Professora Vera Lúcia dos Santos

Professora

Nutrição bacteriana

Composição química de uma célula bacteriana (E. coli)

Componentes água proteínas lipídeos LPS peptidioglicano glicogênio DNA RNA metabólitos íons inorgânicos % Massa úmida 70 15 2 1 0,7 1 1 5 3 0,3 Tipos diferentes 1 2000 4 1 1 1 1 500 350 20

Como estudar microrganismos no laboratório? Cultivo “in vitro”

conhecer as exigências nutricionais e ambientais dos microrganismos

Lei do Mínimo de Liebig

A biomassa total de um organismo é determinada pelo

nutriente presente no meio em menor concentração em

relação aos seus requerimentos.

Composição Química Média da Célula (%)

Oxigênio... 65 Carbono... 18 Hidrogênio... 10 Nitrogênio... 3 Subtotal... 96 Cálcio (Ca)... 1,8 Fósforo (P)... 1,2 Potássio (K). ... ...0,35 Enxofre (S)...0,25 Sódio (Na)... 0,15 Cloro (Cl)... 0,15 Magnésio (Mg)... 0,05 Flúor (F)... 0,007 Ferro (Fe)... 0,005 Subtotal... 3,962 Outros(Zn,Br,Mn,Cu,I,Co)... 0,038

Em um dado ecossistema sempre haverá algum fator nutricional limitante.

Lei da Tolerância de Shelford

A ocorrência e abundância de um microrganismo em um

dado ambiente é determinada não somente pelos

nutrientes disponíveis mas pelos fatores físicos e

químicos.

O microrganismo apresenta um conjunto complexo de

condições, dentro de uma faixa de tolerância.

Se qualquer condição exceder os limites mínimo ou

Máximo= organismo falha e morre.

Principais tipos nutricionais dos microrganismos

Cultivo de bactérias no laboratório

Macronutrientes Funções

Carbono

g

Constituintes de carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos Oxigênio Hidrogênio Nitrogênio Enxofre Fósforo mg

Potássio (K+_{) Atividade enzimática}

Cálcio Resistência ao calor do endosporo

Magnésio (MG2+_{) Cofator de enzimas, complexos com ATP, estabiliza}

ribossomos e membranas

Ferro (Fe2+_/Fe3+_{) Constituição de citocromos, cofator de enzimas, cofator de}

proteínas transportadores de elétrons

Micronutrientes µg

Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr

cofatores de enzimas

geralmente não é preciso adicionar: presentes na água; Água desmineralizada: adicionar solução elementos traço.

Forma de apresentação dos

macronutrientes na natureza

e em meios de cultura

Fatores de crescimento

Compostos orgânicos específicos, necessários em

quantidades muito pequenas devido à incapacidade

das células de os sintetizarem.

Fornecidos como componentes dos meios de cultura

(peptonas, extrato de levedura) utilizados para o

crescimento in vitro dos microrganismos.

1)

Aminoácidos - fundamentais para a síntese protéica

Purinas e pirimidinas - fundamentais na composição

dos ácidos nucléicos

Cultivo de microrganismos in vitro

Meio de Cultura: mistura de compostos nutrientes necessários ao crescimento microbiano.

Algumas bactérias crescem em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e também existem bactérias que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido.

Uso:

Permitem o isolamento, crescimento e manutenção de microrganismos no laboratório.

Facilitam a identificação dos microrganismos a partir de diferentes ambientes

Permitem verificar susceptibilidades a agentes quimioterápicos e outros compostos químicos Uso na indústria: inoculantes, fermentação

Podem ser líquidos (sem agar), semisólidos ou sólidos.

Líquido: obtenção de biomassa e de metabólitos em reatores

Sólido: permite a obtenção de cultura pura - caracterizar um agente infeccioso

Classificação dos meios quanto ao

estado físico

Classificação quanto à composição

Meios sintéticos ou definidos

composição química exata é conhecida

Meios Complexos

composição química exata não é conhecida

Úteis para cultura de microrganismos com requerimentos nutricionais complexos ou desconhecidos.

Hidrolisados de proteínas preparadas por digestão proteolítica parcial de carne, caseína, soja ou gelatina), extrato de carne ou extrato de levedura.

Classificação quanto à composição

Meios de cultura enriquecidos

Meio basal enriquecido com ovo, soro ou sangue, substâncias que permitem o crescimento de bactérias muito exigentes em termos nutricionais e que se encontram em número reduzido.

• Meios caracterizados por ausência de inibidores. Podem ou não ser diferenciais.

Quanto a finalidade

Meios diferenciais

permitem a distinção entre

diferentes grupos de m.o.

Produção de enzimas

DNAse - adição substrato e verificação halo hidrólise

Agar sangue: Meio complexo, enriquecido, não seletivo

•

Meios de enriquecimento

São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, facilitando o isolamento de um microrganismo de interesse.

Ex: caldo de selenito de sódio- permite enriquecimento de Salmonella e

Meios de cultura seletivos

Permitem apenas o

crescimento de certas espécies

de bactéria.

Ex: Meio de McConkey (peptona, lactose, NaCl, sais biliares e vermelho de metila como indicador de pH).

Meio diferencial para fermentação de lactose - Bactérias que fermentam

áçúcares produzem ácidos que reagem com vermelho de metila formando

colônias rosas, colônias não

fermentadoras permanecem incolores.

Seletivo para bacilos gram – (bactérias de origem intestinal, enterobactérias)

- Contém sais biliares e corantes que inibem o crecimento de bactérias gram +.

Meios de transporte

Meios que servem para o transporte e conservação de um

material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais microrganismos.

O papel principal deste meio é manter os microrganismos vivos, mas impede o crescimento e multiplicação até o subcultivo em meio adequado.

Meio de Stuart

Glicerol fosfato de sódio ...10 g Tioglicolato de sódio...1 g Cloreto de cálcio...0,1 g Azul de metileno...0,002 g Ágar...8 g Água……… 1 L

Meios de conservação

São meios que permitem a manutenção das

bactérias num estado de vida latente durante

meses, anos ou décadas.

Ex: Meio GYMP adicionado de

glicerol-crioprotetor

Efeitos ambientais no

crescimento microbiano

Fatores físicos que afetam o

crescimento de bactérias

Procariotos que vivem em pH extremos

parecem manter um pH interno próximo do

neutro bombeando prótons para fora da célula

Neutrófilos: crescem na faixa de pH entre 5 a 8

Acidófilos: crescem melhor em valores <5

Alcalófilos: crescem melhor em valores >5

pH

pH

Os microrganismos podem alterar o pH do micro habitat

Liberação de produtos de degradação ácidos ou básicos.

• Produção de ácidos orgânicos (lático)- Bactérias do ácido lático

• Thiobacillus sp. (quimiolitotrófico) -oxida enxofre reduzido a ácido sulfúrico

• Produção de amônia através da desaminação de aminoácidos

Temperatura

Temperatura ótima de crescimento

psicrófilas (12 a 17°C) psicrotróficas (20 a 30°C)

Efeito da temperatura

Afeta a taxa de crescimento por afetar a taxa das reações celulares

Fator Q10

Mudanças na taxa de crescimento são comparáveis dentro de uma certa faixa às respostas das reações químicas a temperatura.

Efeito de altas temperaturas:

desnaturação de enzimas e proteínas em geral

alteração do dobramento das proteínas reduzindo a sua atividade

desintegração das membranas por fusão lipídica

Adaptações que permitem

crescimento a altas temperaturas

Proteínas e enzimas:

o acúmulo de solutos (2,3 difosfoglicerato cíclico) que estabilizam

proteínas;

o presença de proteínas específicas que estabilizam outras

proteínas por dobramento a temperaturas próximas do limite de crescimento (chaperonina)

Aumento da percentagem de G / C (não universal).

o Presença de proteínas de união ao DNA que impeçam a sua fusão (aumento da estabilidade térmica)

o DNA girase reversa: Superenovelamento (+) no DNA

Modificação de lipídeos da membrana

aumento da percentagem dos ácidos graxos saturados/ insaturados, ramificados e de alto peso molecular.

Fosfolipídios com alto ponto de fusão: CL, PE

Compensar o aumento da fluidez da membrana

Adaptações que permitem

Stress- Baixa temperatura

Desestabilização da bicamada-membrana

Aumento da concentração de soluto

Desidratação

Citoplasma se torna altamente viscoso:

alteração dos processos de difusão,

incluindo osmose

Baixas temperaturas-nível celular

Cristais de gelo grandes se formam no exterior das células, remove água e concentra o soluto.

Aumento dos cristais extracelulares: promovem a saída da água intracelular por osmose.

Microrganismos psicrófilos

Modificação da composição das membrana celulares

o Aumento de ácidos graxos insaturados, encurtamento das cadeias e

diminuição de ácidos graxos cíclicos

o Estas alterações mantém as membranas em um estado semi-fluido a

baixas temperaturas.

Atmosfera gasosa

O₂ e CO₂, são os gases principais que afetam o crescimento De acordo com resposta ao O₂, os microrganismos são

classificados em:

AERÓBIOS

Estritos (obrigatórios): necessitam de O₂ (respiração aeróbica)

Microaerófilo: necessitam de O₂ em níveis menores que atmosfera (respiração aeróbica)

ANAERÓBIOS

Aerotolerantes: não necessitam de O₂ mas podem tolerar sua presença (fermentação)

Facultativos: não necessitam de O₂ mas crescem melhor na sua presença (fermentação, respiração aeróbica)

Estritos (obrigatórios): não toleram O₂ (letal) (fermentação, respiração anaeróbica)

Por que o O

é tóxico para os

anaeróbios?

O₂ é poderoso agente oxidante e excelente aceptor de elétrons na respiração

Processos celulares geram formas reativas de O₂ - são oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares

Formas tóxicas do oxigênio

células devem ser capazes de se proteger contra estas espécies reativas para manter sua integridade

Caracterização de microorganismos

quanto ao metabolismo de O

(a) Aeróbio obrigatório (catalase e superóxido dismutase) (b) Anaeróbio (catalase e superóxido dismutase ausentes na maioria) (c) Anaeróbio facultativo (catalase e superóxido dismutase) (d) Microaerófilo (necessitam de baixos teores de O2)

(pequenas quantidades de catalase e superóxido

dismutase)

(e) Aerotolerante (suportam a presença de O2, apesar de não o utilizarem) (superóxido dismutase)

uso de agentes redutores nos meios de cultura

Ex: tioglicolato de sódio, que reage com oxigênio,

formando água

remoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por

nitrogênio e CO

;

Cultivo de anaeróbios

Uso de sistemas geradores de anaerobiose (GasPak) -Jarra de anaerobiose: adicionadas de bicarbonato de sódio e boroidreto de sódio que reagem com a água liberando hidrogênio e CO₂ com um catalisador de paládio

usada para anaeróbios aerotolerantes

Cultivo de anaeróbios

Transporte de anaeróbios

Embalagem formadora de anaerobiose

Pressão osmótica

Pressão Osmótica - força com a qual a água se move através da membrana

citoplasmática a partir de uma solução de baixa concentração de soluto para uma contendo alta concentração de soluto (osmose).

As células podem estar em

um meio:

Isotônico - Não há

movimento de água para dentro ou para fora da célula

Hipertônico

-concentração de solutos fora da célula é maior que no interior. A água flui para fora da célula - plasmólise

Hipotônico - a concentração

de soluto no interior da célula é maior que fora dela. A água flui para dentro da célula: pode inchar e se romper

Como os microrganismos conseguem crescer em um meio com baixa atividade de água?

Bombeamento de íons inorgânicos (KCl) para o interior da célula Síntese de solutos orgânicos acumulados no interior da célula para o ajuste da atividade de água citoplasmática (BS)

Prolina (G(+) Staphylococcus

aureus);

Glicina betaina (bacterias halófilas)

Ectoina (Ectothiorhodospira) Glutamato

Sacarose, Trehalose, Glucose, Frutose

(Cianobacterias de aguas continentais, fotossintéticas anoxigênicas)

Solutos compatíveis

Glicerol, Manitol, Sorbitol, Ribitol (Cianobacterias e algas marinhas,

Dunaliella, leveduras osmofílicas,

fungos xerófilos)

(Algas marinas)

KCl: Arqueobacterias halófilas

Efeito da concentração do íon sódio no

crescimento de microrganismos

1-15% de NaCl 15ª 30% de NaCl

Os efeitos osmóticos são de maior importância em ambientes salinos. Em relação a necessidade de sal (NaCl) m.o. podem ser

Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio. Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada

Adaptações aos períodos de

dessecação

Formação de esporos: Sobrevivência em estado dormente e crescimento ativo em condições favoráveis

Formação polissacarídeos extracelulares (cápsulas, camada mucosa) com trehalose

Síntese de açúcares (sacarose, trehalose) que se liga a proteínas impedindo a

desnaturação

Trehalose forma ligações de H com lipídios (substituindo moléculas de água) mantendo a membrama celular funcional

Mecanismos de reparo de DNA (fragmentação em condições de dessecação)

Para microrganismos que se dividem por fissão ou por gemulação,

o termo crescimento refere-se a um aumento do número e não ao

tamanho das células.

Os microrganismos em crescimento estão, na verdade,

aumentando o seu número e se acumulando em colônias

COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio.

Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de

microrganismos por unidade de tempo.

Crescimento celular e fissão binária

•As bactérias dividem-se em duas por fissão binária e aumentam o seu número de forma geométrica em que a sua população duplica a cada tempo de geração (Crescimento

exponencial)

•Tempo de geração: é o

intervalo de tempo necessário para que uma célula se

Tempo de geração varia de acordo com sua constituição genética e condições do meio

Escherichia coli se divide a cada 20 minutos em caldo em

Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica:

A – Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem.

B – Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica.

C – Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte

D – Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO

CRESCIMENTO MICROBIANO

Métodos para medida de crescimento

microbiano

Contagem do número de microrganismos

- Direta: ao microscópio ótico

- Indireta: contagem em placa, membrana

filtrante e incubação.

Contagem do número de células

Contagem direta das células, usando uma câmara de contagem (câmara de Neubauer ).

- Vantagens: é o processo mais direto, econômico e rápido de contagem de microrganismos.

- Dá também informação sobre o tamanho e morfologia dos

microrganismos.

- Desvantagem: não permite distinguir as células vivas das células mortas.

CÂMARA DE NEUBAUER

Ao microscópio – aumento de 400X

Contagem em placas

O número original de microrganismos na amostra (UFC/mL) pode ser calculado a partir do número de colônias formado e da diluição feita.

MËTODO DE DILUIÇÕES SUCESSIVAS

CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO

Sistema de filtragem

Células bacterianas na superfície da membrana (poros) A membrana filtrante foi colocada sobre o

Determinação da massa celular

Direto: pesagem

Indireto: determinação do contéudo de N, P e C e

turbidimetria

Determinação do peso seco

- Método que inclui centrifugação, lavagem, secagem

num forno e pesagem.

- Desvantagens: baixa sensibilidade e necessidade de

grandes quantidades de massa orgânica.

Medição da massa celular

- Baseia-se no fato de as células microbianas dispersarem a luz. A quantidade de luz detectadaé proporcional à concentração de células presentes.

- Quando a concentração bacteriana atinge 10 milhões de células por ml o meio aparece ligeiramente turvo. O aumento da concentração celular conduz ao aumento da turvação e menos luz é transmitida através do meio. A luz detectada pode ser medida num espectofotómetro.

- Vantagens: é um método rápido e sensível.

Determinação da atividade celular

Atividade enzimática

Concentração de um metabólito

Medida da respiração

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