INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

Variabilidade genética do loco csd em populações de cativeiro de

Melipona interrupta manaosensis Schwarz, 1932 e Melipona seminigra

merrillae Cockerell, 1919 (Apidae, Meliponini) na Amazônia.

Izaura Bezerra Francini

Manaus, Amazonas Dezembro, 2008

Livros Grátis

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Izaura Bezerra Francini

Variabilidade genética do loco csd em populações de cativeiro de

Melipona interrupta manaosensis Schwarz, 1932 e Melipona seminigra

merrillae Cockerell, 1919 (Apidae, Meliponini) na Amazônia.

Orientadora: Gislene Almeida Carvalho-Zilse

Dissertação apresentada ao PPG-GCBEv do INPA como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus, Amazonas Dezembro, 2008

Sinopse

Estudamos o mecanismo de determinação do sexo de duas espécies de abelhas sem ferrão, no meliponário do GPA/INPA, Manaus, AM,

Melipona interrupta manaosensis e Melipona seminigra merrillae. Estimamos a riqueza de alelos do csd no loco de determinação do sexo (SDL), a partir da produção de machos diplóides, via segregação. Fizemos análise

citogenética e foto documentação do comportamento das operárias em colônias com macho diplóide. Descrevemos o cariótipo de Melipona seminigra merrillae e o comportamento das duas espécies, sob Determinação Complementar do Sexo (CSD).

Palavras-chave

Citogenética, Eussocialidade, CSD, Meliponini, Poliandria.

F817 Francini, Izaura Bezerra

Variabilidade genética do loco csd em populações de cativeiro de

Melipona interrupta manaosensis Schwarz, 1932 e Melipona seminigra merrillae Cockerell, 1919 / Izaura Bezerra Francini.--- Manaus : [s.n.],

2008.

xiv, 93 f. : il. color.

Dissertação(mestrado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador : Gislene Almeida Carvalho-Zilse

Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Abelhas sem ferrão. 2. Biologia reprodutiva. 3. Citogenética. 4. Evolução cariotípica. 5. CSD. I. Título.

Este trabalho é igualmente dedicado

:

Às mulheres, de todas as idades e etnias, que nos diferentes

lugares da Terra, foram vítimas de preconceito, injustiça e

violência, de toda e qualquer natureza, enquanto aos 61 anos de

idade, coloquei–me “ao abrigo dos muros” migrei para Amazônia e

me permiti estudar abelhas sem ferrão.

Ao Klilton Barbosa da Costa, embaixador das pessoas

preciosas que me ajudaram chegar a este momento, com amor e

gratidão. Pelo que lhe cabe neste trabalho e na minha vida, pelo

que me ensinou, por sua generosidade e cooperação, por sua

família, seu amor a Amazônia e às abelhas sem ferrão.

Ao Dr. Warwick Estevam Kerr pelos “memes”.

Ao Dom Sebastião Bandeira Coêlho, Bispo Auxiliar de

Manaus, pela amizade e ajuda espiritual. Quando a solidão testava

minha Fé e ameaçava a continuidade Deus lhe enviou.

À minha família, Ronaldo, Léo, Ro, Naiara e Grazy: juntos na

distância, unidos pelos sonhos, cada um com o seu. Na “luta pela

sobrevivência” apenas a justificativa de minha inquietude pelo

saber e por dias melhores. Amo vocês!

Agradecimentos

À minha orientadora Dra.Gislene Almeida Carvalho-Zilse, pelo desafio de aceitar minha orientação aos 61 anos de idade. Por ter sido um porto seguro como orientadora e como pessoa; por ter me colocado diante de uma questão fascinante, a determinação do sexo em Hymenoptera; pelo prazer do conhecimento.

Ao meu marido Ronaldo Bastos Francini, por ser fiel às suas convicções, pela sua dignidade, por muitos livros, pelo conhecimento, pelos sacrifícios em prol da família ao longo destes 37 anos, por podermos contar com você, na alegria e na tristeza, na saúde e na doença, na riqueza e na pobreza. Pelos filhos e neta.

Aos meus filhos Carlo Leopoldo Bezerra Francini e Ronaldo Bastos Francini Filho, por compreenderem minha inquietação pessoal, meu vôo em busca dos sonhos. Por todos os telefonemas, por todas as vezes que ouvi mãe, querida, te amo! Pelos castelos de areia que fizemos juntos nos verões Santistas, nos idos dos anos 70-80.

À minha neta Naiara Alves Francini, sentido maior de minha vida, pelo amor e pelos fins de semana que compartilhamos em Manaus.

Ao Klilton Barbosa da Costa pelo acolhimento e companheirismo em Manaus, por compartilhar sua família, pelo Natal e Ano Novo de 2007, pelo apoio e amizade, pelos ensinamentos de Meliponicultura indispensáveis ao desenvolvimento deste trabalho, por todas as fotos, pela sua presença nas horas difíceis, pelo sonho de uma parceria no trabalho.

Ao Sr. Humberto Garcia da Costa e Sra. Adiene Barbosa da Costa, pelo acolhimento em Manaus, por todos os bons momentos.

Ao Dr Eduardo Martins Venticinque e Marina Antogiovanni da Fonseca (Dadão e Marininha), pessoas queridas, pela amizade e apoio.

Aos membros da banca examinadora da dissertação Dr. Ademilson Espencer Egea Soares, Dra. Ana Maria Waldschmidt, Dr. Lucio Antônio de Oliveira Campos, Dr. Paulo Sérgio Moreira Carvalho Oliveira e Dra. Vera Margarete Scarpassa por terem dedicado seu precioso tempo na análise e avaliação deste tabalho.

À Maria Claudia Gross por ter compartilhando gentilmente seus conhecimentos de citogenética, pela amizade e delicadeza. Sua competência e disponibilidade em ajudar foram fundamentais, para meu aprendizado, para a

interpretação, discussão e conclusões, referentes ao conteúdo citogenético deste trabalho.

À Dra Neusa Hamada e ao Dr. Giorgio C. Venturieri, pelas correções e sugestões feitas ao meu plano de trabalho.

Aos membros da banca julgadora da qualificação, Dr. Aylton Saturnino Teixeira, Dra. Eliana Feldberg e Dra. Vera Margarete Scarpassa pelas contribuições, sugestões e incentivo.

À Dra. Eliana Feldberg por ter disponibilizado de modo irrestrito o uso de seu laboratório, viabilizando a expansão da análise citogenética no desenvolvimento desse trabalho.

À Dra Vera Margarete Scarpassa por todas as palavras de incentivo e respeito. Muito me ajudaram nesta caminhada.

Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto pelo esclarecimento de dúvidas e pela maneira atenciosa com sempre me tratou.

Ao Dr. Carlos Gustavo Nunes-Silva pelo apoio, comentários e sugestões por ocasião da pré-qualificação.

À Maria Hercília Andrade Ribeiro e Alessandra Marques Nascimento pelo atendimento primoroso e acolhimento, desde o primeiro contato até a presente etapa. Que Deus lhes proteja e lhes dê forças, para que mais estudantes sejam abençoados no acolhimento.

Ao Marcos Prado Lima, colega e amigo, pela cooperação e ajuda, pelo respeito e carinho.

À Fabíola da Costa Rodrigues, amiga querida, bom tê-la comigo, espero que um dia lembre com saudade deste seu tempo de asilo.

À Maria de Fátima Ferreira da Costa Pinto por ter ajudado sempre, esclarecendo dúvidas, partilhando seu conhecimento.

Ao Hélio Vilas-Boas, que por determinação de minha orientadora, me ensinou as primeiras noções de Meliponicultura e multiplicação de colônias, no meliponário do GPA.

Ao Juracy de Freitas Maia pela ajuda no preparo de reagentes.

Às agências financiadoras FAPEAM, SUFRAMA, ProVárzea, INPA e Banco Real pelo suporte financeiro que permitiu a realização deste trabalho.

A todas as pessoas, do GPA e de outros setores do INPA, que direta ou indiretamente colaboraram com a realização deste trabalho.

Velho Tema

Vicente de Carvalho

Só a leve esperança em toda a vida

Disfarça a pena de viver, mais nada;

Nem é mais a existência, resumida,

Que uma grande esperança malograda.

O eterno sonho da alma desterrada,

Sonho que a traz ansiosa e embrevecida,

É uma hora feliz, sempre adiada

E que não chega nunca em toda a vida.

Essa felicidade que supomos,

Árvore milagrosa que sonhamos

Toda arreada de dourados pomos,

Existe sim; mas nós não a alcançamos

Porque está sempre apenas onde a pomos

E nunca a pomos onde nós estamos.

Resumo

As abelhas sem ferrão (Apidae, Meliponini) têm distribuição nas Regiões Tropicais e Subtropicais do Mundo. A riqueza de indivíduos e de espécies de Meliponini é proeminente em muitas áreas limitadas do Brasil e da América Tropical. Monitoramos o loco de determinação do sexo (SDL-Sex Determining Locus) de

Melipona (Melikerria) interrupta manaosensis Schwarz, 1932 e Melipona (Michmelia) seminigra merrillae Cockerell, 1919. Desenvolvemos este trabalho no meliponário do

GPA/INPA (Grupo de Pesquisas em Abelhas/Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) (3º05.838’S 059º59.103’W), Manaus, AM. Com base na técnica de Kerr, quantificamos a segregação de machos e de fêmeas, da prole de novas rainhas, em 64 colônias, 32 de M. interrupta manaosensis e 32 de M. seminigra merrillae. Amostramos de 30 a 100 células do primeiro disco de cria, 40 e 35 dias após o início da postura, respectivamente. Estimamos a razão sexual (RS), aferida por teste G, e em colônias com RS 0,5:0,5 fizemos a análise citogenética para confirmar a diploidia dos machos. Observamos o comportamento das operárias nestas colônias e documentamos por fotografia. Calculamos a riqueza alélica do csd (complementary

sex deteminer), com base na produção de machos diplóides, pela equação de

Laidlaw n=2M(N+1)/(H+1). Estimamos de 22 a 88 alelos para M. interrupta

manaosensis e de 13,2 a 52,8 para M. seminigra merrillae, no loco csd. Descrevemos o cariótipo de M. seminigra merrillae 2n=22 (2n=8m+12sm+2a) (fêmea) e n=11 (n=4m+6sm+1a) (macho haplóide). Enquanto o número diplóide disponível até o presente, para outras 19 espécies de Melipona, incluindo M.

interrupta manaosensis, é 2n=18 (fêmea) e n=9 (macho haplóide). Nas duas

espécies as rainhas foram fertilizadas por até quatro machos. Rainhas de M.

interrupta manaosensis foram inseminadas por dois machos em 9,37% das chances

e por quatro machos em 3,12% destas. Rainhas de M. seminigra merrillae foram inseminadas por dois e por quatro machos em 21,87% e 31,25% das colônias, respectivamente. As duas espécies apresentaram alta variabilidade genética e estão sob Determinação Complementar do Sexo (CSD). M. interrupta manaosensis confirmou o comportamento descrito em estudos prévios para outras espécies de

Melipona sob CDS. Mas, M. seminigra merrillae não. Propomos: M. seminigra merrillae apresenta um nível elevado de poliandria, é derivada em relação às

espécies de Melipona com 2n=18, as operárias têm papel significante na função de reprodução. Sugerimos a revisão do status taxonômico desta abelha.

Abstract

The stingless bees (Apidae, Meliponini) have distributions in the Tropical and Subtropical Regions in the World. Meliponini individuals and species richness is prominent in many Brazilian and Tropical America limited areas. We monitor Sex Determination Locus (SDL) of Melipona (Melikerria) interrupta manaosensis Schwarz,

1932 and Melipona (Michmelia) seminigra merrillae Cockerell, 1919. We developed

this work at the Meliponário of the GPA/INPA (Grupo de Pesquisas em Abelhas/Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) (3º05.838’S 059º59.103’W), Manaus, AM. Based in Kerr´s technique we quantified the segregation of male and female of the newly queens offspring in 64 hives, 32 of M. interrupta manaosensis and 32 of M. seminigra merrillae. We sampled 30 to 100 cells, from the first brood comb, 40 and 35 days, after the beginning of the oviposition, respectively. We estimate the sex ratio (SR), verified by G test, and in hives with SR 0.5:0.5 we carried out cytogenetic analysis to confirm males diploidy. We observed workers behavior in these hives and documented by photography. We calculate allelic richness at csd (complementary sex deteminer), based on diploid male production, by Laidlaw equation n=2M(N+1)/(H+1). We estimate of 22 to 88 alleles to M. interrupta

manaosensis and of 13.20 to 52.8 to M. seminigra merrillae at csd locus. We

described the kariotype of M. seminigra merrillae that is 2n=22 (2n=8m+12sm+2a) (female and diploid male) e n=11 (n=4m+6sm+1a) (haploid male). While the diploid number available at the present for other 19 Melipona species, including M.

interrupta manaosensis, is 2n=18 (female) and n=9 (haploid male). In the two

species the queens were fertilized for at least four males. Queens of M. interrupta

manaosensis were insemined for two males in 9.37% of the chance and for quatro

males in 3.12% of these. M. seminigra merrillae’s queens were insemined by two and four males in 21.87% and 31.25% of the hives, respectively. The two species present high level of genetic variability, but are under Complementary Sex Determination (CSD). M. interrupta manaosensis confirmed the behavior described in previous studies for other Melipona species under CSD, but M. seminigra merrillae didn’t. We propose: M. seminigra merrillae presents a high level of polyandry, is derived in relationship to Melipona species with 2n=18, the workers have a significant role in reproduction function. We suggest the revision of this bee taxonomic status.

Sumário

Lista de Tabelas xii

Lista de Figuras xiii

Capítulo 1 1. Introdução 16 2. Objetivos 25 3. Material e métodos 26 3.1. Material biológico 26 3.2. Área de estudo 27 3.3. Multiplicação de colônias 28 3.4. Alimentação artificial 30

3.5. Monitoramento da rainha e postura 30

3.6. Processo de amostragem 31

3.7. Estimativa da riqueza de alelos 33

3.8. Análise citogenética 34

3.9.Comportamento das operárias nas colônias DMP 35 Capítulo 2 Artigo I - Importância da variabilidade genética para criação

das abelhas sem ferrão Melipona interrupta manaosensis e

Melipona seminigra merrillae.

Normas: Journal of Applied Entomology

36

Capítulo 3 Artigo II - Um novo Comportamento em espécie de Melipona (Apidae, Meliponini) sob Determinação Complementar do Sexo. Normas: Journal of Insects Behavior

58

Capítulo 4 Artigo III - Análise citogenética de Melipona seminigra

merrillae revelou que o número de cromossomos não é

conservado no gênero. Normas: Heredity

Capítulo 5 Artigo IV – Caracterização cariotípica da abelha sem ferrão

Melipona (Michmelia) seminigra merrillae (Apidae, Meliponini)

Normas: European Journal of Entomology.

86

Capítulo 6 Conclusões Gerais 99

Lista de Tabelas

Capítulo 2

Tabela 1 Melipona interrupta manaosensis - formação de rainhas (IP=Início da

postura; ∆t/dias=tempo de formação) 53

Tabela 2 Melipona seminigra merrillae - formação de rainhas (IP=Início da

postura; ∆t/dias=tempo de formação) 54

Tabela 3 Melipona seminigra merrillae – postura média por dia (IP=Início da postura)

55

Tabela 4 Melipona interrupta manaosensis: segregação de ♂ e ♀; razão sexual (RS); Hipóteses nulas: * RS1 0,50:0,50 (1:1); ** RS2 0,25:0,75 (1:3); *** RS3 0,125:0,875 (3:7); * ** *** RS1, RS2 e RS3; valor crítico para o teste de G = 3,841 (1 gl., p=0,95, alfa 0,05); S = significativo; NS = não significativo.

56

Tabela 5 Melipona seminigra merrillae: segregação de ♂ e ♀; razão sexual (RS); Hipóteses nulas: * RS1 0,50:0,50 (1:1); ** RS2 0,25:0,75 (1:3); *** RS3 0,125:0,875

(3:7); * ** *** RS1, RS2 e RS3; valor crítico para o teste de G = 3,841 (1 gl., p=0,95,

alfa 0,05); S = significativo; NS = não significativo; d1 – 1º disco de cria; d2 – 2º disco

de cria; d3 – 3º disco de cria.

57

Capítulo 3

Tabela 1 Melipona seminigra merrillae: segregação de ♂ e ♀; razão sexual (RS) nos três primeiros discos de cria de uma rainha, em colônias com segregação 1:1 no primeiro disco; Em negrito assinalado o desvio da RS em benefício das fêmeas.

72

Capítulo 5

Tabela 1 Espécies de Melipona com o mesmo número diplóide 2n=18 (fêmeas) e n=9 (machos haplóides) *Ocorrência no Amazonas; **única espécie do Amazonas cariotipada. Negrito = localidade de coleta de abelhas da Amazônia cariotipadas

Lista de Figuras

Capítulo 1

Figura 1 Regiões de distribuição mundial dos Meliponíneos. 16 Figura 2 Forrageamento e armazenamento de alimento A- Cenostigma

tocantinum fonte de néctar; B– Operárias de Melipona seminigra merrillae

alimentando-se de mel; C– Melipona sp. coletando pólen em flor de Bixa

orellana.

17

Figura 3 Ninhos de abelhas em troncos. A e B- Melipona interrupta

manaosensis – entrada característica e estrutura interna do ninho,

respectivamente; C- Melipona seminigra merrillae entrada rendada característica da espécie.

18

Figura 4 Castas (Rainha e Operárias) em colônia de Melipona seminigra

merrillae.

19

Figura 5 Espécies de abelhas sem ferrão estudadas: Melipona interrupta

manaosensis (A - discos de cria, B- abelha em flor de Celosia argentea); Melipona seminigra merrillae (C- discos de cria, D- abelha em flor de Bixa orellana).

26

Figura 6 Meliponário GPA/INPA: A – Vista aérea; B– Instalações do meliponário. C - Laboratório de Genética de Abelhas.

27

Figura 7 Estrutura interna de colônia de Melipona, em caixa padrão: A- Ninho de jandaíra com discos de cria nova, ao centro, e potes de alimento (mel e pólen), ao redor. B - Sobreninho com discos de cria nascente e potes de alimento.

28

Figura 8 Caixa de madeira empregada para criação de abelhas sem ferrão. 29 Figura 9 Procedimento de multiplicação de colônias de abelhas sem ferrão pelo método de Perturbação Mínima: A – antes da divisão (1 - caixa com abelhas; 2- caixa vazia). B – após a divisão (1- colônia-mãe; 2- colônia filha).

29

Figura 10 Procedimento de alimentação artificial das colônias. 30 Figura 11 Fotodocumentação da postura da rainha Melipona seminigra

merrillae A – Primeiro disco de postura da rainha recém instalada na colméia

filha (destaque em círculo); B - Rainha marcada para monitoramento.

31

Figura 12 Disco de cria de Melipona seminigra merrillae desoperculado para identificação de rainha (R); macho(M) e operária (O).

32

Figura 13 Estrutura característica do gonóstilo em operária (A) e macho (B) de

Melípona interrupta manaosensis (destaque em círculo)

32

Figura 14 Corbícula característica de operária de Melipona interrupta 33

C

C

manaosensis (destaque em círculo)

Figura 15 Unhas características de operárias (A) e machos (B) de Melipona

seminigra merrillae

33

Capítulo 2

Figura 1 Melipona interrupta manaosensis – operárias atacando e matando macho

em colônia com segregação 1macho:1fêmea 52

Figura 2 Melipona interrupta manaosensis - operárias atacando e matando a rainha mãe em colônia com segregação 1macho:1fêmea

52

Capítulo 3

Figura 1 Melipona seminigra merrillae: rainha marcada para monitoramento da prole. 73

Figura 2 Melipona seminigra merrillae: primeiro disco no início da postura. ₇₃

Capítulo 4

Figura 1 Cromossomos mitóticos de Melipona seminigra merrillae: a. Fêmea (2n=22); b. Macho haplóide (n=11); c. Macho diplóide (2n=22). (Barra: 5μm). 85 Capítulo 5

Capítulo 1

Introdução Objetivos Material e Métodos

1. Introdução

As abelhas da Tribo Meliponini (Hymenoptera, Apidae), conhecidas como “abelhas sem ferrão”, são as únicas abelhas altamente sociais, além dos Apini. Têm distribuição nas regiões de clima tropical e subtropical do planeta, exceto ao leste das Ilhas Salomão no Pacífico; ao sul estendem-se para as regiões temperadas (35º S na Austrália e América do Sul e 28º S na África), para o Norte vão um pouco além do Trópico de Câncer (23,5º N) (Michener, 2007) (Figura 1).

Figura 1. Regiões de distribuição mundial dos Meliponíneos (destaque em círculos).

Essas abelhas vivem em colônias perenes constituídas por algumas dúzias a mais de cem mil indivíduos e alimentam-se de néctar, mel e pólen (Figura 2). A reprodução sexuada de grande parte da vegetação natural do mundo e de plantas cultivadas depende dos polinizadores, primariamente abelhas, que coletam pólen como principal fonte de proteínas e néctar como fonte de carboidratos; as flores fornecem néctar, às vezes óleo e excesso de pólen que usam como armadilha e recompensa ao trabalho de polinização (Kerr et al., 2001; Michener, 2007).

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Figura 2. Forrageamento e armazenamento de alimento. A- Cenostigma tocantinum (pau pretinho)

fonte de néctar; B– Operárias de Melipona seminigra merrillae alimentando-se de mel; C– Melipona sp. coletando pólen em flor de Bixa orellana (urucum).

A maioria das espécies nidifica em cavidades encontradas em troncos de árvores (Figura 3) e no solo, ocupando desde pequenos orifícios deixados por outros insetos até grandes cavidades. Outras espécies podem utilizar ninhos de térmitas e formigas ou fazer ninhos expostos em árvores, paredes e frestas de rochas. Novos ninhos, usualmente, começam pelas operárias que deixam a colônia para construir

Barbosa–Costa, K 2007 Francini, IB 2008 Barbosa-Costa, K 2007

A

outro em um novo local, voltando à colônia pré-existente (colônia mãe) para carregar material de construção (cera, resina, goma e outros) e alimento (pólen, néctar e mel). Por último uma rainha jovem vai para a nova colônia que se torna independente (Michener, 2007).

Figura 3. Ninhos de abelhas em troncos. A e B- Melipona interrupta manaosensis – entrada

característica e estrutura interna do ninho, respectivamente; C- Melipona seminigra merrillae-entrada rendada característica da espécie.

B Barbosa-Costa, K 2007

C

As fêmeas são representadas por castas morfológica e comportamentalmente diferentes (Kerr, 1950; Kerr, 1997) (Figura 4) tendo o ferrão e estruturas associadas, extremamente reduzidas (Kerr e Lello, 1962).

Figura 4. Castas (rainha e operárias) em colônia de Melipona seminigra merrillae.

Michener (2007) considera impossível estimar o número real de espécies de meliponíneos devido à abundância de espécies crípticas, como também, pelo fato da maioria dos gêneros, nas diferentes áreas de ocorrência, não terem sido revistos. No Brasil, os Meliponini são encontrados em todos os Estados, mas, a grande maioria ocorre na Amazônia, onde muitas espécies e subespécies ainda não foram identificadas (Silveira et al., 2002). Camargo e Pedro (1992) consideram 54 gêneros; Moure et al. (2007) listam 33 gêneros exclusivamente neotropicais e 391 espécies válidas, sendo Melipona o gênero que tem o maior número de espécies.

Barbosa-Costa, K 2007

Operárias

Rainha

Em muitas áreas limitadas, no Brasil e na América Tropical, a riqueza dos Meliponini é proeminente, tanto em espécies como em indivíduos, o que permite deduzir que têm papel fundamental na polinização da vegetação nativa (Michener, 2007). Segundo Kerr et al. (2001) as abelhas sem ferrão polinizam de 30 a 90% da flora nativa brasileira, conforme o ecossistema, garantindo o desenvolvimento e manutenção da biodiversidade. Muitos estudos sobre Meliponini foram realizados nos últimos anos, mas considerando a diversidade destas abelhas nos trópicos, outros são necessários (Castro et al. 2006). Para o homem, os produtos apícolas (mel, cera, própolis e outros) e a polinização de plantas cultivadas, são benefícios óbvios, mas não se compara à enorme importância da polinização da vegetação natural, muito provavelmente a atividade mais importante das abelhas (Bart, 1985; Roubik, 1992).

As abelhas sem ferrão são comumente criadas, artesanal ou comercialmente, em diversas regiões do Brasil e especialmente no Amazonas (Carvalho-Zilse, 2006). É uma atividade frequentemente desenvolvida por comunidades tradicionais, fazia parte da vida social e religiosa dos antigos Maias, que consideravam o mel de

Melipona beecheii Bennett, 1831, como sagrado. Atualmente, apesar da criação destas abelhas, em larga escala, representar um desafio, a Meliponicultura (termo cunhado por Nogueira-Neto, 1997) é considerada uma atividade importante para a conservação da biodiversidade e para o desenvolvimento da agricultura sustentável, sinalizando novas possibilidades econômicas (Cortopassi-Laurino et al., 2006). O mel dos meliponíneos tem maior valor comercial que o de Apis mellifera Linnaeus, 1758, por ser usado como produto nutricional e terapêutico pelas populações locais (Kerr et al.,1996). Além do mais, a Amazônia, de acordo com Oliveira e Kerr (2000), tem o maior potencial do Planeta para a criação de abelhas sem ferrão e produção de mel e pólen.

A conservação destas abelhas e de seus habitats é, muito provavelmente, a maior contribuição da Meliponicultura além do benefício imediato de ser uma fonte de renda adicional. Dentre os fatores que devem ser observados para o sucesso da criação de abelhas sem ferrão, a escolha de espécies nativas da região é relevante, devido à adaptação às condições climáticas e florísticas (Kerr et al., 1996). De acordo com Castro et al. (2006) pelo menos nove espécies de abelhas sem ferrão, incluindo espécies do gênero Melipona, têm uso potencial em programas de polinização de plantas da Amazônia, tais como: cupuaçu Theobroma grandiflorum

Schum (cupuaçu), Bixa orellana L. (urucum), Euterpea oleracea Mart. (açaí) e

Paullinia cupana Kunth (guaraná).

Segundo Kerr (2002) cerca de 100 espécies de Meliponini estão sob risco de extinção, devido à crescente destruição das florestas. A destruição dos habitats, principalmente, por ação antrópica, associada ao Mecanismo de Determinação Complementar do Sexo (CSD-Complementary Sex Determination), constitui-se numa grave ameaça a estas abelhas (Carvalho, 2001).

Vários mecanismos de determinação do sexo foram descritos para Hymenoptera, evidenciando a diversidade de processos genéticos que determinam o sexo nesta ordem de insetos (Cowan e Stahlhut, 2004). Destes, o principal é a haplodiploidia ou haploidia masculina, onde machos haplóides são produzidos por partenogênese arrenótoca e fêmeas diplóides resultam do desenvolvimento de ovos fecundados (Crozier, 1977). A formação de machos, a partir de ovos não fertilizados foi vista primeiramente em A. mellifera, quando foram observadas as primeiras características sobre biologia do sexo em Hymenoptera (Dzierzon, 1845). Em estudos posteriores sobre A. mellifera, Siebold (1856), Meves (1907) e Nachtsheim (1913) confirmaram a observação de Dzierzon (Carvalho, 1996; Kerr, 1997). Espécies com partenogênese telítoca, consistindo inteiramente de fêmeas diplóides, são pouco freqüentes. O mesmo foi verificado para espécies com deuterotoquia, que produzem tanto machos como fêmeas por partenogênese (Slobodchikoff e Daly, 1971).

Em diversas espécies de himenópteros, ao contrário do esperado por partenogênese arrenótoca, ocorre produção de machos diplóides (DMP-Diploid Male

Production) de origem biparental (Woyke et al., 1966; Wilgenburg et al., 2006). Estas

espécies estão sob o Mecanismo de Determinação Complementar do Sexo

(CSD-Complementary Sex Determination), onde a heterozigosidade do loco de

determinação do sexo (SDL-Sex Determination Locus) governa o desenvolvimento de fêmeas e a homozigosidade produz machos diploides (Whiting, 1943; Mackensen, 1951; Woyke, 1963a, 1963b; Kerr, 1987; Kerr et al., 1988; Hasselmann

et al., 2008). O SDL é a região do genoma que transporta genes relacionados com a

determinação do sexo, como o csd (complementary sex determiner) e o fem (feminizer) (Hasselmann et al., 2008).

A existência de múltiplos alelos sexuais csd e a DMP em A. mellifera, foi sugerida pela observação de falhas em 50% dos favos de rainhas inseminadas por

seus irmãos (Mackensen, 1951). Constatou-se que as falhas nos favos resultavam do fato de 50% de larvas serem machos 2n, que eram comidos pelas operárias, de um a três dias após a eclosão dos ovos (Woyke 1963a, 1963b).

O gene csd foi mapeado em A. mellifera (Beye et al.,1994; Hunt e Page, 1994), tendo sido isolado e identificado como sinal primário da determinação do sexo. Codifica uma proteína tipo SR (rica em arginina e serina) candidata a proteína de ligação e função de splicing (Beye et al., 2003).

Em diferentes espécies de Hymenoptera, o polimorfismo do csd, inferido a partir da DMP, mostrou-se elevado (Owen & Packer, 1994), em média, variando de 9 a 20 alelos (Cook e Crozier, 1995). Hung et al. (1974) encontraram 86 alelos csd em populações naturais de Solenopsis invicta Buren, 1972 (formiga de fogo). Em abelhas, foram estimados 18,9 alelos csd para A. mellifera, sendo a rainha poliândrica e inseminada, em média, por 17,3 machos (Adams et al., 1977). Em população natural de Melipona compressipes Fabricius, 1804, Kerr (1987) estimou 20 alelos no loco sexual e para Melipona scutellaris Latreille, 1811 a riqueza estimada foi de 23,86 alelos (Carvalho, 2001).

Nem todos os Hymenoptera estudados, citológica e geneticamente, estão sob CSD (Kerr et al., 1988), o que foi confirmado para um pequeno número de himenópteros sociais (Wilgenburg et al., 2006). Em abelhas sem ferrão, foi encontrado em: Trigona quadrangula (Tarelho, 1973 apud Carvalho, 1996); Melipona

quadrifasciata Lepeletier, 1836 (Camargo, 1979); Melipona compressipes fasciculata

Smith, 1854 (Kerr, 1987); M. scutellaris (Carvalho et al., 1995); Trigona carbonaria Smith (Green e Oldroyd, 2002) e Scaptotrigona postica Latreille, 1807 (Paxton et al., 2003).

Machos 2n (DM–Diploid Males), produzidos por Determinação Complementar do Sexo, são inviáveis ou estéreis (Whiting, 1943; Mackensen, 1951; Woyke, 1962; Woyke 1963a, 1963b; Kerr, 1987; Kerr et al.,1988), gerando perda de 50% da população da colônia, a cada geração. De acordo com a visão corrente, em

Melipona, as operárias matam os machos 2n e também as rainhas que os produzem

(Camargo, 1979; Kerr, 1987; Carvalho et al., 1995, Carvalho, 2001).

A diversidade de alelos csd que uma população pode manter depende do tamanho efetivo da população, ou seja, da população geneticamente ativa (Yokoyama e Nei, 1979; Cornuet, 1980). Em populações pequenas que não conseguem manter pelo menos seis alelos csd, a DMP leva ao declínio e extinção

da população em poucas gerações (Woyke, 1980; Stouthamer et al.,1992; Carvalho, 2001).

Para manter seis alelos csd, uma população de meliponíneos precisa ter 44 colônias ou mais, na área de reprodução (Kerr e Vencovsky, 1982). Populações com menos de 44 colônias poderão ser eliminadas em 15 gerações pelo efeito “Yokoyama e Nei” (Kerr, 1997). Portanto, o número de colônias de meliponíneos, que deve ser mantido na área de reprodução é fundamental para assegurar a variabilidade genética e garantir a conservação destas abelhas.

A freqüência de machos diplóides (homozigotos) é empregada para estimar a variabilidade genética em populações de himenópteros haplodiplóides. É um parâmetro importante em genética da conservação, indicando o empobrecimento genético devido ao endocruzamento ou à diminuição da riqueza alélica no loco de determinação do sexo (Zayed et al., 2003).

Em sua maioria, as abelhas sem ferrão são monogínicas, cada colônia tem apenas uma rainha e monândricas, a rainha é inseminada por um macho (Kerr, 1969; Kerr et al., 1962). Vários autores fizeram registros esparsos da ocorrência de poliginia em meliponíneos, sendo Melipona bicolor Lepeletier, 1836, a única espécie que apresenta poliginia natural, facultativa, mas duradoura (Cepeda Aponte, 2003), com até cinco rainhas comandando a colônia (Velthius et al., 2006). Poliandria foi documentada para M. beecheii, cuja rainha é inseminada por um a três machos e para S. postica com a rainha inseminada por um a seis machos (Paxton et al., 1999). Poliandria também foi registrada para M. scutellaris com 34,5 % dos acasalamentos ocorrendo com pelo menos dois machos (Carvalho, 2001). O fato de rainhas de Meliponini, na maioria das vezes, serem inseminadas por um macho diminui a variabilidade genética e consequentemente aumenta a chance de produção de macho diplóide.

Operárias da maioria dos himenópteros sociais produzem ovos haplóides que dão origem a machos viáveis (Bourke, 1988). Em espécies monogínicas e monândricas, as operárias são irmãs completas, compartilhando 75% dos genes (r = 0,75), portanto, de acordo com a teoria da seleção de parentesco (Hamilton, 1964), espera-se que tenham elevada participação na produção de machos (Paxton et al., 2003), contribuindo para o aumento da variabilidade genética.

Um alelo pode aumentar sua freqüência, mesmo quando é individualmente desvantajoso, se conferir maior valor adaptativo aos parentes (Maynard Smith,

1964). Uma característica selecionada por parentesco pode aumentar sua freqüência, ainda que, ocorra diminuição do valor adaptativo do indivíduo, se aumentar o “fitness“ dos parentes (Futuyma, 2003). Como a maternidade das operárias é afetada pela freqüência de cruzamentos da rainha, em insetos sociais, é o fator central dos argumentos sobre a evolução da eussocialidade, por seleção de parentesco, em sociedades haplodiploides de himenópteros (Wilson, 1971; Crozier e Pamilo, 1996; Paxton et al., 1999; Peters et al., 1999).

Melipona (Michmelia) seminigra merrillae Cockerell, 1919, a

jandaíra-da-Amazônia ou uruçu-boca-de-renda e Melipona (Melikerria) interrupta manaosensis Schwarz, 1932, jandaira-preta-da-Amazônia ou jupará, são espécies abundantes na Amazônia Central (Schwarz, 1932; Moure e Kerr, 1950; Kerr et al., 1967; Kerr et al., 2001; Moure et al., 2007); têm papel importante como polinizadores e como produtores de mel (Kerr et al.,1994). Além do fato de serem dispersoras de sementes de Zygia racemosa Barneby & Grimes, em ambientes próximos de meliponários e fragmentos florestais (Bacelar-Lima et al., 2006).

Considerando que tal conhecimento é uma ferramenta útil para o manejo de populações naturais e de meliponários, podendo contribuir com o desenvolvimento e preservação da Amazônia, objetivamos conhecer o mecanismo de determinação do sexo, assim como, outros aspectos da biologia da reprodução de M. seminigra

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

Estudar o mecanismo de determinação do sexo de Melipona (Melikerria)

interrupta manaosensis Schwarz, 1932 e Melipona (Michmelia) seminigra merrillae Cockerell, 1919, em populações de cativeiro (Meliponário urbano).

2.2. Objetivos Específicos

 Estimar a variabilidade genética de M. seminigra merrillae e M. interrupta

manaosensis, através da riqueza de alelos no loco csd, a partir da produção

de machos diplóides, em populações de cativeiro (Meliponário urbano);

 Confirmar a diploidia dos machos por análise citogenética, em colônias com segregação 1:1 de machos e de fêmeas, característica da produção de machos diplóides;

 Caracterizar citogeneticamente M. seminigra merrillae;

 Estudar o comportamento das operárias em colônias com segregação característica da produção de machos diplóides.

3. Material e Métodos

3.1. Material Biológico

Monitoramos 64 colônias de abelhas sem ferrão, 32 de Melipona seminigra

merrillae e 32 de Melipona interrupta manaosensis (Figura 5), a partir da formação

(início da postura da primeira rainha).

Figura 5. Espécies de abelhas sem ferrão estudadas: Melipona interrupta manaosensis (A- discos de

cria, B- abelha em flor de espinafre africano, Celosia argentea); Melipona seminigra merrillae (C- discos de cria, D- abelha em flor de urucum, Bixa orellana).

C

D

C

3.2. Área de Estudo

Realizamos o trabalho no meliponário do Grupo de Pesquisas em Abelhas do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, localizado no Campus Sede (GPA/INPA - 3º 05,838’ S e 059º 59,103’ W), Manaus, Amazonas (Figura 6).

Figura 6. Meliponário GPA/INPA: A– Vista aérea da localização; B– Instalações do Meliponário.

C-Laboratório de Genética de Abelhas.

A

B

C

A

C

B

3.3. Multiplicação de Colônias

Obtivemos as colônias, para monitoramento, pela multiplicação das existentes no meliponário do GPA/INPA, empregando o método Perturbação Mínima (Oliveira e Kerr, 2000; Kerr et al., 2001), que consiste na seleção de colônias fortes para serem divididas. Colônias fortes recebem nota ≥ 7.0, numa escala de 1 a 10, apresentam o ninho e sobreninho completamente ocupados com crias (discos de postura, discos de cria nova e cria nascente) e potes com alimento (mel e pólen) distribuídos, lateralmente, ao redor dos discos de cria (Figura 7) (Carvalho, 1996; Kerr et al., 1996). Após a divisão cada colônia origina duas: a mãe que permanece com a rainha fecundada (fisogástrica) e parte das crias; e a filha (órfã), que recebe a cria nascente e as campeiras (abelhas forrageiras). Este método de multiplicação de colônias é rápido e seguro (Kerr, 2002).

Figura 7. Estrutura interna de colônia de Melipona, em caixa padrão: A- Ninho de jandaíra com

discos de cria nova, ao centro, e potes de alimento (mel e pólen), ao redor. B- Sobreninho com discos de cria nascente e potes de alimento.

Para a criação dos meliponíneos é utilizada uma caixa padrão, verticalizada, alçada, formada de cinco partes: lixeira, ninho, sobreninho, melgueira e tampa (Figura 8).

B

A

Figura 8. Caixa de madeira empregada na criação de abelhas sem ferrão.

Fizemos a multiplicação de colônias pela troca do sobreninho povoado por outro, porém vazio (Figura 9). A caixa filha, na maioria das vezes, permaneceu no lugar de origem e a caixa mãe foi removida para uma nova posição a aproximadamente 10m de distância ou para uma distância menor com a entrada voltada para a direção oposta a da anterior. Cobrimos sobreninho com vidro, para facilitar a observação interna do desenvolvimento da colônia, e sobre este colocamos a tampa. Não utilizamos a alça correspondente à melgueira, empregada quando o objetivo é a produção de mel. Para a identificação das colônias e monitoramento das rainhas utilizamos o sistema Laidlaw et al. (1956) de anotação, que identifica a colônia, a rainha e o ano, respectivamente, por exemplo, 81-1-07 (caixa 81, primeira rainha, fecundada em 2007).

Figura 9. Procedimento de multiplicação de colônias de abelhas sem ferrão pelo método Perturbação

Mínima: A– Antes da divisão (1- caixa com abelhas; 2- caixa vazia). B– Após a divisão (1- colônia-mãe; 2- colônia filha.

B

B

1

2

1

2

3.4. Alimentação Artificial

Antes e após a multiplicação, alimentamos artificialmente as colônias, mãe e filha, com xarope (1 Kg de açúcar, 600 mL de água e 1 mL de complexo vitamínico – Vitagold - empregado em criações de animais) até duas vezes por semana, dependendo da necessidade das colônias e da disponibilidade de pasto apícola (plantas floridas). Colocamos o alimento em recipiente plástico (alimentador) no canto da caixa (Figura 10).

Figura 10. Procedimento de alimentação artificial das colônias de abelhas sem ferrão.

3.5. Monitoramento de rainha e da postura

Com base na técnica de Kerr (1987) observamos a instalação e postura das novas rainhas nas colméias recém formadas (colônias filhas). Amostramos a primeira postura, da rainha recém formada na colméia, 40 dias após seu início, na fase de pupa, quando é possível a identificação, tanto de sexo quanto de castas, para quantificar a segregação de machos e de fêmeas. Estimamos o início da

postura pela contagem do número de células operculadas por dia, com o auxílio de fotodocumentação (Figura 11A). As novas rainhas foram marcadas no pronoto com uma gotinha de corretor errorex (empregado em trabalhos escolares) (Figura 11B).

Figura 11. Foto documentação da postura da rainha Melipona seminigra merrillae A– Primeiro disco

de postura da rainha recém instalada na colméia filha (destaque em círculo); B- Rainha marcada para monitoramento.

3.6. Processo de amostragem

Amostramos de 30 a 100 células do primeiro disco de cria da nova rainha, de cada uma das 64 colônias monitoradas, num total de 2020 indivíduos de M.

interrupta manaosensis e 2995 M. seminigra merrillae. Mantivemos as amostras em

estufa a 28º C, quando necessário, para completar o desenvolvimento das pupas (Carvalho, 1996). Desoperculamos as células para a identificação e quantificação de machos e de fêmeas (operárias e rainhas). Para identificação consideramos os seguintes caracteres fenotípicos: morfologia da cabeça (tamanho, olhos, mandíbulas, antenas) (Figura 12), gonóstilo (único nas fêmeas, duplo nos machos) (Figura 13), corbícula (típica das operárias, ausente nos machos) (Figura 14), unhas (em formato de garra única nas fêmeas e garra bífida nos machos) (Figura 15). Após analisado, fixamos o material em álcool absoluto e guardamos em freezer no GPA/INPA.

B

Rainha

Figura 12. Disco de cria de Melipona seminigra merrillae desoperculado para identificação de

rainha (R); macho(M) e operária (O).

Figura 13. Estrutura característica do gonóstilo em operária (A) e macho (B) de Melipona interrupta manaosensis (destaque em círculo).

B

B

Figura 14. Corbícula característica de operária de Melipona interrupta manaosensis

Figura 15. Unhas características de Melipona seminigra merrillae: A- operária, B -

macho

3.7. Estimativa da riqueza de alelos

Estimamos a riqueza de alelos sexuais csd condiderando apenas a postura da rainha. Utilizamos a equação de Laidlaw et al. (1956): n = 2M(N+1)/(H+1) (Carvalho, 2001), onde:

n é o número de alelos csd na população; N é o número total de colônias amostradas;

H é o número de colônias que produziram macho diplóide M é o número de machos que inseminaram a rainha.

Barbosa-Costa, K 2007

B A

3.8. Análise citogenética

Fizemos a análise citogenética de fêmeas e de machos, em colônias com segregação 1macho:1fêmea, para a verificação da ploidia dos machos e para a caracterização cariotípica de M. seminigra merrillae e de M. interrupta manaosensis. Empregamos a técnica descrita em Imai et al. (1988), utilizando gânglios cerebrais de pupas de olhos rosa, do primeiro disco de postura ou do segundo, quando pertinente.

Lavamos as pupas em água destilada e dissecamos em solução de colchicina hipotônica 0,005% (0,5 mL de solução de colchicina 0,1%/ 9,5 mL de solução de citrato de sódio a 1%), sob estereomicroscópio (40x), com auxílio de estilete e alfinete entomológico, para retirada dos gânglios cerebrais. Estes foram hipotonizados por 1 hora em solução de colchicina 0,005%, dissociados e fixados.

Após este tempo transferimos os gânglios para uma lâmina de microscopia, inclinamos esta entre 10 e 20º e pingamos, sobre a peça, uma gota do fixador I (ácido acético glacial: etanol absoluto: água, na proporção 3:3:1), por 4 vezes, para lavar e drenar o excesso de colchicina. Posicionamos a lâmina a 90º para retirada do excesso de fixador I. Sob estereomicroscópio, pingamos duas gotas de fixador I sobre a peça, dissociamos e espalhamos por toda a lâmina, rapidamente. A seguir pingamos duas gotas do fixador II (ácido acético: etanol absoluto, 1:1), antes de ocorrer retração do material, removendo o excesso de fixador I, nas bordas da lâmina, com papel de filtro. Após dois minutos, quando o fixador II passou a ocupar toda a superfície da lâmina, tendo evaporado parcialmente, pingamos duas gotas do fixador III (ácido acético glacial) e retiramos o excesso de fixador II nas bordas da lâmina. Identificamos as lâminas, deixamos secar à temperatura ambiente por 4 a 12 horas e guardamos em freezer para posterior coloração.

Coramos todas as preparações com Giemsa (1g de Giemsa em pó, 54 mL de Glicerina e 84 mL de Metanol) na seguinte diluição: 1 mL de Giemsa para 11 mL de tampão Sörensen pH 6,8 (fosfato de sódio dibásico 0,06 mol/L, água e fosfato de potássio monobásico 0,06 mol/L na proporção 1:3:1), por 20 minutos, à temperatura ambiente. Observamos as Metáfases mitóticas com microscópio (100X) e fotografamos com câmera digital (Sony DSC–W150).

3.9. Comportamento das operárias nas colônias DMP

Observamos diariamente as colônias que apresentaram segregação de machos e de fêmeas na proporção 1:1, característica da produção de machos diplóides, para registro do comportamento intracolonial. Observamos por períodos contínuos de 30 minutos, pelo menos três vezes pela manhã e três à tarde (das 7 às 18 horas). Para fotodocumentação do comportamento das operárias, em relação aos machos e a rainha fecundada e fisogástrica, nestas colônias (Camargo, 1979; Kerr, 1987; Carvalho et al., 1995, Carvalho, 2001) fizemos observação contínua ao longo de um dia (das 7 às 17 horas).

1

7

Capítulo 2 (Artigo I)

(Normas: Journal of Applied Entomology)

Importância da Variabilidade genética para criação das abelhas

sem ferrão Melipona interrupta manaosensis e Melipona seminigra

merrillae

Izaura Bezerra Francini1* Klilton Barbosa da Costa2 e Gislene Almeida Carvalho-Zilse3

1_{Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, Instituto}

Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Grupo de Pesquisas em Abelhas (GPA), Manaus, Amazonas, Brasil

2

Programa de Pós-graduação em Entomologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Grupo de Pesquisas em Abelhas (GPA), Manaus, Amazonas, Brasil

3

Instituto Nacional e Pesquisas da Amazônia (INPA), Grupo de Pesquisas em Abelhas (GPA), Manaus, Amazonas, Brasil.

*Autor correspondente: ibfrancini@yahoo.com.br

Resumo

Estudamos o mecanismo de determinação do sexo das abelhas sem ferrão

Melipona interrupta manaosensis e Melipona seminigra merrillae, quantificando a

segregação do loco de determinação do sexo (SDL). Monitoramos 64 novas colônias, 32 de cada espécie, de populações urbanas, em Manaus, Amazônia, Brasil, de maio a novembro de 2007. Amostramos 2020 indivíduos de M. interrupta

manaosensis e 2995 de M.seminigra merrillae. O tempo médio para formação de

rainhas foi de 10,25 dias para M. interrupta manaosensis e 7,42 dias para

M.seminigra merrillae. A distribuição de postura foi, em média, de 12,7 ovos/dia para M.seminigra merrillae. Observamos o comportamento das operárias, em colônias

com segregação 1:1, característica da produção de macho diplóide, e validamos citogeneticamente a diploidia dos machos. Foto documentamos as operárias de M.

interrupta manaosensis matando os machos e a rainha mãe, em colônias com

segregação 1macho: 1fêmea, o que não foi observado em M. seminigra merrillae. Estimamos a variabilidade genética das duas espécies, através da produção de machos diplóides, usando a equação de Laidlaw n=2M(N+1)/(H+1) para calcular a riqueza de alelos csd. Encontramos de 22 a 88 alelos em M. interrupta manaosensis e 13, 2 a 52,8 em M. seminigra merrillae, dependendo do número de machos que inseminaram as rainhas. Em M. interrupta manaosensis 87,51% dos cruzamentos ocorreram com apenas um macho, enquanto, em M. seminigra merrillae isto ocorreu em 46,88 % dos casos. As duas espécies apresentaram alta variabilidade genética e se encontram sob Determinação Complementar do Sexo (CSD), o que tem

implicações na Meliponicultura. Especulamos que o comportamento de M. seminigra

merrillae pode resultar da poliandria e da maternidade dos machos pelas operárias.

Abstract

We studied the sex determination mechanism of the stingless bees Melipona

interrupta manaosensis and Melipona seminigra merrillae by quantifying segregation

of the sex determination locus (SDL). We monitor 64 new hives, 32 of each species, of urban populations, in Manaus, Amazônia, Brazil, from May 2007 to November 2008. We sampled 2020 individuals of M. interrupta manaosensis and 2995 of

M.seminigra merrillae. The average time to queen development was of 10.25 days

for M. interrupta manaosensis and 7.42 days for M.seminigra merrillae. The laying distribution was of 12,7 egg/day in mean to M. seminigra merrilla. We observed workers behavior principally in hives with segregation of 1male:1female, which is diploid male production characteristics, and validate the diploidy of the males by cytogenetic analysis. We photo documented workers of M. interrupta manaosensis killing males and the queen mothers in hives with segregation 1male:1female, but we didn’t observe this behavior in M. seminigra merrillae. We estimated the genetic variability in these two species, through diploid male production, utilizing the Laidlaw’s equation that is n=2 M (N+1) / (H+1) to calculate allelic richness in sex determination locus. We found from 22 to 88 alleles in M.interrupta manaosensis and 13.2 to 52.8 in M. seminigra merrillae, depending of the number of males that

inseminated the queens. In M.interrupta manaosensis the queens were fertilized for at least one male in 87.51% of the crosses, while in queens of M. seminigra merrillae it occurs only in 46, 88% of the cases. These two species have high genetic

variability and both are under Complementary Sex Determination (CSD), what has implications in Meliponiculture. We speculate that M. seminigra merrillae behavior may results from polyandry and also of the male maternity by workers.

Introdução

A determinação do sexo em aproximadamente 200,000 espécies de

Hymenoptera (formigas, abelhas, vespas e Symphyta) ocorre prevalentemente por haplodiploidia ou partenogênese arrenótoca. Por este mecanismo, as fêmeas férteis põem ovos fertilizados e ovos não fertilizados, os quais se desenvolvem em fêmeas e em machos (haplóides), respectivamente (Dzierzon 1845; Crozier 1977; Cowan e Stahlhut 2004). A diversidade de mecanismos de determinação do sexo, conhecida para insetos, inclui heterogamia, haplodiploidia, perda do genoma paterno (Bull 1979) e eliminação do cromossomo X (Sanchez e Perondini 1999). Além do nível de ploidia existem outros mecanismos de determinação do sexo, como por exemplo, a Determinação Complementar do Sexo (CSD – Complementary Sex Determination) (Whiting 1943). Sob este sistema o sexo depende da composição alélica no loco de determinação do sexo (SDL – Sex Determination Locus), que é a região do genoma que abriga genes relacionados com a determinação do sexo, tais como, o csd (complementary sex determiner) e o fem (feminizer) (Hasselmann et al. 2008). Em espécies sob CSD a heterozigose do csd controla o desenvolvimento de fêmeas e a homozigose determina o desenvolvimento de machos diplóides. A homozigose do

csd ocorre quando a fêmea fértil compartilha um mesmo alelo csd com o macho

(Whiting 1943), resulta de endocruzamento ou de baixa diversidade alélica. Nestes cruzamentos 50% dos descendentes são machos diplóides, efetivamente estéreis, levando a perda de metade dos indivíduos da colônia por geração (Mackensen 1951; Woyke 1980; Crozier 1977; Cook e Crozier 1995; Kerr 1987; Carvalho 2001; Wilgenburg et al. 2006). Quando os machos diplóides são viáveis produzem

espermatozóides diplóides e consequentemente fêmeas triplóides (El Agoze 1994; Cowan e Stahlhut 2004). Populações muito pequenas em espécies sob CSD não

podem manter a diversidade alélica mínima para evitar a produção de machos diplóides (DMP) em alto nível (Yokoyama e Nei 1979; Cornuet 1980). Para muitas espécies isto é uma evidência genética do declínio e extinção da população em poucas gerações (Carvalho 2001).

Abelhas sem ferrão (Apidae, Meliponini) são insetos eussociais avançados, têm distribuição tropical e subtropical, em todo o mundo. A riqueza, de indivíduos e de espécies, destas abelhas é proeminente em muitas áreas limitadas do Brasil e da América tropical, o que indica que são os principais polinizadores da flora nativa (Michener 2007). No Brasil as abelhas sem ferrão ocorrem em todos os estados, sendo abundantes na Amazônia (Nogueira-Neto 1997; Moure 2007), onde muitas espécies, que ainda não foram identificadas, estão sob risco de extinção devido ao desmatamento (Silveira et al. 2002). Nos ecossistemas brasileiros cerca de 30 a 90% da flora nativa é polinizada por abelhas sem ferrão (Kerr et al. 2001)

demonstrando seu papel vital na manutenção da biodiversidade. Pelo menos nove espécies de abelhas sem ferrão, incluindo espécies do gênero Melipona, têm potencial para uso em programas de polinização de plantas nativas da Amazônia, cultivadas pelo valor comercial, tais como: Theobroma grandiflorum (cupuaçu), Bixa

orellana (urucum), Euterpea oleracea (açaí) e Paullinia cupana (guaraná) (Castro et

al. 2006). A despeito do atual desafio que é a criação destas abelhas em escala comercial, a Meliponicultura tem sido considerada uma atividade significante para a conservação da biodiversidade e para o desenvolvimento da agricultura sustentável, gerando novas possibilidades econômicas (Cortopassi-Laurino et al. 2006).

Melipona interrupta manaosensis Schwarz, 1932, conhecida como jupará, e

Melipona seminigra merrillae Cockerell, 1919, a jandaíra-da-Amazônia, são abelhas

Kerr et al. 1967). Estas têm papel importante como polinizadores de plantas nativas, estão entre as espécies mais criadas pelos meliponicultores locais, porque

produzem e armazenam mel e pólen (Kerr et al.1994).

Monitoramos o loco de determinação do sexo em M. interrupta manaosensis e

M. seminigra merrillae, em populações de meliponário urbano, objetivando conhecer

a variabilidade genética, o mecanismo de determinação do sexo e o comportamento associado.

Material e Métodos

Monitoramos 64 novas colônias (órfãs) de abelhas sem ferrão, 32 de

Melipona interrupta manaosensis e 32 de Melipona seminigra merrillae, em

populações urbanas, no GPA/INPA (Grupo de Pesquisas em Abelhas/Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) (3º 05.838’ S and 059º 59.103’ W), Manaus, Amazônia, Brasil, de maio de 2007 a novembro de 2008. Obtivemos as colônias para monitoramento pela multiplicação daquelas existentes no meliponário do GPA/INPA, empregando o método de Perturbação Mínima (Oliveira e Kerr 2000; Kerr et al. 2001). Este método consiste na seleção de colônias fortes (nota ≥ 7.0, em uma escala de 1 a 10) para serem divididas. Estas apresentam o ninho e o

sobreninho completamente ocupados, com crias (discos de postura, discos de cria nova e cria nascente) e potes com alimento (mel e pólen) distribuídos, lateralmente, ao redor dos discos de cria (Carvalho, 1996; Kerr et al. 1996). Após a divisão cada colônia originou duas: a colônia mãe, que permaneceu com a rainha fecundada (fisogástrica) e parte das crias; e a colônia filha (órfã), que recebeu a cria nascente e as campeiras (abelhas forrageiras), em geral, ficou no lugar de origem.

Comparamos a duração do tempo de formação de rainhas entre as amostras de Melipona interrupta manaosensis e de Melipona seminigra merrillae usando o teste não paramétrico de Mann-Whitney para amostras independentes do programa Biostat 5.0 (Ayres et al. 2007) já que os dados da amostra de M.interrupta

manaosensis mostraram-se significativamente diferentes da normalidade pelo teste

de Lilliefors (n= 32; desvio máximo = 0,1665; p < 0,05).

Com base na técnica de Kerr (1987) marcamos as novas rainhas no pronoto com tinta branca (corretivo escolar errorex) para monitorar a segregação de sexos dos descendentes. Amostramos de 30 a 100 células, do primeiro disco de postura, de M. interrupta manaosensis e M. seminigra merrillae. Mantivemos os discos em estufa a 28º C para completar o desenvolvimento, quando necessário (Carvalho 1996). Desoperculamos as células, identificamos os machos e as fêmeas e

estimamos a razão sexual (RS). Utilizamos o teste G para verificar se as freqüências observadas estavam de acordo com as esperadas, para segregação 1:1, 1:3 e 3:7 de machos e de fêmeas, respectivamente. Em colônias com segregação 1:1, que é característica da produção de macho diplóide documentamos o comportamento das operárias, por fotografia, e fizemos análise citogenética para confirmar a diploidia dos machos.

Para a caracterização citogenética empregamos a técnica de Imai et al. (1988), utilizando gânglios cerebrais de pupas de olho rosa para obtenção de metáfases mitóticas. As pupas foram lavadas em água destilada e dissecadas em solução de colchicina hipotônica 0,005% (0,5 mL de solução de colchicina 0,1%/ 9,5 mL de solução de citrato de sódio a 1%), sob estereomicroscópio (40X), para

retirada dos gânglios cerebrais. Fizemos hipotonização, destes por 1h, em solução de colchicina 0,005%, dissociamos em lâmina para microscopia e fixamos. Coramos

as lâminas com Giemsa a 5% por 20 minutos. Observamos as metáfases com microscópio óptico (100X) e fotografamos com câmera digital (Sony DSC – W150).

Para estimar a variabilidade genética destas espécies, nas populações estudadas, calculamos a riqueza alélica do gene csd (csd - complementary sex

determiner), utilizando a equação de Laidlaw et al. (1956) (modificada por Carvalho

2001) que é n = 2M(N+1)/(H+1), onde n significa o número de alelos csd, N é o número de colônias amostradas, H representa as colônias que produziram macho diplóide e M é o número de machos que inseminaram a rainha.

Resultados

Amostramos 2020 indivíduos de M. interrupta manaosensis e 2995 de M. seminigra

merrillae. O tempo médio, em dias, para formação de rainhas (Tabelas 1 e 2) em M. interrupta manaosensis foi de 10,25 dias (DP=6,5056) e para M. seminigra merrillae

foi de 7,42 (DP=3,9308). Os dados de M. seminigra merrillae mostraram distribuição normal, o que não verificamos para M. interrupta manaosensis. Comparamos o tempo de formação de rainhas entre as amostras de M. interrupta manaosensis e de

M. seminigra merrillae usando o teste de Mann-Whitney para amostras

independentes, o que não foi significativamente diferente (Mann-Whitney U = 390,00; Z(U) = 1.4573; p = 0,1450). A distribuição do número de ovos por dia para

M. seminigra merrillae (Tabela 3) foi normal (Teste de Lilliefors; desvio máximo

0,1429; p > 0,05), variou entre 5 e 16 ovos/dia com média de 12,7 ovos/dia (DP=2,70). Para M. interrupta manaosensis utilizamos a média de 5 ovos/dia

conforme proposto por Kerr (1987) para M. compressipes fasciculata. Os resultados da segregação de machos e de fêmeas, os cálculos da razão sexual e do teste G foram descritos nas tabelas 4 e 5. Para M. interrupta manaosensis (Tabela 4)

registramos segregação igual a 1macho:1fêmea em duas colônias, 1macho:3fêmea em três colônias e 3macho:7fêmea em uma colônia. A análise da segregação de sexos, descrita para M. seminigra merrillae (Tabela 5) revelou que das 32 colônias monitoradas quatro produziram segregação 1macho:1fêmea, sete segregaram 1macho:3fêmea e em dez obtivemos 3macho:7fêmea.

Em colônias de M. interrupta manaosensis que segregaram 1macho:1fêmea, documentamos as operárias atacando e matando os machos, logo após emergirem, e também a rainha mãe (Figura 1 a e b). Em uma destas colônias as operárias mataram a segunda rainha eleita, porque esta também produziu macho diplóide. As operárias de M. seminigra merrillae não mataram a rainha em colônias com

segregação 1:1 e não observamos atacarem os machos.

Em M. interrupta manaosensis estimamos 22 alelos csd quando rainhas foram inseminadas por um macho, 44 se inseminadas por dois machos e 88 quando

inseminadas por quatro machos. Para M. seminigra merrillae encontramos uma riqueza alélica igual a 13,2 alelos quando as rainhas foram inseminadas por um macho, 26,40 alelos por dois machos e 52,8 alelos por 4 machos.

Discussão

As colônias com segregação 1:1 evidenciaram a produção de macho diplóide, indicando que nestas as rainhas compartilhavam um alelo sexual com o macho que a inseminou, produzindo a homozigose do csd (Whiting 1943; Hasselmann et al. 2008). Portanto, as duas espécies estão sob Determinação Complementar do Sexo (CSD), o que tem implicações na Meliponicultura (Carvalho 2001), assim como, para o estabelecimento de estratégias de conservação das populações naturais (Zayed et al. 2003).

De acordo com a visão corrente, em insetos sociais, a produção de macho diplóide dizima a força operária e reduz o potencial de produção de rainhas (Zayed e Packer 2005). Em Melipona as operárias matam os machos, após emergirem e rainha que os produziu (Camargo 1979; Kerr 1987; Carvalho 2001), conforme documentamos para M. interrupta manaosensis. Mas, não observamos este padrão de comportamento para M. seminigra merrillae como predito por estudos prévios.

Em colônias que segregaram 1:3 e 3:7 a rainha foi fertilizada por pelo menos dois e quatro machos, respectivamente. Nestes casos, a rainha compartilha um alelo com pelo menos um macho. Rainhas M. interrupta manaosensis foram inseminadas por pelo menos dois e quatro machos em 9,37% e 3,12 % dos cruzamentos,

respectivamente. Enquanto as rainhas de M. seminigra merrillae foram inseminadas por dois machos em 21,87% dos cruzamentos e por quatro machos em 31,25% destes. Portanto, as rainhas de M. interrupta manaosensis foram inseminadas por 1 macho em 87,51% das colônias e as rainhas de M. seminigra merrillae em apenas 46, 88% destas. Não encontramos segregação característica de cruzamento da rainha com até três machos, um deles compartilhando um alelo csd com a rainha.

As duas espécies apresentaram alta variabilidade genética, considerando o acentuado polimorfismo do csd, mesmo em população de cativeiro (meliponário urbano), onde o grau de parentesco entre as colônias é elevado, aumentando a chance de homozigose por origem comum.

Especulamos que as estratégias evolutivas selecionadas por M. seminigra

merrillae para evitar os efeitos deletérios da produção de macho diplóide, estão

associadas à poliandria e à reprodução das operárias.

O conhecimento dos mecanismos genéticos da biologia da reprodução destas espécies, assim como, do comportamento associado ao sistema de determinação do

sexo, é fundamental para o manejo adequado destas abelhas, tanto em

meliponários como no ambiente natural. Entendemos que a exploração racional dos ecossistemas naturais, depende da transmissão deste conhecimento às populações locais, o que pode ser um bom caminho para a preservação da Amazônia.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr.GAR Melo, pela identificação taxonômica. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Amazônia (FAPEAM), pela Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e pelo Banco Real.

Legenda de Figuras

Figura 1. Melipona interrupta manaosensis – operárias atacando e matando macho em

colônia com segregação 1macho:1fêmea

Figura 2. Melipona interrupta manaosensis - operárias atacando e matando a rainha mãe