante de cloreto de potássio em animais SHAM e 2R1C, sedentários e treinados, expostos ou não ao exercício agudo (Figura 10A e 10B; Tabela 5).
Figura 10 - Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio obtidas em preparações de aortas deendotelizadas (Endo -) provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
Tabela 5 - Valores de pEC50 para nitroprussiato de sódio e cloreto de potássio, determinados
em aortas provenientes de animais SHAM e 2R1C
pEC50 SR SE TR TE SHAM Nitroprussiato de sódio 6,93 ± 0,38 (08) 7,09 ± 0,16 (08) 7,08 ± 0,12 (07) 7,26 ± 0,27 (07) Cloreto de potássio 1,85 ± 0,02 (08) 1,94 ± 0,01 (09) 1,93 ± 0,03 (06) 1,92 ± 0,03 (06) 2R1C Nitroprussiato de sódio 7,03 ± 0,15 (07) 7,54 ± 0,66 (07) 6,89 ± 0,27 (08) 6,87 ± 0,24 (08) Cloreto de potássio 1,85 ± 0,08 (06) 2,12 ± 0,32 (05) 2,13 ± 0,13 (08) 2,03 ± 0,10 (05)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). Os valores de pD2 para nitroprussiato de sódio e cloreto
de potássio foram obtidos em preparações intactas e deendotelizadas, respectivamente.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 SR (07) SE (07) TR (08) TE (08)
SHAM (SALINA Endo -)
A
Cloreto de Potássio Log [mol/L]
T e n sã o ( g ) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 SR (06) SE (05) TR (08) TE (05) 2R1C (SALINA Endo -)
B
Cloreto de Potássio Log [mol/L]
T e n s ã o ( g )
